組氨酸-醋酸鹽緩沖液中的抗體制劑的制作方法

            文檔序號:1111359閱讀:12915來源:國知局
            專利名稱:組氨酸-醋酸鹽緩沖液中的抗體制劑的制作方法
            技術領域
            本發明涉及抗體制劑,包括在組氨酸-醋酸鹽緩沖液中配制的單克隆抗體,以及包含結合HER2的結構域II的抗體的制劑(例如,Pertuzumab),和包含結合DR5的抗體的制劑(例如,Apomab)。
            背景技術
            在過去十年中,生物技術的進步已經使得有可能利用重組DNA技術生產多種蛋白質進行藥物應用。因為蛋白質比傳統有機和無機藥物更大和更復雜(即除了復雜的三維結構之外還具有多個官能團),這些蛋白質的制劑形成了特殊的問題。為了使蛋白質保留生物學活性,制劑必須保持蛋白質氨基酸至少核心序列的構象完整性完好無損,同時保護蛋白質的多個官能團不受降解。蛋白質的降解途徑可以包括化學不穩定性(即涉及通過鍵的形成或剪切修飾蛋白質的任何過程,其致成新的化學實體)或物理不穩定性(即蛋白質較高次序結構的改變)。化學不穩定性可以由脫酰胺作用,外消旋作用,水解,氧化作用,β消除或二硫化物交換產生。物理不穩定性可以例如由變性,聚集,沉淀或吸附作用產生。三種最常見的蛋白質降解途徑為蛋白質聚集,脫酰胺作用和氧化作用。Cleland等人Critical Reviews in TherapeutcDrug Carrier Systems 10(4)307-377(1993)。
            抗體制劑用于藥物應用的蛋白質包括抗體。可用于治療的抗體的例子為結合HER2抗原的抗體,如Pertuzumab。
            美國專利號6,339,142描述了HER2抗體組合物,包括抗HER2抗體及其一種或多種酸性變體的混合物,其中酸性變體的量少于大約25%。Trastuzumab是例示性的HER2抗體。
            美國專利號6,267,958和6,685,940(Andya等人)描述了凍干的抗體制劑,包括HER2和IgE抗體制劑。WO97/04807和US 2004/0197326A1(Fick等人)描述了用IgE抗體治療過敏性哮喘的方法。WO99/01556(Lowman等人)涉及具有傾于異構化作用的天冬酰胺(aspartyl)殘基的IgE抗體,及其改進的變體。US 2002/0045571(Liu等人)提供了粘性降低的濃縮型蛋白質制劑,例示為人源化IgE抗體制劑,rhuMAb E25和E26。WO 02/096457和US2004/0170623(Arvinte等人)描述了包含抗IgE抗體E25的穩定的液體制劑。還參見涉及高濃度抗IgE制劑的US 2004/0197324 A1(Liu和Shire)。
            美國專利號6,171,586(Lam等人)描述了穩定的水性抗體制劑。F(ab’)2rhuMAb CD18抗體配制在醋酸鈉和組氨酸-HCl緩沖液中。rhuMAb CD18的優選制劑為10mM醋酸鈉,8%海藻糖,0.01%TWEEN 20TM,pH 5.0。于40℃保存一個月的rhuMAb CD20的醋酸鹽(pH 5.0)制劑比在組氨酸中配制的那些樣品(pH 5.0或6.0)顯示更大的穩定性。
            US 2003/0190316(Kakuta等人)涉及配制的抗體hPM-1,其為人源化IL-6受體抗體。單體損失在檸檬酸鈉(pH 6.7)中最大,接下來為磷酸鈉(pH6.8),Tris-HCl(pH 7.2),組氨酸-HCl(pH 7.2)和甘氨酸(pH 7.6),依次遞減。評估了磷酸鈉(pH 6.5),磷酸鹽-His(pH 6.0或6.5),His-HCl(pH 6.5),和磷酸鈉(pH 6.0)對hPM-1穩定性的影響。
            WO2004/071439(Burke等人)指出在natalizumab(抗α4整聯蛋白人源化單克隆抗體)制劑中由聚山梨醇酯80的降解導致雜質增多,這顯然是通過涉及金屬離子和組氨酸的氧化反應造成的。因而,選擇磷酸鹽緩沖液。
            WO 2000/066160(英文對應文本EP 1 174 148A1)(Okada等人)涉及在磷酸鈉或檸檬酸鈉緩沖液中結合人血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa的纖維蛋白原受體的人源化C4G1抗體的制劑。
            WO2004/019861(Johnson等人)涉及CDP870,一種聚乙二醇化的抗TNFαFab片段,其在50mM醋酸鈉(pH 5.5)和125mM氯化鈉中以200mg/ml配制。
            WO2004/004639(Nesta,P.)涉及huC242-DM1一種腫瘤-激活的免疫毒素在50mM琥珀酸緩沖液(pH 6.0)和蔗糖(5%w/v)中的制劑。
            WO03/039485(Kaisheva等人)發現Daclizumab(人源化IL-2受體抗體)在琥珀酸鈉緩沖液pH 6.0中具有最高的穩定性,并且在組氨酸中隨著緩沖液被氧化而迅速喪失效力。
            WO 2004/001007涉及在組氨酸HCl,醋酸鈉或檸檬酸鈉緩沖液中的CD80單克隆抗體。
            美國專利號6,252,055(Relton,J.)涉及在馬來酸鹽,琥珀酸鹽,醋酸鈉或磷酸鹽緩沖液中配制的抗CD4和抗CD23抗體,而磷酸鹽被鑒定為優選的緩沖液。
            美國專利號5,608,038(Eibl等人)涉及高度濃縮的多克隆免疫球蛋白制品,其中具有免疫球蛋白,葡萄糖或蔗糖,以及氯化鈉。
            WO03/015894(Oliver等人)涉及100mg/mL SYNAGIS,25mM組氨酸-HCl,1.6mM甘氨酸,pH 6.0,和凍干的SYNAGIS的水性制劑,所述SYNAGIS在配制時(凍干之前)包含25mM組氨酸,1.6mM甘氨酸和3%w/v甘露醇pH 6.0。
            US 2004/0191243 A1(Chen等人)報道了一種人IgG2抗體ABX-IL8的制劑。
            US 2003/0113316 A1(Kaisheva等人)涉及一種凍干的抗IL2受體抗體制劑。
            HER2抗體受體酪氨酸激酶的HER家族是細胞生長,分化和存活重要的調節劑。該受體家族包括四個不同的成員,包括表皮生長因子受體(EGFR,ErbB1,或HER1),HER2(ErbB2或p185neu),HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。
            由erbB1基因編碼的EGFR與人惡性腫瘤的病因有關。具體地,在乳腺、膀胱、肺、頭、頸和胃癌以及膠質母細胞瘤中已經觀察到EGFR表達的提高。EGFR受體表達提高通常與相同腫瘤細胞產生的EGFR配體,轉化生長因子α(TGF-α),增多相關聯,其導致通過自分泌刺激途徑激活受體。Baselga和Mendelsohn Pharmac.Ther.64127-154(1994)。在這些惡性腫瘤的治療中已經將抗EGFR或其配體TGF-α和EGF的單克隆抗體評估為治療劑。參見,例如,Baselga and Mendelsohn.,同上;Masui等人Cancer Research441002-1007(1984);和Wu等人J.Clin.Invest.951897-1905(1995)。
            HER家族的第二個成員,p185neu,最初被鑒定為來自化學處理大鼠的神經母細胞瘤的轉化型基因的產物。neu原癌基因的激活形式通過所編碼蛋白質的跨膜區中的點突變(纈氨酸到谷氨酸)產生。在乳房和卵巢癌中觀察到neu人同系物的擴增并且與預后不良相關聯(Slamon等人,Science,235177-182(1987);Slamon等人,Science,244707-712(1989);和美國專利號4,968,603)。到目前為止,對于人腫瘤未曾報道過與Neu原癌基因中的點突變類似的點突變。HER2的過表達(經常但并非一律由于基因擴增)在其它癌中也曾觀察到,包括胃,子宮內膜,唾腺,肺,腎,結腸,甲狀腺,胰腺和膀胱的癌。參見,King等人,Science,229974(1985);Yokota等人,Lancet1765-767(1986);Fukushige等人,Mol Cell Biol.,6955-958(1986);Guerin等人,Oncogene Res.,321-31(1988);Cohen等人,Oneogene,481-88(1989);Yonemura等人,Cancer Res.,511034(1991);Borst等人,Gynecol.Oncol.,38364(1990);Weiner等人,Cancer Res.,50421-425(1990);Kern等人,Cancer Res.,505184(1990);Park等人,Cancer Res.,496605(1989);Zhau等人,Mol.Carcinog.,3254-257(1990);Aasland等人Br.J.Cancer57358-363(1988);Williams等Pathobiology 5946-52(1991);和McCann等人,Cancer,6588-92(1990)。HER2可以在前列腺癌中過表達(Gu等人Cancer Lett.99185-9(1996);Ross等人Hum.Pathol.28827-33(1997);Ross等人Cancer 792162-70(1997);和Sadasivan等人J.Urol.150126-31(1993))。
            已經描述過抗大鼠p185neu和人HER2蛋白質產物的抗體。Drebin和同事培育出抗大鼠neu基因產物,p185neu的抗體。參見,例如,Drebin等人,細胞41695-706(1985);Myers等人,Meth.Enzym.198277-290(1991);和WO94/22478。Drebin等人Oncogene 2273-277(1988)報道與p185neu兩個不同區域反應的抗體的混合物帶來對于移植入裸小鼠中的neu-轉化NIH-3T3細胞的協同抗腫瘤效應。還參見1998年10月20日公布的美國專利5,824,311。
            Hudziak等人,Mol.Cell.Biol.9(3)1165-1172(1989)描述了一組HER2抗體的生成,其利用人乳腺腫瘤細胞系SK-BR-3表征。在暴露于所述抗體72小時之后通過單層結晶紫染色來測定SK-BR-3細胞的相對細胞增殖。利用這種測定法,用抑制細胞增殖56%的稱作4D5的抗體獲得最大抑制。該組中的其它抗體在此測定法中減少細胞增殖的程度較小。進一步發現抗體4D5使得過表達HER2的乳腺腫瘤細胞系對于TNF-α的細胞毒性效應變得敏感。還參見1997年10月14日公開的美國專利號5,677,171。在Hudziak等人中討論的HER2抗體在以下文獻中做進一步表征。Fendly等人CancerResearch 501550-1558(1990);Kotts等人體外26(3)59A(1990);Sarup等人Growth Regulation 172-82(1991);Shepard等人J.Clin.Immunol.11(3)117-127(1991);Kumar等人Mol.Cell.Biol.11(2)979-986(1991);Lewis等人Cancer Immunol.Immunother.37255-263(1993);Pietras等人Oncogene91829-1838(1994);Vitetta等人Cancer Research 545301-5309(1994);Sliwkowski等人J.Biol.Chem.269(20)14661-14665(1994);Scott等人J.Biol.Chem.26614300-5(1991);D′souza等人Proc.Natl.Acad.Sci.917202-7206(1994);Lewis等人Cancer Resecrch 561457-1465(1996);和Schaefer等人Oncogene 151385-1394(1997)。
            鼠HER2抗體4D5的重組人源化形式(huMAb4D5-8,rhuMAb HER2,Trastuzumab或HERCEPTIN;美國專利號5,821,337)在臨床上對于患有過表達HER2的乳癌的患者有效,所述患者先前已經接受過廣泛的抗癌治療(Baselga等人,J.Clin.Oncol.14737-744(1996))。1998年9月25日Trastuzumab收到食品與藥物管理局的銷售許可,用于治療其腫瘤過表達HER2蛋白的患有轉移性乳癌的患者。
            在Tagliabue等人Int.J.Cancer 47933-937(1991);McKenzie等人Oncogene 4543-548(1989);Maier等人Cancer Res.515361-5369(1991);Bacus等人Molecular Carcinogenesis 3350-362(1990);Stancovski等人PNAS(USA)888691-8695(1991);Bacus等人Cancer Research 522580-2589(1992);Xu等人Int.J.Cancer 53401-408(1993);WO94/00136;Kasprzyk等人Cancer Research 522771-2776(1992);Hancock等人Cancer Res.514575-4580(1991);Shawver等人Cancer Res.541367-1373(1994);Arteaga等人Cancer Res.543758-3765(1994);Harwerth等人J.Biol.Chem.26715160-15167(1992);美國專利號5,783,186;和Klapper等人Oncogene142099-2109(1997)中描述了具有各種特性的其它HER2抗體。
            同源性篩選已經鑒定了兩種其它HER受體家族成員;HER3(美國專利號5,183,884和5,480,968以及Kraus等人PNAS(USA)869193-9197(1989))和HER4(EP Pat Appln No 599,274;Plowman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,901746-1750(1993);和Plowman等人,Nature,366473-475(1993))。這些受體都對于至少某些乳癌細胞系都呈現增強的表達。
            一般在細胞中發現HER受體的各種組合,并且異源二聚體化作用被認為增強對于多種HER配體的細胞反應的多樣性(Earp等人Breast CancerResearch and Treatment 35115-132(1995))。EGFR與六種不同的配體結合;表皮生長因子(EGF),轉化生長因子α(TGF-α),雙調蛋白(amphiregulin),肝素結合型表皮生長因子(HB-EGF),beta細胞蛋白(betacellulin)和上皮調節蛋白(epiregulin)(Groenen等人Growth Factors 11235-257(1994))。緣自單基因選擇性剪切的調蛋白蛋白質家族是HER3和HER4的配體。調蛋白家族包括α,β和γ調蛋白(Holmes等人,Science,2561205-1210(1992);美國專利號5,641,869;和Schaefer等人Oncogene 151385-1394(1997));neu分化因子(NDFs),神經膠質生長因子(GGFs);乙酰膽堿受體誘導活性(ARIA);和感覺與運動神經元衍生的因子(SMDF)。綜述參見Groenen等人Growth Factors11235-257(1994);Lemke,G.Molec.& Cell.Neurosci.7247-262(1996)和Lee等人Pharm.Rev.4751-85(1995)。最近鑒定了三種另外的HER配體;據報道結合HER3或HER4的神經調節蛋白-2(NRG-2)(Chang等人Nature 387509-512(1997);and Carraway等人Nature 387512-516(1997));結合HER4的神經調節蛋白-3(Zhang等人PNAS(USA)94(18)9562-7(1997));和結合HER4的神經調節蛋白-4(Harari等人Oncogene 182681-89(1999))。HB-EGF,beta細胞蛋白和上皮調節蛋白也結合HER4。
            盡管EGF和TGFα并不結合HER2,EGF刺激EGFR和HER2形成異源二聚體,其激活EGFR并導致HER2在異源二聚體中的轉磷酸作用。二聚體化作用和/或轉磷酸作用似乎激活HER2酪氨酸激酶。參見Earp等人,同上。同樣地,當HER3與HER2共表達時,形成活性信號復合物并且抗HER2抗體能夠破壞這種復合物(Sliwkowski等人,J.Biol.Chem.,269(20)14661-14665(1994))。此外,當與HER2共表達時,HER3對調蛋白(HRG)的親和性提高到較高的親和性狀態。關于HER2-HER3蛋白復合物還參見,Levi等人,Journal of Neuroscience 151329-1340(1995);Morrissey等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 921431-1435(1995);和Lewis等人,CancerRes.,561457-1465(1996)。HER4,像HER3一樣,與HER2形成活性信號復合物(Carraway和Cantley,Cell 785-8(1994))。
            為了靶向HER信號途徑,將rhuMAb 2C4(Pertuzumab,OMNITARGTM)開發為人源化抗體,其抑制HER2與其它HER受體的二聚體化作用,由此抑制配體驅動的磷酸化作用和激活作用,以及RAS和AKT途徑的下游激活作用。在Pertuzumab作為治療實體腫瘤的單一藥劑的I期試驗中,用Pertuzumab治療三名患有晚期卵巢癌的受試者。一名患者有持續的部分反應,而其它受試者病情穩定持續15周,Agus等人Proc Am Soc Clin Oncol 22192,Abstract 771(2003)。
            DR5抗體本領域已經鑒定了屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族的各種配體和受體。這些配體包括腫瘤壞死因子-α(“TNF-α”),腫瘤壞死因子-β(“TNF-β”或“淋巴毒素-α”),淋巴毒素-β(“LT-β”),CD30配體,CD27配體,CD40配體,OX-40配體,4-1BB配體,LIGHT,Apo-1配體(也稱作Fas配體或CD95配體),Apo-2配體(也稱作Apo2L或TRAIL),Apo-3配體(也稱作TWEAK),APRIL,OPG配體(也稱作RANK配體,ODF,或TRANCE),和TALL-1(也稱作BlyS,BAFF或THANK)(參見,例如,Ashkenazi,Nature Review,2420-430(2002);Ashkenazi and Dixit,Science,2811305-1308(1998);Ashkenazi andDixit,Curr.Opin.Cell Biol.,11255-260(2000);Golstein,Curr.Biol.,7750-753(1997)Wallach,Cytokine Reference,Academic Press,2000,pages 377-411;Locksley等人,Cell,104487-501(2001);Gruss and Dower,Blood,853378-3404(1995);Schmid等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,831881(1986);Dealtry等人,Eur.J.Immunol.,17689(1987);Pitti等人,J.Biol.Chem.,27112687-12690(1996);Wiley等人,Immunity,3673-682(1995);Browning等人,Cell,72847-856(1993);Armitage等人Nature,35780-82(1992),1997年1月16日公開的WO 97/01633;1997年7月17日公開的WO 97/25428;Marsters等人,Curr.Biol.,8525-528(1998);Chicheportiche等人,Biol.Chem.,27232401-32410(1997);Hahne等人,J.Exp.Med.,1881185-1190(1998);1998年7月2日公開的WO98/28426;1998年10月22日公開的WO98/46751;1998年5月7日公開的WO/98/18921;Moore等人,Science,285260-263(1999);Shu等人,J.Leukocyte Biol.,65680(1999);Schneider等人,J.Exp.Med.,1891747-1756(1999);Mukhopadhyay等人,J.Biol. Chem.,27415978-15981(1999))。
            由這些TNF家族配體介導的各種細胞反應的誘導一般通過它們結合到特異性細胞受體上而起始。某些,但并非全部TNF家族配體通過細胞表面“死亡受體”結合,并誘導各種生物學活性以激活胱天蛋白酶,或執行細胞死亡或凋亡途徑的酶(Salvesen等人,細胞,91443-446(1997))。到目前為止鑒定的TNF受體超家族的成員包括TNFR1,TNFR2,TACI,GITR,CD27,OX-40,CD30,CD40,HVEM,Fas(也稱作Apo-1或CD95),DR4(也稱作TRAIL-R1),DR5(也稱作Apo-2或TRAIL-R2),DcR1,DcR2,osteoprotegerin(OPG),RANK和Apo-3(也稱作DR3或TRAMP)等。
            這些TNF受體家族成員的大多數共有細胞表面受體的典型結構,包括細胞外,跨膜和細胞內區域,而其它成員則被發現天然為缺少跨膜和細胞內結構域的可溶性蛋白質。典型TNFRs的細胞外部分包含起始自NH2端的多重半胱氨酸富集結構域(CRDs)的重復氨基酸序列模式。
            幾年前稱作Apo-2L或TRAIL的配體被鑒定為細胞因子TNF家族的成員(參見,例如,Wiley等人,Immunity,3673-682(1995);Pitti等人,J.Biol.Chem.,27112697-12690(1996);WO 97/01633;WO 97/25428;公開于1998年6月9日的美國專利5,763,223;公開于2001年9月4日的美國專利6,284,236)。全長天然序列人Apo2L/TRAIL多肽為281個氨基酸長的II型跨膜蛋白質。通過酶學剪切多肽的細胞外區域,一些細胞能夠產生天然可溶形式的多肽(Mariani等人,J.Cell.Biol.,137221-229(1997))。可溶形式的Apo2L/TRAIL結晶研究顯示一種類似于TNF和其它相關蛋白質結構的同源三聚體結構(Hymowitz等人,Molec.Cell,4563-571(1999);Cha等人,Immunity,11253-261(1999);Mongkolsapaya等人,Nature Structural Biology,61048(1999);Hymowitz等人,Biochemistry,39633-644(2000))。不過,Apo2L/TRAIL,不像其它TNF家族成員,被發現具有獨特的結構特征,其中三個半胱氨酸殘基(同源三聚體每個亞基的位置230上)一起與鋅原子配位,并且鋅結合對于三聚體穩定性和生物學活性是重要的(Hymowitz等人,同上;Bodmer等人,J.Biol.Chem.,27520632-20637(2000))。
            在文獻中已經報道Apo2L/TRAIL可以在免疫系統調節中發揮作用,包括在自身免疫疾病如風濕性關節炎中(參見,例如,Thomas等人,J.Immunol.,1612195-2200(1998);Johnsen等人,細胞因子,11664-672(1999);Griffith等人,J.Exp.Med.,1891343-1353(1999);Song等人,J.Exp.Med.,1911095-1103(2000))。
            已經報道Apo2L/TRAIL的可溶形式在許多癌細胞中誘導凋亡,包括結腸,肺,乳房,前列腺,膀胱,腎,卵巢和腦的腫瘤,以及黑素瘤,白血病,和多發性骨髓瘤(參見,例如,Wiley等人,同上;Pitti等人,同上;公開于2000年2月29日的美國專利6,030,945;公開于2004年6月8日的美國專利6,746,668;Rieger等人,FEBS Letters,427124-128(1998);Ashkenazi等人,J.Clin.Invest.,104155-162(1999);Walczak等人,Nature Med.,5157-163(1999);Keane等人,Cancer Research,59734-741(1999);Mizutani等人,Clin.Cancer Res.,52605-2612(1999);Gazitt,Leukemid,131817-1824(1999);Yu等人,Cancer Res.,602384-23 89(2000);Chinnaiyan等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,971754-1759(2000))。鼠腫瘤模型的體內研究進一步提示Apo2L/TRAIL,單獨或結合化療或放療,能夠發揮基本的抗腫瘤作用(參見,例如,Ashkenazi等人,同上;Walzcak等人,同上;Gliniak.等人,Cancer Res.,596153-6158(1999);Chinnaiyan等人,同上;Roth等人,Biochem.Biophys.Rea.Comm.,2651999(1999);PCT申請US/00/15512;PCT申請US/01/23691)。與許多類型的癌細胞相反,大多數正常的人細胞類型似乎通過某種重組形式的Apo2L/TRAIL耐受凋亡誘導(Ashkenazi等人,同上;Walzcak等人,同上)。Jo等人報道多組氨酸標記的可溶形式的Apo2L/TRAIL在誘導正常分離的人肝細胞的體外凋亡,但不能誘導非人肝細胞的凋亡(Jo等人,Nature Med.,6564-567(2000);還參見,Nagata,Nature Med.,6502-503(2000))。據信某些重組Apo2L/TRAIL制品對于患病和正常細胞的生化特性和生物學活性可以有所不同,這取決于,例如,標記分子的存在或缺失,鋅含量,和三聚體百分比含量(參見,Lawrence等人,Nature Med.,Letter tothe Editor,7383-385(2001);Qin等人,Nature Med.,Letter to the Editor,7385-386(2001))。
            已經發現Apo2L/TRAIL結合至少五種不同的受體。結合Apo2L/TRAIL的受體中至少兩種包含功能性細胞質死亡結構域。一種這類受體稱作“DR4”(和/或稱作TR4或TRAIL-R1)(Pan等人,Science,276111-113(1997);還參見公開于1998年7月30日的WO98/32856;公開于1999年7月29日的WO99/37684;公開于2000年12月7日的WO 00/73349;公開于2002年8月13日的US 6,433,147;公開于2002年10月8日的US 6,461,823,和公開于2002年1月29日的US 6,342,383)。
            Apo2L/TRAIL的另一種這類受體稱作DR5(或者它還稱作Apo-2;TRAIL-R或TRAIL-R2,TR6,Tango-63,hAPO8,TRICK2或KILLER)(參見,例如,Sheridan等人,Science,277818-821(1997),Pan等人,Science,277815-818(1997),公開于1998年11月19日的WO98/51793;公開于1998年9月24日的WO98/41629;Screaton等人,Curr.Biol.,7693-696(1997);Walczak等人,EMBOJ.,165386-5387(1997);Wu等人,Nature Genetics,17141-143(1997);公開于1998年8月20日的WO98/35986;公開于1998年10月14日的EP870,827;公開于1998年10月22日的WO98/46643;公開于1999年1月21日的WO99/02653;公開于1999年1月25日的WO99/09165;公開于1999年3月11日的WO99/11791;公開于2002年8月13日的US 2002/0072091;公開于2001年12月7日的US 2002/0098550;公開于2001年12月6日的US 6,313,269;公開于2001年8月2日的US2001/0010924;公開于2003年7月3日的US 2003/01255540;公開于2002年10月31日的US 2002/0160446,公開于2002年4月25日的US2002/004878;公開于2002年2月的US 6,342,369;公開于2003年5月27日的US 6,569,642,公開于2000年6月6日的US 6,072,047,公開于2003年11月4日的US 6,642,358;公開于2004年6月1日的IS 6,743,625)。像DR4一樣,據報道DR5包含細胞質死亡結構域并且能夠在配體結合后發出凋亡信號(或經與分子相結合,所述分子如激動劑抗體,其模仿配體的活性)。在Apo-2L/TRAIL和DR5之間形成的復合物的晶體結構描述于Hymowitz等人,Molecular Cell,4563-571(1999)中。
            在配體結合后,DR4和DR5都能夠通過稱作FADD/Mort1的包含死亡結構域的接頭分子,獨立地通過募集和激活凋亡起始因子胱天蛋白酶-8而促進凋亡(Kischkel等人,Immunity,12611-620(2000);Sprick等人,Immunity,12599-609(2000);Bodmer等人,Nature Cell Biol.,2241-243(2000))。
            據報道Apo2L/TRAIL也結合稱作DcR1,DcR2和OPG的那些受體,據信它們充當抑制劑,而非信號傳導劑(參見,例如,DcR1(也稱作TRID,LIT或TRAIL-R3)(Pan等人,Science,276111-113(1997);Sheridan等人,Science,277818-821(1997);McFarlane等人,J.Biol.Chem.,27225417-25420(1997);Schneider等人,FEBS Letters,416329-334(1997);Degli-Esposti等人,J.Exp.Med.,1861165-1170(1997);和Mongkolsapaya等人,J.Immunol.,1603-6(1998));DcR2(也稱作TRUNDD或TRAIL-R4)(Marsters等人,Curr.Biol.,71003-1006(1997);Pan等人,FEBSL etters,42441-45(1998);Degli-Esposti等人,Immunity,7813-820(1997)),和OPG。與DR4和DR5相反,DcR1和DcR2受體并不發出凋亡信號。
            在文獻中已經報道了某些結合DR4和/或DR5受體的抗體。例如,在某些哺乳動物細胞中針對DR4受體并且具有激動性或凋亡性活性的抗DR4抗體在,例如,公開于1999年7月29日的WO 99/37684;公開于2000年7月12日的WO 00/73349;公開于2003年8月14日的WO 03/066661中進行了描述。還參見,例如,Griffith等人,J.Immunol.,1622597-2605(1999);Chuntharapai等人,J.Immunol.,1664891-4898(2001);公開于2002年12月2日的WO 02/097033;公開于2003年5月22日的WO 03/042367;公開于2003年5月8日的WO 03/038043;公開于2003年5月8日的WO03/037913。同樣地描述了某些抗DR5抗體,參見,例如,公開于1998年11月8日的WO 98/51793;Griffith等人,J.Immunol.,1622597-2605(1999);Ichikawa等人,Nature Med.,7954-960(2001);Hylander等人,“An Antibodyto DR5(TRAIL-receptor 2)Suppresses the Growth of Patient DerivedGastrointestinal Tumors Grown in SCID Mouse”,Abstract,2d InternationalCongress on Monoclonal Antibody in Cancers,Aug.29-Sept.1,2002,Banff,Alberta,Canada;公開于2003年5月8日的WO 03/038043;公開于2003年5月8日的WO 03/037913。此外,已經描述了具有對DR4和DR5受體都有交叉反應性的某些抗體(參見,例如,公開于2001年6月26日的美國專利6,252,050)。
            發明概述本發明這里部分涉及,將組氨酸-醋酸鹽(histine-acetate),pH 5.5-6.5,鑒定為特別有用的緩沖液,其用于配制單克隆抗體,特別是易于脫酰胺作用(deamidation)和/或聚集(aggregation)的全長IgG1抗體。該制劑阻止其中抗體產品的降解。
            因而,在第一方面,本發明涉及一種穩定的藥物制劑,其包括在組氨酸-醋酸鹽緩沖液pH 5.5-6.5中的單克隆抗體。所述單克隆抗體優選地結合選自HER2,CD20,DR5,BR3,IgE和VEGF的抗原。
            此外,本發明涉及治療受試者疾病或病癥的方法,包括向受試者施用有效量的所述制劑以治療所述疾病或病癥。
            在另一方面,本發明涉及一種藥物制劑,其包括(a)易于發生脫酰胺作用或聚集的全長IgG1抗體,其量為從大約10mg/mL到大約250mg/mL;(b)組氨酸-醋酸鹽緩沖液(histine-acetate buffer),pH 5.5-6.5;(c)選自海藻糖和蔗糖的糖,其量從大約60mM到大約250mM;和(d)聚山梨醇酯20,其量為從大約0.01%到大約0.1%。
            本發明還提供降低治療性單克隆抗體的脫酰胺作用或聚集作用的方法,包括在組氨酸-醋酸鹽緩沖液,pH 5.5-6.5中配制所述抗體。
            在又一方面,本發明涉及包含抗體,糖和表面活性劑的藥物制劑,所述抗體在pH從大約5.5到大約6.5的組氨酸緩沖液中結合HER2的結構域II。
            本發明還涉及一種藥物制劑,其包含從大約20mg/mL到大約40mg/mL的量的Pertuzumab,組氨酸-醋酸鹽緩沖液,蔗糖,和聚山梨醇酯20,其中所述制劑的pH為大約5.5到大約6.5。
            本發明還涉及一種藥物制劑,其包含在pH從大約5.5到大約6.5的組氨酸緩沖液中的DR5抗體,糖,和表面活性劑。
            在另一方面,本發明涉及一種藥物制劑,其包含從大約10mg/mL到大約30mg/mL的量的Apomab,組氨酸-醋酸鹽緩沖液,海藻糖,和聚山梨醇酯20,其中所述制劑的pH為大約5.5到大約6.5。
            在又一方面,本發明提供一種治療受試者中癌癥的方法,包括向受試者施用有效量的藥物制劑以治療癌癥。
            本發明還涉及帶有可以通過注射器刺穿的塞子的小瓶或不銹鋼罐,所述小瓶或罐中包含可選為凍干形式的所述制劑。
            另外,本發明提供制備藥物制劑的方法,包括(a)制備單克隆抗體制劑;和(b)評估制劑中單克隆抗體的物理穩定性,化學穩定性,或生物學活性。
            附圖簡述

            圖1描繪了HER2的細胞外結構域的結構域I-IV(分別為SEQ IDNos.19-22)。
            圖2A和2B描繪了以下氨基酸序列的比對鼠單克隆抗體2C4可變輕(VL)(圖2A)和可變重(VH)(圖2B)鏈結構域(分別為SEQ ID Nos.1和2);人源化2C4版本574的VL和VH結構域(分別為SEQ ID Nos.3和4),以及人VL和VH共有框架(hum κ1,輕kappa亞基I;humIII,重亞基III)(分別為SEQID Nos.5和6)。星號標識在人源化2C4版本574和鼠單克隆抗體2C4之間或在人源化2C4版本574和人框架之間的區別。互補決定區(CDRs)在括號中。
            圖3A和3B顯示Pertuzumab輕鏈和重鏈的氨基酸序列(分別為SEQ IDNos.15和16)。CDR以粗體顯示。計算的輕鏈和重鏈的分子量為23,526.22 Da和49,216.56 Da(還原形式的半胱氨酸)。糖部分附著于重鏈的Asn 299上。
            圖4A和4B顯示Pertuzumab輕和重鏈的氨基酸序列,每個都包括完整的氨基末端信號肽序列(分別為SEQ ID Nos.17和18)。
            圖5圖示了2C4在HER2的異源二聚體結合位點上的結合,由此阻止與活化的EGFR或HER3的異源二聚體化作用。
            圖6描繪了HER2/HER3與MAPK和Akt途徑的偶聯。
            圖7比較了Trastuzumab和Pertuzumab的活性。
            圖8通過離子交換(IEX)分析顯示了Pertuzumab制劑的穩定性。
            圖9通過大小排阻層析(SEC)分析顯示了Pertuzumab制劑的穩定性。
            圖10反映了Pertuzumab在不同的制劑中的物理穩定性。
            圖11來自Pertuzumab液體制劑的攪動研究(agitation study)。
            圖12來自Pertuzumab液體制劑的其它攪動研究。
            圖13來自Pertuzumab制劑的凍-融研究。
            圖14A和14B顯示Trastuzumab輕鏈(SEQ ID No.13)和重鏈(SEQ ID No.14)的氨基酸序列。
            圖15A和15B描繪了變體Pertuzumab輕鏈序列(SEQ ID No.23)和變體Pertuzumab重鏈序列(SEQ ID No.24)。
            圖16A和16B顯示了在IgG抗體中普遍觀察到的寡糖結構。
            圖17A和17B顯示了特異性抗IgE抗體E25,E26,HAE1和Hu-901折輕和重鏈的序列(SEQ ID Nos.37-44)。在圖17A中,可變輕鏈結構域在殘基111的殘基VEIK結束。在圖17B中,可變重鏈結構域在殘基120附近的殘基VTVSS結束。
            圖18A是比較鼠2H7(SEQ ID No.25),人源化2H7v16變體(SEQ ID No.26),和人kappa輕鏈亞基I(SEQ ID No.27)中每一種的可變輕結構域(VL)的氨基酸序列的序列比對。2H7和hu2H7v16的VL的CDR如下CDR1(SEQID No.57),CDR2(SEQ ID No.58),和CDR3(SEQ ID No.59)。
            圖18B是比較鼠2H7(SEQ ID No.28),人源化2H7v16變體(SEQ ID No.29),和重鏈亞基III的人共同序列(SEQ ID No.30)的可變重結構域(VH)的氨基酸序列的序列比對。2H7和hu2H7v16的VH的CDR如下CDR1(SEQ IDNo.60),CDR2(SEQ ID No.61),和CDR3(SEQ ID No.62)。
            在圖18A和圖18B中,每條鏈中的CDR1,CDR2和CDR3都包括在括號中,側翼為框架區,表示為FR1-FR4。2H7指鼠2H7抗體。在序列兩行之間的星號表示在兩條序列之間不同的位置。殘基根據Kabat等人Sequences of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991)編號,插入顯示為a,b,c,d,和e。
            圖19描繪了三種不同的VEGF抗體的可變結構域序列,其分別為SEQID Nos.31-36。
            圖20顯示下列Apomab樣品的大小排阻層析(SEC)洗脫曲線(a)對照和制劑,其在(b)pH 4.0,(c)pH 5.0,(d)pH 6.0和(e)pH 7.0的條件制備。在分析前將制備的樣品保存于40℃ 2個月。
            圖21描繪了保存過程中Apomab抗體單體損失的pH速率曲線。在保存過程中于30℃和40℃監測SEC的單體動力學,并計算一級速率常數。
            圖22提供Apomab樣品的離子交換層析(IEC)洗脫曲線如下(a)對照和制劑,其在(b)pH 4.0,(c)pH 5.0,(d)pH 6.0和(e)pH 7.0的條件制備。在分析之前將配制的樣品保存于40℃ 2個月。
            圖23顯示在保存期間IEC主峰損失的pH速率曲線。在保存過程中于30℃和40℃監測IEC的主峰動力學,并計算一級速率常數。
            圖24顯示人Apo-2配體cDNA的核苷酸序列(SEQ ID No.45)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID No.46)。核苷酸位置447上的“N”(在SEQ ID No.45中)用來表示核苷酸堿基可以是“T”或“G”。
            圖25A和25B顯示于1998年11月19日在WO 98/51793中公開的人DR5受體(SEQ ID No.47)的411個氨基酸序列,以及編碼核苷酸序列(SEQID No.48)。
            圖26A和26B顯示人DR5受體的440個氨基酸序列以及編碼核苷酸序列(SEQ ID No.50),其也于1998年8月20日在WO 98/35986中公開。
            圖27顯示Apomab 7.3重鏈氨基酸序列(SEQ ID No.51)。
            圖28顯示Apomab 7.3輕鏈氨基酸序列(SEQ ID No.52)。
            圖29顯示16E2重鏈(SEQ ID No.53)和Apomab 7.3重鏈(SEQ ID No.51)氨基酸序列的比對。
            圖30顯示16E2輕鏈(SEQ ID No.54)和Apomab 7.3輕鏈(SEQ ID No.52)氨基酸序列的比對。
            圖31A和31B描繪了Apomab 7.3的可變重鏈氨基酸序列(圖31A;SEQID No.55)和可變輕鏈氨基酸序列(圖31B;SEQ ID No.56)。CDR殘基以粗體標識。
            圖32顯示成熟2H7v16和2H7v511輕鏈(分別為SEQ ID Nos.63和64)的比對。用Kabat可變結構域殘基編號方法和Eu恒定結構域殘基編號方法顯示序列。
            圖33顯示成熟2H7v16和2H7v511重鏈(分別為SEQ ID Nos.65和66)的比對。用Kabat可變結構域殘基編號方法和Eu恒定結構域殘基編號方法顯示序列。
            優選實施方案詳述I.定義術語“藥物制劑”指一種制備物,其形式允許活性成分的生物學活性有效,并且其不包含其它組分,所述其它組分對于將對其施用該制劑的受試者來說具有不可接受的毒性。這些制劑是無菌的。
            “無菌(sterile)”制劑是經滅菌的(asceptic)或不含所有活體微生物及其孢子。
            在這里,“冷凍”制劑是在0℃以下溫度的制劑。一般來說,冷凍制劑不是凍干的,它在之前或之后也未進行凍干。優選地,冷凍制劑包含進行保存的冷凍藥物物質(在不銹鋼罐中)或冷凍藥物產品(在最終的藥瓶配置中)。
            “穩定的”制劑是這樣的制劑,其中的蛋白質在保存后基本上保持其物理穩定性和/或化學穩定性和/或生物學活性。優選地,該制劑在保存后基本上保持其物理和化學穩定性,以及其生物學活性。一般基于希望的制劑保質期來選擇貯存期。用來測量蛋白質穩定性的各種分析技術是本領域已有的并且在例如Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,New York,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.DrugDelivery Rev.1029-90(1993)中進行了綜述。可以在選定的溫度下測量穩定性持續選定的時間。優選地,所述制劑在大約40℃穩定至少大約2-4周,和/或在大約5℃和/或15℃穩定至少3個月,和/或在大約-20℃穩定至少3個月或至少1年。另外,所述制劑優選在制劑的冷凍(至,例如,-70℃)和融解后是穩定的,例如在1,2或3個循環的凍融之后。穩定性能夠以許多不同的方式進行定性和/或定量地評估,包括評估聚集物形成(例如利用大小排阻層析,通過測量濁度,和/或通過肉眼觀察);通過利用陽離子交換層析或毛細管分區電泳評估電荷異質性;氨基末端或羧基末端序列分析;質譜分析;SDS-PAGE分析以比較減小的和完整的抗體;肽圖譜(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析;評估生物學活性或抗體的抗原結合功能;等等。不穩定性可以包括下列的任一種或多種聚集,脫酰胺作用(例如Asn脫酰胺作用),氧化作用(例如Met氧化作用),異構化作用(例如Asp異構化作用),剪切/水解/片段化(例如鉸鏈區片段化),琥珀酰亞胺形成,未配對的半胱氨酸,N-末端延伸,C-末端加工,糖基化作用差異,等等。
            本文的“脫酰胺”單克隆抗體是這樣一種抗體,其中它的一個或多個天門冬酰胺殘基已經被衍生成,例如,天冬氨酸或異-天冬氨酸。
            “易于脫酰胺作用”的抗體是這樣一種抗體,其包括一個或多個被發現易于發生脫酰胺基的殘基。
            “易于聚集”的抗體是這樣一種抗體,其已經被發現與其它抗體分子一起聚集,特別是在冷凍和/或攪動之后。
            “易于片段化”的抗體是這樣一種抗體,其已經被發現剪切成兩個或多個片段,例如在其鉸鏈區。
            “減弱脫酰胺作用,聚集,或片段化”意欲相對于在不同的pH或在不同的緩沖液中配制的單克隆抗體來防止或減少脫酰胺作用,聚集,或片段化的量。
            在這里,單克隆抗體的“生物學活性”指該抗體結合抗原并導致可測量生物學反應的能力,所述生物學反應可以在體外或體內進行測量。這種活性可以是拮抗性的(例如當所述抗體為HER2抗體時)或激動性的(例如當所述抗體結合DR5時)。對于Pertuzumab而言,在一個實施方案中,生物學活性指配制的抗體抑制人乳癌細胞系MDA-MB-175-VII增殖的能力。當所述抗體為Apomab時,生物學活性可以指,例如,配制的抗體殺傷結腸癌,Colo205細胞的能力。
            “等滲的”意指目標制劑具有與人血液基本上相同的滲透壓。等滲制劑一般將具有從大約250到350mOsm的滲透壓。等滲性可以利用例如蒸氣壓或冰凍型滲壓計進行測量。
            如本文所用的,“緩沖液”指通過其酸-堿共軛組分的作用而耐受pH變化的緩沖溶液。本發明的緩沖液優選具有的pH從大約5.0到大約7.0,優選從大約5.5到大約6.5,例如從大約5.8到大約6.2,最優選具有大約6.0的pH。將控制pH在此范圍中的緩沖液的例子包括醋酸鹽,琥珀酸鹽,琥珀酸鹽,葡萄糖酸鹽,組氨酸,檸檬酸鹽,甘氨酰甘氨酸和其它有機酸緩沖液。本文的優選緩沖液是組氨酸緩沖液。
            “組氨酸緩沖液”是包括組氨酸離子的緩沖液。組氨酸緩沖液的實例包括組氨酸氯化物,組氨酸醋酸鹽,組氨酸磷酸鹽,組氨酸硫酸鹽。發現在本文實施例中鑒定的優選組氨酸緩沖液是組氨酸醋酸鹽。在優選的實施方案中,通過用醋酸(液體)滴定L-組氨酸(游離堿,固體)來制備組氨酸醋酸鹽緩沖液。優選地,組氨酸緩沖液或組氨酸-醋酸鹽緩沖液為pH 5.5-6.5,優選地pH 5.8-6.2。
            本文的“糖”包含常規組合物(CH2O)n及其衍生物,包括單糖,二糖,三糖,多糖,糖醇,還原性糖,非還原性糖等等。本文的糖的實例包括葡萄糖,蔗糖,海藻糖(trehalose),乳糖,果糖,麥芽糖,右旋糖苷,甘油,右旋糖苷,赤藻糖醇,丙三醇,阿拉伯糖醇,sylitol,山梨糖醇,甘露醇,密里二糖(mellibiose),松三糖(melezitose),蜜三糖(raffinose),甘露三糖(mannotriose),水蘇糖(stachyose),麥芽糖,乳果糖(lactulose),麥芽酮糖(maltulose),山梨醇(glucitol),麥芽糖醇,乳糖醇,異-麥芽酮糖(maltulose),等等。本文優選的糖是非還原性二糖,如海藻糖或蔗糖。
            在本文中,“表面活性劑”指表面活性制劑,優選非離子性表面活性劑。本文的表面活性劑的實例包括聚山梨醇酯(例如,聚山梨醇酯20和,聚山梨醇酯80);聚羥亞烴(poloxamer)(例如聚羥亞烴188);Triton;十二烷基磺酸鈉(SDS);月桂基磺酸鈉;辛基糖甙鈉;月桂基-、肉豆蔻基-、亞油基-、或硬脂基-磺基甜菜堿;月桂基-、肉豆蔻基-、亞油基-、或硬脂基-肌氨酸;亞油基-、肉豆蔻基-、或鯨蠟基-甜菜堿;月桂酰胺基丙基-、柯卡酰胺基丙基-、亞油酰胺基丙基-、肉豆蔻酰胺基丙基-、棕櫚酰胺基丙基-、或異硬脂酰胺基丙基-甜菜堿(如月桂酰胺基丙基);肉豆蔻酰胺基丙基-、棕櫚酰胺基丙基-、或異硬脂酰胺基丙基-二甲基胺;甲基可可酰基鈉或甲基油基牛磺酸鈉;以及MONAQUATTM系列(Mona Industries,Inc.,Paterson,New Jersey);聚乙二醇,聚丙二醇,和乙烯與丙烯二醇的共聚物(例如Pluronics,PF68等);等等。本文優選的表面活性劑是聚山梨醇酯20。
            “HER受體”是受體蛋白質酪氨酸激酶,它屬于HER受體家族,包括EGFR,HER2,HER3和HER4受體以及將來鑒定的此家族的其它成員。HER受體一般將包含細胞外結構域,它可以結合HER配體;親脂性跨膜結構域;保守性細胞內酪氨酸激酶結構域;和具有幾個酪氨酸殘基的羧基末端信號結構域,它可以進行磷酸化。優選地HER受體是天然序列人HER受體。
            HER2的細胞外結構域包含四個域,結構域I(氨基酸殘基從大約1-195),結構域II(氨基酸殘基從大約196-320),結構域III(氨基酸殘基從大約321-488),和結構域Iv(氨基酸殘基從大約489-632)(沒有信號肽的殘基編號)。參見Garrett等人Mol.Cell..11495-505(2003),Cho等人Nature 421756-760(2003),Franklin等人癌細胞5317-328(2004),或Plowman等人Proc.Natl.Acad.Sci.901746-1750(1993)。還參見本文的圖1。
            術語“ErbB1”,“HER1″,“表皮生長因子受體”和“EGFR”在本文中可以相互交換使用,并且如例如在Carpenter等人Ann.Rev.Biochem.56881-914(1987)中公開的,稱作EGFR,包括其自然發生的突變形式(例如Humphrey等人PNAS(USA)874207-4211(1990)中的刪除突變體EGFR)。erbB1指編碼EGFR蛋白質產物的基因。
            表述方式“ErbB2”和“HER2”在本文中可以相互交換使用,并且稱作人HER2蛋白質,例如,在Semba等人,PNAS(USA)826497-6501(1985)和Yamamoto等人Nature 319230-234(1986)(Genebank編號X03363)中所述。術語“erbB2”指編碼人ErbB2的基因而“neu”指編碼大鼠p185neu的基因。優選的HER2是天然序列人HER2。
            “ErbB3”和“HER3”指例如,在美國專利號5,183,884和5,480,968以及Kraus等人PNAS(USA)869193-9197(1989)中所公開的受體多肽。
            本文的術語“ErbB4”和“HER4”指例如在歐洲專利申請號599,274;Plowman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,901746-1750(1993);和Plowman等人,Nature,366473-475(1993)中公開的受體多肽,包括其異構體,例如,在公開于1999-04-22的WO99/19488中所披露的。
            “HER配體”意指結合和/或激活HER受體的多肽。本文中具體的目標HER配體是天然序列人HER配體如表皮生長因子(EGF)(Savage等人,J.Biol.Chem.2477612-7621(1972);轉化生長因子α(TGF-a)(Marquardt等人,Science 2231079-1082(1984));雙調蛋白也稱作雪旺細胞瘤(schwanoma)或角化細胞自分泌生長因子(Shoyab等人Science 2431074-1076(1989);Kimura等人Nature 348257-260(1990);和Cook等人Mol.Cell.Biol.112547-2557(1991));β纖維素(Shing等人,Science 2591604-1607(1993);和Sasada等人Biochem.Biophys.Res.Commun.1901173(1993));肝素結合型表皮生長因子(HB-EGF)(Higashiyama等人,Science 251936-939(1991));上皮調節蛋白(epiregulin)(Toyoda等人,J.Biol.Chem.2707495-7500(1995);和Komurasaki等人Oncogene 152841-2848(1997));調蛋白(參見下文);神經調節蛋白-2(NRG-2)(Carraway等人,Nature 387512-516(1997));神經調節蛋白-3(NRG-3)(Zhang等人,Proc.Natl.Acad.Sci. 949562-9567(1997));神經調節蛋白-4(NRG-4)(Harari等人Oncogene 182681-89(1999))或cripto(CR-1)(Kannan等人J.Biol.Chem.272(6)3330-3335(1997))。結合EGFR的HER配體包括EGF,TGF-α,雙調蛋白,β纖維素,HB-EGF和上皮調節蛋白。結合HER3的HER配體包括調蛋白。能夠結合HER4的HER配體包括β纖維素,上皮調節蛋白,HB-EGF,NRG-2,NRG-3,NRG-4和調蛋白。
            當用在本文中時“調蛋白”(HRG)指由在美國專利號5,641,869或Marchionni等人,Nature,362312-318(1993)中公開的調蛋白基因產物所編碼的多肽。調蛋白的實例包括調蛋白-α,調蛋白-β1,調蛋白-β2和調蛋白-β3(Holmes等人,Science,2561205-1210(1992);和美國專利號5,641,869);neu分化因子(NDF)(Peles等人細胞69205-216(1992));乙酰膽堿受體誘導活性(ARIA)(Falls等人.Cell 72801-815(1993));]神經膠質生長因子(GGFs)(Marchionni等人,Nature,362312-318(1993));感覺和運動神經元衍生因子(SMDF)(Ho等人J.Biol.Chem.27014523-14532(1995));γ-調蛋白(Schaefer等人Oncogene 151385-1394(1997))。該術語包括天然序列HRG多肽的生物學活性片段和/或氨基酸序列變體,如其EGF樣結構域片段(例如HRGβ1177-244)。
            本文的“HER二聚體”是非共價結合的二聚體,包括至少兩種不同的HER受體。當表達兩種或多種HER受體的細胞暴露于HER配體時可以形成這種復合物,并且可以通過免疫沉淀進行分離并通過SDS-PAGE進行分析,如例如Sliwkowski等人,J.Biol.Chem.,269(20)14661-14665(1994)所述。這些HER二聚體的實例包括EGFR-HER2,HER2-HER3和HER3-HER4異二聚體。另外,HER二聚體可以包含兩個或多個結合不同HER受體,如HER3,HER4或EGFR的HER2受體。其它蛋白質,如細胞因子受體亞基(例如gp130)可以與二聚體相結合。
            HER2上的“異二聚體結合位點”,指HER2的細胞外結構域中的區域,在形成二聚體后,它與EGFR,HER3或HER4細胞外結構域中的區域相接觸,或相接觸。在HER2的結構域II中發現該區。Franklin等人Cancer Cell5317-328(2004)。
            “HER激活”或“HER2激活”指任何一個或多個HER受體,或HER2受體的激活,或磷酸化作用。一般來說,HER激活導致信號轉導(例如由HER受體的細胞內激酶結構域引發的信號轉導,所述結構域磷酸化HER受體或底物多肽中的酪氨酸殘基)。HER激活可以通過HER配體與包括目標HER受體的HER二聚體的結合來介導。HER配體結合HER二聚體可以激活二聚體中一個或多個HER受體的激酶結構域并由此導致一個或多個HER受體中酪氨酸殘基的磷酸化作用,和/或其它底物多肽中酪氨酸殘基的磷酸化作用,如Akt或MAPK細胞內激酶。
            以最寬泛的意義使用本文的術語“抗體”,具體包括全長單克隆抗體,多克隆抗體,由至少兩個全長抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體),和抗體片段,只要它們展示所需的生物學活性。
            本文中所用的術語“單克隆抗體”指從實質上均一的抗體群獲得的抗體,即包含該群體的單個抗體除了可能在單克隆抗體生產過程中發生的變體以外都相同和/或結合相同的表位,這些變體一般以小量存在。與一般包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制品相反,每種單克隆抗體都針對抗原上的單一決定簇。除了它們的特異性之外,其優勢還在于它們未被其它免疫球蛋白污染。修飾語“單克隆的”指抗體獲自實質上均一的抗體群的特征,不應理解為限定由任何特定方法產生抗體。例如根據本發明使用的單克隆抗體可以通過由Kohler等,自然,256495(1975)首次描述的雜交瘤方法來制備,或可以通過重組DNA法(如美國專利4,816,567)來制備。“單克隆抗體”還可以用Clackson等,自然,352624-628(1991)和Marks等,分子生物學雜志,222581-597(1991)所述技術從噬菌體抗體庫中分離。
            本文中單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白),其中重鏈和/或輕鏈的一部分等同于或同源于源自特定物種的抗體或屬于特定抗體類或亞類的抗體的相應序列,而鏈的其余部分等同于或同源于來自另一種物種的抗體或屬于另一抗體類或亞類的抗體的相應序列條件是它們展示所需生物學活性(見美國專利4,816,567;Morrison等,美國國家科學院學報,816851-6855(1984))。本文的目標嵌合抗體包括“靈長類化(primatized)”抗體,其包含源于非人靈長類可變結構域抗原結合序列(例如Old World Monkey,猿等)和人恒定區序列。
            抗體片段”包括全長抗體的一部分,優選包括其抗原結合區或可變區。抗體片段的實例包括Fab,Fab’,F(ab’)2,和Fv片段;二價抗體;線性化抗體;單鏈抗體分子;和由抗體片段構成的多特異性抗體。
            “全長抗體”是這樣一種抗體,其包含抗原-結合可變區以及輕鏈恒定結構域(CL)和重鏈恒定結構域s,CH1,CH2和CH3。恒定結構域可以是天然序列恒定結構域(例如人天然序列恒定結構域)或其氨基酸序列變體。優選地,全長抗體具有一種或多種效應功能。
            本文中術語“主要種類抗體”指組合物中的一種抗體結構,其在該組合物中是在量上占優勢的抗體分子。在一個實施方案中,主要種類抗體是HER2抗體,如結合HER2結構域II的抗體,比Trastuzumab更有效抑制HER二聚體化作用的抗體,和/或結合HER2的異二聚體結合位點的抗體。本文的主要組分HER2抗體的優選實施方案是這樣一種實施方案,其包括SEQID Nos.3和4中的可變輕和可變重氨基酸序列,最優選包括SEQ ID Nos.15和16中的輕鏈和重鏈氨基酸序列(Pertuzumab)。
            本文中“氨基酸序列變體”抗體是具有不同于主要種類抗體的氨基酸序列的抗體。一般,氨基酸序列變體將與主要種類抗體具有至少大約70%同源性,優選地,它們至少將與主要種類抗體具有大約80%,更加優選至少大約90%同源性。氨基酸序列變體在主要種類抗體的氨基酸序列之內或鄰近的某些位置上具有取代,刪除,和/或添加。本文的氨基酸序列變體的實例包括酸性變體(例如脫酰胺抗體變體),堿性變體,在其一個或兩個輕鏈上具有氨基末端引導延伸(例如VHS-)的抗體,在其一個或兩個重鏈上具有C-末端賴氨酸殘基的抗體,等等,并且包括重和/或輕鏈氨基酸序列變異的組合。本文的特定目標抗體變體是在其一個或兩個輕鏈上包含氨基末端引導延伸的抗體,任選地進一步包括相對于主要種類抗體的其它氨基酸序列和/或糖基化作用差異。
            “治療性單克隆抗體”是用于治療人受試者的抗體。本文公開的治療性單克隆抗體包括用于癌癥和各種非惡性疾病或病癥的HER2抗體;用于治療B細胞惡性瘤,自身免疫疾病,移植物排斥,或阻抑針對外源抗原的免疫反應的CD20或BR3抗體;用于治療IgE介導的病癥的IgE抗體;用于治療癌癥的DR5或VEGF抗體。
            本文的“糖基化作用變體”抗體是具有一個或多個糖部分附于其上的抗體,其不同于附于主要種類抗體上的一個或多個糖部分。本文的糖基化作用變體的實例包括具有G1或G2寡糖結構,而非G0寡糖結構附于其Fc區上的抗體,有一個或兩個糖部分附于其一個或兩個輕鏈上的抗體,沒有糖附于抗體的一個或兩個重鏈上的抗體,等等,以及糖基化作用變化的組合。
            當抗體具有Fc區時,可以將寡糖結構如圖16所示的結構附于抗體的一個或兩個重鏈上,例如在殘基299上(298,殘基的Eu編號)。對于Pertuzumab來說,G0是占優勢的寡糖結構,在Pertuzumab組合物中發現有較少量的其它寡糖結構如G0-F,G-1,Man5,Man6,G1-1,G1(1-6),G1(1-3)和G2。
            除非另外指定,本文的“G1寡糖結構”包括G-1,G1-1,G1(1-6)和G1(1-3)結構。
            本文中“氨基末端引導延伸(amino-terminal leader extension)”指氨基末端引導序列的一個或多個氨基酸殘基,其存在于抗體的任何一個或多個重或輕鏈的氨基末端。例示性的氨基末端引導延伸包含或由存在于抗體變體一條或兩條輕鏈上的三個氨基酸殘基,VHS組成。
            “同源性”被定義為在比對序列和引入缺口之后氨基酸序列變體殘基相同的百分比,如果有必要的話,去實現最大百分比同源性。進行比對的方法和計算機程序是本領域公知的。一種這類計算機程序為“Align 2”,其于1991年12月10日在美國版權局,華盛頓區,DC20559以用戶文件存檔。
            抗體“效應功能”指那些可歸結于抗體Fc區的生物學活性(天然序列Fc區或氨基酸序列變體Fc區)。“效應功能”的例子包括C1q結合;補體依賴性細胞毒性;Fc受體結合;抗體-依賴型細胞介導的細胞毒性(ADCC);吞噬作用;細胞表面受體的下調(例如B細胞受體;BCR)等。
            根據其重鏈恒定結構域的氨基酸序列,可以將全長抗體指定到不同的“類別”。有五種主要的全長抗體類別IgA,IgD,IgE,IgG,和IgM,其中幾種可以進一步分入“亞類”(同種型),例如,IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA,和IgA2。對應于不同類別抗體的鏈恒定結構域分別叫作α,δ,ε,γ,和μ。不同類別免疫球蛋白的亞基結構和三維構型是公知的。
            “抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”和“ADCC”指一種細胞介導的反應,其中表達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒細胞(如自然殺傷(NK)細胞,中性粒細胞,和巨噬細胞)識別靶細胞上結合的抗體,并隨后引起靶細胞的裂解。介導ADCC的主要細胞即NK細胞僅表達FcγR III,而單核細胞表達FcγR I,FcγR II和FcγR III。Raveth和Kinet在免疫學年鑒9457-92(1991),464頁的表3中總結了造血細胞上的FcR表達。為評估目的分子的ADCC活性,可進行體外ADCC試驗,如美國專利5,500,362號或5,821,337號中所述。這類試驗中有用的效應細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細胞。任選地或另外,目的分子的ADCC活性可在體內評估,例如在Clynes等PNAS(USA)95652-656(1998)公開的動物模型中。
            “人效應細胞”是表達一種或多種FcR并執行效應劑功能的白細胞。優選所述細胞至少表達FcγR III并執行ADCC效應劑的功能。例如可介導ADCC的人白細胞包括人外周血單個核細胞(PBMC),自然殺傷(NK)細胞,單核細胞,細胞毒T細胞和中性粒細胞;其中優選PBMC和NK細胞。效應細胞可分離自其天然來源,例如如本文所述分離自血液和PBMC。
            術語“Fc受體”或“FcR”用于描述與抗體Fc區結合的受體。優選的FcR是天然序列的人FcR。而且,優選的FcR是與IgG抗體結合的受體(γ受體),包括FcγR I,FcγR II和FcγR III亞型,以及這些受體的等位基因變體和可替換的剪接形式。FcγR II受體包括FcγR IIA(“活化型受體”)和FcγR IIB(“抑制型受體”),二者的氨基酸序列相似,主要區別在其胞漿結構域。活化型受體FcγR IIA在其胞漿結構域包含基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制型受體FcγR IIB在其胞漿結構域包含基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(見綜述Daeron,免疫學年鑒15203-234(1997))。在Ravetch和Kinet,免疫學年鑒9457-92(1991);Capel等,免疫方法(免疫學方法)425-34(1994);和de Haas等,實驗室及臨床醫學雜志(J.Lab.Clin.Med.)126330-41(1995)中對FcR進行了綜述。其它FcR,包括將來被確定的,均被包含在術語“FcR”中。該術語也包括新生期的受體,FcRn,其負責將母體的IgG轉運至胎兒(Guyer等,免疫學雜志117587(1976)和Kim等,免疫學雜志24249(1994))。
            “補體依賴性細胞毒性”或“CDC”是指在補體存在時分子裂解標靶的能力。補體活化途徑由補體系統第一個成分(C1q)結合至一個與同源抗原形成復合物的分子(如抗體)來啟動。為評價補體活化,可如Gazzano-Santoro等,免疫學方法雜志202163(1996)所述進行CDC試驗。
            “天然抗體”通常是約150,000道爾頓的異源四聚體糖蛋白,由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)構成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接,而免疫球蛋白不同種型的重鏈中二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈還具有規則間隔的鏈內二硫鍵。每個重鏈在其一個端有可變結構域(VH),緊接著多個恒定結構域。每個輕鏈端有可變結構域(VL),而另一端有恒定結構域;輕鏈恒定結構域與重鏈第一恒定結構域并列,輕鏈的可變結構域與重鏈的可變結構域并列。據信在輕鏈和重鏈的可變結構域之間特定氨基酸形成一個界面。
            術語“可變的”是指不同抗體的可變區某些部分序列差異很大,且這些部分在每種特定抗體與其特定抗原的結合和特異性中有用。然而在抗體整個可變區中可變性的分布并不均等。它集中在輕鏈和重鏈可變區的三個被稱為高變區的節段中。可變區的更高度保守部分被稱為框架區(FR)。天然輕鏈和重鏈的可變區分別包含四個FR,它們大多采用β片層構型,通過三個高變區相連,這些高變區與β片層結構形成環狀,有時形成部分環狀。每條鏈的高變區通過FR連接至十分接近,并與其他鏈的高變區共同形成抗體的抗原結合位點(見Kabat等,具有免疫學意義的蛋白的序列,第5版,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定區不直接參與抗體對抗原的結合,但顯示多種效應功能,如使抗體參與抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)。
            當用在本文中時術語“高變區”指抗體中負責抗原結合的氨基酸殘基。高變區通常含有來自“互補決定區”或“CDR”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變區的殘基24-34(L1),50-56(L2)和89-97(L3),重鏈可變區的殘基31-35(H1),50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等,具有免疫學意義的蛋白的序列,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)),和/或“高變環”的殘基(例如輕鏈可變區的殘基26-32(L1),50-52(L2)和91-96(L3),重鏈可變區的殘基26-32(H1),53-55(H2)和96-101(H3);Chothia和Lesk,分子生物學雜志196901-917(1987))。“框架區”或“FR”殘基是除本文所定義的高變區殘基以外的可變區殘基。
            抗體經木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的稱為“Fab”的抗原結合片段和一個殘余“Fc”片段,每個Fab片段具有單個抗原結合位點,Fc的名稱反映了其容易形成結晶的能力。胃蛋白酶處理產生一個F(ab’)2片段,它有兩個抗原結合位點并仍能與抗原交聯。
            “Fv”是最小抗體片段,包含完整的抗原識別和抗原結合位點。這個區域是由一條重鏈和一個輕鏈可變區緊密、非共價結合成的二聚體。在VH-VL二聚體表面,每個可變區的三個高變區在構型上相互作用,從而限定抗原結合位點。六個高變區共同賦予抗體以抗原結合特性。但即使單個可變區(或Fv中僅包含三個抗原特異性高變區的那一半)也能識別并結合抗原,只是比完整結合位點的親和力低。
            Fab片段還包含輕鏈恒定區和重鏈的第一恒定區(CH1)。Fab’不同于Fab片段之處在于,其重鏈CH1結構域的羧基端添加了數個殘基,其中包括來自抗體鉸鏈區的一或多個半胱氨酸。本文中Fab’-SH指一種Fab’,其中恒定區的半胱氨酸殘基有至少一個游離巰基。F(ab’)2抗體片段最初是作為Fab’片段對且它們之間有鉸鏈區半胱氨酸的形式產生的。抗體片段的其它化學連接也是已知的。
            可以將脊椎動物任何物種的抗體的“輕鏈”指定為兩種完全不同的型之一,稱作κ和λ,型別區分的依據是其恒定區氨基酸序列。
            “單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包括抗體的VH和VL結構域,這些結構域存在于單個多肽鏈上。優選地,Fv多肽在VH和VL結構域之間還包含一個多肽接頭,它能使scFv形成抗原結合所需的結構。關于scFv的綜述見Pluckthun在《單克隆抗體的藥理學》,第113卷,Rosenburg和Moore編,Springer-Verlag,New York,第269-315頁(1994)。HER2抗體scFv片段在WO93/16185;美國專利號5,571,894;和美國專利號5,587,458中進行了描述。
            術語“二價抗體(diabodies)”是指具有兩個抗原結合位點的小分子抗體片段,這些片段在一條多肽鏈(VH-VL)上含有相連的一個重鏈可變區(VH)和一個輕鏈可變區(VL)。利用一種非常短的接頭,其使得同一條鏈上的兩個結構域無法配對,被迫與另一條鏈上的互補結構域配對,從而形成兩個抗原結合位點。在EP 404,097;WO93/11161;和Hollinger等,美國國家科學院學報,906444-6448(1993)中對二價抗體作更充分地描述。
            “人源化”形式的非人(例如嚙齒動物)抗體是包含源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。對于大多數的部分而言,人源化抗體人免疫球蛋白(受體(recipient)抗體),其中受體的高變區殘基被具有所需特異性、親和力和能力(capacity)的非人物種如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類(供體(donor)抗體)的高變區的殘基所替代。在一些情況下,人免疫球蛋白框架區(FR)殘基被相應的非人殘基取代。而且人源化抗體可包含未在受體抗體或供體抗體中發現的殘基。這些修飾旨在進一步細化抗體的功能。一般情況下,人源化抗體基本上包含至少一個、通常兩個可變區的全部,其中所有或基本上所有高變環對應于非人免疫球蛋白的那些,所有或基本上所有FR是人的免疫球蛋白序列中的那些。人源化抗體任選地還包含免疫球蛋白恒定區(Fc)、通常為人免疫球蛋白的至少一部分。祥見Jones等,自然321522-525(1986);Riechmann等,自然332323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
            人源化HER2抗體包括huMAb4D5-1,huMAb4D5-2,huMAb4D5-3,huMAb4D5-4,huMAb4D5-5,huMAb4D5-6,huMAb4D5-7和huMAb4D5-8或Trastuzumab(HERCEPTIN),如美國專利5,821,337的表3中所述,本文特別將其并入作為參考;本文所述的人源化520C9(WO93/21319)和人源化2C4抗體。
            對于本文的目的而言,“Trastuzumab,”“HERCEPTIN,”和“huMAb4D5-8″分別指包括SEQ ID NOS.13和14中的輕和重鏈氨基酸序列的抗體。
            在這里,“Pertuzumab,”“rhuMAb 2C4,”和“OMNITARGTM”分別指包括SEQ ID NOS.3和4中的可變輕和可變重氨基酸序列的抗體。其中Pertuzumab是全長抗體,優選地它分別包含SEQ ID NOS.15和16中的輕鏈和重鏈氨基酸序列。
            “裸抗”是未偶聯到異種分子,如細胞毒性部分或放射性標準上的抗體(如本文所定義的)。
            “親和性-成熟的”抗體是在其一個或多個高變區中具有一或多種變化的抗體,所述變化導致所述抗體與不具有那些變化的親代抗體相比,前者對于抗原的親和性提高。優選的親和性成熟的抗體將具有納摩爾的或甚至皮摩爾的靶抗原親和性。通過本技術領域已知的方法產生親和性-成熟的抗體。Marks等,Bio/Technology,10779-783(1992)描述了通過VH和VL域重排的親和性成熟(affinity maturation)。CDR和/或框架殘基的隨機突變由Barbas等,Proc.Nat.Acad.Sci,USA,913809-3813(1994);Schier等,Gene,169147-155(1995);Yelton等,J.Immunol.,1551994-2004(1995);Jackson等,J.Immunol.,154(7)3310-3319(1995);和Hawkins等,J.Mol.Biol.,226889-896(1992)描述。
            “激動劑抗體”是結合并激活受體的抗體。一般地,激動劑抗體的受體激活能力將至少在定性上與受體的天然激動劑配體相似(并且可以是基本上在定性上相似)。激動劑抗體的實例是結合TNF受體超家族中的受體,如DR5的抗體,并且其誘導表達TNF受體(例如DR5)的細胞的凋亡。確定凋亡誘導的測定法在WO98/51793和WO99/37684中進行了描述,特此將二者并入本文作為參考。
            “分離的”抗體是指從其天然環境成份中鑒定和分離和/或回收的抗體。其天然環境的污染成份是會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質,且可能包括酶,激素,和其它蛋白型或非蛋白型溶質。在優選的實施方案中,該抗體將純化成(1)按勞里(Lowry)方法測定的抗體重量百分比超過95%,且最優選重量百分比超過99%,(2)其純化程度足以通過使用轉杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內部氨基酸序列,或(3)在還原性或非還原性條件下進行SDS-PAGE并使用考馬斯藍或者,優選銀染測定具有同質性。分離的抗體包括在重組細胞內的原位抗體,因為該抗體天然環境中的至少一種成份不存在。然而,一般來說,分離的抗體由至少一個純化步驟制備。
            “比Trastuzumab更有效地抑制HER二聚體化作用”的HER2抗體是比Trastuzumab更有效地(例如至少大約2-倍更加有效地)減弱或消除HER二聚體的抗體。優選地,這種抗體至少大約與鼠單克隆抗體2C4,鼠單克隆抗體2C4的Fab片段,Pertuzumab,和Pertuzumab的Fab片段同樣有效地抑制HER2二聚體化作用。可以通過直接研究HER二聚體,或通過評估HER激活,或緣自HER二聚化作用的下游信號,和/或通過評估抗體-HER2結合位點等等來評估HER二聚化作用抑制。篩選具有比Trastuzumab更有效地抑制HER二聚體化作用的抗體的測定法在Agus等人Cancer Cell 2127-137(2002)和WO01/00245(Adams等人)中進行了描述。例如,可以通過評估,例如,HER二聚體形成的抑制(參見,例如,Agus等人Cancer Cell 2127-137(2002)的圖1A-B;和WO01/00245);表達HER二聚體的細胞的HER配體激活的減弱(例如,WO01/00245和Agus等人Cancer Cell 2127-137(2002)的圖2A-B);HER配體與表達HER二聚體的細胞的結合的阻抑(例如,WO01/00245,和Agus等人Cancer Cell 2127-137(2002)的圖2E);在HER配體存在(或缺失)時表達HER二聚體的癌細胞(例如MCF7,MDA-MD-134,ZR-75-1,MD-MB-175,T-47D細胞)的細胞生長抑制(例如,WO01/00245和Agus等人Cancer Cell 2127-137(2002)的圖3A-D);下游信號的抑制(例如,HRG-依賴型AKT磷酸化作用的抑制或HRG-或TGFα-依賴型MAPK磷酸化作用的抑制)(參見,例如,WO01/00245,和Agus等人Cancer Cell 2127-137(2002)的圖2C-D)來測定HER二聚體化作用的抑制。還可以通過研究抗體HER2結合位點,例如,通過評估結合HER2的抗體的結構或模型,如晶體結構,來評估抗體是否抑制HER二聚體化作用(參見,例如,Franklin等人Cancer Cell 5317-328(2004))。
            HER2抗體可以比Trastuzumab更加有效地“抑制HRG-依賴型AKT磷酸化作用”和/或抑制“HRG-或TGFα-依賴型MAPK磷酸化作用”(例如至少2-倍更加有效地)(例如參見Agus等人Cancer Cell 2127-137(2002)和WO01/00245)。
            HER2抗體可以“不抑制HER2外部結構域(ectodomain)切割”(Molina等人Cancer Res.614744-4749(2001)。
            “結合HER2的異二聚體結合位點”的HER2抗體,結合結構域II中的殘基(任選地還結合其它HER2細胞外結構域,如結構域I和III中的殘基),并且至少在某種程度上可以空間阻礙HER2-EGFR,HER2-HER3,或HER2-HER4異二聚體的形成。Franklin等人Cancer Cell 5317-328(2004)表征了HER2-Pertuzumab晶體結構,保存在RCSB蛋白質數據庫(ID CodeIS78),例證了結合HER2的異二聚體結合位點的例示性抗體。
            “結合HER2的結構域II”的抗體結合結構域II中的殘基并且任選地結合HER2其它結構域,如結構域I和III中的殘基。優選地結合結構域II的抗體結合到HER2的結構域I,II和III之間的連接上。
            當在本文中使用時“生長抑制劑”指在體外或體內抑制細胞,特別是表達HER的癌細胞的生長的化合物或組合物。因而,生長抑制劑可以是顯著減少處于S期的表達HER的細胞的百分比的抑制劑。生長抑制劑的實例包括阻抑細胞周期進程(在S期以外處)的試劑,如誘導G1阻滯和M-期阻滯的試劑。典型的M-期阻抑劑包括長春花堿類(vincas)(長春新堿和長春堿),紫杉烷,和拓撲II抑制劑如阿霉素,表柔比星(epirubicin),柔紅霉素(daunorubicin),依托泊苷(etoposide),和博來霉素。那些阻滯G1的試劑也延伸到S期阻滯,例如,DNA烷化劑如它莫西芬,強的松,達卡巴嗪(dacarbazine),氮芥(mechlorethamine),順鉑,氨甲蝶呤,5-氟尿嘧啶,和阿糖胞苷(ara-C)。其它信息可以見于The Molecular Basis of Cancer,Mendelsohnand Israel,eds.,Chapter 1,entitled″Cell cycle regulation,oncogenes,andantineoplastic drugs″by Murakami等人(WB SaundersPhiladelphia,1995),特別是第13頁。
            “生長抑制性”抗體的實例是那些結合HER2和抑制過表達HER2癌細胞的生長的抗體。優選的生長抑制性HER2抗體以大約0.5-30μg/ml的抗體濃度抑制細胞培養物中SK-BR-3乳房腫瘤細胞的生長超過20%,優選超過50%(例如從大約50%到大約100%),其中所述生長抑制是在SK-BR-3細胞暴露于抗體六天之后(參見發布于1997年10月14日的美國專利號5,677,171)測定的。SK-BR-3細胞生長抑制測定在該專利和下文中作更加詳細的描述。優選的生長抑制性抗體是鼠單克隆抗體4D5的人源化變體,例如,Trastuzumab。
            “誘導凋亡”的抗體是指誘導程序性細胞死亡的抗體,所述死亡可通過膜聯蛋白(annexin)V的結合,DNA片段化,細胞皺縮,內質網膨脹,細胞碎裂,和/或膜泡(稱為凋亡小體)形成確定。所述細胞通常是表達該抗體所結合抗原的細胞。優選地所述細胞是腫瘤細胞。例如磷脂酰絲氨酸(PS)轉位可以通過膜聯蛋白結合測量DNA片段化可以通過DNA梯度評估;而伴隨著DNA片段化的核/染色質濃縮可以通過亞二倍體細胞的任何增長進行評估。優選地,在膜聯蛋白結合測定中,誘導凋亡的抗體是導致相對于未處理細胞對膜聯蛋白結合的誘導為大約2-50倍,優選地大約5-50倍,最優選大約10-50倍的抗體,所述測定利用表達該抗體所結合抗原的細胞進行。誘導凋亡的抗體的實例為HER2抗體7C2和7F3,和某些DR5抗體。
            “表位2C4”是抗體2C4結合的HER2細胞外結構域中的區域。為了篩選結合2C4表位的抗體,可以進行常規交叉阻抑測定,如在Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and DavidLane(1988)中所述的測定。或者,可以進行表位圖譜繪制以評估抗體是否結合到HER2的2C4表位上。表位2C4包含來自HER2細胞外結構域中結構域II的殘基。2C4和Pertuzumab在結構域I,II和III的連接處結合HER2的細胞外結構域。Franklin等人癌細胞5317-328(2004)。
            “表位4D5”是抗體4D5(ATCC CRL 10463)和Trastuzumab進行結合的HER2細胞外結構域中的區域。這一表位靠近HER2的跨膜結構域,并且在HER2的結構域IV內。為了篩選結合4D5表位的抗體,可以進行常規交叉阻抑測定,如在Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中所述的測定。或者,可以進行表位圖譜繪制以評估抗體是否結合到HER2的4D5表位上(例如從HER2的大約殘基529到大約殘基625的區域中任何一個或多個殘基,包括殘基529和殘基625)。
            “表位7C2/7F3”是7C2和/或7F3抗體(都保存在ATCC,參見下文)結合的HER2細胞外結構域的結構域I之內的,氨基末端上的區域。為了篩選結合7C2/7F3表位的抗體,可以進行常規交叉阻抑測定,如在Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and DavidLane(1988)中所述的測定。或者,可以進行表位圖譜繪制以證實抗體是否結合到HER2上的7C2/7F3表位上(例如從HER2的大約殘基22到大約殘基53的區域中任何一個或多個殘基)。
            “治療”指治療性治療和預防性措施。需要處理的人包括已經患有疾病的人以及要預防疾病的人。因此,可以將本文待處理的患者診斷為患有疾病或可能傾向或易于患有該疾病。
            術語“癌癥”和“癌的”指或描述哺乳動物的生理狀態,其一般表征為無節制的細胞生長。癌癥的實例包括,但不限于,癌,淋巴瘤,胚細胞瘤(包括髓母管細胞瘤和視網膜母細胞瘤),肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑液細胞肉瘤),神經內分泌腫瘤(包括類癌樣腫瘤,促胃泌素瘤,和胰島細胞癌),間皮瘤,神經鞘瘤(包括聽神經瘤),脊膜瘤、腺癌、黑素瘤,和白血病或淋巴惡性瘤。這些癌癥的更加具體的實例包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌),肺癌包括小細胞肺癌,非小細胞肺癌,肺的腺癌和肺的鱗狀細胞癌,腹膜癌,肝細胞癌,腸胃癌包括胃腸癌,胰腺癌,膠質母細胞瘤,頸癌,卵巢癌,肝癌,膀胱癌,肝癌,乳癌,結腸癌,直腸癌,結腸直腸癌,子宮內膜或子宮癌,唾液腺癌,腎癌,前列腺癌,外陰癌,甲狀腺癌,肝癌,肛門癌,陰莖癌,陰囊癌,食道癌,膽道腫瘤,以及頭和頸部的癌。
            術語“有效量”指對患者疾病有效的藥物量。當所述疾病是癌癥時,藥物的有效量可以減少癌細胞的數目;減少腫瘤大小;抑制(即,在某種程度上延緩并且優選終止)癌細胞浸潤入外周器官;抑制(即,在某種程度上延緩并且優選終止)腫瘤轉移;在某種程度上抑制腫瘤生長;和/或在某種程度上減輕一種或多種與癌癥相關聯的癥狀。在藥物可以阻止癌細胞生長和/或殺死現存癌細胞的程度上,它可以是抑制細胞生長的和/或細胞毒性的。所述有效量可以延長進程自由存活,導致產生目標反應(包括部分反應,PR,或完全反應,CR),提高整體存活時間,和/或改善癌癥的一種或多種癥狀。
            “表達HER2的癌癥”是包含具有HER2蛋白存在于其細胞表面上的細胞的癌癥。
            “過表達”HER受體的癌癥是這樣一種癌癥,其與相同組織類型的非癌細胞相比,在其細胞表面具有顯著更高水平的HER受體,如HER2。這種過表達可能是由基因擴增或由增強的轉錄或翻譯而引起的。HER受體過表達可以在診斷性或預后性測定中通過評估存在于細胞表面上的HER蛋白質的水平提高而進行測定(例如通過免疫組化測定;IHC)。或者,或此外,可以通過例如熒光原位雜交(FISH;參見1998年10月公開的WO98/45479),DNA印跡,或聚合酶鏈式反應(PCR)技術,如定時定量PCR(RT-PCR)測量編碼HER的核酸在細胞中的水平。還可以通過測量在生物液如血清中滲出的抗原來研究HER受體過表達(參見,例如,1990-06-12發布的美國專利號4,933,294;1991-04-18公開的WO91/05264;1995-03-28發布的美國專利5,401,638;和Sias等人J.Immunol. Methods 13273-80(1990))。除了以上測定之外,熟練專業人員還可利用各種體內測定法。例如,可以將患者體內的細胞暴露于抗體,所述抗體任選地標記了可檢測標記,例如放射性同位素,并且可以通過例如外部掃描放射性或通過分析取自先前暴露于抗體的患者的活檢組織來評估抗體與患者體內細胞的結合。
            相反,“不過表達HER2受體”的癌癥是這樣一種癌癥,其與相同組織類型的非癌細胞相比,并不會表達高于正常水平的HER2受體。
            “過表達”HER配體的癌癥是這樣一種癌癥,其與相同組織類型的非癌細胞相比,產生顯著更高水平的該配體。這種過表達可能是由基因擴增或由增強的轉錄或翻譯引起的。可以通過評估患者體內配體(或編碼它的核酸)的水平來診斷性確定HER配體的過表達,例如在腫瘤活檢組織中或通過各種診斷性測定法如IHC,FISH,DNA印跡,PCR或上述的體內測定法來進行。
            本文中所用的術語“細胞毒制劑”指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質。該術語旨在包括放射性核素(例如At211,I131,I125,Y90,Re186,Re188,Sm153,Bi212,P32和镥的放射性同位素),化療劑,和毒素如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素,包括其片段和/或變體。
            “化療劑”是可用于治療癌癥的化學化合物。化療劑的實例包括烷化劑,如噻替哌(thiotepa)和環膦酰胺(cyclosphamide)(CYTOXAN);烷基磺酸酯如白消安(busulfan),英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶如benaodopa,卡波醌(carboquone),美妥替哌(meturedopa)和尿烷亞胺(uredopa);乙撐亞胺和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine),三亞乙基蜜胺(triethylenemelamine),三亞乙基磷酰胺,三亞乙基硫代磷酰胺和三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine);acetogenins(特別是bullatacin和bullatacinone);delta-9-四氫大麻酚(dronabinol,MARINOL);beta-拉帕酮;拉帕醇;colchicines;白樺脂酸;喜樹堿(包括合成的類似物拓撲替康(topotecan));CPT-11(依立替康,CAMPTOSAR);乙酰基喜樹堿,東莨菪甙元,和9-氨基喜樹堿);苔蘚抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物);鬼臼毒素;鬼臼樹酸;替尼泊甙;cryptophycins(特別是cryptophycin 1和cryptophycin 8);海兔毒素(dolastatin);duocarmycin(包括合成類似物,KW-2189和CBI-TMI);eleutherobin;pancratistatin;sarcodictyin;spongistatin;氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥,萘氮芥,膽磷酰胺(cholophosphamide),雌氮芥(estramustine),異環磷酰胺(ifosfamide),氮芥(mechlorethamine),鹽酸氧氮芥左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan),新氮芥(novembichin),膽甾醇苯乙酸氮芥,松龍苯芥(prednimustine),曲磷胺(trofosfamide),尿嘧啶氮芥;亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine),氯脲菌素(chlorozotocin),福莫司汀(fotemustine),洛莫司汀(lomustine),尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素如烯二醇抗生素(如加利車霉素,尤其是加利車霉素γ1和加利車霉素ω1,參見例如Agnew Chem Intl.Ed.Engl.33183-186(1994);dynemicin,包括dynemicinA;esperamicin;以及新制癌菌素生色團(chromophore)和相關的色蛋白enediyne抗生素生色團),阿克拉霉素,放線菌素,authramycin,重氮絲氨酸,博來霉素,放線菌素C(cactinomycin),carabicin,洋紅霉素(carminomycin),嗜癌素(carzinophilin),色霉素,放線菌素D,柔紅菌素(daunorubicin),地托比星(detorubicin),6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸,阿霉素(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN,嗎啉代-阿霉素,氰基嗎啉代-阿霉素,2-吡咯啉基-阿霉素,阿霉素HCl脂質體注射液(DOXIL),脂質體阿霉素TLC D-99(MYOCET),聚乙二醇化的脂質體阿霉素(CAELYX),和脫氧阿霉素),表阿霉素(epirubicin),依索比星(esorubicin),伊達比星(idarubicin),發波霉素(marcellomycin),絲裂霉素如絲裂霉素C,霉酚酸,諾加霉素(nogalamycin),橄欖霉素(olivomycin),培洛霉素(peplomycin),potfiromycin,嘌呤霉素,三鐵阿霉素(quelamycin),羅多比星(rodorubicin),鏈黑菌素;鏈脲霉素(streptozocin),殺結核菌素,烏苯美司(ubenimex),凈司他丁(zinostatin),佐柔比星(zorubicin);抗代謝藥如氨甲蝶呤,5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物,如二甲葉酸(denopterin),氨甲蝶呤,蝶羅呤,三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤類似物如氟達拉濱(fludarabine),6-巰基嘌呤,硫咪嘌呤,硫鳥嘌呤;嘧啶類似物,如安西他濱(ancitabine),阿扎胞苷(azacitidine),6-氮尿苷,卡莫氟(carmofur),阿糖胞苷,雙脫氧尿苷,去氟氧尿苷(doxifluridine),依諾他濱(enocitabine),氟尿苷;抗腎上腺類,如氨魯米特(aminoglutethimide),米托坦(mitotane),曲洛司坦(trilostane);葉酸補充劑如frolinic acid;醋葡內酯;醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid);安吖啶(amsacrine);bestrabucil;比生群(biasntrene);依達曲沙(edatraxate);地磷酰胺(defofamine);秋水仙胺;地吖醌(diaziquone);elfornithine;依利醋銨(elliptinium acetate);epothilone;依托格魯(etoglucid);硝酸鎵;羥基脲;香菇多糖(lentinan);氯尼達明(lonidamine);美登木素生物堿(maytansinoids)(包括美登素和柄型菌素)米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌達醇(mopidamol);硝呋旦(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);鬼臼樹酸(podophyllinic acid);2-乙基酰肼;丙卡巴肼(procarbazine);PSK多糖復合物(JHS Natural Products,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);rhizoxin;西索菲蘭(sizofiran);鍺螺胺(spirogerrnanium);細交鏈孢菌酮酸;三亞胺醌;2,2′,2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine);單端孢霉烯族毒素類(尤其是T-2毒素,verracurinA,桿孢菌素A,蛇形菌素(anguidine));烏拉坦(urethan);達卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥;二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛矛醇;哌泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿拉伯糖苷(“Ara-C”);三胺硫磷(thiotepa);紫杉烷(taxoid),如紫杉醇(TAXOL,紫杉醇的白蛋白改造納米顆粒制劑(ABRAXANETM),和紫杉萜(TAXOTERE);chloranbucil;6-硫代鳥嘌呤;巰基嘌呤;氨甲蝶呤;鉑類藥劑如順鉑,奧沙利鉑和卡鉑;長春花堿,其阻止微管蛋白聚合作用形成微管,包括長春堿(VELBAN),長春新堿(ONCOVIN),長春地辛(ELDISINE,FILDESIN),和長春瑞賓(NAVELBINE);依托泊甙(etoposide)(VP-16);異環磷酰胺;米托蒽醌;leucovovin;諾安托(novantrone);依達曲沙;柔紅霉素;氨基蝶呤;伊拜膦酸鹽;拓撲異構酶抑制劑RFS2000,二氟甲基鳥氨酸(DMFO);視黃醛如維甲酸,包括bexarotene(TARGRETIN);二膦酸鹽如氯甲雙磷酸鹽(例如,BONEFOS或OSTAC),依替膦酸鈉(DIDROCAL),NE-58095,唑來膦酸(zoledronic acid)/zoledronate(ZOMETA),阿侖膦酸鈉(FOSAMAX),帕米膦酸鈉(AREDIA),替魯膦酸鹽(SKELID),或利塞膦酸鹽(ACTONEL);曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊烷核苷胞核嘧啶類似物);反義寡核苷酸,特別是那些抑制在涉及失控細胞增殖的信號途徑中的基因表達的反義寡核苷酸,如,例如,PKC-α,Raf,H-Ras,和表皮生長因子受體(EGF-R);疫苗如THERATOPE疫苗和基因治療疫苗,例如,ALLOVECTIN疫苗,LEUVECTIN疫苗,和VAXID疫苗;拓撲異構酶1抑制劑(例如,LURTOTECAN);rmRH(例如,ABARELIX);BAY439006(sorafenib;Bayer);SU-11248(Pfizer);哌立福辛(perifosine),COX-2抑制劑(例如塞來考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib)),蛋白體抑制劑(例如PS341);bortezomib(VELCADE);CCI-779;tipifarnib(R11577);orafenib,ABT510;Bcl-2抑制劑如oblimersen sodium(GENASENSE);pixantrone;EGFR抑制劑(參見下面的定義);酪氨酸激酶抑制劑(參見下面的定義);和可藥用的鹽,酸或任何上述藥劑的衍生物;以及以上藥劑中的兩種或多種的組合,如CHOP,環磷酰胺,阿霉素,長春新堿和脫氫皮質醇的組合療法的縮寫,以及FOLFOX,用奧沙利鉑(ELOXATINTM)結合5-FU和leucovovin的治療方案的縮寫。
            這一定義還包括作用來調節或抑制激素對腫瘤作用的抗激素劑,如具有混合激動劑/拮抗劑模式的抗雌激素劑,包括,他莫昔芬(NOLVADEX),4-羥基他莫昔芬,托瑞米芬(FARESTON),碘昔芬,屈洛昔芬,雷洛昔芬(EVISTA),曲沃昔芬,keoxifene,和選擇性雌激素受體調節劑(SERMs)如SERM3;無激動劑特性的純抗雌激素劑如fulvestrant(FASLODEX),和EM800(這種藥劑可以阻抑雌激素受體(ER)二聚作用,抑制DNA結合,增強ER更新,和/或抑制ER水平);芳香酶抑制劑,包括甾族芳香酶抑抑制劑如福美司坦和依西美坦(exemestane)(AROMASIN),和非甾族芳香酶抑制劑如阿納托唑(ARIMIDEX),來曲唑(FEMARA)和氨魯米特,和其它芳香酶抑制劑包括伏氯唑(vorozole)(RIVISOR),甲地孕酮醋酸鹽(MEGASE),fadrozole,咪唑;促黃體激素釋放激素激動劑,包括亮丙瑞林(LUPRON和ELIGARD),戈舍瑞林,布舍瑞林,和tripterelin;性類固醇,包括孕激素如甲地孕酮醋酸鹽和甲羥孕酮醋酸鹽,雌激素如己烯雌酚和普雷馬林(premarin),和雄性激素/視黃醛如氟甲睪酮,所有的transretionicacid和芬維A胺;奧那司酮(onapristone);抗黃體酮劑;雌激素受體下調劑(ERDs);抗雄性激素如氟他胺,尼魯米特和比卡魯胺(bicalutamide);睪丸酮;和可藥用的鹽,酸或任何上述藥劑的衍生物;以及以上藥劑中的兩種或多種的組合。
            如本文所用的,術語“EGFR靶向藥物”指結合EGFR并且,任選地,抑制EGFR激活的治療劑。這種制劑的實例包括結合EGFR的抗體和小分子。結合EGFR的抗體的實例包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506),MAb 455(ATCC CRL HB8507),MAb 225(ATCC CRL 8508),MAb 528(ATCC CRL8509)(參見,美國專利號4,943,533,Mendelsohn等人)及其變體,如嵌合的225(C225或Cetuximab;ERBUTIX)和重構的人225(H225)(參見,WO96/40210,Imclone Systems Inc.);結合II型突變體EGFR的抗體(美國專利號5,212,290);結合EGFR的人源化和嵌合抗體,如美國專利號5,891,996中所述;和結合EGFR的人抗體,如ABX-EGF(參見WO98/50433,Abgenix)。抗EGFR抗體可以綴合以細胞毒性劑,由此生成免疫綴合物(參見,例如,EP659,439A2,Merck Patent GmbH)。結合EGFR的小分子實例包括ZD1839或Gefitinib(IRESSATM;Astra Zeneca),CP-358774或Erlotinib HCL(TARCEVATM;Genentech/OSI)和AG1478,AG1571(SU 5271;Sugen)。
            “酪氨酸激酶抑制劑”是在某種程度上抑制酪氨酸激酶如HER受體的酪氨酸激酶活性的分子。這類抑制劑的實例包括在前段落中提到的EGFR靶向藥物以及小分子HER2酪氨酸激酶抑制劑如可獲自Takeda的TAK165,雙-HER抑制劑如優選結合EGFR但抑制HER2和EGFR-過表達細胞的EKB-569(可獲自Wyeth),口服HER2GW572016(可獲自Glaxo)和EGFR酪氨酸激酶抑制劑,和PKI-166(可獲自Novartis);pan-HER抑制劑如canertinib(CI-1033;Pharmacia);Raf-1抑制劑如可獲自ISIS Pharmaceuticals的反義試劑ISIS-5132,其抑制Raf-1信號過程;非-HER靶向TK抑制劑如Imatinib甲磺酸鹽(GleevacTM),可獲自Glaxo;MAPK細胞外調節的激酶I抑制劑CI-1040(可獲自Pharmacia);喹唑啉,如PD 153035,4-(3-氯苯胺)喹唑啉;pyridopyrimidines;pyrimidopyrimidines;pyrrolopyrimidines,如CGP 59326,CGP 60261和CGP 62706;pyrazolopyrimidines,4-(苯氨基)-7H-吡咯基[2,3-d]嘧啶;姜黃素(diferuloyl甲烷,4,5-二(4-對氟苯胺)鄰苯二甲酰亞胺);包含硝基噻吩部分的tyrphostines;PD-0183805(Warner-Lamber);反義分子(例如結合HER-編碼核酸的那些);喹噁啉(美國專利號5,804,396);tryphostins(美國專利號5,804,396);ZD6474(Astra Zeneca);PTK-787(Novartis/Schering AG);pan-HER抑制劑如CI-1033(Pfizer);Affinitac(ISIS 3521;Isis/Lilly);Imatinib甲磺酸(Gleevac;Novartis);PKI 166(Novartis);GW2016(Glaxo SmithKline);CI-1033(Pfizer);EKB-569(Wyeth);Semaxinib(Sugen);ZD6474(AstraZeneca);PTK-787(Novartis/Schering AG);INC-1C11(Imclone);或下面任一個專利公開文本中所述的美國專利號5,804,396;WO99/09016(American Cyanimid);WO98/43960(American Cyanamid);WO97/38983(Warner Lambert);WO99/06378(Warner Lambert);WO99/06396(WarnerLambert);WO96/30347(Pfizer,Inc);WO96/33978(Zeneca);WO96/3397(Zeneca);和WO96/33980(Zeneca)。
            “抗血管生成劑”指在某種程度中阻抑或干擾血管形成的化合物。抗血管生成因子可以,例如,是結合參與促進血管生成的生長因子或生長因子受體的小分子或抗體。本文優選的抗血管生成因子是結合血管內皮生長因子(VEGF)的抗體,如Bevacizumab(AVASTIN)。
            術語“細胞因子”是由一個細胞群釋放的、作為細胞間介質作用于另一細胞的蛋白的總稱。這類細胞因子有淋巴因子,單核因子,和傳統的多肽激素。細胞因子包括生長激素,如人生長激素,N-甲二磺酰人生長激素,和牛生長激素;甲狀旁腺素;甲狀腺素;胰島素;前胰島素;松馳素;前松馳素;糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH),甲狀腺刺激素(TSH),促黃體(生成)激素(LH);肝細胞生長因子;成纖維細胞生長因子;催乳激素;胎盤催乳素;腫瘤壞死因子-α和β;苗勒管(mullerian)-抑制物;小鼠促性腺激素相關肽;抑制素;苯丙酸諾龍;血管內皮細胞生長因子;整合素;血小板生成素(TPO);神經生長因子如NGF-β;血小板生長因子;轉化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β;胰島素樣生長因子-I和-II;促紅細胞生成素(EPO);骨誘導因子(osteoinductive factors);干擾素如干擾素-α,-β,-γ;集落刺激因子(CSF)如巨噬細胞-CSF(M-CSF);粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF);粒細胞-CSF(G-CSF);白細胞介素(IL)如IL-1,IL-1α,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-9,IL-11,IL-12,IL-15;腫瘤壞死因子如TNF-α或TNF-β;和其它多肽因子包括LIF和kit配體(KL)。本文所用的術語細胞因子包括天然蛋白或來自重組細胞培養物的蛋白以及天然序列細胞因子的生物活性等效物。
            配制的抗體優選是基本上純的并且是基本上均一的(即不含污染性蛋白質等)。“基本上純的”抗體意指基于組合物的總重量,包括至少大約90%重量比的抗體的組合物,優選至少大約95%重量比。“基本上均一的”抗體意指基于組合物的總重量,包括至少大約99%重量比的抗體的組合物。
            本文的“B細胞表面標記”或“B細胞表面抗原”是在B細胞表面上表達的抗原,其可以用與其結合的抗體靶向。例示性的B細胞表面標記包括CD10,CD19,CD20,CD21,CD22,CD23,CD24,CD37,CD40,CD53,CD72,CD73,CD74,CDw75,CDw76,CD77,CDw78,CD79a,CD79b,CD80,CD81,CD82,CD83,CDw84,CD85和CD86白細胞表面標記(有關描述參見The Leukocyte Antigen Facts Book,2ndEdition.1997,ed.Barclay等人Academic Press,Harcourt Brace & Co.,New York)。其它B細胞表面標記包括RP105,FcRH2,B細胞CR2,CCR6,P2X5,HLA-DOB,CXCR5,FCER2,BR3,Btig,NAG14,SLGC16270,FcRH1,IRTA2,ATWD578,FcRH3,IRTA1,FcRH6,BCMA,和239287。與哺乳動物的其它非B細胞組織相比本文的特定目標B細胞表面標記優選在B細胞上表達,并且可以在前體B細胞和成熟B細胞上表達。本文的優選B細胞表面標準是CD20或BR3。
            “CD20”抗原,或“CD20”是大約35-kDa,非糖基化的磷蛋白,見于來自外周血或淋巴器官的超過90%的B細胞表面。CD20存在于正常的B細胞以及惡變的B細胞,但是并不在干細胞上表達。在文獻中CD20的其它名稱包括″B-淋巴細胞限制型抗原″和″Bp35″。CD20抗原在例如Clark等人Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 821766(1985)中進行了描述。
            僅僅對于本文的目的而言,“人源化2H7”指2H7抗體的人源化變體,所述2H7抗體的CDR序列公開于美國專利號5,500,362(圖5和6)中,特此將其并入本文作為參考。本文的人源化2H7抗體的實例包括WO2004/056312中所述的變體,以及其它變體,包括,但不限于2H7v16,2H7v31,2H7v73,2H7v75,2H7v96,2H7v114,2H7v115,2H7v116,2H7v138,2H7v477,2H7v375,等等,在此將WO2004/056312也并入本文作為參考。
            在一個實施方案中,人源化2H7抗體包含下列CDR序列中的一種,兩種,三種,四種,五種或六種CDR L1序列RASSSVSYXH其中X是M或L(SEQ ID No.67),例如SEQ ID No.57(圖18A),SEQ ID No.58的CDR L2序列(圖18A),CDR L3序列QQWXFNPPT其中X是S或A(SEQ ID No.68),例如SEQ ID No.59(圖1 8A),SEQ ID No.60的CDR H1序列(圖18B),AIYPGNGXTSYNQKFKG的CDR H2序列,其中X是D或A(SEQ IDNo.69),例如SEQ ID No.61(圖18B),和VVYYSXXYWYFDV的CDR H3序列,其中位置6上的X是N,A,Y,W或D,而位置7上的X是S或R(SEQ ID No.70),例如SEQ ID No.62(圖18B)。
            上面的CDR序列一般存在于人可變輕和可變重框架序列之內,如基本上人輕鏈κ亞基I(VL-I)的人共有FR殘基,和基本上人重鏈亞基III(VHIII)的人共有FR殘基。還參見WO 2004/056312(Lowman等人)。
            可變重區可以連接到人IgG鏈恒定區上,其中該區可以是,例如,IgG1或IgG3,包括天然序列和變體恒定區。
            在優選的實施方案中,這類抗體包含SEQ ID No.29的可變重結構域序列(v16,如圖18B中所示),任選地還包括SEQ ID No.26的可變輕結構域序列(v16,如圖18A中所示),其在位置56,100,和/或100a上任選地包含一個或多個氨基酸取代,例如D56A,N100A或N100Y,和/或可變重結構域中的S100aR,在可變輕結構域位置32和/或92上的一個或多個氨基酸取代,例如M32L和/或S92A。優選地,抗體是完整抗體,包括SEQ ID Nos.63或64的輕鏈氨基酸序列,和SEQ ID No.65,66,71或72的重鏈氨基酸序列。
            優選的人源化2H7抗體是ocrelizumab(Genentech)。
            本文的抗體可以進一步包含Fc區中的提高ADCC活性的至少一個氨基酸取代,如這樣一種氨基酸取代,其中氨基酸取代在位置298,333,和334上,優選S298A,E333A,和K334A,其利用重鏈殘基的Eu編號。還參見美國專利號6,737,056B1,Presta。
            這些抗體的任一種可以包含Fc區中的至少一個取代,其增強FcRn結合或血清半壽期,例如在重鏈位置434上的取代,如N434W。還參見美國專利號6,737,056B1,Presta。
            這些抗體的任一種可以包含Fc區中的至少一個氨基酸取代,其增強CDC活性,例如,至少包含位置326上的取代,優選K326A或K326W。還參見美國專利號6,528,624B1(Idusogie等人)。
            一些優選的人源化2H7變體是那些包括SEQ ID No.26的可變輕結構域和SEQ ID No.29的可變重結構域的變體,包括在Fc區(如果存在的話)中有或無取代的變體,以及那些包括在SEQ ID No.29中具有取代N100A;或D56A和N100A;或D56A,N100Y,和S100aR的可變重結構域以及在SEQ ID No.26中具有取代M32L;或S92A;或M32L和S92A的可變輕結構域的變體。
            已經將2H7v16的可變重鏈中的M34鑒定為抗體穩定性的潛在來源并且是另一種取代的潛在候選物。
            在本發明的一些優選實施方案的總結中,基于2H7v16的變體的可變區包含v16的氨基酸序列,但除了在下表中所指出的氨基酸取代位置之外。除非另外指定,2H7變體將與v16具有相同的輕鏈。
            例示性的人源化2H7抗體變體

            一種優選的人源化2H7包含2H7v16可變輕結構域序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID No.26);和2H7v16可變重結構域序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ IDNo.29).
            當所述人源化2H7v16抗體是完整抗體時,它可以包含輕鏈氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID No.63);和SEQ IDNo.65的重鏈氨基酸序列或EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ IDNo.71).
            另一種優選的人源化2H7抗體包含2H7v511可變輕結構域序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID No.73)和2H7v511可變重結構域序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ IDNo.74).
            當所述人源化2H7v511抗體是完整抗體時,它可以包含輕鏈氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID No.64)和SEQ ID No.66的重鏈氨基酸序列或EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ IDNo.72)。
            本文的“B田胞惡性瘤”包括非何杰金(Hodgkin’s)淋巴瘤(NHL),包括低級/濾泡NHL,小淋巴細胞(SL)NHL,中級/濾泡NHL,中級彌散性NHL,高級免疫母細胞NHL,高級淋巴母細胞NHL,高級小非凹陷性細胞NHL,bulky病NHL,套細胞淋巴瘤,AIDS-相關性淋巴瘤,和Waldenstrom’s巨球蛋白血癥;白血病,包括急性淋巴母細胞白血病(ALL),慢性淋巴母細胞白血病(CLL),毛細胞白血病和慢性髓母細胞白血病(chronic myeloblastic leukemia);和其它血液學惡性瘤。這些惡性瘤可以用抗B細胞表面標記,如CD20的抗體進行治療。
            如本文所用的術語“非何杰金氏淋巴瘤”或“NHL”,指除了何杰金氏淋巴瘤之外的淋巴細胞的癌癥。一般通過何杰金氏淋巴瘤中存在Reed-Sternberg細胞而非何杰金氏淋巴瘤中缺失所述細胞可以將何杰金氏淋巴瘤與非何杰金氏淋巴瘤區分開來。如本文所用的術語所包括的非何杰金氏淋巴瘤的實例包括任何可以由本領域技術人員(例如腫瘤學家或病理學者)按照本領域已知的分類方案來鑒定的疾病,所述分類方案如修訂的歐美淋巴瘤(European-American Lymphoma)(REAL)方案,描述于Color Atlas ofClinical Hematology,Third Edition;A.Victor Hoffbrand and John E.Pettit(eds.)(Harcourt Publishers Limited 2000)(具體參見圖11.57,11.58和/或11.59)。更具體的實例包括但不限于,復發性或難治性NHL,前線(front line)低級NHL,III/IV期NHL,化療耐受型NHL,前體B成淋巴細胞白血病和/或淋巴瘤,小淋巴細胞淋巴瘤,B細胞慢性淋巴細胞白血病和/或前淋巴細胞(prolymhocytic)白血病和/或小淋巴細胞淋巴瘤,B細胞前淋巴細胞淋巴瘤,免疫細胞瘤和/或淋巴漿細胞淋巴瘤,邊緣區B細胞淋巴瘤,脾邊緣區淋巴瘤,結節外邊緣區-MALT淋巴瘤,結節邊緣區淋巴瘤,毛狀細胞白血病,漿細胞瘤和/或漿細胞骨髓瘤,低級/濾泡淋巴瘤,中級/濾泡NHL,套細胞淋巴瘤,濾泡中心淋巴瘤(濾泡樣(follicular)),中級彌散型NHL,彌散型大B細胞淋巴瘤,浸潤性NHL(包括浸潤性前線NHL和浸潤性復發NHL),自體同源干細胞移植后復發性或難治性NHL,原發性縱隔大B細胞淋巴瘤,原發性滲出淋巴瘤,高級成免疫細胞NHL,高級成淋巴細胞NHL,高級小非凹陷性細胞NHL,bulky病NHL,Burkitt’s淋巴瘤,前體(外源)T細胞淋巴母細胞白血病和/或淋巴瘤,成人T細胞淋巴瘤和/或白血病,T細胞慢性淋巴細胞白血病和/或前淋巴細胞白血病,大顆粒淋巴細胞白血病,蕈樣肉芽腫病和/或Sezary綜合征,結節外天然殺傷/T細胞(鼻型)淋巴瘤,腸型T細胞淋巴瘤,肝脾型T細胞淋巴瘤,皮下脂膜炎樣T細胞淋巴瘤,皮膚淋巴瘤,間變性(anaplastic)大細胞淋巴瘤,血管中心性淋巴瘤,腸T細胞淋巴瘤,外周T細胞(未另外指定)淋巴瘤和血管免疫母細胞型T細胞淋巴瘤。
            在本文中“自身免疫疾病”是源自或針對個體自身組織或其共分離物或臨床表現,或緣自其病癥的疾病或紊亂。自身免疫疾病或紊亂的實例包括,但不限于關節炎(類風濕性關節炎,幼年型類風濕性關節炎,骨關節炎,銀屑病關節炎,和關節強硬性脊椎炎),銀屑病,皮炎包括特應性皮炎、慢性特發性蕁麻疹,包括慢性自身免疫蕁麻疹,多肌炎/皮肌炎,毒性表皮壞死溶離,硬皮病(包括系統性硬皮病),硬化癥如進行性系統硬化癥,炎性腸病(IBD)(例如,克羅恩氏病,潰瘍性結腸炎,自身免疫炎性腸病),壞疽性膿皮病,結節性紅斑,原發性硬化性膽管炎,鞏膜表層炎),呼吸窘迫綜合征,包括成人呼吸窘迫綜合征(ARDS),腦膜炎,IgE-介導的疾病如過敏性和變應性和特應性鼻炎,腦炎如Rasmussen氏腦炎、葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎,大腸炎如顯微鏡結腸炎和膠原樣結腸炎,血管球性腎炎(GN)如膜性GN(膜性腎病),先天性膜性腎病,膜性增生性GN(MPGN),包括I型和II型,和快速進展性GN,過敏疾病,過敏反應,濕疹,哮喘,涉及T細胞和慢性炎性反應的疾病,動脈粥樣硬化,自身免疫心肌炎,白血球粘著不足,系統性紅斑狼瘡(SLE)如皮膚SLE,亞急性皮膚紅斑狼瘡,狼瘡(包括腎炎型、大腦炎型、幼兒型、非腎型、平圓形、脫發型),幼兒型(I型)糖尿病,包括幼兒胰島素依賴型糖尿病(IDDM),成人糖尿病(II型糖尿病),多發性硬化癥(MS)如脊-眼(spino-optical)MS,由細胞因子和T-淋巴細胞介導的與急性和延遲性過敏癥相關聯的免疫反應,肺結核,結節病,肉芽腫病包括淋巴瘤樣肉芽腫病,韋格納肉芽腫病,粒細胞缺乏癥,脈管炎(包括大血管脈管炎(包括風濕性多肌痛和巨細胞(Takayasu’s)脈管炎),中血管脈管炎(包括川崎病和多發性結節性動脈炎),CNS脈管炎,全身壞死性脈管炎,和ANCA-相關性脈管炎,如Churg-Strauss脈管炎或綜合征(CSS)),顳動脈炎,再生障礙性貧血,Coombs陽性貧血,Diamond Blackfan貧血,溶血性貧血或免疫性溶血性貧血包括自身免疫性溶血性貧血(AIHA),惡性貧血,純紅細胞發育不全(PRCA),因子VIII缺乏癥,血友病A,自身免疫中性粒細胞減少癥,全血細胞減少,白血球減少癥,與白細胞滲出有關的疾病,CNS炎性疾病,多器官損傷綜合癥,抗原抗體復合物介導的疾病,抗腎小球基膜病,抗磷脂抗體綜合癥,過敏性神經炎,白塞病,Castleman綜合癥、Goodpasture綜合征、雷諾氏綜合癥、干燥綜合癥、滲出性多形性紅斑(Steven-Johnson syndrome)、類天皰瘡比如大皰性類天皰瘡、天皰瘡(包括尋常型天皰瘡(vulgaris),落葉型天皰瘡(foliaceus),和天皰瘡粘膜類天皰瘡(pemphigus mucus-membranepemphigoid)),自身免疫性多性發內分泌病,Reiter′氏病,免疫復合物性腎炎,慢性神經病如IgM多發性神經元炎或IgM介導的神經病,血小板減少癥(例如由心肌梗塞患者發展的),包括血栓性血小板減少性紫癜(TTP)和自身免疫性或免疫介導的血小板減少癥如特發性血小板減少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP,睪丸或卵巢的自身免疫疾病包括自身免疫睪丸炎和卵巢炎,原發性甲狀腺功能減退,甲狀旁腺機能減退,自身免疫內分泌疾病包括甲狀腺炎如自身免疫甲狀腺炎,慢性甲狀腺炎(Hashimoto’s甲狀腺炎),或亞急性甲狀腺炎,自身免疫性甲狀腺病,特發性甲狀腺機能減退,阿狄森氏病,Grave氏病,多腺綜合癥如自身免疫性多腺綜合癥(或多腺內分泌綜合癥),副腫瘤(paraneoplastic)綜合征,包括神經學腫瘤伴隨綜合征如Lambert-Eaton肌無力綜合征或Lambert-Eaton綜合征,僵人綜合癥,腦脊髓炎如變態反應性腦脊髓炎,重癥肌無力,小腦變性,邊緣系統和/或腦干腦炎,神經性肌強直,斜視眼陣攣或斜視肌陣攣綜合癥(OMS),和感覺性神經病,Sheehan綜合征,自身免疫肝炎,慢性肝炎,狼瘡樣肝炎,慢性活動型肝炎或自身免疫性慢性活動型肝炎,淋巴樣間質性肺炎(lymphoid interstitialpneumonitis)、閉塞性細支氣管炎(非移植物)相對于NSIP,Guillain-Barré綜合癥,Berger氏病(IgA腎病),原發性膽汁性肝硬變、口炎性腹瀉(麩質腸病),頑固性口炎性腹瀉、皰疹樣皮炎、冷球蛋白血癥、肌萎縮性側索硬化(ALS;Lou Gehrig氏病),冠狀動脈病,自身免疫性內耳疾病(AIED),或自身免疫性聽力損失、眼肌陣攣綜合癥(opsoclonus myoclonus syndrome)(OMS),多發性軟骨炎如頑固性多軟骨炎,肺泡蛋白沉積癥,淀粉樣變性,巨細胞性肝炎,鞏膜炎,非癌性淋巴細胞增多,原發性淋巴細胞增多,其包括單克隆B細胞性淋巴細胞增多(例如,良性單克隆丙種球蛋白病和意義未確定的單克隆丙種球蛋白病,MGUS),外周神經病,副腫瘤綜合征,神經通路疾病(channelopathies)如癲癇癥,偏頭痛,心律不齊,肌肉紊亂,聾,盲,周期性麻痹,和中樞神經系統神經通路疾病,孤獨癥,炎性肌病,局灶節段性腎小球硬化癥(FSGS),內分泌性眼病,葡萄膜視網膜炎(uveoretinitis),自身免疫性肝病,纖維肌痛,多發性內分泌失調,Schmidt氏綜合癥,腎上腺炎,胃萎縮,老年性癡呆,脫髓鞘病,心肌梗塞后綜合征(Dressler’s syndrome),脫發(alopecia)arcata,CREST綜合癥(鈣質沉著,雷諾現象,食管動力障礙(dysmotility),指端硬化,和毛細血管擴張),男性和女性自身免疫性不育,強直性脊柱炎,混合結締組織病,南美洲錐蟲病,風濕熱,反復流產,農民肺,多形性紅斑,心臟切開后綜合征,Cushing綜合征,鳥類愛好者(bird-fancier′s)肺,阿爾波特氏綜合征、肺泡炎如過敏性肺泡炎和纖維性肺泡炎,間質性肺病,輸血反應,麻風病,瘧疾,利什曼病,kypanosomiasis,血吸蟲病,蛔蟲病,曲菌病,Sampter氏綜合癥,Caplan綜合征,登革熱,心內膜炎,心內膜心肌纖維化,內眼炎,erythema elevatum et diutinum,胎兒成紅細胞增多癥(erythroblastosis fetalis),嗜酸性粒細胞筋膜炎(eosinophilicfaciitis),Shulman綜合癥,Felty綜合征,flariasis,睫狀體炎比如慢性睫狀體炎,異時性睫狀體炎,或Fuch睫狀體炎,Henoch-Schonlein紫癜,人免疫缺陷病毒(HIV)感染,埃可病毒感染,心肌病,阿爾茨海默氏病,細小病毒感染,風疹病毒感染,免疫接種后綜合癥,先天性風疹感染,Epstein-Barr病毒感染,腮腺炎,Evan氏綜合癥,自身免疫性腺功能不良,Sydenham舞蹈病,鏈球菌感染后腎炎,閉塞性血栓性脈管炎,甲狀腺毒癥(thyrotoxicosis),脊髓癆(tabes dorsalis),和巨細胞多肌痛。
            本文的“腫瘤壞死因子受體超家族”或“TNF受體超家族”指被TNF家族的細胞因子結合的受體多肽。一般,這些受體是在其細胞外結構域中具有一個或多個半胱氨酸富集重復序列的I型跨膜受體。TNF受體超家族可以進一步細分成(1)死亡受體;(2)誘餌(decoy)受體;和(3)缺失死亡結構域的信號受體。“死亡受體”在其細胞質或細胞內區中包含“死亡結構域”,即作用來在細胞中轉導能夠導致凋亡或某些基因的誘導的信號的區域或序列。“誘餌受體”缺失功能性死亡結構域并且不能轉導導致凋亡的信號。TNF基因家族中的細胞因子的實例包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α),腫瘤壞死因子-β(TNF-beta或淋巴毒素),CD30配體,CD27配體,CD40配體,OX-40配體,4-1BB配體,Apo-1配體(也稱作Fas配體或CD95配體),Apo-2配體(也稱作TRAIL),Apo-3配體(也稱作TWEAK),護骨蛋白(osteoprotegerin)(OPG),APRIL,RANK配體(也稱作TRANCE),和TALL-1(也稱作BlyS,BAFF或THANK)。TNF受體超家族中的受體的實例包括1型腫瘤壞死因子受體(TNFR1),2型腫瘤壞死因子受體(TNFR2),p75神經生長因子受體(NGFR),B細胞表面抗原CD40,T細胞抗原OX-40,Apo-1受體(也稱作Fas或CD95),Apo-3受體(也稱作DR3,swl-1,TRAMP和LARD),稱作“跨膜激活劑和CAML-互作劑”或“TACI”的受體,BCMA蛋白質,DR4,DR5(或者稱作Apo-2;TRAIL-R2,TR6,Tango-63,hAPO8,TRICK2或KILLER),DR6,DcR1(也稱作TRID,LIT或TRAIL-R3),DcR2(也稱作TRAIL-R4或TRUNDD),OPG,DcR3(也稱作TR6或M68),CAR1,HVEM(也稱作ATAR或TR2),GITR,ZTNFR-5,NTR-1,TNFL1,CD30,淋巴毒素β受體(LTBr),4-1BB受體和TR9(EP988,371A1)。
            術語“Apo-2配體”,“Apo-2L”,“Apo2L”,Apo-2配體/TRAIL”和“TRAIL”在本文中可以互換使用,指包括圖24(SEQ ID No.46)中所示氨基酸序列的氨基酸殘基114-281的多肽序列,包括95-281,包括殘基92-281,包括殘基91-281,包括殘基41-281,包括殘基39-281,包括殘基15-281,或包括殘基1-281,以及以上序列的生物學活性片段,刪除,插入,和/或取代變體。在一個實施方案中,所述多肽序列包含圖24(SEQ ID No.46)的殘基114-281。任選地,所述多肽序列包含圖24(SEQ ID No.46)的殘基92-281或殘基91-281。Apo-2L多肽可以由圖24(SEQ ID No.45)中所示的天然核苷酸序列編碼。任選地,編碼殘基Pro119 (圖24;SEQ ID No.45)的密碼子可以是“CCT”或“CCG”。任選地,所述片段或變體是具有生物學活性的并且具有與任一種以上序列至少大約80%氨基酸序列同一性,或至少大約90%序列同一性,或至少95%,96%,97%,98%,或99%序列同一性。該定義包括Apo-2配體的取代變體,其中它的天然氨基酸中的至少一個被其它氨基酸如丙氨酸殘基所取代。該定義還包括分離自Apo-2配體來源或通過重組和/或合成方法制備的天然序列Apo-2配體。本發明的Apo-2配體包括在1997-01-16公布的WO97/01633,1997-07-17公布的WO97/25428,公布的July 22,1999-07-22公布的WO 99/36535,2001-01-04公布的WO 01/00832,2002-02-07公布的WO 02/09755,2000-12-14公布的WO 00/75191,和2000-02-29發布的美國專利號6,030,945中公開的稱作Apo-2配體或TRAIL的多肽。該術語一般用來指包括多肽的單體,二聚體,三聚體,六聚體或高度寡聚體形式。除非另外特別聲明,所用提及Apo-2L序列的氨基酸殘基的編號都使用根據圖24(SEQ ID No.46)的編號。
            “Apo-2配體受體”包括本領域稱作“DR4”和“DR5”的受體。Pan等人描述了稱作″DR4″的TNF受體家族成員(Pan等人,Science,276111-113(1997);還參見1998-07-30公開的WO98/32856;1999-07-29公開的WO 99/37684;2000-12-07公開的WO 00/73349;2002-08-13發布的US 6,433,147;2002-10-08發布的US 6,461,823,和2002-01-29發布的US 6,342,383)。Sheridan等人,Science,277818-821(1997)和Pan等人,Science,277815-818(1997)描述了Apo2L/TRAIL的另一種受體(還參見,1998-11-19公開的WO98/51793;1998-09-24公開的WO98/41629)。這種受體稱作DR5(或者該受體還被稱作Apo-2;TRAIL-R,TR6,Tango-63,hAPO8,TRICK2或KILLER;Screaton等人,Curr.Biol.,7693-696(1997);Walczak等人,EMBO J.,165386-5387(1997);Wu等人,Nature Genetics,17141-143(1997);1998-08-20公開的WO98/35986;1998-10-14公開的EP870,827;1998-10-22公開的WO98/46643;1999-01-21公開的WO99/02653;1999-02-25公開的WO99/09165;1999-03-11公開的WO99/11791;2002-08-13公開的US2002/0072091;2001-12-07公開的US 2002/0098550;2001-12-06發布的US6,313,269;2001-08-02公開的US 2001/0010924;2003-07-03公開的US2003/01255540;2002-10-31公開的US 2002/0160446,2002-04-25公開的US 2002/0048785;2003-05-27發布的US 6,569,642,2000-06-06發布的US6,072,047,2003-11-04發布的US 6,642,358)。如上所述,Apo-2L的其它受體包括DcR1,DcR2,和OPG。當在本文中使用時術語“Apo-2L受體”包括天然序列受體和受體變體。這些術語包括在許多哺乳動物,包括人中表達的Apo-2L受體。Apo-2L受體可以如在許多人組織種系中天然發生的那樣進行內源表達,或者可以通過重組或合成方法進行表達。“天然序列Apo-2L受體”包含具有與衍生自天然的Apo-2L受體相同的氨基酸序列的多肽。因而,天然序列Apo-2L受體可以具有來自任何哺乳動物,包括人的天然發生的Apo-2L受體的氨基酸序列。這種天然序列Apo-2L受體可以分離自天然或者能夠通過重組或合成方法產生。術語“天然序列Apo-2L受體”具體包括天然發生的截短或分泌形式的受體(例如,包含,例如,細胞外結構域序列可溶形式),天然發生的變體形式(例如,其它剪切形式)和天然發生的等位基因變體。受體變體可以包括天然序列Apo-2L受體的片段或刪除突變體。圖25A-C顯示1998-11-19在WO 98/51793中公開的人DR5受體的411氨基酸序列,及其核苷酸序列(SEQ ID Nos.47和48)。人DR5受體的轉錄剪切變體是本領域已知的。這種剪切變體編碼圖26A-C中所示的人DR5受體的440氨基酸序列,及其核苷酸序列(SEQ ID Nos.49 and 50),如1998-08-20在WO 98/35986中所公開的。
            本文中所用的“死亡受體抗體”一般指針對腫瘤壞死因子受體超家族中的受體,并且包含能夠產生凋亡信號的死亡結構域的抗體,這類抗體包括DR5抗體和DR4抗體。
            以寬泛的意義使用“DR5受體抗體”,“DR5抗體”,或“抗DR5抗體”來意指結合至少一種形式的DR5受體或其細胞外結構域的抗體。任選地DR5抗體融合或連接到異源序列或分子上。優選地所述異源序列允許或有助于抗體形成較高級或寡聚復合物。任選地,DR5抗體結合DR5受體但不結合或與任何其它Apo-2L受體(例如DR4,DcR1,或DcR2)交叉反應。任選地抗體是DR5信號活性的激動劑。
            任選地,如在BIAcore結合測定中所測量的,本發明的DR5抗體在大約0.1nM到大約20mM的濃度范圍上結合DR5受體。任選地,如在BIAcore結合測定中所測量的,本發明的DR5抗體顯示大約0.6nM到大約18mM的IC50值。
            僅僅對于本文的目的而言,術語“Apomab”指結合DR5并且包含SEQ IDNos.55和56的可變重和可變輕氨基酸序列的激動劑抗體。優選地Apomab分別包含SEQ ID Nos.51和52的重和輕鏈。
            II.抗體的生產可以根據本發明配制的抗體的生產技術如下。
            (i)抗原篩選和制備優選地,抗體結合的抗原是生物學上重要的糖蛋白并且將抗體施用給患疾病或病癥的哺乳動物可以帶來哺乳動物的治療益處。不過,也考慮了針對非多肽抗原(如腫瘤相關糖脂抗原,見美國專利5,091,178)的抗體。
            在抗原是多肽時,其可以是跨膜分子(例如受體)或配體例如生長因子等。抗原的實例包括如腎素等分子;生長激素,包括人生長激素和牛生長激素;生長激素釋放因子;甲狀旁腺激素;甲狀腺刺激激素;脂蛋白;α-1-抗胰蛋白酶;胰島素A-鏈;胰島素-B鏈;前胰島素;卵泡刺激激素;降鈣素;黃體激素;胰高血糖素;因子VIIIC、因子IX、組織因子(TF)和yonWillebrands因子等凝血因子;蛋白C等抗凝血因子;心房利鈉因子;肺表面活性物質;纖溶酶原激活劑,例如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活劑(t-PA);蛙皮素;凝血酶;造血生長因子;腫瘤壞死因子α和β;腦啡肽酶;RANTES(調節對T細胞表達和分泌的正常激活);人巨噬細胞炎癥蛋白(MIP-1-α);血清白蛋白,例如人血清白蛋白;苗勒管(Muellerian)抑制物質;松弛素A鏈;松弛素B鏈;前松弛素;小鼠絨毛膜促性腺激素相關肽;微生物蛋白,例如β內酰胺酶;DNase;IgE;細胞毒T淋巴細胞相關抗原(CTLA),例如CTLA-4;抑制素(inhibin);激活素(activin);血管內皮生長因子(VEGF);激素或生長因子的受體;蛋白A或D;類風濕因子;神經營養因子,例如骨衍生神經營養因子(BDNF),神經營養素-3、-4、-5或6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神經生長因子,例如NGF-β;血小板衍生的生長因子(PDGF);纖維母細胞生長因子,例如aFGF和bFGF;表皮生長因子(EGF);轉化型生長因子(TGF),例如TGF-α和TGF-β,包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5;胰島素樣生長因子I和II(IGF-I和IGF-II);des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I),胰島素樣生長因子結合蛋白;CD蛋白,例如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20;促紅細胞生成素;骨誘導因子(osteoinductivefactor);免疫毒素;骨形態發生(morphogenetic)蛋白(BMP);干擾素,例如干擾素-α、-β和γ;集落刺激因子(CSF),例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF;白細胞介素(IL),例如IL-1到IL-10;超氧化物歧化酶;T細胞受體;表面膜蛋白;衰變(decay)加速因子;病毒抗原,例如AIDS包膜的一部分;轉運蛋白;歸巢受體;粘著素;調節蛋白;整合素,例如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM;腫瘤相關抗原,例如HER2、HER3或HER4受體;以及上述任何多肽的片段。
            本發明所包含的抗體的例示性分子靶標包括CD蛋白質如CD3,CD4,CD8,CD19,CD20,CD22,CD34和CD40;ErbB受體家族的成員如EGF受體,HER2,HER3或HER4受體;B細胞表面抗原,如CD20或BR3;腫瘤壞死受體超家族的成員,包括DR5;前列腺干細胞抗原(PSCA);細胞粘附分子如LFA-1,Mac1,p150.95,VLA-4,ICAM-1,VCAM,α4/β7整合素,和αv/β3整合素包括其α或β亞基(例如抗CD11a,抗CD18或抗CD11b抗體);生長因子如VEGF及其受體;組織因子(TF);腫瘤壞死因子(TNF)如TNF-α或TNF-β,α干擾素(α-IFN);白介素,如IL-8;IgE;血液組抗原;flk2/flt3受體;肥胖癥(OB)受體;mpl受體;CTLA-4;蛋白質C等等。
            可以將可溶性抗原或其片段,任選地偶聯到其它分子上,用作產生抗體的免疫原。對于跨膜分子,如受體,可以將這些的片段(例如受體的細胞外結構域)用作免疫原。或者,可以將表達跨膜分子的細胞用作免疫原。這類細胞可以來自天然來源(例如癌細胞系)或者可以是通過重組技術進行轉化來表達跨膜分子的細胞。可以用于制備抗體的其它抗原及其各種形式對于本領域技術人員來說將是顯而易見的。
            為產生HER2抗體,用于其生產的HER2抗原可以是,例如,HER2或其部分的細胞外結構域的可溶形式,其包含所需的表位。或者,可以使用在其細胞表面表達HER2的細胞(例如過表達HER2的經轉化的NIH-3T3細胞;或癌細胞系如SK-BR-3細胞,參見Stancovski等人PNAS(USA)888691-8695(1991))來生成抗體。
            (ii)單克隆抗體單克隆抗體獲自一群基本上同質的抗體,即,包含該群的單個抗體是相同的和/或結合相同的表位,除了可以在單克隆抗體生產期間生成的可能的變體。因而,修飾語“單克隆”表明抗體并非不同抗體組合物的特性。
            例如,可以利用Kohler,自然256495(1975)首次描述的雜交瘤方法或者可以通過重組DNA方法(美國專利號4816567)制備單克隆抗體。
            在雜交瘤方法中,按上述方法免疫小鼠或其它適當的宿主動物,例如倉鼠,來誘導出產生或能夠產生抗體的淋巴細胞,所述抗體可與免疫中應用的蛋白特異性結合。或者,可以將淋巴細胞在體外進行免疫,然后,用聚乙二醇等適當的融合劑將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合,形成雜交瘤細胞(Goding,單克隆抗體原理與應用,pp.59-103(Academic Press,1986))。
            在適當的培養基中接種并培養如此制備的雜交瘤細胞,所述培養基優選包括一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的物質。例如,如果親本骨髓瘤細胞缺少次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT),那么用于雜交瘤的所述培養基通常包括次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培養基),這些物質可防止HGPRT缺陷型細胞的生長。
            優選的骨髓瘤細胞是那些可有效融合、支持所選抗體產生細胞穩定產生高水平抗體、并且對HAT等培養基敏感的骨髓瘤細胞。其中,優選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤細胞系,例如來源于MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤的細胞系(得自Salk Institute Cell Distribution Center,圣迭戈,加利福尼亞,美國)和SP-2或X63-Ag8-653細胞(美國典型培養物保藏中心,Rockville,馬里蘭,美國)。還有報道將人雜交瘤細胞和小鼠-人異質性雜交瘤細胞系用于制備人單克隆抗體(Kozbor,免疫學雜志,1333001(1984);Brodeur等,單克隆抗體制備技術和應用,51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,紐約,1987))。
            測定雜交瘤細胞生長培養基中針對所述抗原的單克隆抗體的產生。優選地,通過免疫沉淀或體外結合試驗,例如放射免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附試驗(ELISA),測定由雜交瘤細胞產生的單克隆抗體的結合特異性。
            單克隆抗體的結合親和性可以,例如,通過Munson等人,Anal.Biochem.,107220(1980)的Scatchard分析進行測定。
            在產生具有所需的特異性、親和力和/或活性之抗體的雜交瘤細胞被鑒定之后,可以通過有限稀釋方法將所述克隆進行亞克隆,并通過標準方法進行培養(Goding,單克隆抗體原理和應用,pp.59-103,Academic Press,1986))。用于此目的的適當培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。另外,雜交瘤細胞可以在動物體內生長形成腹水瘤。
            通過常規免疫球蛋白純化方法,例如蛋白A-Sepharose,羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析,將亞克隆分泌的單克隆抗體從培養基、腹水或血清中適當分離。
            用傳統的方法可容易地分離編碼單克隆抗體的DNA并測定其序列(例如,利用能夠與編碼單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)。所述雜交瘤細胞可作為此類DNA的優選來源。所述DNA一經分離,將其連接入表達載體,然后將載體轉化入宿主細胞,例如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞,在重組宿主細胞中合成單克隆抗體。有關在細菌中重組表達編碼抗體的DNA的綜述性論文包括Skerra等人,Curr.Opinion in Immunol.,5256-262(1993)和Plückthun,Immunol.Revs.,130151-188(1992)。
            在另一個實施方案中,單克隆抗體或抗體片段可以從抗體噬菌體文庫中分離,所述抗體噬菌體文庫用在McCafferty等,自然348552-554中所述技術制備。Clackson等,自然352624-628(1991)和Marks等,生物化學雜志222581-597(1991)分別敘述了利用噬菌體文庫對鼠和人的抗體的分離。隨后的文獻敘述了高親和力(nM范圍)人抗體的產生,其通過鏈改組(chain shuffling)(Marks等,生物/技術,10779-783(1992))以及組合感染和體內重組作為構建很大的噬菌體文庫的策略(Waterhouse等,核酸研究,212265-2266(1993))。因此,對于單克隆抗體的分離,這些技術是傳統的單克隆抗體雜交瘤技術的可替代方法。
            也可以對DNA進行修飾,例如,用編碼人重鏈和輕鏈恒定區的序列取代其鼠同源序列(美國專利號4816567;Morrison等,美國國家科學院院刊816851(1984)),或通過將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列共價連接至免疫球蛋白的編碼序列。
            通常這類免疫球蛋白多肽取代抗體恒定區,或取代抗體的一個抗原結合位點的可變區已產生嵌合型二價抗體,其包括一個特異性針對一種抗原的抗原結合位點,和具有針對不同抗原的特異性的另一個抗原結合位點。
            (iii)人源化抗體本領域已經描述了人源化非人抗體的方法。優選地,人源化抗體具有一個或多個被引入的非人類來源的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基通常是“引入”的殘基,其典型地來源于“引入”可變區。根據Winter和其同事的方法(Jones等,自然,321522-525(1986);Riechmann等,自然332323-327(1988);Verhoeyen等,科學2391534-1536(1988)),通過用人抗體的相應序列取代鼠類CDR或CDR序列,可以基本上進行人源化。因此,這類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利號4816567),其中基本上少于完整的人可變區的序列被來源于非人類物種的相應序列代替。實際上,人源化抗體一般是人抗體,其中一些CDR殘基和一些FR殘基被噬齒類抗體中類似位點的殘基代替。
            在制備人源化抗體中應用的人重鏈和輕鏈可變區的選擇對于降低抗原性非常重要。根據所謂的“最適”方法,可在已知人可變區序列的完整文庫中篩選嚙齒類抗體的可變區序列。然后,將與嚙齒類序列最相近的人的序列作為人源化抗體的框架(FR)(Sims等,免疫學雜志.1512296(1993);Chothia等,分子生物學雜志.196901(1987))。另一種方法應用來源于特定亞組輕鏈或重鏈之所有人類抗體共同序列的特定框架。相同的框架可以用于若干不同的人源化抗體(Carter等,美國國家科學院院刊894285(1992);Presta等,免疫學雜志.,1512623(1993))。
            更為重要的是抗體被人源化且保留對抗原的高親和力和其它良好的生物學活性。為了達到此目的,根據優選的方法,利用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念上的人源化產物,通過此方法制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型為公眾可獲得且為本領域技術人員所熟知。已有能說明并顯示所選候選免疫球蛋白序列可能的三維構象結構的計算機程序。觀察這些顯示結果可以分析所述殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能的作用,即分析能影響候選免疫球蛋白與抗原結合能力的殘基。這樣,可以從受體篩選FR殘基,并將其與重要的序列組合,以得到所需抗體特性,例如對靶抗原的親和力增強。通常,CDR殘基直接并且主要涉及對抗原結合的影響。
            WO 01/00245描述了結合HER2并且阻抑HER受體的配體激活的例示性人源化HER2抗體的生產。本文的特定目標人源化抗體基本上與鼠單克隆抗體2C4(或其Fab片段)同樣有效地阻抑EGF,TGF-α和/或HRG介導的MAPK的激活,和/或與鼠單克隆抗體2C4(或其Fab片段)同樣有效地結合HER2。本文的人源化抗體可以,例如,包含并入人可變重結構域的非人高度可變區殘基,并且可以進一步包含選自69H,71H和73H位置上的框架區(FR)取代,上述操作利用在Kabat等人,Sequence of Protein ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)中給出的可變結構域編號系統。在一個實施方案中,人源化抗體包含在位置69H,71H和73H位置中的兩個或全部位置上的FR取代。
            本文的例示性的目標人源化抗體包含可變重結構域互補決定殘基GFTFTDYTMX,其中X優選為D或S(SEQ ID No.7);DVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQ ID No.8);和/或NLGPSFYFDY(SEQ ID No.9),任選地包含那些CDR殘基的氨基酸修飾,例如其中所述修飾基本上保留或提高抗體的親和性。例如,目標抗體變體可以在以上可變重CDR序列中具有從大約一個到大約七個或大約五個氨基酸取代。這類抗體變體可以通過,例如,如下所述的親和性成熟來制備。最優選的人源化抗體包含SEQID No.4中的可變重結構域氨基酸序列。
            除了前段中的那些可變重結構域CDR殘基之外,人源化抗體可以包含例如可變輕結構域互補決定殘基KASQDVSIGVA(SEQ ID No.10);SASYXXX,其中位置5上的X優選是R或L,其中位置6上的X優選是Y或E,而位置7上的X優選是T或S(SEQ ID No.11);和/或QQYYIYPYT(SEQ ID No.12)。這類人源化抗體任選地包含以上CDR殘基的氨基酸修飾,例如其中所述修飾基本上保持或增強抗體的親和性。例如,目標抗體變體可以在以上可變輕CDR序列中具有從大約一個到大約七個或大約五個氨基酸取代。這類抗體變體可以通過,例如,如下所述的親和性成熟來制備。最優選的人源化抗體包含SEQ ID No.3中的可變輕結構域氨基酸序列。
            本申請還涉及結合HER2并阻抑HER受體的配體激活的親和性成熟抗體。親本抗體可以是人抗體或人源化抗體,例如,分別包含SEQ ID Nos.3和4的可變輕和/或重序列的抗體(即變體574)。親和性成熟抗體優選地以優于鼠2C4或變體574(例如從大約兩倍或大約四個倍,到大約100倍或大約1000倍增強親和性,例如,如利用HER2-細胞外結構域(ECD)ELISA所評估的)的親和性結合HER2受體。例示性的進行取代的可變重CDR殘基包括H28,H30,H34,H35,H64,H96,H99,或兩個或多個的組合(例如這些殘基的兩個,三個,四個,五個,六個,或七個)。進行改變的可變輕CDR殘基的實例包括L28,L50,L53,L56,L91,L92,L93,L94,L96,L97或兩個或多個(例如這些殘基的兩個,三個,四個,五個,高達大約十個)的組合。
            要求保護各種形式的人源化抗體或親和性成熟抗體。例如,人源化抗體或親和性成熟抗體可以是抗體片段,如Fab,其任選地與一種或多種細胞毒性劑偶聯,以便生成免疫偶聯物。或者,人源化抗體或親和性成熟抗體可以是全長抗體,如全長IgG1抗體。
            (iv)人抗體除了進行人源化以外還可制備人類抗體。例如現在已能產生如下轉基因動物(如小鼠),它們通過免疫能產生人類抗體的所有成分而不產生內源免疫球蛋白。例如,有報道稱,嵌合及種系(germ-line)突變小鼠中抗體重鏈連接區(JH)基因的純合缺失導致內源抗體的產生被完全抑制。將人類種系免疫球蛋白基因陣列轉移到這類種系突變小鼠中將導致因抗原攻擊而產生人類抗體。見,例如,Jakobovits等,美國國家科學院學報,902551(1993);Jakobovits等,自然,362255-258(1993);Bruggermann等,Year in Immuno.733(1993);和美國專利號5591669,5589369和5545807。
            或者,可用噬菌體展示技術(McCafferty等,自然348552-553(1990))從未免疫供者的免疫球蛋白可變(V)區基因的所有組成而體外產生人類抗體和抗體片段。依據此技術,將抗體V區基因克隆在與絲狀噬菌體(如M13或fd)主要或次要衣殼蛋白基因相同的框架內,并在噬菌體顆粒的表面展示為功能性抗體片段。因為絲狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝,根據抗體的功能特點進行的選擇也導致對顯示這些性質的抗體的編碼基因進行選擇。因此,噬菌體模仿了B細胞的部分特點。噬菌體展示可以以多種形式進行;其綜述見,例如,Johnson,Kevin S.和Chiswell,David J.,結構生物學的最新觀點(Current Opinion in Structural Biology)3564-571(1993)。可使用若干來源的V基因片段進行噬菌體展示。Clackson等,自然,352624-628(1991)從免疫小鼠脾臟來源的V基因的隨機組合小文庫中分離了抗-惡唑酮抗體的一個多樣性陣列。可基本如Marks等,分子生物學雜志222581-597(1991),或Griffith等,EMBOJ.12725-734(1993)所述構建未經免疫的人類供者V基因的所有組成,并分離針對抗原多樣性陣列(包括自身抗原)的抗體。亦參見美國專利號5565332和5573905。
            如上所述,人類抗體也可通過體外活化的B細胞而產生(見美國專利5,567,610和5,229,275)。
            人類抗HER2抗體在1998年6月30日公布的美國專利5772997和1997年1月3日公開的WO97/00271中敘述。
            (v)抗體片段已開發了生成抗體片段的多種技術。傳統上,這些片段通過對完整抗體的蛋白水解性消化獲得(見Morimoto等,生物化學和生物物理學方法雜志(Journal of Biochemical and Biophysical Methods)24107-117(1992))和Brennan等,科學,22981(1985))。但現在可直接通過重組宿主細胞產生這些片段。例如,可從上述抗體噬菌體庫分離抗體片段。或者,可從大腸桿菌直接回收Fab’-SH片段,并經化學連接形成F(ab’)2片段(Carter等,生物/技術10163-167(1992))。依據另一種方法,可直接從重組宿主細胞培養中分離F(ab’)2片段。其它產生抗體片段的技術對本領域技術人員是顯而易見的。在其它實施方案中,所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見WO93/16185;美國專利5,571,894;和美國專利5,587,458。抗體片段也可以是“線性化抗體”,如美國專利5,641,870所述。這類線性化抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。
            (vi)雙特異性抗體雙特異性抗體是具有針對至少兩種不同表位的結合特異性的抗體。例示性的雙特異性抗體可以與HER2蛋白的兩種不同表位結合。其它這種抗體可將HER2結合位點與針對EGFR、HER3和/或HER4的結合位點組合。或者,可將抗HER2臂與結合白細胞上引發分子的臂結合,從而集中針對HER2表達細胞的細胞防御機制,所述引發分子如T細胞受體分子(例如CD2或CD3),或IgG Fc受體(FcγR)如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。雙特異性抗體還可用于將細胞毒制劑定位至表達HER2的細胞。這些抗體具有HER2結合臂和結合細胞毒制劑(例如皂草素,抗INF-α,長春花生物堿,蓖麻毒蛋白A鏈,氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗體可制備成全長抗體或抗體片段(如F(ab’)2雙特異性抗體)。
            WO 96/16673描述了雙特異性HER2/FcγRIII抗體,而在美國專利5837234中公開了雙特異性ErbB2/FcγRI抗體IDM1(Osidem)。雙特異性HER2/Fcα抗體見WO98/02463。美國專利5821337中教導了雙特異性HER2/CD3抗體。MDX-210是雙特異性HER2-FcγRIII Ab。
            制備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。完整雙特異性抗體的傳統制備方法是基于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達,其中這兩條鏈具有不同特異性(Millstein等,自然,305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈輕鏈隨機分配,這些雜交瘤(細胞雜交瘤(quadroma))可能產生10種不同抗體分子的混合物,其中只有一種具有正確的雙特異性結構。對所述正確分子的純化(通常通過親和層析步驟來進行)非常復雜,且產量很低。類似的方法見WO93/08829和Traunecker等,EMBO J,103655-3659(1991)。
            依據不同的方法,將具有所需結合特異性(抗體-抗原結合位點)的抗體可變區與免疫球蛋白恒定區序列融合。該融合優選與包含鉸鏈區的至少一部分、CH2及CH3區的免疫球蛋白重鏈恒定區融合。優選使含有輕鏈結合所需位點的第一重鏈恒定區(CH1)出現在至少在一種融合中。可將編碼免疫球蛋白重鏈融合體,以及必要時,編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達載體,共轉染至適當宿主生物。這使得在使用非等比的三種多肽鏈進行構建的實施方案中,能較靈活地調整三種多肽片段的相互比例,以獲得最佳產量。但也可在至少兩種多肽鏈以等比例表達而獲得高產時或所述比例無特別意義時,將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體中。
            在該方法的優選實施方案中,所述雙特異性抗體由一條臂上的帶有第一結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。已發現這種不對稱結構有利于從非必要免疫球蛋白鏈的混合中分離出所需雙特異性化合物,因為只有該雙特異性分子的一半上存在免疫球蛋白輕鏈,這使得分離更加容易。此方法公開于WO94/04690中。制備雙特異性抗體的進一步細節,見Suresh等,酶學方法,121210(1986)。
            根據美國專利5,731,168所述的另一種方法,可改造一對抗體分子之間的界面,使得從重組細胞培養中獲得的異源二聚體的百分比最大。優選的界面包括抗體恒定區CH3結構域的至少一部分。在該方法中,源于第一抗體分子界面上的一條或多條氨基酸小側鏈被較大側鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。與所述大側鏈大小相同或相近的互補“溝”可通過將氨基酸大側鏈用小側鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代而在第二抗體分子的界面上形成。這使得異二聚體的產量比不想要的終產物如同型二聚體的高。
            雙特異性抗體包括交聯抗體或“異源偶聯的”抗體。例如,可使異源偶聯物中的抗體之一與抗生物素蛋白偶聯,使另一抗體與生物素偶聯。有觀點認為,這類抗體可用于將免疫細胞導向不想要的細胞(美國專利號4676980),也可用于治療HIV感染(WO91/00360,WO92/200373,EP03089)。異源偶聯抗體可通過任何適當的交聯方法制備。適當的交聯制劑和多種交聯技術為本領域已知,公開于美國專利號4676980中。
            從抗體片段制備雙特異性抗體的技術也已有文獻描述。例如,雙特異性抗體可利用化學連接制備。Brennan等,科學22981(1985)中描述了將完整抗體經蛋白水解制備F(ab′)2片段的方法。這些片段在二巰基復合劑亞砷酸鈉存在時被還原,從而穩定相鄰的巰基,并阻止分子間二硫鍵的形成。生成的Fab′片段被轉化為硫硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物。其中一種Fab′-TNB衍生物經巰基乙胺還原成Fab′-硫醇,再與等分子量的其它Fab′-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。如此產生的雙特異性抗體可作為酶的選擇性固相化中所用的試劑。
            近期的進展促進了Fab′-SH片段從大腸桿菌的直接回收,該片段可經化學偶聯形成雙特異性抗體。Shalaby等,實驗醫學雜志,175217-225(1992)描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab′)2分子的產生。每一Fab′片段分別從大腸桿菌中分泌出來,體外直接化學偶聯形成雙特異性抗體。如此制備的雙特異性抗體能與過度表達HER2受體的細胞和正常人T細胞結合,還能引發人類細胞毒淋巴細胞對人乳腺腫瘤細胞的裂解活性。直接從重組細胞培養中制備并分離雙特異性抗體片段的多種技術也已有描述。例如,可用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體。Kostelny等,免疫學雜志,148(5)1547-1553(1992))。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab′部分通過基因融合而連接。使抗體的同型二聚體在鉸鏈區被還原成單體,然后被再氧化形成抗體的異二聚體。該方法也可用于制備抗體同型二聚體。由Hollinger等,美國國家科學院學報,906444-6448(1993))描述的“二價抗體”技術提供了另一種制備雙特異性抗體片段的方法。所述片段中含有重鏈可變區(VH),其通過接頭與輕鏈可變區(VL)相連,該接頭非常短,使得同一鏈的兩個結構域之間無法配對。因此,同一片段上的VH和VL結構域被迫與另一片段上的互補VL和VH結構域配對,從而形成兩個抗原結合位點。還報道了另一種用單鏈Fv(sFv)二聚體來制備雙特異性抗體的策略。見Gruber等,免疫學雜志,1525368(1994)。
            考慮二價以上的抗體。如可制備三特異性抗體。Tutt等,免疫學雜志,14760(1991)。
            (vii)其它氨基酸序列修飾考慮本文所述抗體的氨基酸序列修飾。例如,可能需要改進抗體的結合親和力和/或其它生物學特點。抗體的氨基酸序列變體可通過在抗體核酸中引入適當的核苷酸變化或通過肽合成制備。這類修飾包括例如抗體的氨基酸序列內殘基的缺失、和/或插入和/或取代。可進行缺失、插入和取代的任何組合以獲得最終的構建體,只要最終的構建體具有所需的特性。所述氨基酸變化還可改變抗體的翻譯后加工過程,例如改變糖基化位點的數目或位置。
            一種鑒別抗體中處于誘變優選位置的某些殘基或區域的有用方法是Cunningham和Wells,科學2441081-1085(1989)所述的“丙氨酸掃描誘變”。這里,鑒定一個殘基或一組靶殘基(例如,帶電的殘基如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)并用中性或帶負電的氨基酸取代(最優選丙氨酸或多聚丙氨酸)取代,以便影響氨基酸與抗原的相互作用。那些證實對取代具有功能敏感性的氨基酸位置通過在取代點引入進一步的或其他的變體而改進。因而,盡管引入氨基酸序列變異的位點是預先決定的,但突變本身的性質不必是預定的。例如,為分析在指定位點處突變的作用,在所述靶密碼子或區域實行丙氨酸掃描或隨機誘變,并篩選所表達的具有預期活性的抗體變體。
            氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-端的融合(其長度從一個殘基至包括100個或更多殘基的多肽),以及序列內單個或多個氨基酸殘基的插入。末端插入的例子包括帶有N-末端甲硫氨酰殘基的抗體或與細胞毒性多肽融合的該抗體。抗體分子的其它插入變體包括使該抗體的N-或C-末端與能增加該抗體的血清半衰期的酶或多肽融合。
            另一類變體是氨基酸取代變體。這些變體使抗體分子中至少一個氨基酸殘基被不同殘基取代。最有興趣進行取代誘變的位點包括高變區,也可以考慮FR的改變。保守取代見表1的“優選取代”欄。如果這些取代引起生物學活性的改變,則可引入表1中“取代舉例”欄的更實質性改變,或進一步在下文的氨基酸分類中所述的更實質性改變,并篩選產物。
            表1

            通過選擇取代來實現抗體生物學特性的基本修飾,所述取代在其維持(a)取代區多肽骨架結構,例如,如片層或螺旋狀構象,(b)在靶位點上分子的電荷或疏水性,或(c)側鏈大小的效應上明顯不同。氨基酸可根據它們側鏈性質的相似性分組(在A.L.Lehninger,in Biochemistry,second ed.,pp.73-75,Worth Publishers,New York(1975)中)(1)非極性Ala(A),Val(V),Leu(L),Ile(I),Pro(P),Phe(F),Trp(W),Met(M)(2)不帶電的極性Gly(G),Ser(S),Thr(T),Cys(C),Tyr(Y),Asn(N),Gln(Q)(3)酸性Asp(D),Glu(E)(4)堿性Lys(K),Arg(R),His(H)或者,天然存在的殘基可根據共有的側鏈特性分成幾組(1)疏水型正亮氨酸,met,ala,val,leu,ile;(2)中性親水型cys,ser,thr;(3)酸性asp,glu;(4)堿性asn,gln,his,lys,arg;(5)影響鏈方向的殘基gly,pro;和(6)芳香基trp,tyr,phe。
            非保守取代將限定上述某一類的成員被另一類取代。
            不參與維持抗體的正確構象的任何半胱氨酸殘基也可被取代,通常被絲氨酸取代,以提高該分子的氧化穩定性,并阻止異常交聯。相反,可在該抗體中添加半胱氨酸連接以提高其穩定性(特別當該抗體為抗體片段如FV片段時)。
            取代變體的特別優選類型包括取代親本抗體高變區的一或多個殘基。通常,所選用于進一步開發的變體相對于其親本抗體應具有改進的生物學活性。產生這種取代變體的一個方便方法是利用了噬菌體展示的親和力成熟。簡單地說,使高變區的幾個位點(如6-7個位點)突變以便在每一位點產生所有可能的氨基酸取代。這樣產生的抗體變體以單價形式展示在絲狀噬菌體顆粒上,其為與每個顆粒內包裝的M13基因III產物的融合體。然后篩選噬菌體展示的變體是否具有本文所述生物學活性(如結合親和力)。為了鑒定備選的高變區修飾位點,可通過丙氨酸掃描誘變來鑒定對抗原結合作出主要貢獻的高變區殘基。此外,分析抗原-抗體復合物的晶體結構以確定抗原與抗體之間的接觸點也較有利。這些接觸殘基及其鄰近殘基是根據本文所述技術進行取代的候選位點。一旦產生這樣的變體,如本文所述對它們全部進行篩選,選出在一或多個相關實驗中具有優勢特性的抗體以便進一步開發。
            所述抗體的另一種類型的氨基酸變體改變了該抗體原來的糖基化模式。所謂改變就是去掉該抗體中的一或多個碳水化合物部分,和/或添加一或多個原本不存在于該抗體中的糖基化位點。
            抗體的糖基化通常為N-連接或O-連接。N-連接指將碳水化合物部分與天冬酰胺殘基的側鏈相連。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是使碳水化合物部分與天冬酰胺側鏈酶促相連的識別序列。因此,多肽中存在上述任一種三肽序列都可產生潛在的糖基化位點。O-連接糖基化指將N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖附著于羥基氨基酸,主要是絲氨酸、蘇氨酸,但也可用5-羥脯氨酸和5-羥賴氨酸。
            在抗體中添加糖基化位點可通過改變氨基酸序列,使其包含一或多個上述三肽序列而實現(在添加N-連接糖基化位點的情況下)。這種改變也可通過在原始抗體的序列中添加或取代一或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來實現(在添加O-連接的情況下)。
            當所述抗體包含Fc區時,可以改變附于其上的糖。例如,具有成熟糖結構的抗體在美國專利申請號US 2003/0157108 A1,Presta,L.中進行了描述,所述成熟糖結構缺少海藻糖附于抗體的Fc區上。還參見US2004/0093621 A1(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。在附于抗體Fc區上的糖中具有對分N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的抗體在WO03/011878,Jean-Mairet等人和美國專利號6,602,684,Umana等人中提及。在附于抗體Fc區上的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體在WO97/30087,Patel等人中報道。還參見,WO98/58964(Raju,S.)和WO99/22764(Raju,S.),其涉及具有變化的糖附于其Fc區上的抗體。
            編碼抗體的氨基酸序列變體的核酸分子由本領域已知的各種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來源分離(在天然氨基酸序列變體的情況下),或通過對抗ErbB2抗體之早期制備的變體或非變體形式進行寡核苷酸介導的(或定點)誘變,PCR誘變和盒式誘變來制備。
            (viii)篩選具有所需特性的抗體以上已經描述了生成抗體的技術。可以根據需要進一步選擇具有某種生物學特性的抗體。
            為了鑒定抑制HER受體的配體激活的抗體,可以測定該抗體阻抑HER配體結合表達HER受體的細胞的能力(例如結合另一種HER受體,該受體與目標HER受體一起形成HER異寡聚體)。例如,可以將天然表達,或經轉染后表達HER異寡聚體的HER受體的細胞與抗體一起溫并且隨后暴露于經標記的HER配體。隨后可以評估HER2抗體阻抑配體結合HER異寡聚體中的HER受體的能力。
            例如,基本上如WO01/00245中所述可以利用24孔板中的冰上單層MCF7培養物進行HER2抗體對HRG結合MCF7乳腺瘤細胞系的抑制。可以將HER2單克隆抗體加到每個孔中并溫育30分鐘。隨后可以添加125I-標記的rHRGβ1177-224(25pm),可以將溫育持續4到16個小時。可以制備劑量反應曲線并對目標抗體計算IC50值。在一個實施方案中,阻抑HER受體的配體激活的抗體在這種測定中將具有大約50nM或更少,更加優選10nM或更少的IC50,以抑制HRG結合MCF7細胞。其中所述抗體是抗體片段如Fab片段,在這種測定中抑制HRG結合MCF7細胞的IC50可以是,例如,大約100nM或更少,更加優選50nM或更少。
            或者,或此外,可以評估HER2抗體阻抑存在于HER異寡聚體中的HER受體的HER配體-刺激的酪氨酸磷酸化作用的能力。例如,可以將內源表達HER受體或經轉染后表達它們的細胞與抗體一起溫育并且隨后利用抗磷酪氨酸單克隆(其任選地綴合以可檢測的標記)測定HER配體-依賴型酪氨酸磷酸化作用活性。還可利用美國專利號5,766,863中所述的激酶受體激活測定法來確定HER受體激活以及抗體對該活性的阻抑。
            在一個實施方案中,可以基本上如WO01/00245中所述來篩選抗體,所述抗體抑制MCF7細胞中的p180酪氨酸磷酸化作用的HRG刺激。例如,可以將MCF7細胞接種在24-孔板中并且可以將針對HER2的單克隆抗體添加到每孔中并于室溫溫育30分鐘;隨后可以將rHRGβ1177-244加入到每管中至終濃度0.2nM,可以將溫育持續8分鐘。從每孔中吸出培養基,可以通過添加100μl的SDS樣品緩沖液(5%SDS,25mM DTT,和25mM Tris-HCl,pH 6.8)來終止反應。可以將每個樣品(25μl)在4-12%梯度凝膠(Novex)上進行電泳并且隨后電泳轉移到聚偏二氟乙烯膜上。可以將抗磷酪氨酸(以1μg/ml)免疫印跡顯影,并可以通過反射密度計量來量化Mr~180,000上的優勢反應條帶的強度。選擇的抗體在這種測定中將優選顯著抑制p180酪氨酸磷酸化作用的HRG刺激至對照的大約0-35%。可以準備通過反射密度計量測定的p180酪氨酸磷酸化作用的HRG刺激的抑制劑量反應曲線,并且可以計算目標抗體的IC50。在一個實施方案中,阻抑HER受體的配體激活的抗體將具有大約50nM或更少,更加優選10nM或更少的IC50,以便在這種測定中抑制p180酪氨酸磷酸化作用的HRG刺激。當所述抗體是抗體片段如Fab片段時,IC50為大約100nM或更少,更加優選100nM或更少,以便在這種測定中抑制p180酪氨酸磷酸化作用的HRG刺激。
            還可以評估抗體對MDA-MB-175細胞的生長抑制作用,例如,基本上如Schaefer等人Oncogene 151385-1394(1997)中所述的那樣。根據這種測定,可以用HER2單克隆抗體(10μg/mL)處理MDA-MB-175細胞4天并且結晶紫染色。與HER2抗體一起溫育可以顯示對這種細胞系的生長抑制作用,類似于單克隆抗體2C4所展示的那樣。在另一個實施方案中,外源性HRG將不會顯著逆轉這種抑制。優選地,在外源性HRG存在和缺失的情況下,該抗體將能夠在比單克隆抗體4D5更大的程度上抑制MDA-MB-175細胞的細胞增殖(任選地,在比單克隆抗體7F3更大的程度上)。
            在一個實施方案中,目標HER2抗體可以阻抑MCF7和SK-BR-3細胞中HER2與HER3的調蛋白依賴型關聯,如在共免疫沉淀實驗中所測定的,所述實驗如在WO01/00245中所述,這種阻抑基本上比單克隆抗體4D5更加有效,并且優選基本上比單克隆抗體7F3更加有效。
            為了鑒定生長抑制性HER2抗體,可以篩選抑制過表達HER2的癌細胞生長的抗體。在一個實施方案中,選擇的生長抑制性抗體能夠抑制細胞培養物中的SK-BR-3細胞的生長大約20-100%并且優選大約50-100%,抗體濃度為大約0.5-30μg/ml。為了鑒定這種抗體,可以進行美國專利號5,677,171中所述的SK-BR-3測定。根據這種測定,將SK-BR-3細胞生長在F12和DMEM培養基的1∶1混合物中,所述培養基添加了10%胎牛血清,谷氨酸鹽和青霉素鏈霉素。將SK-BR-3細胞以20,000細胞接種在35mm細胞培養皿(2mls/35mm皿)中。每皿添加0.5-30μg/ml的HER2抗體。六天后,利用電子COULTERTM細胞計數儀與細胞數目,與未處理的細胞相比較。可以將抑制SK-BR-3細胞生長大約20-100%或大約50-100%的那些抗體選作生長抑制抗體。篩選生長抑制抗體,如4D5和3E8的測定法參見美國專利號5,677,171。
            為了選擇誘導凋亡的HER2抗體,可以利用BT474細胞進行膜聯蛋白結合測定。如前段所述,培養BT474細胞并接種在培養皿中。隨后移除培養基并以單獨的新鮮培養基或包含10μg/ml單克隆抗體的培養基替代。三天培育期后,用PBS洗滌單層并通過胰蛋白酶化作用進行分離。隨后離心細胞,重懸于Ca2+結合緩沖液中并如上面有關細胞死亡測定所討論的那樣等分到試管中。隨后試管接受標記過的膜聯蛋白(例如膜聯蛋白V-FTIC)(1μg/ml)。可以利用FACSCANTM流式細胞儀和FACSCONVERTTMCellQuest軟件(Becton Dickinson)來分析樣品。將那些相對于對照來說誘導了統計學上顯著水平的膜聯蛋白結合的抗體選作凋亡誘導抗體。除了膜聯蛋白結合測定之外,還可以利用使用BT474細胞的DNA染色測定法。為了進行這種測定,把如前兩段所述用目標抗體處理過的BT474細胞與9μg/ml HOECHST33342TM一起于37℃溫育2hr,隨后利用MODFIT LTTM軟件(Verity SoftwareHouse)在EPICS ELITETM流式細胞儀(Coulter Corporation)上進行分析。利用這種測定可以將抗體選作促凋亡抗體,所述抗體誘導凋亡細胞百分比的變化比未經處理的細胞的情況(高達100%的凋亡細胞)高2倍或更多(優選3倍或更多)。篩選誘導凋亡的HER2抗體,如7C2和7F3的測定法參見WO98/17797。
            為了篩選被目標抗體結合的HER2上的表位的抗體,可以進行常規交叉阻抑測定,如在Antibody,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中所述,以便評估抗體是否交叉阻抑抗體,如2C4或Pertuzumab是否結合HER2。或者,或此外,可以通過本領域已知的方法進行表位繪圖和/或可以研究抗體-HER2結構(Franklin等人Cancer Cell 5317-328(2004)),看HER2的何種結構域被抗體所結合。
            (ix)免疫偶聯物本發明還涉及免疫偶聯物,其含有與細胞毒藥物偶聯的抗體,所述細胞毒藥物如化療藥物、毒素(例如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素,包括其片段和/或變體)或放射性同位素(即放射偶聯物)。
            可有效用于制備這類免疫偶聯物的化療藥物如上述。本文還涉及抗體與一或多種小分子毒素,如加利車霉素,美登素(美國專利5,208,020),單端孢霉烯(trichothene),CC1065的偶聯物。
            在本發明的一個優選實施方案中,使抗體與一或多個美登素分子偶聯(如每個抗體分子與約1-約10個美登素分子偶聯)。美登素可轉化成May-SS-Me,然后還原成May-SH3,并與修飾過的抗體反應(Chari等,癌癥研究52127-131(1992))產生美登木素生物堿-抗體偶聯物。
            另一種目標免疫偶聯物包含與一個或多個加利車霉素分子偶聯的HER2抗體。加利車霉素家族的抗生素能在亞pM濃度水平產生雙鏈DNA斷裂。可使用的加利車霉素結構類似物包括,但不限于γ11、α21、α31、N-乙酰基-γ11、PSAG以及θ11(Hinmam等,癌癥研究533336-3342(1993)和Lode等,癌癥研究582925-2928(1998))。也見美國專利5,714,586;5,712,374;5,264,586和5,773,001,其包含在本文作為參考。
            可以應用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI,PAPII,PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑,白樹毒素,米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢菌毒素(tricothecenes)。例見1993年10月28日公開的WO93/21232。
            本發明還涉及一種免疫偶聯物,其在抗體與具有核裂解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA內切核酸酶如脫氧核糖核酸酶;DNase)之間形成。
            多種放射性同位素可用于制備放射性偶聯的抗體,實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32以及Lu的放射性同位素。
            抗體與細胞毒制劑的偶聯物可通過多種雙功能蛋白偶聯劑來連接,所述雙功能蛋白偶聯劑如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸酯(SPDP),琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨甲基)環己烷-1-羧酸酯,iminothiolane(IT),亞氨酸酯的雙功能衍生物(如亞氨基己二酸二甲酯鹽酸鹽),活性酯類(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯),醛類(如戊二醛(glutareldehyde)),雙-疊氮化合物(如雙(對-疊氮基苯甲酰基)己二胺),雙-重氮衍生物(如雙-(對-重氮苯甲酰基)-乙二胺),二異氰酸酯(如亞甲代苯基2,6-二異氰酸酯),和雙-活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如,蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等,科學2381098(1987)所述制備。C14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三氨五乙酸酯(MX-DTPA)是將放射性核苷酸偶聯至抗體的例示性偶聯劑。見WO94/11026。這種接頭可能是有利于細胞毒藥物在細胞內釋放的“可斷開的接頭”。例如,可使用酸不穩定型接頭,肽酶敏感型接頭,二甲基接頭或含二硫鍵的接頭(Chari等,癌癥研究52127-131(1992))。
            在另一實施方案中,抗體可與腫瘤預靶向中應用的“受體”(如鏈霉抗生物素蛋白)偶聯,將該抗體-受體偶聯物給予患者,之后用清除劑除去循環中未結合的偶聯物,再給予已偶聯了細胞毒制劑(如放射性核苷酸)的“配體”(如抗生物素蛋白)。
            (x)其它抗體修飾本文涉及對抗體的其它修飾。例如,可以使抗體與一種非蛋白多聚物,如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯(polyoxyalkylene)、或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物交聯。還可將抗體包被于通過凝聚技術或界面聚合作用制備的微囊(例如,分別為羥甲基纖維素或明膠微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯(methylmethacylate)微囊)中,膠體藥物傳遞系統(如脂質體、白蛋白小球體、微乳膠、納米顆粒和納米膠囊)或巨乳膠(macroemulsions)中。這些技術公開于Remingtons’s Pharmaceutical Sciences,16版,Oslo,A.,Ed.(1980)。
            在效應功能方面可能希望改進本發明的抗體,以增強抗體的抗原依賴型細胞介導的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴型細胞毒性(CDC)。這可以通過在抗體的Fc區中引入一個或多個氨基酸取代來實現。或者或此外,可以在Fc區中引入半胱氨酸殘基,從而在該區域中形成鏈間二硫鍵。這樣制得的同質二聚抗體可能有改進的內化能力和/或提高的補體介導的細胞殺傷能力和依賴于抗體的細胞毒性(ADCC)。參見Caron等,J.Exp Med.1761191-1195(1992)和Shopes,B.J.Immunol.1482918-2922(1992)。也可如Wolff等Cancer Research 532560-2565(1993)描述的那樣,用異二聚功能性交聯劑來制備抗腫瘤活性增強的同質二聚抗體。或者,可將抗體工程改造成具有雙Fc區,從而可能增強補體裂解和ADCC能力。見Stevenson等,Anti-Cancer Drug Design 3219-230(1989)。
            WO00/42072(Presta,L.)描述了在人效應細胞存在時ADCC功能提高的抗體,其中所述抗體在其Fc區包含氨基酸取代。優選地,ADCC提高的抗體在Fc區的位置298,333,和/或334上包含取代。優選地經改變的Fc區是人IgG1 Fc區,其包括這些位置中的一個,兩個或三個上的取代或由其組成。
            在WO99/51642,美國專利號6,194,551B1,美國專利號6,242,195B1,美國專利號6,528,624B1和美國專利號6,538,124(Idusogie等人)中描述了C1q結合和/或補體依賴型細胞毒性(CDC)改變了的抗體。所述抗體在其Fc區的氨基酸位置270,322,326,327,329,313,333和/或334中的一個或多個位置上包含氨基酸取代。
            例如,為了提高抗體的血清半壽期,可以如美國專利5,739,277中所述,將補救受體結合表位并入抗體(特別是抗體片段)中。如本文所用的,術語“補救受體結合表位”指負責提高體內血清半壽期的IgG分子的Fc區的表位(例如,IgG1,IgG2,IgG3,或IgG4)。在其Fc區具有取代并且血清半壽期提高的抗體還在WO00/42072(Presta,L.)中進行了描述。
            還考慮具有三個或更多(優選四個)功能性抗原結合位點的經改造的抗體(美國申請號US2002/0004587 A1,Miller等人)。
            還可以將本文公開的HER2抗體配制成免疫脂質體。通過本領域已知的方法,如在Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,823688(1985);Hwang等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA,774030(1980);美國專利號4,485,045和4,544,545;和1997-1-23日公開的WO97/38731中所述的方法,來制備包含抗體的脂質體。在美國專利號5,013,556中公開了具有提高的周轉時間的脂質體。
            可以通過反相蒸發方法用包含磷脂酰膽堿,膽固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物生成特別有用的脂質體。將脂質體通過確定孔徑大小的濾器壓出以產生具有所需直徑的脂質體。如在Martin等人J.Biol.Chem.257286-288(1982)中所述,可以將本發明的抗體的Fab′片段通過二硫交互反應偶聯到脂質體上。任選地將化療劑包含在所述脂質體中。參見Gabizon等人J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
            (ix)例示性抗體可以根據本發明配制的例示性抗體包括,但不限于下列抗ErbB抗體,包括抗HER2抗體,如本文中更加詳細描述的那些;
            結合B細胞表面標記的抗體,所述B細胞表面標記如CD19,CD20(例如Rituximab(RITUXAN)和人源化2H7),CD22,CD40或BR3;結合IgE的抗體,包括可由Genentech商購的Omalizumab(XOLAIR),E26(本文的圖17A-B),HAE1(本文的圖17A-B),在其Fc區的位置265上具有氨基酸取代的IgE抗體(US 2004/0191244 A1),Hu-901(圖17A-B herein),WO2004/070011中的IgE抗體,或包含任何這些IgE抗體的可變結構域的抗體(包括抗體片段和全長抗體)。還參見,Presta等人,J.Immunol.1512623-2632(1993);國際公開號WO 95/19181;美國專利號5,714,338,發布于1998-02-03;美國專利號5,091,313,發布于1992-02-25;1993-03-04公開的WO 93/04173;1999-01-14公開的WO 99/01556;和美國專利號5,714,338;結合血管內皮生長因子(VEGF)或其受體的抗體,包括可由Genentech商購的Bevacizumab(AVASTINTM),和Ranibizumab(LUCENTISTM);抗IL-8抗體(St John等人,Chest,103932(1993),和國際公開號WO95/23865);抗PSCA抗體(WO01/40309);抗CD40抗體,包括S2C6及其人源化變體(WO00/75348);抗CD11a抗體,包括efalizumab(RAPTIVA)(美國專利號5,622,700,WO 98/23761,Steppe等人,Transplant Intl.43-7(1991),和Hourmant等人,Transplantation 58377-380(1994));抗CD18抗體(1997-04-22發布的美國專利號5,622,700,或1997-07-31公開的WO 97/26912);抗Apo-2受體抗體(1998-11-19公開的WO 98/51793);抗TNF-α抗體包括cA2(REMICADE),CDP571和MAK-195(參見,1997-09-30發布的美國專利號5,672,347,Lorenz等人J.Immunol.156(4)1646-1653(1996),和Dhamaut等人Crit.Care Med.23(9)1461-1469(1995));抗組織因子(TF)(歐洲專利號0 420 937 B1,1994-11-09授權);抗人α4β7整合素(1998-02-19公開的WO 98/06248);抗EGFR抗體,包括1996-12-19公開的WO 96/40210中的嵌合的或人源化225抗體;抗CD3抗體,如OKT3(1985-05-07發布的美國專利號4,515,893);
            抗CD25或抗tac抗體如CHI-62 1(SIMULECT)和(ZENAPAX)(參見1997-12-02發布的美國專利號5,693,762);抗CD4抗體如cM-7412抗體(Choy等人Arthritis Rheum 39(1)52-56(1996));抗CD52抗體如CAMPATH-1H(Riechmann等人Nature 332323-337(1988);抗Fc受體抗體如Graziano等人J.Immunol.155(10)4996-5002(1995)中的抗FcγRI的M22抗體;抗癌胚抗原(CEA)抗體如hMN-14(Sharkey等人Cancer Res.55(23Suppl)5935s-5945s(1995);抗乳腺上皮細胞的抗體包括huBrE-3,hu-Mc 3和CHL6(Ceriani等人Cancer Res.55(23)5852s-5856s(1995);和Richman等人Cancer Res.55(23Supp)5916s-5920s(1995));結合結腸癌細胞的抗體如C242(Litton等人Eur J.Immunol.26(1)1-9(1996));抗CD38抗體,例如AT13/5(Ellis等人J.Immunol.155(2)925-937(1995));抗CD33抗體如Hu M195(Jurcic等人Cancer Res 55(23Suppl)5908s-5910s(1995)和CMA-676或CDP771;抗CD22抗體如LL2或LymphoCide(Juweid等人Cancer Res 55(23Suppl)5899s-5907s(1995);抗EpCAM抗體如17-1A(PANOREX);抗GpIIb/IIIa抗體如abciximab或c7E3 Fab(REOPRO);抗RSV抗體如MEDI-493(SYNAGIS);抗CMV抗體如PROTOVIR;抗HIV抗體如PRO542;抗肝炎抗體如抗Hep B抗體OSTAVIR;抗CA 125抗體OvaRex;抗特異型GD3表位抗體BEC2;抗αvβ3抗體VITAXIN;抗人腎細胞癌抗體如ch-G250;ING-1;
            抗人17-1A抗體(3622W94);抗人結腸直腸腫瘤抗體(A33);抗GD3神經節苷脂的抗人黑色素瘤抗體R24;抗人鱗狀細胞癌(SF-25);和抗人白細胞抗原(HLA)抗體如Smart ID10和抗HLA DR抗體Oncolym(Lym-1)。
            (xi)抗體變體組合物在至少一個方面,本發明涉及包括組合物的制劑,所述組合物包含主要種類抗體及其一種或多種變體的混合物。當所述主要種類抗體結合HER2時,優選地HER2抗體(主要組分HER2抗體及其抗體變體的其中之一或二者)是這樣一種抗體,其結合HER2的結構域II,比Trastuzumab更加有效地抑制HER二聚體化作用,和/或結合HER2的異二聚體結合位點。在這里主要種類抗體的優選實施方案是這樣的抗體,其包括SEQ ID Nos.3和4中的可變輕和可變重氨基酸序列,最優選包括選自SEQ ID No.15和23的輕鏈氨基酸序列,和選自SEQ ID Nos.16和24的重鏈氨基酸序列。
            在一個實施方案中,配制的HER2抗體組合物包含主要組分HER2抗體與其包含氨基末端引導延伸的氨基酸序列變體的混合物。優選地,氨基末端引導延伸在抗體變體的輕鏈上(例如在抗體變體的一個或兩個輕鏈上)。主要組分HER2抗體或抗體變體可以是全長抗體或抗體片段(例如F(ab’)2片段的Fab),但是優選兩者都是全長抗體。本文的抗體變體可以在其任何一個或多個重或輕鏈上包含氨基末端引導延伸。優選地,氨基末端引導延伸在抗體的一個或兩個輕鏈上。氨基末端引導延伸優選包含或由VHS-組成。組合物中氨基末端引導延伸的存在可以通過各種分析技術進行檢測,包括,但不限于,N-末端序列分析,電荷異質性測定(例如,陽離子交換層析或毛細管區位電泳),質譜分析,等等。組合物中抗體變體的量一般從構成任何用于檢測變體的測定法(優選N末端序列分析)的檢測極限的量到小于主要種類抗體的量。一般組合物中抗體分子的大約20%或更少(例如從大約1%到大約15%,例如從5%到大約15%)包含氨基末端引導延伸。優選利用定量N-末端序列分析或陽離子交換分析(優選地利用高分辨率,弱陽離子交換柱,如PROPAC WCX-10TM陽離子交換柱)來測定這種百分比量。除了氨基末端引導延伸變體之外,還包括其它的主要種類抗體和/或變體的氨基酸序列變化,包括但不限于在其一個或兩個重鏈上包含C-末端賴氨酸殘基的抗體,去酰胺化的抗體變體,等等。
            另外,主要種類抗體或變體可以進一步包含糖基化作用變異,非限制性的實例包括含有附著在其Fc區上的G1或G2寡糖結構的HER2抗體,含有附著在其輕鏈上的糖部分的HER2抗體(例如附著到抗體的一個或兩個輕鏈上的一個或兩個糖部),HER2抗體包括非糖基化重鏈。
            III.制劑的制備在第一方面,本發明提供穩定的藥物制劑,其包括單克隆抗體,優選地全長人或人源化IgG1抗體,所述抗體在pH 5.5-6.5,優選pH 5.8-6.2的組氨酸-醋酸鹽緩沖液中。不過,制劑中的抗體可以是包含抗原-結合區的抗體片段,如Fab或F(ab’)2片段。
            在另一實施方案中,本發明涉及一種藥物制劑,其包含以下成份或基本上由以下成份組成大約10mg/mL到大約250mg/mL的易于發生脫酰胺或聚集的全長IgG1抗體;組氨酸-醋酸鹽緩沖液,pH 5.5-6.5;大約60mM到大約250mM的量的選自海藻糖和蔗糖的糖;和大約0.01%到大約0.1%量的聚山梨醇酯20。
            在又一個實施方案中,本發明提供一種藥物制劑,其包含在pH從大約5.5到大約6.5的組氨酸緩沖液中的結合HER2的結構域II的抗體,糖和表面活性劑。例如,該制劑可以包含從大約20mg/mL到大約40mg/mL的量的Pertuzumab,組氨酸-醋酸鹽緩沖液,蔗糖,和聚山梨醇酯20,其中該制劑的pH為從大約5.5到大約6.5。
            在另一方面,本發明提供一種藥物制劑,其包含在pH從大約5.5到大約6.5的組氨酸緩沖液中的DR5抗體,糖和表面活性劑。這種制劑可以,例如,包含從大約10mg/mL到大約30mg/mL的量的Apomab,組氨酸-醋酸鹽緩沖液,海藻糖,和聚山梨醇酯20,其中該制劑的pH為從大約5.5到大約6.5。
            該制劑尤其對易于發生脫酰胺和/或聚集和/或片段化的抗體有用,因為該緩沖液阻滯其中配制的抗體的脫酰胺和/或聚集和/或片段化。此外,不像其它利用HCl制備的組氨酸緩沖液,組氨酸-醋酸鹽緩沖液缺少在本文中發現有益的氯離子,因為當其與糖組合時這種緩沖液與聚山梨醇酯20對抗體具有相同的保護作用,并且是穩定的且可以保存在不銹鋼罐中。因而,除了其本身包含易于發生脫酰胺和/或聚集和/或片段化的抗體的制劑以外,本發明還提供減弱治療性單克隆抗體的脫酰胺,聚集和/或片段化的方法(例如,相對于在不同的pH或在不同的緩沖液中的組合物),包括在組氨酸-醋酸鹽緩沖液,pH 5.5-6.5中配制抗體。在這一實施方案中,可以在配制抗體之前或之后測定或測量脫酰胺,聚集和/或片段化,所述配制的抗體在制劑中及其保存時顯示可接受的脫酰胺作用,聚集和/或片段化。
            制劑中的抗體可以結合抗原,包括但不限于HER2,CD20,IgE,DR5,BR3和VEGF。
            當所述配制的抗體結合HER2時,它優選結合HER2的結構域II,比Trastuzumab更加有效地抑制HER二聚體化作用,和/或結合HER2的異二聚體結合位點。在本文中HER2抗體的優選實施方案是這樣的抗體,其包括SEQ ID Nos.3和4中的可變輕和可變重氨基酸序列,最優選包括SEQ IDNos.15和16中的輕鏈和重鏈氨基酸序列(Pertuzumab)。
            可以在這里配制的CD20抗體的實例包括“C2B8”,它現在叫做“Rituximab”(“RITUXAN”)可由Genentech商購(還參見美國專利號5,736,137,特此并入本文作為參考);釔-[90]-標記的2B8鼠抗體,命名為“Y2B8″或“Ibritumomab Tiuxetan”ZEVALIN,可由Biogen-Idec商購(還參見美國專利號5,736,137,特此并入本文作為參考);鼠IgG2a“B1,”也稱作“Tositumomab,”任選地標記131I以生成“131I-B1”抗體(碘I131 tositumomab,BEXXARTM)(美國專利號5,595,721,特此并入本文作為參考);鼠單克隆抗體“1F5”(Press等人血液69(2)584-591(1987)及其包括“補綴框架(framecworkpatched)”或人源化1F5的變體(WO03/002607,Leung,S.);ATCC保藏號HB-96450);鼠2H7和嵌合2H7抗體(Clark等人PNAS 821766-1770(1985);美國專利號5,500,362,并入本文作為參考);人源化2H7;huMax-CD20(WO04/035607,Genmab,Denmark);AME-133(Applied Molecular Evolution);A20抗體或其變體如嵌合或人源化A20抗體(分別為cA20,hA20)(US2003/0219433,Immunomedics);和單克隆抗體L27,G28-2,93-1B3,B-C1或NU-B2,其可獲自International Leukocyte Typing Workshop(Valentine等人,InLeukocyte Typing III(McMichael,Ed.,p.440,Oxford University Press(1987))。
            在配制的CD20抗體的優選實施方案中,CD20抗體是人源化2H7抗體。在本文中優選的人源化2H7抗體是2H7v16和2H7v511。人源化2H7v16可以是完整抗體或包含可變輕和可變重序列的抗體片段(SEQ ID Nos.26和29)。當所述人源化2H7v16抗體是全長抗體時,優選地它包含SEQ ID Nos.63和65的輕和重鏈氨基酸序列。
            當所述抗體結合VEGF時,優選地它包含圖19中所示的可變結構域序列。最優選的抗VEGF抗體是全長人源化IgG1抗體,Bevacizumab(AVASTINTM),可由Genentech商購。
            當所述配制的抗體結合IgE時,優選地它選自以下抗體組成的組E25,可由Genentech商購的Omalizumab(XOLAIR)(還參見圖17A-B),E26(本文的圖17A-B),HAE1(本文的圖17A-B),在其Fc區的位置265上具有氨基酸取代的IgE抗體(US 2004/0191244 A1),Hu-901(本文的圖17A-B),WO2004/070011中的IgE抗體,或包括那些IgE抗體任一種的可變結構域的抗體(包括抗體片段和全長抗體)。
            當所述抗體結合腫瘤壞死因子(TNF)超家族中的受體或死亡受體時,優選地它結合DR5,并優選是激動劑抗體。在這一領域中的出版物包括Sheridan等人,Science,277818-821(1997),Pan等人,Science,277815-818(1997),1998-11-19公開的WO98/51793;1998-09-24公開的WO98/41629;Screaton等人,Curr.Biol.,7693-696(1997);Walczak等人,EMBO J.,165386-5387(1997);Wu等人,Nature Genetics,17141-143(1997);1998-08-20公開的WO98/35986;1998-10-14公開的EP870,827;1998-10-22公開的WO98/46643;1999-01-21公開的WO99/02653;1999-02-25公開的WO99/09165;1998-03-11公開的WO99/11791;2002-08-13公開的US2002/0072091;2001-12-07公開的US 2002/0098550;2001-12-06發布的US6,313,269;2001-08-02公開的US 2001/0010924;2003-07-03公開的US2003/01255540;2002-10-31公開的US 2002/0160446,2002-04-25公開的US 2002/0048785;2002-02發布的US 6,342,369;2003-05-27公開的US6,569,642,2000-06-06發布的US 6,072,047,2003-11-04發布的US 6,642,358;2004-06-01發布的US 6,743,625。最優選的DR5抗體是Apomab。
            以上提及的每種制劑都包含緩沖液,優選組氨酸緩沖液,最優選組氨酸-醋酸鹽緩沖液pH 5.5-6.5,優選地5.8-6.2,例如大約6.0。緩沖液的濃度至少部分根據所需的pH來規定。緩沖液的例示性濃度從大約1mM到大約200mM,優選地從大約10mM到大約40mM,最優選大約20mM。
            制劑中的抗體濃度優選為從大約10mg/mL到大約250mg/mL。抗體濃度可以根據所希望的用途和制劑施用模式來確定。例如,當所述制劑用于IV給藥(例如HER2抗體)時,制劑中的抗體濃度優選地從大約20mg/mL到大約40mg/mL。在例示性的希望用于靜脈內(IV)給藥的Pertuzumab制劑中,抗體濃度為從大約20mg/mL到大約40mg/mL,最優選大約30mg/mL。
            當所述抗體用于SQ或IM給藥(例如對于抗IgE抗體來說)時,可能需要較高濃度的抗體。這種基本上高的抗體濃度可以從大約50mg/mL到大約250mg/mL,或從大約80mg/mL到大約250mg/mL,或從大約100mg/mL到大約200mg/mL。
            當所述制劑包含DR5抗體,如Apomab時,例示性的抗體濃度從大約10mg/mL到大約30mg/mL,例如大約20mg/mL DR5抗體;這類制劑可以用于靜脈內給藥。
            用于給藥的制劑優選為含水制劑(未凍干的)并且之前亦未進行凍干。盡管所述制劑可以進行凍干,但優選不做凍干處理。不過,沒有在凍干過程中同時進行干燥的水性制劑的冷凍是特別要求保護的,這有利于其更長期的保存,例如在不銹鋼罐中。
            所述制劑優選地進一步包含糖,最優選二糖,如海藻糖或蔗糖。一般包含減少可溶性聚集物形成的量的糖,所述可溶性聚集物如在凍/融之后出現的那些。對于HER2抗體制劑來說,例示性的糖濃度為從大約10mM到大約1M,例如從大約60mM到大約250mM,最優選大約120mM,對于DR5抗體制劑來說為大約240mM。
            盡管本文發現包含組氨酸-醋酸鹽緩沖液和糖的制劑是穩定的,所述制劑任選地進一步包含表面活性劑,如聚山梨醇酯,最優選聚山梨醇酯20。一般包含減少可溶性聚集物形成(如在搖晃或運輸后發生的)的量的表面活性劑。表面活性劑濃度優選地為從大約0.0001%到大約1.0%,最優選從大約0.01%到大約0.1%,例如大約0.02%。
            任選地,所述制劑并不包含大量的鹽如氯化鈉。
            制劑一般是無菌的,而這可以根據本領域技術人員已知的用于制成適于向人受試者給藥的藥物制劑的方法來實現,包括在制備制劑之前或之后通過無菌濾膜濾過。
            另外,希望制劑在保存時穩定。熟練技術人員可以采用各種穩定性測定法來確定制劑的穩定性。例如,所述制劑可以是在以下保存條件下穩定的制劑于大約40℃至少4周;于大約5℃或大約15℃至少3個月或至少1年;和/或大約-20℃至少3個月。穩定性可以在配劑時或在所述溫度下保存后,通過評估制劑中抗體的物理穩定性,化學穩定性,和/或生物學活性來進行測試。物理和/或穩定性可以通過多種不同的方式定性和/或定量地評估,包括評估聚集物形成(例如利用大小排阻層析,通過測量濁度,和/或通過肉眼觀察);通過利用陽離子交換層析或毛細管區位電泳評估電荷異質性;氨基末端或羧基末端序列分析;質譜分析;SDS-PAGE分析以比較減小的和完整的抗體;肽圖譜(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析;評估抗體的生物學活性或抗原結合功能;等等。不穩定性可能會導致聚集,脫酰胺作用(例如Asn脫酰胺作用),氧化作用(例如Mei氧化作用),異構化作用(例如Asp異構化作用),剪切/水解/片段化(例如鉸鏈區片段化),琥珀酰亞胺形成,未配對的半胱氨酸(s),N-末端延伸,C-末端加工,糖基化作用差異,等等。能夠利用熟練技術人員可以獲得的各種技術來評估生物學活性或抗原結合功能。
            如上所述,特別考慮了制劑的冷凍。因此,可以在凍融后對制劑測試穩定性。
            因此,本發明還提供了一種制備藥物制劑的方法,包括制備本文所述的制劑,和評估制劑中的單克隆抗體的物理穩定性,化學穩定性,或生物學活性。
            在優選的實施方案中,提供在小瓶中的優選水性形式的制劑,所述小瓶具有能夠被注射器穿刺的蓋子。合意地將小瓶保存于大約2-8℃,直到將它給藥于其需要的受試者。小瓶可以是例如20cc的小瓶(例如對于420mg劑量)或50cc小瓶(例如對于1050mg劑量)。對于DR5抗體,如Apomab,可以在5cc玻璃小瓶(例如5.5ml注滿)提供該制劑。
            在另一實施方案中,在不銹鋼罐中提供制劑。在不銹鋼罐中的制劑任選地是冷凍的和未凍干的。
            可以在制劑中包括一種或多種其它可藥用的載體,賦形劑或穩定劑,如在Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)中所述的那些,只要它們不會副作用于制劑的所需特性。可接受的載體,賦形劑或穩定劑在采用的劑量和濃度上對接受者無毒,包括其它緩沖液劑;共溶劑;抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸;螯合劑如EDTA;金屬復合物(例如Zn-蛋白質復合物);可生物降解的聚合物如聚酯;防腐劑;和/或形成鹽的補償離子如鈉。
            IV.用抗體制劑進行治療在一個實施方案中,本發明提供治療受試者中疾病或病癥的方法,包括向受試者施用有效量的本文所述的制劑以治療疾病或病癥。
            當制劑中的抗體結合HER2時,優選將它用于治療癌癥。所述癌癥一般將包含HER2-表達細胞,從而使得本文的HER2抗體能夠結合癌細胞。因而,在此實施方案中本發明涉及在受試者中治療表達HER2的癌癥的方法,包括向受試者施用有效量的HER2抗體藥物制劑以治療癌癥。能夠用該組合物進行治療的各種癌癥列在上面定義一節中。
            還考慮HER2抗體制劑可以用于治療和種非惡性疾病或病癥,包括自身免疫疾病(例如銀屑病);子宮內膜異位;硬皮病;再狹窄;息肉如結腸息肉,鼻息肉或胃腸息肉;纖維腺瘤;呼吸道疾病(參見上面的定義);膽囊炎;神經纖維瘤病;多囊腎病;炎性疾病;皮膚病包括銀屑病和皮炎;血管病(參見上面的定義);涉及血管上皮細胞異常增生的病癥;胃腸潰瘍;Menetrier氏病,分泌性腺瘤或蛋白質流失綜合癥;腎病;血管生成疾病;眼睛疾病如老年性黃斑變性,眼假組織胞漿菌病綜合征(presumed ocular histoplasmosissyndrome),增生型糖尿病視網膜病變導致的視網膜新血管形成,視網膜血管生成,糖尿病性視網膜病,或老年性黃斑變性;骨相關病理如骨關節炎、軟骨病和骨質疏松癥;腦局部缺血事件后損傷;纖維變性或水腫(edemia)疾病如肝硬化,肺部纖維化,carcoidosis,throiditis,系統性高粘滯性綜合征,Osler Weber-Rendu病,慢性閉塞性肺病,或燒傷、外傷、輻射、中風、缺氧或局部缺血后的水腫;皮膚過敏反應;糖尿病性視網膜病和糖尿病性腎病;Guillain-Barre綜合癥;移植物抗宿主疾病或移植排斥;Paget氏病;骨或關節炎;光老化(例如由對人皮膚的UV輻射引起的);良性前列腺肥大;某些微生物感染,所述微生物包括選自腺病毒,漢灘病毒,博氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi),耶爾森菌屬(Yersinia spp.)和百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的微生物病原;由血小板聚集引發的血栓;生殖性疾病如子宮內膜異位,卵巢過度刺激綜合征,先兆子癇,功能障礙性子宮出血,或月經頻多;滑膜炎;動脈粥樣瘤(atherorma);急性和慢性腎病(包括增生性血管球性腎炎和糖尿病誘導的腎病);濕疹;肥厚性瘢痕形成;內毒素性休克和真菌感染;家族性腺瘤息肉病;神經變性疾病(例如阿爾茨海默氏病、愛滋病相關的癡呆、震顫性麻痹、肌萎縮性側索硬化、色素性視網膜炎、脊柱肌肉萎縮(spinal muscular atrophy)和小腦變性);骨髓增生異常綜合征;再生障礙性貧血;局部缺血性損傷;肺、腎或肝的纖維化;T細胞介導的過敏疾病;嬰兒肥大性幽門狹窄;泌尿障礙綜合癥;銀屑病關節炎;和橋本氏甲狀腺炎。本文療法的優選非惡性指征包括銀屑病、子宮內膜異位、硬皮病、血管病(例如再狹窄、動脈粥樣硬化、冠狀動脈病,或高血壓),結腸息肉,纖維腺瘤或呼吸道疾病(例如哮喘、慢性支氣管炎、支氣管擴張或囊性纖維化)。
            在制劑中的抗體結合B細胞表面標記如CD20或BR3時,可以將該制劑用于治療B細胞惡性瘤,如NHL或CLL,自身免疫疾病,移植排斥,或阻抑對外來抗原,如抗體,毒素,基因治療病毒載體,移植物,感染因子,或同種抗原的免疫反應(參見WO 01/03734,Grillo-Lopez等人)。
            當在制劑中的抗體是IgE抗體時,可以將它用于治療IgE介導的病癥(USSN 2004/0197324 Al,Liu and Shire),如過敏性哮喘,過敏性鼻炎,特應性(atopic)皮炎,過敏性胃腸病(allergic gastroenteropathy),過敏,濕疹,風疹,過敏性支氣管肺曲菌病(bronchopulmonary aspergillosis),寄生蟲病,高(hyper)-IgE縮合征,共濟失調性毛細血管擴張癥(ataxia-telangiectasia),維-奧二氏綜合征(Wiskott-Aldrich syndrome),胸腺淋巴發育不全(thymicalymphoplasia),IgE骨髓瘤,和移植物抗宿主的反應。
            結合TNF超家族中受體(例如結合DR5)的抗體,或結合VEGF(或其受體)的抗體,可以用來治療癌癥,所述癌癥的各種形式在上面的定義一節進行了描述。優選地,DR5抗體制劑治療的癌癥是實體腫瘤或NHL。
            當所述適應癥是癌癥時,可以用抗體制劑與化療劑的組合來治療患者。組合給藥包括利用分離的制劑或單一藥物制劑進行共給藥或同時給藥,和以任一種順序連續給藥,其中有一個時期兩種(或所有)活性藥劑同時發揮其生物學活性。因而,化療劑可以在組合物施用之前或之后施用。在此實施方案中,在化療劑的至少一次施用和組合物的至少一次施用之間的時間優選為大約1個月或更少,最優選大約2周或更少。或者,將化療劑和組合物在單一制劑或分離制劑中同時施用給患者。
            用所述制劑治療將帶來癌癥或疾病的病征或癥狀的改善。例如,當進行治療的疾病為癌癥時,這種治療可以帶來存活的改善(整體存活和/或無進展存活)和/或可以帶來目標臨床反應(部分或完全)。另外,用化療劑和抗體制劑的組合進行治療可以對患者帶來協同性的或大于加成性的治療益處。
            優選地,施用的制劑中的抗體是裸抗體。不過,施用的抗體可以與細胞毒性劑偶聯。優選地,其結合的免疫偶聯物和/或抗原由細胞內化,導致免疫偶聯物殺傷其結合的癌細胞的治療效力提高。在優選的實施方案中,細胞毒性劑靶向或干擾癌細胞中的核酸。這些細胞毒性劑的實例包括美登木生物堿(maytansinoids),刺孢霉素(calicheamicins),核糖核酸酶和DNA核酸內切酶。
            根據已知方法,如靜脈內給藥,例如,作為丸藥,或通過一段時間的持續灌注,通過肌肉內,腹膜內,腦脊髓內(intracerobrospinal),皮下,關節內,滑液內,鞘內,口服,局部,或吸入途徑將所述制劑施用給人患者。優選靜脈內,肌肉內或皮下給藥抗體組合物,最優選靜脈內給藥。
            對于皮下遞送來說,可以通過注射器;注射裝置(例如INJECT-EASETM和GENJECTTM裝置);注射筆(如GENPENTM);無針裝置(例如MEDIJECTORTM和BIOJECTORTM);或皮下貼片遞送系統施用所述制劑。
            對于疾病的預防和治療來說,適當劑量的抗體將取決于如上所定義的待治療的疾病類型,疾病的嚴重性和進程,給藥抗體是為了預防性還是治療性目的,先前的治療,患者的臨床病史和對抗體的反應,以及主治醫生的判斷。將抗體一次性或經過一系列治療施用給患者。根據疾病的類型和嚴重性,大約1μg/kg到50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的HER2或DR5抗體是用于施用給患者的起始候選劑量,可以通過一次或多次分離的給藥,或通過連續灌注來進行。抗體的劑量一般為從大約0.05mg/kg到大約10mg/kg。如果施用化療劑,通常以其已知的劑量施用它,或任選地降低用量,因為施用化療劑會帶來藥物的組合作用或副作用。這類化療劑的制備和劑量方案可以根據生產商的說明書或醫師經驗確定來使用。這類化療的制備和劑量方案還在Chemotherapy Service Ed.,M.C.Perry,Williams & Wilkins,Baltimore,MD(1992)中進行了描述。
            其它治療性方案可以與抗體組合,包括,但不限于第二(第三,第四,等等)化療劑(即不同化療劑的混合物);另一種單克隆抗體;生長抑制劑;細胞毒性劑;化療劑;EGFR-靶向藥物;酪氨酸激酶抑制劑;抗血管生成劑;和/或細胞因子;等等。
            除了上面的治療方案之外,患者還可以進行手術去除癌細胞和/或放療。
            V.制造的商品在本發明的另一實施方案中,提供包含本發明的藥物制劑的制造商品,并提供其使用說明書。所述制造商品包括容器。合適的容器包括,例如,瓶子,小瓶(例如雙室小瓶),注射器(如雙室注射器)和試管。所述容器要以由許多材料如玻璃或塑料形成。所述容器盛有制劑,而在容器上或與之相關聯的標記可以標示用法說明。盛有制劑的容器可以是多用途小瓶,其允許反復施用重構的制劑(例如2-6次施用)。制造商品可以進一步包括從其它商業和用戶立場所需要的材料,包括其它緩沖液,稀釋劑,過濾器,針,注射器,以及在前部分所述的使用說明書的包裝插入物。
            通過參照下列實施例將會更加充分地理解本發明。不過,它們不應被視為限制本發明的范圍。將引用的所有文獻和專利并入本文作為參考。
            實施例穩定的Pertuzumab液體制劑這些實施例描述了穩定的液體制劑的研制和穩定性測試,所述液體制劑包含蛋白質濃度為大約10mg/mL-180mg/mL的Pertuzumab。選定的制劑具有低混濁度,并且在物理和化學上是穩定的。從該制劑中去除氯離子以減少溶蝕的危險。該制劑是等滲的,并且適于皮下或肌肉內遞送。利用組氨酸-醋酸鹽和蔗糖制劑防止振蕩(agitation stress)后形成不可溶的聚集物,無需包括聚山梨醇酯20。
            分析方法顏色,外觀和澄清度(CAC)在室溫白色熒光下通過相對于白色和黑色背景肉眼觀察小瓶來測定樣品的顏色,外觀和澄清度。
            UV濃度測量首先將液體產品用制劑緩沖液稀釋從而使278nm附近的Amax為0.5-1.0吸光度單位。在HP 8453分光光度計上在1cm徑長的石英杯中測量經稀釋樣品的UV吸光度。測量278nm和320nm的吸光度。將來自320nm的吸光度用于校正由于較大聚集物、泡沫和顆粒造成的背景光散射。相對于制劑緩沖液將測量調零。利用1.50(mg/mL)-1cm-1的吸收率來測定蛋白質濃度。
            pH測量利用RADIOMETER COPENHAGEN PHM82TMpH計于室溫測量pH。所用的探測器是與放射計連接器相組合的玻璃/參照電極(Sigma,Cat#E-5759)。使用pH 4.01和pH 7.00(EM Science)的標準溶液來校準所述pH計。
            離子交換層析(IEX)采用陽離子交換層析測量電荷變量的改變。這種測定采用在HP 1100TMHPLC系統上的DIONEX PROPAC WCX-10TM柱。用包含20mM MES pH 6.0的流動相A將樣品稀釋到1mg/mL。隨后將50mL的經稀釋樣品加載到保持環境溫度的柱上。利用包含20mM MES,250mM NaCl,pH 6.0的流動相B以淺NaCl梯度洗脫峰。于280nm監測洗脫物。利用HPCHEMSTATIONTM軟件(Rev A08.03)分析數據。
            毛細管區位電泳(CZE)通過CZE測定Fab和F(ab’)2片段的純度。將這一測定在BIORADBIOFOCUSTM3000TM毛細管電泳系統上以BIOCAP XLTM毛細管,50μmI.D.,44.6cm全長,和距離檢測儀40cm的條件跑電泳。
            大小排阻層析(SEC)使用大小排阻層析來量化聚集物和片段。這種測定利用TSK G3000SWXLTM,7.8×300mm柱并在HP 1100TMHPLC系統上運行。用流動相將樣品稀釋到10mg/mL并且注射體積為20μL。流動相為pH 6.8的100mMK2HPO4并且用等度梯度以0.5mL/min將蛋白質洗脫45分鐘。于280nm監測洗脫物的吸光度。利用HP CHEMSTATIONTM軟件(Rev A08.03)進行整合。
            生物學活性通過測量其抑制人乳癌細胞系MDA-MB-175-VII的增殖的能力來測定Pertuzumab的生物學活性。
            實施例1在下列緩沖液條件中以1.0mg/mL的蛋白質濃度來配制Pertuzumab Fab和F(ab’)2抗體片段10mM檸檬酸鹽,140mM NaCl,pH 4.0;10mM琥珀酸鹽,140mM NaCl,pH 5.0;10mM琥珀酸鹽,140mM NaCl,pH 6.0;10mM組氨酸,140mM NaCl,pH 7.0;和10mM甘氨酰甘氨酸(glycylglycine),140mM NaCl,pH 8.0。
            過濾每種制劑并等分到3cc WHEATONTMUSP I型玻璃瓶中,所述玻璃瓶用涂布TEFLONTM的灰色丁基合成橡膠塞子封口。將樣品保藏于40±2℃。藥物產品的穩定性分析顯示Fab和F(ab’)2在pH 5.0和6.0之間最穩定。
            表2.pH對保存于40℃的Fab或F(ab’)2的降解的效應

            實施例2
            用120mM蔗糖和0.02%聚山梨醇酯20將Pertuzumab配制到20mM組氨酸-醋酸鹽緩沖液中。用醋酸將制劑的pH調節到5.0和7.0之間的最終pH。蛋白質濃度為30mg/mL。將每種制劑填充入3cc USP I型玻璃瓶中并保存于40℃進行穩定性分析。結果顯示Pertuzumab在pH 6.0左右最穩定。
            表3.pH對保存于40℃的Pertuzumab的降解的影響

            實施例3在下列賦形劑中制備蛋白質濃度為100mg/mL的Pertuzumab制劑(1)10mM組氨酸-HCl,240mM蔗糖,0.02%聚山梨醇酯20,pH 6.0;(2)10mM組氨酸-醋酸鹽(histine-acetate),240mM蔗糖,0.02%聚山梨醇酯20,pH 6.0;(3)10mM組氨酸-磷酸鹽(histine-phosphate),240mM蔗糖,0.02%聚山梨醇酯20,pH 6.0;(4)10mM組氨酸-硫酸鹽(histine-sulfate),240mM蔗糖,0.02%聚山梨醇酯20,pH 6.0.
            將每種制劑填充入3cc FORMA VITRUMTMUSP I型玻璃瓶,所述玻璃瓶用FLUROTECTM面(faced)的丁基橡皮塞子封口。將樣品保存于30℃和40℃并對穩定性評估質量(CAC)和純度(SEC,IEC)。穩定性結果顯示于40℃保存后組氨酸-磷酸鹽緩沖液中的Pertuzumab比在其它組氨酸緩沖液中降解得快得多(圖8和圖9)。
            實施例4在下列緩沖液中通過超濾/滲濾將Pertuzumab濃縮至各種濃度(1)20mM組氨酸-醋酸鹽,pH 6.0;(2)10mM組氨酸-HCl,pH 6.0,和(3)10mM組氨酸-硫酸鹽,pH 6.0。
            在過濾前測量每種制劑的濁度。結果,如圖10中所示,表明在組氨酸-醋酸鹽和組氨酸-HCl中配制的Pertuzumab樣品比在組氨酸-硫酸鹽緩沖液中的樣品具有更少量的不溶性聚集物。
            實施例5Pertuzumab以30mg/mL配制在20 mM組氨酸-醋酸鹽,120mM蔗糖,0.02%聚山梨醇酯20,pH 6.0中。將Pertuzmab填充在316L和HASTELLOYTM不銹鋼微型罐中。將所有樣品保存于-20℃和5℃并評估質量(CAC),純度(SEC,IEC)和強度(UV-Vis)。穩定性分析顯示Pertuzumab在這種制劑中于-20℃和5℃保存至少3個月后是穩定的。無氯化物的制劑與316L和HASTELLOYTM不銹鋼罐是相容的。
            表4.在不銹鋼罐中Pertuzumab的穩定性


            a.顏色,外觀和透明度的通過澄清到微乳白色,無色到淺黃色溶液。
            實施例6利用切流過濾(TFF)來配制Pertuzumab。最終的制劑包含20mM組氨酸-醋酸鹽,120mM蔗糖,0.02%聚山梨醇酯20,pH 6.0,蛋白質濃度為30mg/mL。將樣品填充入20Ml FORMA VITRUMTMUSP I型玻璃瓶,所述玻璃瓶蓋用20mm FLUROTECTM面的丁基橡皮塞子加帽,并以鋁片蓋封口。將所有樣品保存于-70℃,5℃,15℃,并通過質量(CAC),純度(SEC,IEC),強度(UV-Vis),和勢能(Bio測定)評估穩定性。結果顯示Pertuzumab在這種制劑中于5℃和15℃保存至少3個月后是穩定的。
            表5.在玻璃瓶中的Pertuzumab的穩定性

            實施例7在下列緩沖液條件中配制100mg/mL的Pertuzumab(1)10mM組氨酸-HCl,pH 6.0;(2)10mM組氨酸-HCl,240mM蔗糖,pH 6.0;(3)20mM琥珀酸鹽pH 6.0;和(4)20mM琥珀酸鹽,240mM蔗糖pH 6.0.
            將每種制劑添加以不同濃度的聚山梨醇酯20。將所有樣品填充入3ccUSP I型玻璃瓶中并于室溫以70rpm水平攪動達7天。在第7天時間點上就濁度方面評估每個樣品的穩定性。結果表明在最終的制劑中使用聚山梨醇酯20有效防止了不溶性聚集物的形成。參見圖11。
            實施例8在下列制劑中制備Pertuzumab(1)25mg/mL Pertuzumab,10mM組氨酸-HCl,240mM蔗糖,pH 6.0;(2)50mg/mL Pertuzumab,10mM組氨酸-HCl,240mM蔗糖,pH 6.0;(3)60mg/mL Pertuzumab,20mM組氨酸-醋酸鹽,120mM蔗糖,pH 6.0.
            將各種量的聚山梨醇酯20添加到每種制劑中。將所有樣品填充入3ccUSP I型玻璃瓶中,并于室溫以70rpm水平攪動達7天。在第7天時間點上就濁度方面評估每個樣品的物理穩定性。結果表明使用組氨酸-HCl和蔗糖制劑中的聚山梨醇酯20有效防止了不溶性顆粒的形成。包含組氨酸-醋酸鹽和蔗糖的制劑對于蛋白質似乎具有與聚山梨醇酯20相同的保護性作用。參見圖12.
            實施例9如下配制Pertuzumab(1)100mg/mL蛋白質,10mM組氨酸-HCl,pH 6.0;(2)100mg/mL蛋白質,20mM琥珀酸鹽,pH 6.0;(3)60mg/mL蛋白質,20mM組氨酸-醋酸鹽,pH 6.0。
            將每種制劑混合以不同量的蔗糖。將所有樣品無菌裝入3cc USP I型玻璃瓶中。隨后將它們冷凍于-70℃并于5℃融解三次。在三個周期的凍融之后測定每個樣品的物理穩定性。結果表明蔗糖防止在凍融過程中形成可溶性聚集物。參見圖13。
            實施例10用于治療性用途的優選的Pertuzumab制劑基本上由20mM組氨酸醋酸鹽、120mM蔗糖、0.02%聚山梨醇酯20、pH 6.0中的30mg/mL Pertuzumab組成。

            MW分子量420mg劑量瓶配置小瓶20cc Formal Vitrum Type I glass塞子20mm DAIKYO GREYTM,氟-樹脂壓制帽20mm頂部鋁片滿裝體積14.50mL遞送物生理鹽水IV袋中的14.0mL Pertuzumab.
            1050mg劑量瓶配置小瓶50cc Formal Vitrum Type I glass塞子20mm DAIKYO GREYTM,氟-樹脂壓制帽20mm頂部鋁片滿裝體積36.0mL遞送物生理鹽水IV袋中的35.0mL Pertuzumab.
            實施例11本實施例涉及另一種Pertuzumab制劑,其已經用于I期和II期臨床試驗。該組合物由25mg/ml Pertuzumab,10mM組氨酸-HCl緩沖液,240mM蔗糖,0.02%聚山梨醇酯20,pH 6.0組成。

            實施例12細胞凋亡由內在和外在途徑介導。化療可以引發細胞損害并且可能通過響應細胞損害的內在途徑而促進凋亡。不過,癌細胞經常通過在p53腫瘤抑制劑基因中的突變形成對化療的抗性(Ashkenazi A.Targeting Death andDecoy Receptors of the Tumour-Necrosis Factor Superfamily.Nature Reviews2420-430(2002))。位于細胞表面上的死亡受體,如DR4和DR5,通過不包括p53的外在途徑促進凋亡。激動性分子,如Apo2L,結合DR4和DR5受體并通過Fas-關聯的死亡結構域激活胱天蛋白酶(caspase)8和10。胱天蛋白酶8和10隨后激活胱天蛋白酶3,6,和7以誘導凋亡。腫瘤細胞上的死亡受體的分子信號對于消除耐受傳統療法和分子像Apo2L的癌細胞有治療性效力,目前正對其進行臨床評估。
            “Apomab”是全長CHO衍生的人源化IgG1,構建有λ輕鏈。它是針對DR5的激動劑抗體,其已經顯示誘導各種癌細胞系的凋亡。利用鼠腫瘤植入模型的臨床前研究已經顯示Apomab與Apo2L相比具有類似或增強的腫瘤減小作用。正在將Apomab作為抗癌劑進行評估,其用于晚期實體腫瘤和非Hodgkin氏淋巴瘤(NHL)中。用在這些實驗中的Apomab的重和輕鏈氨基酸序列顯示在圖27和28中。
            抗體制劑的制備重組產生的Apomab具有非常稀的蛋白質濃度和高pH。將所述材料濃縮到大約20mg/mL并利用Millipore Labscale切流過濾(TFF)系統以MILLIPORE PELLICONTMXL,PLCGC10,50cm膜交換入20mM醋酸鈉,pH 5.0緩沖液中。利用沒有海藻糖和TWEEN 20的醋酸鈉,組氨酸醋酸鹽,和磷酸鈉將Apomab樣品配制入各種緩沖液系統中,pH從4.0到7.0,利用10,000Da分子量隔絕膜(Pierce,Inc)進行透析。在最后的透析中添加240mM的海藻糖。透析后,向制劑中加入0.02%TWEEN 20TM并用0.22μm濾器(Millipore,Inc.)過濾樣品。將0.5mL體積的Apomab裝入無菌3cc玻璃瓶(Forma Vitrum,Inc.)中并以13mm塞子(Daikyo,Inc)封閉。在-70℃,5℃,30℃,和40℃保存達3個月來評估蛋白質穩定性。
            Apomab制劑的穩定性對于藥物產品穩定性測試,將Apomab配劑品裝入5cc FORMAVITRUM玻璃瓶中。使小瓶裝填5.5mL的配制抗體,用20mm DAIKYO塞子封閉,并以頭朝上的位置保存于-70℃,5℃,30℃,和40℃。
            對于藥物物質穩定性測試,將Apomab配劑品通過0.22μm濾器進行無菌過濾并將10mL裝入高壓蒸汽處理過的20cc 316L不銹鋼小罐。將小罐頭朝上豎直放置于-20℃和5℃。于規定的時間間隔從小罐中無菌移取1mL等份試樣以評估蛋白質質量。對照小瓶為保存于-20℃中的3cc玻璃瓶中的1mL等份試樣。
            顏色,外觀和澄清度在室溫白色熒光下利用白色和黑色背景的觀察臺來肉眼評估樣品的澄清度,外觀和顏色。為了分析藥物物質,將小罐樣品轉移至3cc玻璃小瓶中進行檢查。
            pH以用來測量緩沖液的THERMO ORION SURE-FLOW ROSSTM半微pH電極或用來測量蛋白質pH篩選樣品的THERMO ORION GLSTM組合微pH電極,用于毒理學穩定性樣品的Beckman微電極在室溫測量pH。用pH 7和pH 4的緩沖液標準(EM Science)每天校準METERLABTMpHM240 pH/離子儀(Radiometer Analytical)。
            濃度利用AGILENT 8453TM分光光度計通過紫外線吸收光譜來測定蛋白質濃度。以合適的空白制劑緩沖液來稀釋樣品以給出從0.5到1.0的吸光度。用稀釋溶液將儀器調零并從240到500nm掃描光譜。從279nm納米處的吸光度減去320nm納米處的吸光度值以糾正偏移和光散射。通過下列等式來計算蛋白質濃度 最初將基于序列的吸收率系數測定為1.32cm-1(mg/mL)-1并將這個值用于pH篩選研究。通過氨基酸分析和蛋白質水解法測定的后來的值為1.7cm-1(mg/mL)-1并且將這個值用于用在毒理學研究中的Apomab的穩定性分析。
            離子交換層析在裝備了二極管陣列檢測器的1100系列HPLC(Agilent Technologies,Inc.)上進行離子交換層析。在PROPAC WCX-10TM(Dionex)柱(4×250mm)上以0.5mL/min的流速,柱溫度40℃進行層析。流動相A為25mM磷酸鈉,pH 6.5。流動相B為100mM氯化鈉,與流動相A在相同的緩沖液中。用100%流動相A平衡柱。對于pH篩選樣品將20mg量的Apomab加到柱上并于214nm監測吸光度。以下列梯度將蛋白質從柱上洗脫下來時間(min)%A%B0 1000500 100511000701000對于用在毒理學研究中的物質的穩定性分析,將30mg量的Apomab加到柱上并于280nm監測吸光度。以下列梯度將蛋白質從柱上洗脫下來梯度時間(min)%A%B0 100 040.040 6041.00 10045.00 10045.1100 060.0100 0大小排阻層析在裝備了二極管陣列檢測器的1100系列HPLC(Agilent Technologies,Inc.)上進行大小排阻層析。將50μg量的Apomab加到TSK凝膠3000SWXLTM(7.8×300mm)柱上并對pH篩選樣品以0.9mL/min的流速運行20分鐘,而對毒理學穩定性樣品以0.5mL/min的流速運行30分鐘,以0.20M磷酸鉀,0.25M氯化鉀,pH 6.2作為流動相。于280nm監測吸光度。
            效能效能生物測定的目的是利用ALAMARBLUETM測量Apomab殺傷Colo205細胞的能力。Colo205是一種結腸癌細胞系,它表達DR5和DR4死亡受體。這種測定包括基于代謝活性檢測的熒光/比色生長指示劑。ALAMARBLUETM是一種氧化還原染料,它在氧化狀態是藍色和非熒光性的。細胞內代謝還原作用將它轉變成紅色,這種紅色也是熒光性的。顏色和熒光的改變與活體細胞的代謝活性和數目成比例。當細胞死亡時信號降低。用抗Fc將Apomab稀釋在培養基中,隨后將Colo 205細胞加入到Apomab樣品中,于37℃溫育48小時。最后2-3小時加入ALAMARBLUETM。于530nm激發和590nm發射讀取培養板以得到相對熒光單位(RFU)。通過KALEIDAGRAPHTM分析數據。生成殺傷的稀釋曲線。
            結果制劑pH篩選研究利用由未增殖的穩定細胞系產生的Apomab研究pH對抗體穩定性的作用。對于這種分析,將Apomab以20mg/mL抗體配制在20mM醋酸鈉緩沖液中,pH4.0,4.5,5.0,5.5;20mM組氨酸醋酸鹽緩沖液中,pH 6.0和6.5;和20mM磷酸鈉緩沖液中,pH 7.0。所有制劑都包含240mM海藻糖和0.02%TWEEN 20。將制劑于-70℃,5℃,30℃,和40℃的溫度保存達3個月,并通過各種分析測定法,包括CAC,pH,濃度,SEC和IEC來測定蛋白質穩定性。在樣品保存過程中沒有觀察到CAC,pH或蛋白質濃度的顯著變化。
            通過SEC分析樣品顯示在5℃和-70℃保存期間沒有發生顯著的變化。不過,在30℃和40℃保存期間觀察到了降解,其表現抗體片段和可溶性的聚集物的形成(圖20)。為了比較制劑,監測保存期間抗體單體的動力學并且計算一級速率常數。對于抗體單體損失所獲得的pH速率曲線顯示在圖21中。通過在pH 6.0的組氨酸醋酸鹽緩沖液中配制而獲得了對于抗體單體穩定性的最佳條件。
            通過IEC監測Apomab電荷異質性。在5℃和-70℃保存期間沒有發生IEC曲線的顯著變化。不過,觀察到了降解,其表現根據制劑的不同而形成了酸性或堿性的變體(圖22)。通常,增強堿性的變體在較低的制劑pH下形成而更酸性的變體在較高的制劑pH下形成。為了比較制劑,在保存期間監測IEC主峰的動力學并計算一級速率常數。對于IEC主峰損失所獲得的pH速率曲線顯示在圖23中。通過IEC觀察到的速率常數比由SEC觀察到的常數高大約10倍(圖21)。所以,IEC主峰的損失是抗體的初步降解,其將最終限制產品的保存期。另外,通過SEC觀察到,通過在pH 6.0的組氨酸醋酸鹽緩沖液中配制而獲得了穩定IEC主峰的最佳抗體穩定性。
            在上述pH篩選數據的分析之后,選擇Apomab制劑,其包含20mM組氨酸醋酸鹽,240mM海藻糖,0.02%聚山梨醇酯20,pH 6.0中的20mg/mL抗體。對于藥物產品,藥瓶配置包括裝在5cc FORMA VITRUMTM小瓶中的5.5mL,所述小瓶帶有20mM DAIKYOTMWest塞子。將Apomab保存在不銹鋼罐中。
            在上述5cc玻璃瓶配置中評估Apomab藥物產品的穩定性。將小瓶保存于-70℃(對照),5℃,30℃,和40℃。于特定的時間間隔抽取樣品并通過下列測定進行分析顏色,外觀,澄清度(CAC),pH,蛋白質濃度,SEC,IEC,和效能。保存于-70℃和5℃的樣品的這些測定結果顯示在表6中,而保存于30℃和40℃的樣品的結果顯示在表7中。
            表6.保存于-70℃和5℃的Apomab的穩定性數據

            表7.保存于30℃和40℃的Apomab的穩定性數據

            NT=未定量在-70℃和5℃下保存12個月后沒有觀察到蛋白質質量的變化。例如,pH保持在6.0±0.3,Apomab呈現為澄清和無色液體,蛋白質濃度保持在20.0±2.0mg/mL,并且%單體未改變。另外,%IEC主峰沒有顯著變化而通過細胞殺傷效能測定確定的%比活性在60%到140%比活性的測定精度內。結果顯示保存在5cc玻璃瓶中的Apomab在5℃穩定至少12個月。
            表7顯示蛋白質質量的改變發生在30℃和40℃。SEC顯示%單體降低,伴隨著主要為片段的物質的增多。聚集物與更高溫度的情況一樣增多,但速率低得多。不過,聚集物在40℃、6個月后明顯增多。IEC%主峰降低,伴隨著酸性變體的相應增多。在40℃、2個月和30℃、9個月后堿性峰稍微降低。在40℃保存六個月后,降低發生到IEC主峰不再能整合的程度。細胞殺傷生物測量顯示在較高溫度下較長的保存時間導致%比活性的損失。蛋白質濃度和pH未改變。溶液在40℃、3個月和30℃、9個月后變得淺黃并且在40℃、9個月后變成黃色。
            藥物物質穩定性藥物物質的凍融穩定性數據顯示在表8中。
            表8.裝在小型不銹鋼罐中的Apomab的凍融穩定性數據

            表9.裝在小型不銹鋼罐中的Apomab的穩定性數據

            在-20℃冷凍至少15小時并在環境溫度下融解三次之后沒有觀察到蛋白質的化學特性顯著改變。例如,Apomab呈現為澄清和無色液體,pH保持在6.0±0.3,而SEC單體峰百分比未改變。
            在-20℃和5℃評估不銹鋼容器中的Apomab穩定性(表9)。
            于特定的間隔、在無菌條件下從小罐中抽取樣品并進行分析。
            就pH,CAC,蛋白質濃度和通過IEC獲得的%主峰而言,Apomab未顯示蛋白質質量的改變,但通過SEC可知每3個月損失0.1%的單體。在5℃保存3個月期間觀察到效力降低。不過,樣品的效力在6個月和9個月的時間點再次提高。所以,在3個月時間點的效力差異被歸結為測定偏差。通過pH,CAC,蛋白質濃度,SEC得到的%單體,IEC得到的%主峰,可見Apomab未顯示蛋白質質量的改變,并且效力沒有明顯改變。穩定性數據顯示Apomab在-20℃穩定至少1年而在5℃穩定三個月。
            結論進行制劑篩選研究以選擇Apomab制劑。利用醋酸鈉,組氨酸醋酸鹽,和磷酸鈉,與240mM二水海藻糖和0.02%聚山梨醇酯20一起作為緩沖液,pH范圍覆蓋了4.0到7.0的pH篩選顯示,Apomab在pH 6.0的溶液中最穩定。所以,開發了由20mM組氨酸醋酸鹽,240mM海藻糖,0.02%聚山梨醇酯2,pH 6.0組成的制劑,并且通過實驗證明是穩定的。利用這種制劑,顯示Apomab在5℃穩定至少12個月。另外,當保存在316L不銹鋼容器中時,顯示Apomab在-20℃穩定至少12個月而在5℃穩定三個月。當進行多達3次凍融循環時還顯示Apomab是穩定的。
            權利要求
            1.一種穩定的藥物制劑,其包括在組氨酸-醋酸鹽緩沖液、pH5.5-6.5中的單克隆抗體。
            2.權利要求1的制劑,其中所述pH為從5.8到6.2。
            3.權利要求1的制劑,其中所述組氨酸-醋酸鹽緩沖液濃度為從大約1mM到大約200mM。
            4.權利要求3的制劑,其中所述組氨酸-醋酸鹽緩沖液濃度為從大約10mM到大約40mM。
            5.權利要求1的制劑,其中所述抗體濃度為從大約10mg/mL到大約250mg/mL。
            6.權利要求5的制劑,其中所述單克隆抗體濃度為從大約20mg/mL到大約40mg/mL。
            7.權利要求5的制劑,其中所述單克隆抗體濃度為從大約80mg/mL到大約250mg/mL。
            8.權利要求1的制劑,其還包括糖。
            9.權利要求8的制劑,其中所述糖是二糖。
            10.權利要求8的制劑,其中所述糖是海藻糖。
            11.權利要求8的制劑,其中所述糖是蔗糖。
            12.權利要求8的制劑,其中所述糖濃度是從大約10mM到大約1M。
            13.權利要求12的制劑,其中所述糖濃度是從大約60mM到大約250mM。
            14.權利要求1的制劑,其還包括表面活性劑。
            15.權利要求14的制劑,其中所述表面活性劑是聚山梨醇酯。
            16.權利要求15的制劑,其中所述表面活性劑是聚山梨醇酯20。
            17.權利要求14的制劑,其中所述表面活性劑的濃度是從大約0.0001%到大約1.0%。
            18.權利要求17的制劑,其中所述表面活性劑的濃度是從大約0.01%到大約0.1%。
            19.權利要求1的制劑,其中所述單克隆抗體是全長抗體。
            20.權利要求19的制劑,其中所述單克隆抗體是IgG1抗體。
            21.權利要求1的制劑,其中所述單克隆抗體是人源化抗體。
            22.權利要求1的制劑,其中所述單克隆抗體是包括抗原-結合區的抗體片段。
            23.權利要求22的制劑,其中所述抗體片段是Fab或F(ab’)2片段。
            24.權利要求1的制劑,其是無菌的。
            25.權利要求1的制劑,其中所述單克隆抗體結合選自HER2,CD20,DR5,BR3,IgE和VEGF的抗原。
            26.權利要求25的制劑,其中所述抗原是CD20而單克隆抗體是人源化的2H7。
            27.權利要求25的制劑,其中所述抗原是VEGF而所述單克隆抗體是Bevacizumab。
            28.權利要求1的制劑,其中所述單克隆抗體易于發生脫酰胺或聚集。
            29.權利要求1的制劑,其在大約40℃保存至少4周的情況下是穩定的。
            30.權利要求1的制劑,其在于大約5℃或大約15℃保存至少3個月的情況下是穩定的。
            31.權利要求1的制劑,其在于大約-20℃保存至少3個月的情況下是穩定的。
            32.權利要求1的制劑,其在凍融的情況下是穩定的。
            33.權利要求1的制劑,其是水性的。
            34.權利要求1的制劑,其是冷凍的。
            35.權利要求1的制劑,其不是凍干的并且先前未對其進行過凍干。
            36.權利要求35的制劑,其是水性的并可施用于受試者。
            37.權利要求36的制劑,其中所述制劑用于經靜脈內(IV),皮下(SQ)或肌肉內(IM)給藥。
            38.權利要求37的制劑,其用于經IV給藥,所述抗體濃度為從大約20mg/mL到大約40mg/mL。
            39.權利要求37的制劑,其用于SQ給藥,所述抗體濃度為從大約80mg/mL到大約250mg/mL。
            40.一種帶可被注射器穿透的塞子的小瓶,該小瓶中包含權利要求1的制劑。
            41.權利要求40的小瓶,其保存于大約2-8℃。
            42.權利要求40的小瓶,其是20cc或50cc的小瓶。
            43.一種不銹鋼罐,在罐中包含權利要求1的制劑。
            44.權利要求43的罐,其中的制劑是冷凍的。
            45.一種治療受試者中的疾病或病癥的方法,包括向受試者施用可有效治療所述疾病或病癥的量的權利要求1所述的制劑。
            46.一種藥物制劑,其包括(a)易于發生脫酰胺或聚集的全長IgG1抗體,其量為大約10mg/mL到大約250mg/mL;(b)組氨酸-醋酸鹽緩沖液,pH5.5-6.5;(c)選自海藻糖和蔗糖組成的組的糖,其量為大約60mM到大約250mM;和(d)聚山梨醇酯20,其量為大約0.01%到大約0.1%。
            47.一種減少治療性單克隆抗體的脫酰胺或聚集的方法,包括在組氨酸-醋酸鹽緩沖液,pH5.5-6.5中配制抗體。
            48.權利要求47的方法,包括在抗體的配制之前或之后評估任何抗體脫酰胺或聚集。
            49.一種藥物制劑,其包含在pH大約5.5到大約6.5的組氨酸緩沖液中的結合HER2的結構域II的抗體,糖和表面活性劑。
            50.權利要求49的制劑,其中緩沖液是組氨酸-醋酸鹽。
            51.權利要求49的制劑,其中HER2抗體包含分別在SEQ ID Nos.3和4中的可變輕鏈氨基酸序列和可變重鏈氨基酸序列。
            52.權利要求51的制劑,其中HER2抗體包含選自SEQ ID No.15和23的輕鏈氨基酸序列,和選自SEQ ID No.16和24的重鏈氨基酸序列。
            53.權利要求49的制劑,其中制劑的pH為大約5.8到大約6.2。
            54.權利要求49的制劑,其中抗體結合HER2的結構域I、II和III之間的接合部。
            55.權利要求49的制劑,其中抗體是全長抗體。
            56.權利要求49的制劑,其中抗體濃度為大約20mg/mL到大約40mg/mL。
            57.一種藥物制劑,其包含大約20mg/mL到大約40mg/mL的量的Pertuzumab,組氨酸-醋酸鹽緩沖液,蔗糖和聚山梨醇酯20,其中所述制劑的pH從大約5.5到大約6.5。
            58.權利要求57的制劑,其包含大約30mg/mL的Pertuzumab,大約20mM的組氨酸-醋酸鹽,大約120mM的蔗糖,和大約0.02%的聚山梨醇酯20,其中所述制劑的pH為大約6.0。
            59.一種帶可被注射器穿透的塞子的小瓶,其中包含權利要求49的制劑。
            60.一種不銹鋼罐,在該罐中包含權利要求49的制劑。
            61.一種治療受試者中的HER2表達型癌癥的方法,包括向受試者施用有效治療所述癌癥的量的權利要求49的藥物制劑。
            62.權利要求61的方法,其中將所述制劑經靜脈內、皮下,或肌肉內施用給受試者。
            63.制備藥物制劑的方法,包括(a)制備權利要求1的制劑;和(b)評估該制劑中單克隆抗體的物理穩定性,化學穩定性或生物學活性。
            64.一種藥物制劑,其包括在pH大約5.5到大約6.5的組氨酸緩沖液中的DR5抗體,糖和表面活性劑。
            65.權利要求64的制劑,其中所述緩沖液是組氨酸-醋酸鹽。
            66.權利要求64的制劑,其中DR5抗體是激動劑抗體。
            67.權利要求64的制劑,其中DR5抗體是Apomab。
            68.權利要求67的制劑,其中DR5抗體包含SEQ ID No.51的重鏈氨基酸序列和SEQ ID No.52的輕鏈氨基酸序列。
            69.權利要求64的制劑,其中所述制劑的pH為大約5.8到大約6.2。
            70.權利要求64的制劑,其中所述抗體是全長抗體。
            71.權利要求64的制劑,其中所述抗體濃度為大約10mg/mL到大約30mg/mL。
            72.一種藥物制劑,其包含從大約10mg/mL到大約30mg/mL的量的Apomab,組氨酸-醋酸鹽緩沖液,海藻糖和聚山梨醇酯20,其中所述制劑的pH為大約5.5到大約6.5。
            73.權利要求72的制劑,其包括大約20mg/mL的Apomab,大約20mM的組氨酸醋酸鹽,大約240mM的海藻糖,和大約0.02%的聚山梨醇酯20,其中所述制劑的pH為大約6.0。
            74.一種帶可被注射器穿透的塞子的小瓶,其中包含權利要求64的制劑。
            75.一種不銹鋼罐,在該罐中包含權利要求64的制劑。
            76.一種治療受試者中癌癥的方法,包括向受試者施用有效治療所述癌癥的量的權利要求64的藥物制劑。
            77.權利要求76的方法,其中所述癌癥是實體腫瘤。
            78.權利要求76的方法,其中所述癌癥是非何杰金氏淋巴瘤。
            79.權利要求76的方法,其中將所述制劑經靜脈內、皮下,或肌肉內施用給受試者。
            全文摘要
            本申請描述了抗體制劑,其包含在組氨酸-醋酸鹽緩沖液中配制的單克隆抗體,以及包含結合HER2的結構域II的抗體(例如,Pertuzumab)的制劑,和包含結合DR5的抗體(例如,Apomab)的制劑。
            文檔編號A61K47/18GK101084015SQ200580043463
            公開日2007年12月5日 申請日期2005年10月19日 優先權日2004年10月20日
            發明者詹姆斯·D·安迪亞, 魏俊湘, 劉駿, 沈曄 申請人:健泰科生物技術公司
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