專利名稱：含有mj1基因的重組載體和使用其的重組方法
技術領域：
本發明涉及一種含有MJ1基因的重組載體及其使用該重組載體的重組(site-specific integration)方法，其中所述的MJ1基因編碼一種源自腸球菌(Enterococcus)溫和噬菌體FC1的整合酶。更具體而言，本發明涉及一種含有MJ1基因的重組載體，所述基因可獨立地在人體細胞中產生位點特異性重組而不需其它因子并且不造成切除，本發明還涉及使用所述載體的重組方法。
背景技術：
糞腸球菌(Enterococcus faecalis)是一種革蘭氏陽性厭氧菌，其通常存在于從蟑螂到人類的大部分動物的腸內。在發明人的實驗室中經過紫外照射誘導后(Kim et al.，(1994)Mol.Cell.，4，155-158)首次從溶源性菌株KBL703的培養物中分離到E.faecalis KBL703菌株和其溫和噬菌體FC1。細菌噬菌體FC1具有約為40.5Kbp的雙鏈DNA基因組，頭部為20面體和尾部為非收縮尾鞘。噬菌體FC1通過位點特異機制整合到宿主染色體中。已鑒定出MJ1基因位于attP位點上游，該基因編碼一種位點特異性整合酶。MJ1編碼一段465個氨基酸的多肽，并在其N-端結構域和位點特異性整合酶相似。在attP區域附近對DNA序列的分析鑒定出兩個預測的細菌-噬菌體接合區域(attL和attR)。從這些區域的序列中推斷出相應的細菌附著位點(attB)(Kim et al.，(1996)Biochem.Mol.Biol，29，448-45412)。
整合酶MJ1介導兩個DNA識別序列之間的單向位點特異性重組，所述的兩個序列是噬菌體附著位點attP和細菌附著位點attB。為了完成整合，溫和噬菌體FC1編碼一種整合酶MJ1，MJ1介導attP和attB之間的整合。在290bp的attB序列中，attB位點有3bp的保守核心序列，其與730bp的attP的3bp保守核心序列重疊。圍繞核心序列，attP和attB各占其序列的一半，從而形成attL、attR和重復3bp核心序列(Yang et al.，(2002)J.Bacteriol.，184，1859-1864)。
在基因治療中，載體是用于將目的基因轉移到靶細胞中的工具。問題在于，并沒有一種“良好的通用載體”，目前可以得到的所有載體既有優點也有不足。例如，一種病毒載體可能可以非常高效地進入靶細胞，但是一旦進入就產生強烈的免疫應答，導致該細胞被免疫系統殺死，從而，首先對宿主安全造成了威脅。因此，很顯然原來在病毒和非病毒載體之間清晰的界限變得更加模糊。由于這些原因，開發安全的整合系統以獲得基因是非常重要的。然而，普遍的用于將外源基因放置到基因組中的原始方法，現有技術通常是隨機整合。對于引入DNA的位置缺乏控制，導致不可預知的基因表達和重要基因潛在的不期望的突變。一個好的解決方法是可以在靶基因組中制造高效位點特異性整合入安全位點。在這些情況下，保守位點特異性重組在基因工程策略上是很重要的。
位點特異性重組酶也具有高度專一性，另外，其作用效率更高。一些重組酶不需要輔助因子，允許其在外源細胞環境中具有活性。重組酶例如Cre和FLP在同一靶位點既可以整合也可以切除(Sauer，B.(1994)Curr.Opin.Biotechnol.，5，521-527)。因此盡管這些重組酶可高效地實現在哺乳動物細胞的整合，但由于其切除反應，它們所介導的凈整合頻率很低。為了在特異位點穩定并且高效的表達目的基因，必須要解決例如低整合效率和穩定性的問題。
本發明鑒定出源自糞腸球菌FC1的整合酶MJ1在效率和穩定性上是很好的實例。
發明內容
(技術問題)本發明提供了一種含有MJ1基因的重組載體，所述基因編碼具有氨基酸序列SEQ ID No.2的整合酶，其中該整合酶在動物細胞中介導位點特異性重組而不介導切除。
根據本發明權利要求1的重組載體，MJ1基因可以具有任何能編碼具有氨基酸序列SEQ ID No.2的整合酶的堿基序列。優選地，MJ1基因具有SEQ ID No.1的堿基序列和具有如圖3所示的質粒圖譜的重組載體。
本發明提供一種在動物細胞中進行位點特異性重組的方法，所述方法包括用一含有編碼具有氨基酸序列SEQ ID No.2的整合酶的MJ1基因的重組載體，一含有attB基因的重組載體和一含有attP基因的重組載體共轉染動物細胞。
在本發明的方法中，重組載體可以是任何具有MJ1基因，attB基因或者attP基因的重組載體。優選地，MJ1基因具有序列SEQ ID No.1的堿基序列和含有MJ1基因的重組載體具有如圖3所示的質粒圖譜。
(技術方案)在本發明中，顯示源自糞腸球菌的FC1的整合酶MJ1在人細胞以及大腸桿菌(E.coli.)中也發揮作用。在染色體外載體系統中，構建了含有attP，attB和整合酶MJ1編碼序列的每個質粒并共轉染到人細胞系HEK293T(圖1～7)。在MJ1存在或不存在時，通過綠色熒光蛋白(GFP)作為報告標記對位點特異性重組和反向切除反應進行監測。帶有attB(pcB)基因和整合酶MJ1編碼基因(pcMJ1)的質粒具有細胞巨化病毒(CMV)啟動子。然而，同時帶有attP和GFP的質粒(pGP(-))由于沒有CMV啟動子而不能表達GFP，因此不能構建重組質粒(pREC-I)。由此，當attP和attB被attL和attR代替時可觀察到位點特異性切除反應。
此外，已經確認在染色體外載體系統中，MJ1整合酶在人體細胞中沒有任何輔助因子下起作用，以及整合酶MJ1的效率由于無切除而更高。而且att位點的幾百堿基對可以減少到大約50bp。
在本發明中，attP指在細菌噬菌體的附著位點(739bp)和attB指在細菌的附著位點(290bp)。以及，attL和attR指由在attP和attB之間位點特異性重組所產生的左側區域(404bp)和右側區域(624bp)。
為了克隆attB，使用細菌噬菌體FC指示菌菌株腸球菌KBL707(保藏號KFCC 12177)的基因組DNA作為PCR的模板，所述菌種由韓國微生物保藏中心(KCCM)保藏。至于attL和attR，使用KBL703菌株(Kim et al.Mol.Cells4；155-158)的基因組DNA作為PCR模板，其染色體和細菌噬菌體FC整合。對于attP，使用插入了7.7kbFC1的DNA的pFE1作為PCR模板(Kim andY.W.1999.Genetic studies of bacteriophage FC1 from Enterococcus faecalis.PH.D.Thesis.Korea University.Korea)。
在本發明中，SEQ ID No.1顯示了MJ1基因的堿基序列而SEQ ID No.2顯示了MJ1整合酶的氨基酸序列。此外，SEQ ID No.3顯示了attP基因的堿基序列和SEQ ID No.4顯示了attB的堿基序列。
對attP和attB位點最小區域的檢測對于利用高效策略進行基因治療是非常有價值的。利用已經報道的739bp的attP和290bp的attB全長對于有效的基因治療太長了。因此進行基于MJ1結合位點在att處的attP和attB套式缺失以找到att位點的最小區域。這些結果證明attP和attB的有效最小區域是54bp(SEQID No.3中166-233堿基)和48bp(SEQ ID No.4中66-113堿基)，以及這個區域大小對于MJ1介導的整合已經足夠發揮作用。
在本發明的具體實施例中，對細菌和細菌噬菌體進行培養，構建含有MJ1基因，attP或attB位點的質粒，使用所述質粒共轉染人胎兒腎細胞系293，測定GFP報告基因的熒光活性，在動物細胞中進行MJ1基因的RT-PCR，進行FACS(流式細胞儀)分析，并確定attP和attB的整合以及attL和attR的切除。
通過
具體實施例方式
的描述并參考附圖，本發明的上述和其他特性及優點將更加顯而易見，其中圖1是含有290bp attB基因和CMV啟動子的pcB載體的質粒圖譜。
圖2是含有739bp attP基因和不包括CMV啟動子但有GFP報告基因的pGP(-)載體的質粒圖譜。
圖3是含有本發明的MJ1基因的pcMJ1載體的質粒圖譜。
圖4是含有624bp attL基因和CMV啟動子的pcL載體的質粒圖譜。
圖5是含有404bp attR基因和不包括CMV啟動子但有GFP報告基因的pGR(-)載體的質粒圖譜。
圖6是由于和PcB，pGP(-)以及pcMJ1共轉染整合形成的pREC-I載體的質粒圖譜。
圖7是由于和PcL，pGR(-)以及pcMJ1共轉染整合形成的pREC-E載體的質粒圖譜。
圖8是MJ1在293T細胞中表達的圖像。
圖9是共聚焦顯微鏡下顯示的在293T細胞中整合結果的圖像。
圖10是顯示沒有MJ1的GFP表達的FACS數據。(Y軸是細胞數而X軸是GFP表達水平)圖11是顯示有MJ1的GFP表達的FACS數據。(Y軸是細胞數而X軸是GFP表達水平)圖12是顯示圖10和11的量化數值的圖表。
圖13是共聚焦顯微鏡下顯示的在293T細胞中切除結果的圖像。
圖14是顯示attP和attB的套式缺失的模式圖。
圖15是由于attP和attB位點區域大小得到的整合效率的圖表。
具體實施方式
通過下述具體實施例將更加具體地描述本發明。下述具體實施例是為了解釋說明發明目的，而并不限制本發明的范圍。
實施例1細菌和細菌噬菌體的培養在Todd Hewitt肉湯培養基中(THBDifco Co.U.S.A)，37℃靜止培養糞腸球菌KBL703菌株和KBL707菌株(保藏號KFCC 12177)。E.Coli(DH5)在LB培養基于37℃振蕩培養。使用紫外照射從糞腸球菌KBL703中誘導溫和細菌噬菌體FC1并純化。本發明所用細菌菌株和質粒如表1所示。
表1
實施例2用于轉染到動物細胞中的質粒的構建為了合成大約1500bp的MJ1整合酶基因，290bp的attB基因和347bp的attL基因，使用細菌噬菌體FC1的DNA和KBL707以及KBL703的基因組DNA作為模板和如表2所示的引物進行PCR反應。在pcDNA3(Invitrogen Carsbad，CA)的BamHI和EcoRI位點或者HindIII和BamHI位點對PCR產物進行亞克隆而構建pcMJ1(圖3)，pcB(圖1)和pcL(圖4)。
通過從pEGFP-N1(ClonTech，Palo Alto，CA)上切除其上小的NdeI-BglII片段并使用klenow處理進行平末端自連接構建質粒pG(-)。通過對使用表2引物擴增的attP和attR的PCR產物進行亞克隆得到質粒pGP(-)(圖2)和pGR(-)(圖5)。本發明用作引物的合成寡核苷酸如表2所示。
表2
實施例3轉染和熒光顯微分析在追加了10％熱-滅活胎牛血清(FBS)和100U/ml青霉素的Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)100mm的平板中培養人胚腎細胞293T(American TypeCulture Collection，Manassas，Va)。細胞被分開到8個六孔培養板或60mm的平板上并生長直至約50％發生融合。在實施例2中制備的攜帶attP，attB和MJ1編碼序列的質粒通過磷酸鈣方法等量轉染(6μg或3μg總DNA)。
轉染了的細胞在蓋玻片上生長并置于6孔培養板上。培育72h后，在共聚焦熒光顯微鏡下(Zeiss)檢測細胞的GFP表達。轉染效率由在被轉染細胞中的熒光細胞百分數測定。
實施例4反轉錄-PCR(RT-PCR)使用TrIzol試劑(Invitrogen)從pcMJ1轉染的293T細胞中提取總RNA。使用SUPERSCRIPT II RNase-反轉錄酶(Invitrogen)和pfu DNA聚合酶(Promega)進行反轉錄和PCR擴增。GAPDH基因表達水平作為內部對照和表2描述了引物的序列。PCR反應進行25個循環，條件是94℃5min，94℃20s，52℃30s和68℃40s。用1.5％瓊脂糖凝膠對PCR產物進行分析和用溴化乙錠染色以顯影。如圖8所示，和內部對照基因GAPDH相比，MJ1的RNA表達水平顯著提高。PCR產生了帶有MJ1編碼區域的特異引物對的320bp產物(圖8)。RT-PCR顯示整合酶MJ1在人細胞中異位表達。
實施例5熒光激活細胞分選(FACS)分析對GFP的表達進行FACS分析。在轉染后72h，收集細胞，用3ml 5mM的EDTA/PBS重懸并沖洗兩次，然后固定到300μl 0.1％BSA和0.05％NaN3/PBS中。用使用CellQuset程序(Becton Dickinson)的FACScan分析儀(Becton DickinsonImmunocytometry Systems)進行FACS分析。
下面，將對證明了上述提及的本發明實施例結果的實驗結果進行公開。
實驗例1位點特異性重組或切除不同結構可以控制整合反應(attP×attB)或者切除(attL×attR)。為了測定MJ1在整合反應中的作用，293T細胞和質粒pcB和pGP(-)，以及和pcMJ1或者不和pcMJ1一起進行共轉染。72小時后，用共聚焦顯微鏡觀察細胞。只在由MJ1-介導整合產生的質粒pREC-I(圖6)中，發生GFP的表達(圖9A)。作為對比，在沒有MJ1的共轉染細胞中如預料一般未觀察到GFP的表達(圖9B)。為了顯示每種情況都不是因為啟動子，也分別對在有CMV啟動子和沒有CMV啟動子下，和質粒pGP(+)或pGP(-)轉染的細胞進行了共聚焦顯微鏡觀察(圖13)。如預期，在只用pGP(-)轉染的細胞中沒有觀察到GFP的表達。為了調查整合效率，用質粒pcB和pGP(-)以及和MJ1表達質粒pcMJ1或者不和pcMJ1一起轉染293T細胞并且在轉染72小時后對細胞進行FACS分析。表明了在MJ1存在或不存在情況下轉染細胞的熒光性的柱狀圖如圖10和圖11所示。在沒有MJ1的情況下，和帶有att位點的質粒一起轉染的細胞顯示396個熒光細胞(圖10)。相反，在MJ1存在時，整合反應中的熒光細胞數為1237，所以如圖12所示其差距達到大約4倍。
對于切除，帶有attR(pGR(-))和attL(pGL)而不是pGP(-)的質粒和pcB共轉染到293T細胞中。其結果是，與整合形成對比，沒有觀察到GFP表達(圖13A)。為了證明此結果不是由啟動子造成，用共聚焦顯微鏡分別對和帶有或者不帶有CMV啟動子的質粒pGR(+)或者pGR(-)一起轉染的細胞進行觀察。pGR(+)，而不是pGR(-)顯示出GFP活性(圖13B和13C)。這一結果表明推定的重組質粒pREC-E(圖7)不是由MJ1產生。結果顯示MJ1催化的切除不在attL和attR之間發生。
已證明在人細胞染色體外載體基礎上，MJ1高效介導attP和attB之間位點特異性整合，但是MJ1-催化的切除在attR和attL之間并不發生。
實驗例2attB和attP之間最小區域的測定在本發明之前，沒有關于對MJ1起作用的attB和attP之間最小區域的報道。為了最小化這些att位點的作用區域，使用attB和attP的套式缺失克隆(圖14)進行上述位點特異性整合分析系統的測定。在已知的MJ1結合位點周圍通過套式缺失得到每個帶有3bp保守核心序列的缺失位點的質粒。通過單鏈寡核苷酸退火得到含有不同長度的att位點的短的雙鏈接頭分子。使用這些缺失位點以代替pGP(-)和pcB質粒中的全長att位點，質粒和pcMJ1或不和pcMJ1共轉染以及通過FACS分析測定整合效率。
結果是，圖15顯示了由于attP和attB位點區域大小得到的整合效率。和質粒pcMJ1一起或者不和其一起轉染的細胞的差異由個數值％表示。整合效率的不隨attP以及attB位點的減小而降低。然而，整合效率由54bp attP和48bp attB之間的整合效率逐漸降低。在最終的分析中，在50bp attP和44bp attB之間幾乎所有整合作用都沒有。這些結果證明attP和attB之間有效的最小區域是54bp(SEQ ID No.3中166-233堿基)和48bp(SEQ ID No.4中66-113堿基)，和這一大小足夠MJ1在整合中起作用。
(工業實用性)整合酶MJ1在構建基因轉移系統中比其它病毒載體或存在的基因轉移系統有更多的優點。
第一，MJ1不需要任何糞腸球菌-特異性輔助因子進行位點特異性重組。相反，λ噬菌體在兩種類型的重組都需要IHF，并且許多類型的重組都需要IHF，包括噬菌體HK022和HP1(Dorgai et al.，(1998)J.Mol.Biol.，277，1059-1070)。
本發明證明發生在人細胞attP和attB之間的位點特異性重組如觀測的GFP表達一樣，只需要整合酶MJ1而不需要任何輔助因子。
第二，不像其它來自噬菌體的同時介導整合和切除的整合酶(重組酶)，整合酶MJ1只顯示出整合的作用。有報道來自噬菌體HK022的整合酶(重組酶)可以在鼠NIH3T3細胞中進行整合(attP/attB)和切除(attL/attR)重組(kolot et al.，(1999)Mol.Biol.Rep.，26，207-213)。在本發明中，MJ1只介導整合，并且被整合的基因不被從宿主基因組中切除，所以期望的基因可以被連續表達。
第三，已顯示attB和attP位點的最小區域48bp和54bp使得MJ1介導整合。似乎可以在與原始att序列(Thyagarajan et al.，(2000)Gene，244)高度相似的真核基因組自然發生的假-att位點完成這一整合。與att位點良好匹配的預期的稀有度可以限制整合到小量染色體假-att位點，這可以在染色體內部位置產生可用的整合頻率。
除了這些優點，MJ1-介導的位點特異性整合系統對于基因轉移系統的改進是有益的。由于這一系統使得插入的基因整合到宿主基因組DNA假位點而使得影響必須基因的表達或/和干擾宿主細胞機制的可能性必然降低。另外來自噬菌體的整合酶可以轉移大于10kb的插入基因到靶位點，使得許多數十kb-大小的噬菌體聚集，由于噬菌體可以通過其本來的整合酶轉移性將其全噬菌體基因組整合到細菌基因組。
序列表1138 2007-4-5<110>高麗大學校產學協力團<120>含有MJ1基因的重組載體和使用該重組載體的位點特異性整合方法<130>PU050022JP<150>KR2004-0107077<151>2004-12-16<160>4<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>1392<212>DNA<213>細菌噬菌體FC1(Bacteriophage FC1)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1392)<400>1atg aaa cgt gca gca ttg tat ata cgt gta tcc aca atg gaa caa gcc48Met Lys Arg Ala Ala Leu Tyr Ile Arg Val Ser Thr Met Glu Gln Ala1 5 10 15aag gaa gga tac agc att ccc gca caa aca gat aaa cta aaa gct ttt96Lys Glu Gly Tyr Ser Ile Pro Ala Gln Thr Asp Lys Leu Lys Ala Phe20 25 30gca aaa gca aaa gat atg gca gtt gca aaa gta tat act gat cca ggg 144Ala Lys Ala Lys Asp Met Ala Val Ala Lys Val Tyr Thr Asp Pro Gly35 40 45ttt tca gga gca aaa atg gag cgc cct gca tta caa gaa atg ata tct 192Phe Ser Gly Ala Lys Met Glu Arg Pro Ala Leu Gln Glu Met Ile Ser50 55 60gat att caa aat aaa aaa att gat gtg gtt cta gtc tac aaa tta gac 240Asp Ile Gln Asn Lys Lys Ile Asp Val Val Leu Val Tyr Lys Leu Asp65 70 75 80agg ctt tca cgt tca caa aag aat aca ttg tat tta att gaa gat gta 288Arg Leu Ser Arg Ser Gln Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Ile Glu Asp Val85 90 95ttt cta aaa aat aat gta gac ttt atc agc atg caa gaa agc ttt gac 336Phe Leu Lys Asn Asn Val Asp Phe Ile Ser Met Gln Glu Ser Phe Asp100 105 110aca tca aca cct ttt ggc cgt gcg acg ata gga atg tta tcc gtt ttt 384Thr Ser Thr Pro Phe Gly Arg Ala Thr Ile Gly Met Leu Ser Val Phe115 120 125gca caa tta gag cga gac aca att aca gaa aga atg cac atg gga aga 432Ala Gln Leu Glu Arg Asp Thr Ile Thr Glu Arg Met His Met Gly Arg130 135 140aca gaa cgt gca aaa caa gga tac tat cac gga agt ggc att gtt ccc 480Thr Glu Arg Ala Lys Gln Gly Tyr Tyr His Gly Ser Gly Ile Val Pro145 150 155 160tta ggt tac gat tat gtg cat gga gaa tta att atc aat gat tac gag 528Leu Gly Tyr Asp Tyr Val His Gly Glu Leu Ile Ile Asn Asp Tyr Glu165 170 175gcg caa att att caa gaa atc tat gat tta tat gtg aac caa ggt aaa 576Ala Gln Ile Ile Gln Glu Ile Tyr Asp Leu Tyr Val Asn Gln Gly Lys180 185 190gga cag caa tat ata aca aaa cgt atg gtt gca aaa tac cca gat aag 624Gly Gln Gln Tyr Ile Thr Lys Arg Met Val Ala Lys Tyr Pro Asp Lys195 200 205
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權利要求
1.一種含有編碼整合酶的MJ1基因的重組載體，所述整合酶具有SED IDNo.2所示氨基酸序列，其中該整合酶介導在動物細胞中的位點特異性重組，而不介導切除。
2.根據權利要求1所述的重組載體，其中MJ1基因具有SED ID No.1的堿基序列和重組載體具有圖3所示的質粒圖譜。
3.一種在動物細胞中進行位點特異性重組的方法，包括用一含有根據權利要求1的MJ1基因的重組載體、一含有attB基因的重組載體以及一含有attP基因的重組載體共轉染該動物細胞。
4.根據權利要求3的方法，其中所述重組載體是根據權利要求2的重組載體。
全文摘要
本發明涉及一種含有MJ1基因的重組載體及使用該重組載體的重組方法，其中所述的MJ1基因編碼一種源自腸球菌(Enterococcus)溫和噬菌體φFC1的整合酶。更具體而言，本發明涉及一種含有MJ1基因的重組載體，所述基因可獨立地在人細胞中產生位點特異性重組而不需其它因子并且不造成切除。因此，本發明對于哺乳動物的基因治療非常有用。
文檔編號A61K48/00GK101072878SQ200580041683
公開日2007年11月14日 申請日期2005年12月16日 優先權日2004年12月16日
發明者張孝一, 崔孝淑 申請人:高麗大學校產學協力團