專利名稱：出血敗血性巴斯德氏菌疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及出血敗血性巴斯德氏菌(pasteurella multocida)種的活的減毒細菌、涉及包含這種活的減毒細菌的活的減毒疫苗、涉及這種細菌在制備這種疫苗中的應用、涉及制備這種疫苗的方法和用于這種細菌的檢測的診斷化驗。
背景技術：
一個世紀以來就已知革蘭氏陰性細菌出血敗血性巴斯德氏菌是一些動物物種中疾病的病原體。出血敗血性巴斯德氏菌是導致禽類中禽霍亂、牛中出血性敗血病和豬中萎縮性鼻炎的已知的傳染源。此外，在過去60年中，它作為人類病原體的重要性已經變得越來越清楚。
出血敗血性巴斯德氏菌僅有一個種，不存在亞種。然而，可以基于莢膜抗原和LPS抗原的不同進行細分。基于莢膜抗原已定義5種出血敗血性巴斯德氏菌組，即A-E，并且基于LPS抗原已經定義了16種菌體血清型。致病性或者毒力不受莢膜菌株的莢膜抗原組或者LPS血清型的影響。莢膜抗原組僅僅決定任何特定菌株的宿主動物。
導致禽霍亂的菌株主要屬于A組莢膜抗原。已知兩種疾病急性和慢性禽霍亂。急性禽霍亂的癥狀是抑郁、波緣羽毛、發熱、食欲減退、粘液排出和增加的呼吸率。通常見到損傷如瘀點和瘀斑性出血、全身被動性充血和增加的腹膜和心包液。
慢性感染的鳥類中疾病的癥狀通常與局部化感染有關。通常發生肉垂、竇房結、眼眶周圍皮下組織、腿或者翅膀的腫脹。慢性感染的鳥類中的損傷通常的特征是纖條體非化膿性滲出液、局灶性壞死和結締組織增殖。
導致牛和水牛以及豬、綿羊、山羊、鹿和駱駝中的出血性敗血病的菌株主要屬于B和E組莢膜抗原。出血性敗血病是一種急性疾病，其特征是頭-咽喉-胸部區中的快速過程、水腫性腫脹、腫脹和出血性淋巴結和存在許多亞血清瘀點性出血。
在豬中，出血敗血性巴斯德氏菌導致萎縮性鼻炎和肺炎。這些綜合征主要由A和D型莢膜引起。還已經描述了急性敗血病的病例，其由B型莢膜引起。與萎縮性鼻炎有關的臨床病征是噴嚏、鼻涕、鼻口部縮短和扭動、肺炎和生長遲緩。肺炎主要表現為繼發性感染，增加原發損害的嚴重性。臨床病征包括非排痰性干咳，其可以變成排痰性咳嗽，并且在嚴重病例中，體溫升高。
原則上，當為抵抗出血敗血性巴斯德氏菌而接種時，有兩種方法保護免于出血敗血性巴斯德氏菌感染用殺死的疫苗(菌苗)接種和用活的減毒疫苗接種。菌苗是經濟上有吸引力的，因為它們生產廉價。然而，它們必須注射，它們通常導致嚴重的組織反應，高刺激壓力(challengepressure)仍然可以導致在菌苗接種的動物中爆發疾病，并且在最糟糕的是它們僅給予針對同種血清型的保護。
與此相反的是，用活的減毒疫苗接種給予良好的交叉保護，不僅提供針對同種血清型的保護而且提供針對異源血清型的保護。因此，這些疫苗會成為所選擇的疫苗，但是使用活疫苗存在兩個嚴重的缺點首先，當前使用的活的減毒出血敗血性巴斯德氏菌疫苗菌株是沒有確切定義的(ill-defefined)它們的減毒行為的性質是未知的。因此，總是存在逆轉為毒性的危險。
其次，存在規因于使用的活的疫苗菌株而爆發巴斯德氏菌病，這種爆發的可能原因可能是使用的疫苗菌株的逆轉為毒性或者減毒的水平不足。
因此，明顯需要有效并且安全的減毒的活的出血敗血性巴斯德氏菌，這種疫苗必須提供對出血敗血性巴斯德氏菌感染的保護或者其效果，同時行為為減毒的并且不易于逆轉為毒性的。
本發明的一個目的是提供滿足這些需要的活的減毒出血敗血性巴斯德氏菌。
發明內容
現在令人驚奇地發現，可以缺失一種出血敗血性巴斯德氏菌中的新型的、迄今未知的基因(進一步稱作Orf-15基因)而不損害菌株的免疫反應性，同時顯著地降低該細菌的毒力(virulence)。野生型出血敗血性巴斯德氏菌中該基因的存在不局限于特定莢膜抗原組或者菌體血清型。不論莢膜抗原組或者菌體血清型，在出血敗血性巴斯德氏菌菌株中存在該基因發現它存在于所有16種菌體血清型和5種所有莢膜抗原組中。
因此，該基因是出血敗血性巴斯德氏菌中普遍的減毒靶標，現在首次允許制備用于出血敗血性巴斯德氏菌相關疾病的安全疫苗。該方法因此同樣適于制備例如，保護人類免于出血敗血性巴斯德氏菌感染或者其效果的疫苗、保護禽類免于禽霍亂的疫苗、保護豬免于萎縮性鼻炎的疫苗和保護牛和水牛免于出血性敗血病的疫苗。
此外，發現缺失Orf-15基因的活的減毒出血敗血性巴斯德氏菌菌株不僅提供針對它們的同種血清型的良好保護，而且針對異源血清型的非常好的交叉保護。
圖1顯示了刺激后接種的動物(通過飲用水接種和氣溶膠接種)對比對照動物的累積死亡率的比較。
具體實施例方式
本發明的第一個實施方案涉及不能表達功能性Off-15蛋白質的活的減毒的出血敗血性巴斯德氏菌細菌。功能性Orf-15蛋白質的新的閱讀框的序列在SEQ ID NO1中給出，并且它編碼的Orf-15蛋白質在SEQ IDNO2中描繪。
功能性Orf-15蛋白質理解為能夠導致如野生型出血敗血性巴斯德氏菌中完整毒性的Orf-15蛋白質。
因此，認為至少在該能力方面有缺陷的出血敗血性巴斯德氏菌不能表達功能性Orf-15蛋白質。Orf-15基因中的任何突變，如插入替代或者缺失突變而導致當與野生型出血敗血性巴斯德氏菌菌株相比其毒力降低時，認為該突變在本發明的范圍內。
以兩種方式定義用于本發明的菌株的毒力的降低。毒力降低的一種定義涉及針對致命感染的保護水平已知在受控的條件下用出血敗血性巴斯德氏菌野生型菌株對火雞的感染得到高于50％的死亡率(見例如實施例部分)。由于根據本發明的Orf-15基因中的突變而毒力降低的出血敗血性巴斯德氏菌在相同條件下提供了低于10％的死亡率的菌株。
毒力的降低的另一定義涉及疫苗接種后，與野生型出血敗血性巴斯德氏菌菌株的亞致命感染相比較的損傷水平和嚴重性。從而，根據毒力降低的第二種定義，如果出血敗血性巴斯德氏菌菌株導致的損傷水平低于野生型出血敗血性巴斯德氏菌菌株感染導致的損傷水平的30％，那么認為該出血敗血性巴斯德氏菌菌株具有降低的毒力水平。
從而，如果出血敗血性巴斯德氏菌菌株例如在Orf-15基因中具有例如突變或者具有干擾Orf-15基因編碼的蛋白質的表達的物質(見下文)，其導致上面提供的毒力降低的兩種定義的至少一種的毒力降低，那么認為所述出血敗血性巴斯德氏菌在本發明范圍之內。
這種突變可以是插入、缺失、替代或者其組合，條件是該突變導致不能表達功能性Orf-15。(不言而喻，無效突變，如密碼子CTC向CTT的突變不影響Orf-15蛋白質并且因此不導致表達功能性Orf-15蛋白質的失敗)，因此對于本發明，不考慮這種突變)。
通常，突變是一個或多個核苷酸的插入、替代或者缺失。特別地，不能被3整除的許多核苷酸的插入或者缺失導致移碼，其又導致無義密碼。結果，將合成截短的Orf-15蛋白質，其具有降低的功能性或者甚至根本沒有功能性。
本領域中已知多種方法可以在閱讀框中引入突變。得到這種突變的一種可能的方法是通過經典方法，如用誘變劑如堿基類似物處理野生型細菌，用紫外線或者溫度處理處理。然而，Orf-15突變體的選擇將是相當費時的任務。
此外，經典突變技術導致的突變的性質將是未知的。這可以是Orf-15基因中的點突變，其可以最終恢復為野生型。為了避免這種小的危險，轉座子誘變將是好的備選方案。通過轉座子誘變制備突變體也是本領域中公知的技術。這是一種在染色體的局部位點建立的突變。從而可以產生穩定的、無毒的、免疫原性轉座子介導的出血敗血性巴斯德氏菌突變體。轉座子介導的突變體是具有插入細菌基因組的轉座子的那些突變體。
“轉座子”是通過轉座可以插入DNA分子的DNA元件，轉座是非同源重組過程，其不需要很高的DNA序列同源性。轉座子通常包括編碼稱作轉座酶的轉座酶的基因，所述轉座酶在轉座子的末端切割DNA并將轉座子插入到靶DNA。此外，轉座子通常含有編碼抗生素抗性的標記基因，其可以用于選擇具有轉座子插入的突變體的選擇。已知的轉座子包括Tn3、Tn5、TnphoA、Tn7、Tn9、Tn10和其功能片段(Mobile DNA，編著D.E.Berg和M.M.Howe，ASM Press，1989)。僅僅作為實例，Tn10轉座子是本領域中熟知的并且由Lee(Lee，M.D.，Henk，A.D.，Veterinary Microbiology，50，1996，143-1480)描述。可以通過本領域技術人員公知的標準方法產生轉座子插入突變體(Mobile DNA，編著D.E.Berg和M.M.Howe，ASM Press，1989)。Orf-15轉座子突變的選擇將更容易并且較不費時，由于使用位于Orf-15基因的3’-末端和5’-末端邊的引物進行PCR將直接顯示轉座子-插入是否位于Orf-15基因中或別處。
現在，可以通過重組DNA技術，更特別地通過位點定向誘變(site-directed mutagenesis)向Orf-15中的預定位點(有意地而不是隨機地)非常巧妙地導入突變。這種突變可以再次是插入、缺失或者將一個核苷酸用另一個替代或者它們的組合，唯一的條件是突變的基因不再編碼功能性Orf-15。這種突變可以例如通過缺失許多堿基對進行。甚至非常小的缺失如導致移碼的單個堿基對缺失可以足夠使得Orf-15成為非功能的。更優選地，除去更長的一段序列，如10個、50個或者更多堿基對。甚至更優選地，缺失整個Orf-15基因。
通過位點定向誘變構建Orf-15陰性突變體的技術是公知的標準技術。它們涉及例如克隆Orf-15基因，通過位點定向誘變修飾基因序列，限制酶消化接著再連接或者PCR方法，和隨后用突變基因置換野生型Orf-15基因(等位基因交換或者等位基因替換)。標準重組DNA技術如質粒中Orf-15基因的克隆、用限制酶消化基因，接著內切核酸酶處理，再連接和宿主菌株中的同源重組都是本領域中公知的并且例如在Maniatis/Sambrook(Sambrook，J.等人Molecular cloningalaboratory manual.ISBN 0-87969-309-6)中描述。使用Clontech出售的Transformer試劑盒，通過體外位點定向誘變可以進行例如位點定向突變(Dieffenbac h&Dreksler；PCR primers，a laboratory manual.ISBN 0-87969-447-3和ISBN 0-87969-447-5)。
如上文解釋的，用于構建不能表達功能性Orf-15蛋白質的活的減毒的出血敗血性巴斯德氏菌的最常用的方法依賴于Orf-15基因中的突變。然而，存在備選的制備不能表達功能Orf-15蛋白質的活的減毒的出血敗血性巴斯德氏菌細菌的方法。該備選方法涉及與編碼Orf-15蛋白質的信使RNA的相互作用。蛋白質的表達是兩步過程，其包括通過DNA的轉錄產生Orf-15 mRNA的步驟和隨后將該mRNA翻譯成Orf-15蛋白質的步驟。細菌中某些類型的RNA，如Orf-15特異性dsRNA、Orf-15特異性短干擾RNA或者Orf-15特異性反義RNA的存在將干擾Orf-15 mRNA，并且因此阻斷Orf-15 mRNA向野生型量的Orf-15蛋白質的翻譯。該機制所基于的RNA或者類似的機制通常稱作RNAi。因此，例如，Orf-15特異性siRNA、dsRNA或者Orf-15特異性反義RNA的存在將具有與Orf-15基因中突變相同的效果這種細菌將不能夠表達功能性Orf-15蛋白質。
數十年來就已經知道反義RNA用于基因沉默的用途，并且RNAi(例如dsRNA或siRNA)的使用(通常迄今使用了約5年)也是本領域中熟知的成熟的技術。關于該主題的綜述已經由Hnnmon，G.J.在Nature 418244-251(2002)和Deni，A.M.和Hnnmon，GJ.在TRENDS inBiochemical Sciences 28196-201(2003)中著述。描述siRNA在基因沉默中的用途的其他文章為Bertrand，J.R.等人，B.B.R.C.2961000-1004(2002)和Sorensen，D.R.等人，J.Mol.Biol.327761-766(2003)。RNAi用于哺乳動物中病毒的沉默的用途也在最近提出并且已經由Quan-Chu Wang等人，(World J.Gas troenterol.91657-1661(2003))綜述。
一般而言，技術人員將可能稍微偏愛第一種方法在Orf-15基因中產生突變。這是由于與基于任何RNA干擾的方法相反，基因的突變不向細胞中引入任何額外的遺傳物質。
因此，該實施方案的優選形式涉及活的減毒細菌，其由于Orf-15基因中的突變而不能表達功能性Orf-15蛋白質。
缺失或者插入，特別是框外突變(out-of-frame-mutation)將對于Orf-15蛋白質的功能性具有顯著影響。
因此，在該實施方案的更優選的形式中，突變包括插入和/或缺失。在最優選的形式中，缺失整個Orf-15基因或者至少它的編碼序列。
Orf-15基因包括編碼序列以及啟動子區域和核糖體結合部位。啟動子位點包括至少包含SEQ ID NO1的核苷酸22-71的區域，而且核糖體結合部位跨越核苷酸92-96。因此，不言而喻，認為使得啟動子或者核糖體結合部位無效從而導致Orf-15的降低的表達或者不表達的任何突變也在本發明的范圍內。
考慮到現今施用于寵物和農場動物的大量疫苗，顯然如果僅僅為了降低接種成本的原因，組合使用幾種疫苗將是被人們所希望的。因此非常吸引人的是使用活的減毒細菌作為異源基因的重組載體，所述異源基因編碼選自其他致病生物或者病毒的抗原。這種重組載體的施用具有同時針對兩種或多種疾病誘導免疫性的優點。根據本發明的活的減毒細菌由于它們的減毒行為而提供了異源基因的非常合適的載體。
因此，該實施方案的甚至更優選的形式涉及根據本發明的活的減毒細菌，其攜帶編碼選自對人和/或動物致病的微生物或者病毒的一種或多種抗原的異源基因。
Orf-15基因作為異源基因的插入位點的用途具有額外的優點，即失活Orf-15基因的同時，新導入的異源基因可以表達(與異源細菌基因協調)。因此，該實施方案的甚至更優選的形式涉及根據本發明的活的減毒的出血敗血性巴斯德氏菌，其具有異源基因插入到編碼Orf-15的基因中這一特征。
異源基因可以攜帶被出血敗血性巴斯德氏菌RNA聚合酶識別的同源啟動子或者任何其他啟動子。還可以使用天然Orf-15啟動子。這可以通過缺失ORF-15編碼序列并將其用所選的異源基因替換最容易地設置。
使用如上述的標準分子生物學技術，這種重組載體的構建可以常規地進行。
在該實施方案的一種最優選的形式中，異源基因編碼選自豬病原體的一種或多種抗原，所述病原體由豬繁殖呼吸綜合征(PRRS)病毒、偽狂犬病病毒、豬流感病毒、豬短小病毒、傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒、豬環病毒1或者2、大腸桿菌、豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、支氣管敗血性博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)、豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)和豬鏈球菌(Streptococcus suis)組成。
在該實施方案的另一最優選的形式中，異源基因編碼選自牛病原體的一種或多種抗原，所述牛病原體選自牛皰疹病毒(BoyineHerpesvirus)、牛病毒性腹瀉(Boyine Viral Diarrhoea)病毒、3型副流感病毒(Parainfluenza type 3 virus)、牛副黏病毒(BoyineParamyxovirus)、口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease virus)、溶血性巴斯德菌(Pasteurella haemolytica)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、Staphylococcus uberis、牛呼吸道合胞病毒(Bovine RespiratorySyncytial Virus)、小泰累爾梨漿蟲(Theileria parva)、環狀泰累爾梨漿蟲(Theileria annulata)、牛巴貝蟲(Babesia boyis)、二聯巴貝蟲(Babesia bigemina)、大巴貝蟲(Babesia major)、錐蟲屬種(Trypanosoma species)、邊緣無形原體(Anaplasma marginale)、中央無形原體(Anaplasma centrale)或Neospora caninum。
在該實施方案的另一最優選的形式中，異源基因編碼選自家禽病原體的一種或多種抗原，所述家禽病原體選自禽痘病毒(Fowlpox virus)、傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis virus)、傳染性囊病(Infectious Bursal Disease(Gumboro))、馬立克氏病病毒(Marek′sDisease Virus)、雞貧血病原體(Chicken Anaemia agent)、鳥呼腸病毒(Avian Reovirus)、雞敗血支原體(Mycoplasma gallisepticum)、火雞鼻氣管炎病毒(Turkey Rhinotracheitis virus)、副雞嗜血桿菌(Haemophilus paragallinarum)、雞痘病毒(Chicken Poxvirus)、禽腦脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis virus)、鴨疫病毒(DuckPlague virus)、新城疫病毒(Newcastle Disease virus)、Egg Drop綜合征病毒、傳染性喉氣管炎病毒(Infectious Laryngotracheitisvirus)、火雞皰疹病毒(Herpes Virus of Turkeys)、艾美蟲屬種(Eimeriaspecies)、鳥鼻氣管炎細菌(Ornithobacterium rhinotracheale)、關節液支原體(Mycoplasma synoviae)、產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)、沙門氏菌屬種(Salmonella species)和大腸桿菌。
另一吸引人的可能性是插入、優選在Orf-15基因中插入編碼涉及引發免疫系統的蛋白質的基因，如細胞因子、白介素或者干擾素或者涉及免疫調節的另一基因。
因為它們在體內的出乎意料的減毒性和具有免疫原性特征，根據本發明的細菌非常適于作為活的減毒疫苗的基礎。
從而本發明的另一實施方案涉及用于保護動物或者人免于出血敗血性巴斯德氏菌感染或者其致病效果的活的減毒疫苗，其包含根據本發明的活的減毒細菌和可藥用載體。
一類疫苗包含免疫學有效量的根據本發明的活的減毒細菌。免疫學有效的是指接種時施用的活的減毒細菌的量足以在宿主中誘導針對細菌的毒性形式的有效的免疫應答。
除了免疫學有效量的上述活的減毒細菌外，根據本發明的疫苗還含有可藥用載體。這種載體可以簡單為水，但是它還可以包含培養液，在該培養液中培養細菌。另一合適的載體是例如生理鹽濃度的溶液。
將施用的有用劑量將根據年齡、體重和接種的動物、施用方式和接種所針對的病原體的類型而變。下面的實施例給出了合適的劑量的實例。技術人員能夠將將這些數字外推到其他動物物種。
疫苗可以包含足以引起有效免疫應答的任何劑量的細菌。低于102個活的減毒細菌的劑量不總是成功地足夠刺激免疫系統并且高于1010個活的減毒細菌的劑量從經濟學觀點看不很吸引人。
103到109個細菌的劑量通常是非常合適的劑量。
任選地，可以向疫苗中加入具有佐劑活性的一種或多種化合物。根據本發明的活的減毒的出血敗血性巴斯德氏菌不一定需要這種佐劑來實現功效，但是特別對應包含根據本發明的活的減毒的出血敗血性巴斯德氏菌和來自另一致病病毒或微生物(見下文)的抗原性物質的組合疫苗，將值得加入佐劑。佐劑是免疫系統的非特異性刺激劑。它們增強宿主對疫苗的免疫應答。本領域中已知的佐劑的實例是弗氏完全和不完全佐劑、維生素E、非離子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、ISCOMs(免疫刺激復合體，參考例如歐洲專利EP 1099 42)、皂苷、礦物油、植物油，和Carbopol。
特別適于粘膜應用的佐劑是例如大腸桿菌熱不穩定的毒素(LT)或者霍亂毒素(CT)。
其他合適的佐劑是例如氫氧化鋁、磷酸鋁或者氧化鋁、油-乳劑(例如，Bayol F或者Marcol 52的)、皂苷或者維生素E可溶性鹽。如果加入其他的病毒或者亞基疫苗，例如對于出血敗血性巴斯德氏菌組合疫苗的情況，特別優選使用這種佐劑。
因此，在該實施方案的優選形式中，根據本發明的活的減毒疫苗包含佐劑。
可用于本發明的可藥用載體或者稀釋劑的其他實例包括穩定劑，如SPGA、糖類(例如，山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、蛋白質，如白蛋白或者酪蛋白、含有蛋白質的物質，如牛血清或者脫脂乳和緩沖液(例如，磷酸鹽緩沖液)。
特別當將這種穩定劑加入疫苗時，疫苗非常適于冷凍干燥。冷凍干燥具有如下優點冷凍干燥的物質不需要專門的保存條件，如低于-20或者甚至-80攝氏度下保存。因此，在該實施方案的更優選的形式中，活的減毒疫苗是冷凍干燥的形式。
在如上述的包含本發明的細菌的疫苗中，有利地包括來自對人或者動物致病的另一微生物或者病毒的抗原或者針對這種抗原的抗體。
有多種方法可以得到這種疫苗。一種容易應用的方法是將根據本發明的活的減毒出血敗血性巴斯德氏菌菌株與其他人或者動物病原體的一種或多種抗原和可藥用載體混合。
從而，該實施方案的甚至更優選的形式涉及根據本發明的活的減毒疫苗，其特征在于它還包含選自對人和/或動物致病的病毒和微生物的一種或多種抗原。
優選地，這種抗原選自上述豬、牛或者家禽病原體。
本發明的另一實施方案再次涉及用于疫苗的根據本發明的活的減毒細菌。
本發明的再一個實施方案涉及根據本發明的活的減毒細菌用于生產保護人或者動物免于出血敗血性巴斯德氏菌的感染或者感染的致病效果的疫苗的用途。
對于施用于動物或者人，根據本發明的疫苗可以鼻內、皮內、皮下、口服、通過氣溶膠或者肌內施用。對于應用于家禽，如果僅僅為了這種施用途徑容易進行，那么口服(飲水)、噴霧和滴眼劑施用是特別合適的。
技術人員將知道怎樣施用根據本發明的疫苗，因為方法將與用現有的出血敗血性巴斯德氏菌疫苗，特別是活的減毒出血敗血性巴斯德氏菌疫苗接種的方法無顯著不同。根據本發明的疫苗，特別是當用于家禽時，將優選通過飲用水或者通過噴霧優選地經口給藥。
本發明的再一個實施方案涉及制備根據本發明的疫苗的方法。這種方法包括混合根據本發明的活的減毒細菌和可藥用載體。
考慮到出血敗血性巴斯德氏菌導致的疾病在多數情況下是高度感染的，對于動物中出血敗血性巴斯德氏菌感染的早期檢測，擁有快速和容易的工具、診斷測試將是非常有益的。
這種診斷測試將是快速和選擇性的，因為它們必須提供早期檢測并且它們必須對于出血敗血性巴斯德氏菌是特異的并且不與其他細菌存在假陽性反應，不管那些其他細菌是否屬于其他巴斯德氏菌種還是非巴斯德氏菌種。
基于針對出血敗血性巴斯德氏菌的抗體的存在或不存在的診斷測試盡管是可靠的，但是如果需要細菌的早期檢測，那么不是非常吸引人的。這是由于在受感染的動物中針對出血敗血性已斯德氏菌的抗體的產生可以輕易地消耗多大2周。
因此，本發明的另一目的是提供適于出血敗血性巴斯德氏菌感染的早期和特異診斷的診斷工具。
現在令人驚奇地發現Orf-15基因序列對于出血敗血性巴斯德氏菌是獨特的，并且不存在于其他巴斯氏菌科中。
因此，另一實施方案涉及用于檢測出血敗血性巴斯德氏菌的基于RNA或者DNA的測試。
用于檢測出血敗血性巴斯德氏菌的診斷測試例如基于從待測試的動物中分離的DNA或者RNA與特異探針的反應，或者它例如是基于Orf-15基因序列或者基于與該序列互補的核酸序列的(RT-)PCR測試。如果對根據本發明的出血敗血性巴斯德氏菌相關的蛋白質特異的核酸分子存在于動物中，那么這些核酸分子將例如特異結合到特定PCR引物并且將隨后在(RT-)PCR反應中擴增。PCR反應產物可以在DNA凝膠電泳中容易地檢測。(RT-)PCR反應是本領域中公知的(見下面的參考文獻)。核酸分子可以最容易地從待測試的動物的受侵襲的組織或者體液中分離。在豬中，來自受侵襲的肺組織的材料的鼻拭子提供了用于(RT-)PCR測試的合適的材料。來自受感染的肝臟、肺或者心臟組織的器官拭子或者物質將是雞中優選的來源。在水牛、綿羊和牛中，所選的器官將是鼻和受侵襲的肺組織。
標準PCR教科書提供了用于與對根據本發明的Orf-15基因特異的核酸分子進行選擇性PCR反應的引物的長度。通常使用具有至少12個核苷酸的核苷酸序列的引物，但是多于15、更優選18個核苷酸的引物更具選擇性。特別是長度為至少20，優選至少30個核苷酸的引物是非常普遍可應用的。PCR技術在(Dieffenbach&Dreksler；PCR primets，alaboratory manual.ISBN 0-87969-447-5(1995))中詳細描述。
Orf-15基因的核酸分子或者那些核酸分子的在那個優選級別的長為至少12、優選15、更優選18、甚至更優選20、22、25、30、35或者40個核苷酸的部分或者與其互補的核酸分子因此也是本發明的部分。這種核酸分子可以例如用作(RT-)PCR反應中的引物以便增加編碼根據本發明的蛋白質的核酸的量。這允許快速擴增特定核苷酸序列，其用作診斷工具以例如檢測如上述的組織中出血敗血性巴斯德氏菌。
PCR反應和雜交反應都是本領域中公知的并且例如在Maniatis/Sambrook(Sambrook，J.等人Molecular cloningalaboratory manual.ISBN 0-87969-309-6)中描述。
從而，本發明的另一實施方案涉及用于檢測出血敗血性巴斯德氏菌相關的DNA或者RNA的診斷測試，其中所述測試具有如下特征性特征它包含具有如SEQ ID NO1中所示的核酸序列的核酸分子或者與所述核酸序列互補的核酸分子，或者其的長為至少12個、優選至少15個、更優選至少18個核苷酸的片段。
實施例實施例1P-1059的自發的萘啶酸抗性突變體的選擇將出血敗血性巴斯德氏菌菌株在Luria-Bertani(LB)培養液中在37℃下過夜培養。將0.2ml培養物噴霧到含有10mg/ml萘啶酸的LB瓊脂板中并在37℃溫育48小時。挑選一對抗性菌落并在含有萘啶酸的LB瓊脂板上劃線培養。再次溫育48小時后，挑選一個抗性菌落并接種在含有20mg/ml萘啶酸的10ml LB培養液中并在過夜培養。將培養物與5ml甘油混合，等分到1.8ml管(1ml/管)中并在-70℃保存。萘啶酸抗性菌株稱作P-1059NR。
實施例2P-1059NR的自發thyA-突變體的選擇將P-1059NR在含有20mg/ml萘啶酸和10mg/ml胸腺嘧啶的LB培養基中37℃培養。將0.2ml培養物涂布到含有20mg/ml萘啶酸、10mg/ml甲氧芐啶和50mg/ml胸腺嘧啶的LB平板上，并在37℃溫育24-48小時。將10個菌落轉移到相同類型的平板并且LB平板含有僅20mg/ml萘啶酸和10mg/ml甲氧芐啶。在第一個平板上生長但是不在第二個平板上生長的菌落是thyA-突變體。將thyA-突變體突變體之一接種到含有20mg/ml萘啶酸和150mg/ml胸腺嘧啶的10ml LB的培養液中并在37℃過夜培養。培養基與5ml甘油混合，等分成1ml/管并在-70℃保存。保存的thyA-突變體稱作P9818。
實施例3載體pYL1.3的構建使用引物5′-AAGCTTGGCTGTCTCAGGTTTGTTCC-3′和5′-TAGCTTGGCCAGTTTCTATTTCTTCG-3′，通過聚合酶鏈式反應(PCR)從大腸桿菌K-12的基因組DNA擴增大腸桿菌thyA基因。將PCR片段用T4 DNA聚合酶加上dGTP修整。將pLOF/Ptt(Herreno，M.，de Lorenzo，V.Timmis，K.N.，J.Bacteriology，172，1990，6557-6567)用Xba I和Sf消化以除去Ptt基因并用Klenow酶和dCTP部分填平。將修整的PCR片段(一個末端)連接到消化的質粒的部分填充Xba I末端。PCR片段的另一末端和消化的質粒的Sfi末端用T4 DNA聚合酶和dNTP平末端化。該用連接的PCR片段處理的質粒自身連接并轉化到大腸桿菌SM 10。純化含有正確大小的質粒的一個轉化體，等分培養，并在-70℃保存。將該轉化體中的質粒命名為pYL1.3。
實施例4出血敗血性巴斯德氏菌Tn突變體文庫的構建在添加200mg/ml胸腺嘧啶的LB培養液中劇烈攪拌下在37℃培養P9818約48小時。在LB培養液中過夜培養含有pYL1.3的大腸桿菌SM10。混合0.1ml P9818和大腸桿菌SM10培養物，涂布在LB+(IPTG 100mg/ml+10mM MgSO4+胸腺嘧啶200mg/ml)上并在37℃過夜培育。從平板洗滌細菌菌苔并收集。將0.1ml收集的懸浮液涂布在添加20mg/ml萘啶酸的LB平板上并在37℃培育48小時。挑選約150個轉接合子并在添加20mg/ml萘啶酸的LB平板上再次劃線培養用于純化。這些轉接合子在添加20mg/ml萘啶酸的LB平板上培養并在-70℃保存。將這些轉接合子同時在添加20mg/ml萘啶酸的LB平板上和添加20mg/ml萘啶酸和25mg/ml氨芐青霉素的LB平板上再次劃線培養以選擇轉座子突變體。將僅在添加20mg/ml萘啶酸的LB平板上生長的轉接合子(約120個)在20mg/ml萘啶酸的LB平板再次培養，等分并在-70℃保存。
實施例5轉座子突變體的表征(DNA印跡)隨機挑取許多17Tn突變體并在添加20mg/ml萘啶酸的LB培養液中培養。使用QIAmp試劑盒(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)提取突變體的基因組DNA。將DNA用Hind III消化。P-1059基因組DNA用Hind III消化，也包括pGP704(Herreno，M.，de Lorenzo，V.Timmis，K.N.，J.Bacteriology，172，1990，6557-6567)和pYL1.3作為對照。通過標準方法(Sambrook，等人，編著，MoleGular Cloning，第二版，ColdSprings Harbor Labora tory Press，Plainview，NY，1989)進行DNA印跡。DIG DNA labeling and Detection Kit(Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN，USA)用于探針標記和DNA印跡。將pGP704和PCR擴增的大腸桿菌thyA基因用洋地黃毒苷標記，并根據生產商的使用說明書探測消化的基因組DNA。所過顯示多數突變體是具有一個Tn插入的轉座突變體，一些突變體是質粒整合突變體。
對所得的轉座子突變體用標準動物試驗檢查它們的減毒行為。
在具有減毒行為的那些轉座子突變體中，鑒定了轉座子的插入位點并對破壞的基因測序。
發現的一個轉座子突變體描繪為出血敗血性巴斯德氏菌P15(簡稱菌株P15)。該突變體具有插入Orf-15中的轉座子。該菌株已經用于下面實施例中的接種實驗中。
實施例6接種實驗在這些實驗中，接種與針對新城病接種一起進行。這樣做是因為用出血敗血性巴斯德氏菌疫苗和新城病疫苗接種將在獸醫實踐中優選同一天，甚至在同一時刻進行。因此這里描述的實驗方案的優點是它額外給予在田間條件下對于疫苗行為的印象。
PM疫苗培養物TPB中的出血敗血性巴斯德氏菌菌株P15的新鮮培養物用于氣溶膠接種。用后立即確定感染性效價。用于引發的出血敗血性巴斯德氏菌菌株P15培養物包含1.5×108CFU/ml并且用于加強的培養物包含1.6×109CFU/ml。
對于以飲用水施用，離心500ml每種培養物，并將沉淀溶解在500ml脫脂乳溶液中。用于引發的出血敗血性巴斯德氏菌菌株P15培養物包含1.2×108CFU/ml并且用于加強的培養物包含1.3×109CFU/ml。
ND培養物ND疫苗培養物含有每只鳥每劑7.3EID50(卵感染劑量)。
對火雞給予水并隨意進食。
分組和給藥表1治療方案
接種治療方案見表1。所有鳥都用ND疫苗以噴霧器噴霧接種。使用涂料噴霧器通過氣溶膠(鳥保持在氣溶膠中10分鐘，關閉空氣循環)或者通過飲用水進行菌株P15的接種。對于飲用水接種，離心500ml新鮮培養物并重懸浮在500ml2％脫脂乳(20g脫脂乳/升水)中。接種前對火雞禁水至少6小時。以水/飲水塔給予500ml疫苗培養物。接種后，照常應用通常的飲用水。
出血敗血性巴斯德氏菌刺激通過肌內注射(1.0ml，乳腺)含有1.5×105CFU/ml的血清型1的野生型出血敗血性巴斯德氏菌菌株的新鮮稀釋的培養物進行刺激。以TPB制備刺激培養物為新鮮的5小時培養物。
在7天內每天記錄死亡率。從死亡的鳥到刺激后7天所有其他鳥，試圖從肝臟分離出血敗血性巴斯德氏菌。
統計學分析使用Fischer精確檢驗(Statistix for Windows，版本2.0)比較死亡率。
表2接種后結果總結
表3刺激后的結果總結
粗體與對照顯著不同結果和討論接種后觀察在表2中概述。接種后和刺激前，P15氣溶膠組中2只鳥死亡，P15飲用水組中0只死亡，對照組中0只死亡。該死亡率可能與疫苗菌株有關，因為在對照組中沒有發現死亡。接種后尸體解剖表明氣溶膠途徑與飲用水組相比導致稍微更大的異常(輕微的肺泡損傷，可以是由于疫苗菌株)。
表3和圖1中概述了刺激后觀察。致死性異源刺激(1000×LD50)后，發現不同水平的保護。氣溶膠接種途徑似乎是最有效的途徑(100％)，飲用水途徑次之(81％)。
從結果可以斷定本發明的出血敗血性巴斯德氏菌Orf-15非常適于作為疫苗中活的減毒菌株。接種后觀察到的死亡率是使用最高可能的劑量(＞109CFU/ml)接種后觀察到的死亡率。應該記住，該實驗中使用的接種劑量和刺激劑量都很高。疫苗劑量可以強烈減少到觀察不到死亡或者病征的水平。刺激劑量(1000×LD50)也可以強烈減少。
結論從結果可以斷定本發明的出血敗血性巴斯德氏菌Orf-15突變體為有效和安全的活的減毒出血敗血性巴斯德氏菌疫苗提供了非常好的基礎。
序列表<110>AKZO Nobel N.V.
<120>出血敗血性巴斯德氏菌疫苗<130>2004.026<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>476<212>DNA<213>出血敗血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)<220>
<221>CDS<222>(102)..(476)<400>1caaggcaaag gcggattttt tattttaatc tgaatacaag gtacccattg tatattctct 60gattatccca gtgggtttcc aatttaatga caggagcgtt t atg cat ata atc aaa 116Met His Ile Ile Lysl 5acc tta atc tct gtt ggc gta gca ttt tca ctc agt gct tgc ctg agt164Thr Leu Ile Ser Val Gly Val Ala Phe Ser Leu Ser Ala Cys Leu Ser10 15 20ctg gaa ggc gtt gaa ata gcg ggc tta gaa gga aaa tcc tct ggc aca212
Leu Glu Gly Val Glu Ile Ala Gly Leu Glu Gly Lys Ser Ser Gly Thr25 30 35tta acc aaa tat cgt tgt gaa aat ggc tat aaa gcc tct ata aaa caa260Leu Thr Lys Tyr Arg Cys Glu Asn Gly Tyr Lys Ala Ser Ile Lys Gln40 45 50cgc gat aat ggt gtg gta agt atc gct ttc aat gat ggc aaa gac agc308Arg Asp Asn Gly Val Val Ser Ile Ala Phe Asn Asp Gly Lys Asp Ser55 60 65tat gtc agc tac tta aat cat gtg cct tcc gct tcg gga acg ctg tat356Tyr Val Ser Tyr Leu Asn His Val Pro Ser Ala Ser Gly Thr Leu Tyr70 75 80 85gtc aat gat aaa aat act tta aaa tgg cat cag aaa aat aat att gca404Val Asn Asp Lys Asn Thr Leu Lys Trp His Gln Lys Asn Asn Ile Ala90 95 100gta ttt acc tac cca gat cgc aac tat gca aaa acg ggg caa tta gtg452Val Phe Thr Tyr Pro Asp Arg Ash Tyr Ala Lys Thr Gly Gln Leu Val105 110 115aca aca aac tgt cat aag tat taa476Thr Thr Asn Cys His Lys Tyr120<210>2<211>124<212>PRT<213>出血敗血性巴斯德氏菌<400>2
Met His Ile Ile Lys Thr Leu Ile Ser Val Gly Val Ala Phe Ser Leu1 5 10 15Ser Ala Cys Leu Ser Leu Glu Gly Val Glu Ile Ala Gly Leu Glu Gly20 25 30Lys Ser Ser Gly Thr Leu Thr Lys Tyr Arg Cys Glu Asn Gly Tyr Lys35 40 45Ala Ser Ile Lys Gln Arg Asp Asn Gly Val Val Ser Ile Ala Phe Asn50 55 60Asp Gly Lys Asp Ser Tyr Val Ser Tyr Leu Asn His Val Pro Ser Ala65 70 75 80Ser Gly Thr Leu Tyr Val Asn Asp Lys Asn Thr Leu Lys Trp His Gln85 90 95Lys Asn Asn Ile Ala Val Phe Thr Tyr Pro Asp Arg Asn Tyr Ala Lys100 105 110Thr Gly Gln Leu Val Thr Thr Asn Cys His Lys Tyr115 120
權利要求
1.活的減毒出血敗血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)細菌，所述細菌不能表達功能性Orf-15蛋白質。
2.根據權利要求1的活的減毒細菌，其特征是由于Orf-15基因中的突變，所述細菌不能表達功能性Orf-15蛋白質。
3.根據權利要求2的活的減毒細菌，其特征是所述突變包含插入和/或缺失。
4.根據權利要求1-3中任一項的活的減毒細菌，其特征是所述細菌攜帶編碼選自對人和/或動物致病的病毒和微生物的一種或者多種抗原的異源基因。
5.根據權利要求4的活的減毒細菌，其特征是所述異源基因插入在編碼Orf-15的基因中。
6.根據權利要求4或5的活的減毒細菌，其特征是所述一種或多種抗原選自豬繁殖性呼吸綜合征(PRRS)病毒、偽狂犬病病毒、豬流感病毒、豬短小病毒、傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒、豬環病毒1或者2、大腸桿菌、豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、支氣管敗血性博德特菌(Bordetellabronchiseptica)、副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)、豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)和豬鏈球菌(Streptococcus suis)。
7.根據權利要求4或5的活的減毒細菌，其特征是所述一種或多種抗原選自牛皰疹病毒(Bovine Herpesvirus)、牛病毒性腹瀉(BoyineViral Diarrhoea)病毒、3型副流感病毒(Parainfluenza type 3 virus)、牛副黏病毒(Bovine Paramyxovirus)、口蹄疫病毒(Foot and MouthDisease virus)、溶血性巴斯德菌(Pasteurella haemolytica)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、Staphylococcus uberi、大腸桿菌(Escherichia coli)、牛呼吸道合胞病毒(Bovine RespiratorySyncytial Virus)、小泰累爾梨漿蟲(Theileria parva)、環狀泰累爾梨漿蟲(Theileria annulata)、牛巴貝蟲(Babesia bovis)、二聯巴貝蟲(Babesia bigemina)、大巴貝蟲(Babesia major)、錐蟲屬種(Trypanosoma species)、邊緣無形原體(Anaplasma marginale)、中央無形原體(Anaplasma centrale)或Neospora caninum。
8.根據權利要求4或5的活的減毒細菌，其特征是所述一種或多種抗原選自禽痘病毒(Fowlpox virus)、傳染性支氣管炎病毒(InfectiousBronchitis virus)、傳染性囊病(Infectious Bursal Disease)、馬立克氏病病毒(Marek′s Disease Virus)、雞貧血病原體(Chicken Anaemiaagent)、鳥呼腸病毒(Avian Reovirus)、雞敗血支原體(Mycoplasmagallisepticum)、火雞鼻氣管炎病毒(Turkey Rhinot racheitisvirus)、副雞嗜血桿菌(Haemophilus paraga llinarum)、雞痘病毒(ChickenPoxvirus)、禽腦脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis virus)、鴨疫病毒(Duck Plague virus)、新城疫病毒(Newcastle Disease virus)、Egg Drop綜合征病毒、傳染性喉氣管炎病毒(InfectiousLaryngotracheitis virus)、火雞皰疹病毒(Herpes Virus of Turkeys)、艾美蟲屬種(Eimeria species)、鳥鼻氣管炎細菌(Ornithobacteriumrhiaotracheale)、關節液支原體(Mycoplasma synoviae)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、沙門氏菌屬種(Salmonella species)和大腸桿菌。
9.用于保護動物或者人免于出血敗血性巴斯德氏菌感染或者其致病效果的活的減毒疫苗，其特征是所述疫苗包含根據權利要求1-8中的任一項的活的減毒細菌和可藥用載體。
10.根據權利要求9的活的減毒疫苗，其特征是它包含佐劑。
11.根據權利要求9或10的活的減毒疫苗，其特征是它是凍干的形式。
12.根據權利要求9-11中任一項的活的減毒疫苗，其特征是它另外包含選自對人和/或動物致病的病毒和微生物的一種或多種抗原。
13.根據權利要求1-8中任一項的活的減毒細菌在疫苗中的應用。
14.根據權利要求1-8中任一項的活的減毒細菌在制備用于保護動物或者人免于出血敗血性巴斯德氏菌感染或者感染的致病效果的疫苗中的應用。
15.制備根據權利要求9-12中任一項的疫苗的方法，其特征是所述方法包括混合如權利要求1-8中任一項中定義的活的減毒細菌與可藥用的載體。
16.用于檢測與出血敗血性巴斯德氏菌相關的DNA或者RNA的診斷化驗，其特征是在所述化驗中包含如SBQ ID NO1所述的核酸分子或者與所述核酸序列互補的核酸分子，或者其具有至少12個、優選至少15個、更優選至少18個核苷酸的長度的片段。
全文摘要
本發明涉及出血敗血性巴斯德氏菌(pasteurella multocida)種的活的減毒細菌、涉及包含這種活的減毒細菌的活的減毒疫苗、涉及這種細菌在制備這種疫苗中的應用、涉及制備這種疫苗的方法和用于這種細菌的檢測的診斷化驗。
文檔編號A61K35/74GK101087803SQ200580044494
公開日2007年12月12日 申請日期2005年12月21日 優先權日2004年12月22日
發明者羅玉剛, P·韋爾梅杰, A·A·C·雅各布斯 申請人:英特威國際有限公司