新型抗微生物肽的制作方法

專利名稱：新型抗微生物肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有SEQ ID NO1所示序列的肽在用于制備抗微生物組合物中的用途，所述肽的序列中至少有一個氨基酸殘基被取代，以提高該肽的效力。上述組合物可用作抗微生物，例如細菌、病毒、真菌、包括酵母或寄生蟲的藥物組合物。
背景技術：
哺乳動物，例如人類的免疫系統能夠成功地抵御幾種感染。然而某些情況下并不總能清除細菌、真菌或病毒，這會導致發生局部或全身性的急性感染。這對于處于圍產期、燒傷或需要特別護理的病患以及免疫缺陷的個體來說，都是需要嚴重關注的情況。在另外的情況下，細菌連續的存在于上皮表面將導致發生或惡化慢性疾病。在人類中，這樣的情況可例舉出慢性皮膚潰瘍、特應性皮炎或其它類型的濕疹、痤瘡或泌尿生殖器感染等。
有多種藥物可治療有癥狀的感染。一些病癥還可采用現有的疫苗進行治療。然而疫苗并不總是最佳的治療方案，而且對于有些微生物并無相應的可用的疫苗。當沒有可行的保護措施時，就必須對疾病進行治療。通常的治療都采用殺死微生物的抗生素藥物。然而近幾年來很多微生物已經對抗生素變得具有抗藥性。抗藥性問題極有可能在近期內愈發變得嚴重。另外，一些人群逐漸發展為對抗生素藥物的敏感體質，因此減少了有效使用某些抗生素藥物的可能性。
多種器官的上皮表面是持續地暴露于細菌環境下的。近年來認為基于抗微生物肽(antimicrobial peptide)的先天的免疫系統在啟動對處于易被感染的生物界的細菌的清除中發揮重要作用(Lehrer，R.I.，and Ganz，T.(1999)Curr Opin Immunol 1123-27，Boman，H.G.(2000)Immunol.Rev.173，5-16)。抗微生物肽通過透過細菌的細胞膜殺死細菌，因此其缺少特異性的分子微生物靶，這最大限度地降低了對其的抗藥性的發展。
已知現有技術中有幾種與上面所述的肽類相關的抗微生物肽和蛋白質。
在US 6503881中公開了一種被用作抗微生物肽的indolicidin(來源于牛中性粒細胞的多肽抗生素)的類似物的陽離子肽。該陽離子肽來源于包括動物和植物的不同的物種。
在US 5912230中公開了抗真菌和抗細菌的基于histatin(一種富組氨酸多肽)的肽。該肽基于天然存在的人histatin的確定的氨基酸序列部分，以及在治療真菌和細菌中使用的方法。
在US 5717064中公開了甲基化的富賴氨酸的溶菌肽。該肽是具有胰蛋白酶消化抗性，并且是非天然肽。該細胞溶菌酶適合用于體內給藥。
在US 5646014中公開了一種抗微生物肽。該肽是從一種來自蠶的血淋巴的抗微生物級分中分離而來的。該肽顯示出對幾種細菌株優良的抗菌活性，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽胞桿菌。
在McCabe et al.，J.Biol.Chem.Vol 27727477-27488，2002中描述了一種37kDa的抗微生物性的和趨化性蛋白天青殺素(azurocidin)，其包含結合相同基序XBBXBX和XBBBXXBX的肝素。
在WO2004016653中公開了基于天青殺素的20-44序列的肽。該肽包含由二硫鍵連接的環狀結構。
在US 6495516及相關專利中公開了基于殺菌的55kDa蛋白質的提高殺菌/滲透性的蛋白質(BPI)。該肽發揮抗微生物效果并且具有肝素和LPS的能力。
WO01/81578公開了編碼與G蛋白偶聯蛋白質受體相關的多肽的多種序列，這些多肽可被用于多種疾病。
目前，已知大約有700種不同的抗微生物肽類序列(www.bbcm.univ.trieste.it/～tossi/search.htm)，包括天蠶素(cecropins)、防御素(defensins)、蛙皮素(magainin)以及組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)。
雖然目前已經可得到相對多的抗微生物肽，然而對于新型改進的抗微生物肽的需求仍在增加。需要能夠被用于抵御微生物的抗微生物肽，所述微生物是具有對抗生素藥物和/或其他抗微生物類藥物的抗藥性或耐藥性的微生物。更加重要的是，需要一種當導入哺乳動物或人類時不產生過敏的新型的抗微生物肽。細菌在進化過程中遇到過內源性產生的抗微生物肽，不產生明顯的抗性。

發明內容
本發明涉及新型改進的肽在制備用于抗微生物的抗微生物組合物中的用途，該肽包含SEQ ID NO1及其類似物，其中該肽與SEQ ID NO1的不同在于其選自C1、N2、T5、E6、R8、R9、H11、A12、R13、A14、S15、H16、L17、G18以及A20之中的至少一個氨基酸殘基被取代。
另外，本發明還涉及一種藥物組合物，該組合物包含上述肽及藥學上允許的緩沖液、稀釋液、載體、佐劑、賦形劑。
本發明還涉及利用一種與SEQ ID NO2所示序列具有至少70％的同源性的多肽，該多肽被用于制備一種用于防御、抑制、降低或破壞選自細菌、病毒、寄生蟲、真菌和酵母中的微生物的抗微生物組合物。
最后，本發明涉及治療患有微生物感染的哺乳動物的方法，該方法包含對哺乳動物施用治療有效劑量的含有本發明的肽或肽類的藥物組合物。
通過提供該抗微生物的肽類，對于抗微生物的肽類產生過敏反應的風險可以被減小，這是因為上述肽類是由內源性蛋白和/或肽類的多肽序列衍生而來的。與更長的肽和蛋白質相比，通過使用短肽可提高該肽的穩定性并降低其生產成本，因此本發明在經濟方面更有優勢。
本發明的肽類提供一種能夠方便地有效預防、減少或殺滅微生物的組合物。因此抵御對抗生素藥物具有抗藥性或耐藥性的微生物的可能性提高。而且對市售的抗生素藥物過敏的哺乳動物也可得到治療。通過提供抗由改良的內源性蛋白質衍生的抗微生物/藥物組合物，哺乳動物對特定肽的過敏的可能性將被減小甚至消除。因此該抗微生物/藥物組合物可作為治療藥物或預防感染的添加劑用于與哺乳動物相接觸的幾種用途中。
另外，短肽的使用可提高生物利用度。另外，使用對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌、或真菌具有特異性或者優先作用的結構上獨特的肽，能夠特異性地靶向多種微生物，因此最大限度的減少了抗藥性和生態學問題的發展。通過使用與已經存在于哺乳動物中的肽類等同的肽作為補充肽，新型抗生素帶來的附加的生態壓力風險被進一步減小。最后，上述藥物還可提高內源性抗微生物肽的效果。
上述有創造性的抗微生物肽的出現增加了抗微生物藥物的種類，增加了在包括但不僅限于例如侵入或感染哺乳動物(例如人類)等所有應用中的用于預防、減少或殺滅微生物抗微生物藥物的選擇。


圖1A描述了CNY21對于糞腸球菌(E.faecalis)2374(-●-)、以及假單胞綠膿桿菌(P.aeruginosa)27.1(-□-)的殺菌效果。
圖1B描述了CNY21在不同緩沖液中的存活計數分析。
圖2示出CNY21肽的螺旋環(Helical Wheel)的投影圖。
圖3示出CNYIEELRRQLLRALLRGLAR肽的螺旋環投影圖。
圖4a-c為大腸桿菌37.4、金黃色葡萄球菌分離株BD14312、金黃色葡萄球菌ATCC29213、白色假絲酵母等不同微生物作為RDA值的函數的凈電荷以及溶血活性的示意圖。
圖5a-b為肽39、42、43和47的螺旋環投影圖。
圖6為理想的兩親性α-螺旋的示意圖。用數字表示CNY20的氨基酸在螺旋環圖中的位置。黑色代表疏水性殘基，白色代表親水性殘基，灰色代表N-和C-末端。
圖7a-b為在N-末端、C-末端、或中間區域帶有兩親性斷點(breakof amphipathicity)的肽的螺旋環投影圖。
圖8顯示CNY變體的放射狀擴散測驗分析。
圖9顯示CNY-變異體的抗真菌效果。
圖10顯示抗微生物肽的溶血效果。
圖11說明CNY-變異體對真核細胞膜的效果。
具體實施例方式
定義下述定義適用于本申請和發明的內容中術語“核苷序列”指的是兩個以上的核苷的序列。核苷可以來自基因組DNA、cDNA、RNA、半合成或全合成來源的核苷、或它們的混合物。該術語包括單或雙鏈形式的DNA或RNA。
術語“取代”指的是氨基酸殘基被另一氨基酸殘基所取代。例如，S15V指SEQ ID NO1中的第15位的絲氨酸殘基被例如纈氨酸所取代。
術語“其類似物”指的是SEQ ID NO 1的多肽的全部或一部多肽分是基于非蛋白質氨基酸殘基的，例如氨基異丁酸(Aib)、正纈氨酸γ-氨基丁酸(Abu)或鳥氨酸。其它非蛋白質氨基酸殘基可在下述網址中找到http://www.hort.purdue.edu/rhodcv/hort640c/polyam/po00008.htm。
術語“刪除”指的是至少一個氨基酸殘基被刪除，例如從多肽中放出而不是用另外的氨基酸代替。
術語“同源性”指的是與多肽SEQ ID NO2的整體同源性，而不應與指特定的氨基酸殘基屬于同一組(例如疏水的、親水的)的術語“相似性”(similarity)混淆，也不應與指氨基酸殘基為相同的術語“同一性”(identity)混淆。
術語“抗微生物肽”指的是能夠預防、抑制、減少或殺滅微生物的肽。其抗微生物活性可以被任一種方法所測定，例如實施例3-5中的方法。
術語“兩親性分子的”指親水和疏水的氨基酸殘基分布于α-螺旋結構、β-片層、線形、環形、或其它二級結構的相對的表面上，以及分布于肽一級結構的相對的兩端，因此使得分子的一個表面或一端顯著地帶有電荷而顯示親水性，而另一表面或一端主要顯示疏水性。一個肽的兩親性程度可以通過多種基于網絡的算法來劃分氨基酸序列的方法檢測出，例如可在下述網址中找到這些算法http://us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl或http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html。疏水性殘基的分布可以被螺旋環圖可視化。二級結構預測算法例如GORIV和AGADIR可在下述網址找到www.expasy.com。
術語“陽離子”指在pH大約4～大約12，例如pH大約4～大約10的范圍內具有凈正電荷的分子。
術語“微生物”指任何一種活的微生物。微生物的例子為細菌、真菌、病毒、寄生蟲和酵母。
術語“抗微生物藥物”指任何一種可以預防、降低或殺滅微生物生命的藥劑。抗微生物藥物的例子可在《斯坦福抗微生物治療指南》(第32版，抗微生物治療，Inc，US)(The Sanford Guide toAntimicrobial Therapy(32ndedition，Antimicrobial Therapy，Inc，US))找到。
在本發明的內容中，氨基酸名稱以及原子名稱根據ProteinDataBank(PDB)(www.pdb.org)的定義使用，該定義基于IUPAC命名法(IUPAC氨基酸和肽類的命名法以及符號使用(殘基名稱，原子名稱等))，Eur J Biochem.，138，9-37(1984)，以及它們在Eur J Biochem.，152，1(1985)中的校正本。術語“氨基酸”指選自下面的任何一種氨基酸丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、組氨酸(His或H)、異亮氨酸(Ile或I)、賴氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)、纈氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)以及它們的衍生物。
描述抗微生物肽本發明涉及具有SEQ ID NO1的肽及其類似物在制備用于降低或殺滅微生物的抗微生物的組合物中的用途，所述肽與SEQ ID NO1的不同在于，其中至少有一個選自C1、N2、T5、E6、R8、R9、H11、A12、R13、A14、S15、H16、L17、G18和A20中的氨基酸被取代。上述取代使得多肽具有比SEQ ID NO1肽更好的活性。已確定通過使用基于螺旋-卷曲變換理論的算法AGADIR來預測適合被取代的螺旋性方法(參考實施例1)。由于目前認為抗微生物的效力與α-螺旋構象在模擬細胞膜的環境下的可誘導性相關，而不是與其內在穩定性相關(TossiA，Sandri L，Giangaspero A.(2000)，Amphipathic，alpha-helicalantimicrobial peptides，Biopolymers，55，4-30)，因此上述取代增加多肽在抵御微生物方面的活性。
上述取代可以由另一個氨基酸殘基進行取代，或者由一個非蛋白質氨基酸殘基取代，前提是相比上述SEQ ID NO1的抗微生物活性，取代的多肽的抗微生物功能仍然被保留和/或被提高。
上述取代基團可選自C1G、N2S、N2T、N2K、T5E、T5D、T5N、E6A、E6V、E6L、E6I、E6M、E6F、E6Y、E6W、R8A、R8V、R8L、R8I、R8M、R8W、R8K、R9K、H11A、H11V、H11L、H11I、H11M、H11K、H11R、H11W、A12L、R13K、A14V、A14L、A14I、A14M、S15A、S15V、S15L、S15I、S15M、S15T、S15N、S15Q、S15K、S15R、S15W、H16K、H16R、H16A、H16V、H16L、H16I、H16M、L17K、L17R、L17A、L17V、L17I、L17M、G18W和A20R，例如選自N2S、N2K、T5E、T5D、T5N、E6A、E6V、E6L、E6I、E6M、E6F、E6Y、E6W、R8A、R8V、R8L、R8I、R8M、R8K、E8W、H11A、H11V、H11L、H11I、H11M、H11K、H11R、H11W、A12L、A14L、S15A、S15V、S15L、S15I、S15M、S15T、S15N、S15Q、S15K、S15R、S15W、H16K、H16R、H16A、H16V、H16L、H16I、H16M、L17K、L17R、L17A、L17V、L17I、L17M、G18W和A20R。
另外，本發明的抗微生物肽可以與SEQ ID NO1中所示的氨基選序列有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個氨基酸殘基的不同。
另外，可有一個或多個氨基酸殘基從SEQ ID NO1的C或N兩個末端中被刪除，也可從其中一個部分中被刪除，前提是其抗微生物活性仍然保留。可以從SEQ ID NO1中被刪除的氨基酸殘基的例子為C1、N2、T5、E6、R8、R9、H11、A12、R13、A14、S15、H16、L17、G18和A20。不過，原則上，上述所有提到的可能被取代的氨基酸殘基都可被刪除。1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個氨基酸殘基可從SEQ IDNO1中被刪除。
該多肽可以含有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個氨基酸大小的殘基。
上面提到的SEQ ID NO1可最初基于部分輔因子C3分子(見SEQID NO2)。然而它也可是合成甚至半合成的。
上述抗微生物肽類可被一個或多個氨基酸殘基延伸，例如1～100個氨基酸殘基、5～50個氨基酸殘基或6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個氨基酸殘基。上述附加的氨基酸殘基可以復制與由非抗微生物蛋白衍生的抗微生物肽的序列鄰近的序列。被添加的數目取決于需要抵御何種微生物，包括肽的穩定性、毒性、被治療的哺乳動物、或該肽應存在于什么產品中以及該抗微生物肽應基于哪種肽結構。應該被添加至多肽上的氨基酸的數目還取決于產品的選擇，例如表達載體和表達宿主、以及制備抗微生物/藥物組合物的選擇。可以在該抗微生物肽的N-或C-末端部分或這兩部分進行延長，前提是這樣并不破壞該肽的抗微生物活性。該抗微生物肽還可以是融合蛋白，此情況下該肽與另一種肽融合。
另外，該抗微生物肽可以可操作地與另一已知的抗微生物肽連接，或與其它物質，例如其它的肽、蛋白質、寡糖、多糖、其它有機化合物或無機物質相連接。例如，該抗微生物肽可與保護該抗微生物肽在哺乳動物體內進行抑制、預防或殺滅微生物之前不被降解的物質相綴合。
進而，上述抗微生物肽類還可在C-末端被酰胺化或酯化修飾，或在N-末端被酰化、乙酰化、PEG化、烷基化等修飾。
被上述抗微生物肽抑制、預防或殺滅的微生物的例子為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌這兩種，例如糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、大腸桿菌(Eschericia coli)、假單胞綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、奇異變形菌(Proteus mirabilis)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、病毒、寄生蟲、真菌和酵母，例如白色假絲酵母(Candida albicans)、近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)上述抗微生物肽類可由天然存在的來源，例如人細胞、c-DNA、基因組克隆、化學合成中獲得，或通過重組DNA技術以表達產物的形式從細胞源中獲得。
上述抗微生物肽類可通過標準的化學合成法方法，包括由自動化工藝進行合成。總之，肽類似物可以通過基于采用HATU(N-[二甲基氨基-1H-1.2.3-三氮唑[4，5-B]嘧啶-1-基亞甲基]-N-甲基甲烷銨六氟硫酸鹽氮氧化物)作為綴合劑或其它例如HOAt-1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑作為綴合劑的標準的固相Fmoc保護方法進行合成。上述肽被含有適當的可以使側鏈功能基團脫保護的脫氧劑的三氟乙酸切斷從固相樹脂上脫離下來。粗制肽可采用制備用反相色譜層析進一步純化。還可以采用其它的純化方法例如分配色譜層析法、凝膠過濾、凝膠電泳法或離子色譜層析。還可使用其它本領域已知的合成技術，例如tBoc保護方法或不同的綴合劑等來制備等同的肽。
或者，肽也可由重組制備方方式合成(例如參見U.S.Pat.No.5,593,866)。有多種宿主系統適合生產上述肽類似物，所述系統包括細菌，例如大腸桿菌；酵母、釀酒酵母或畢赤酵母；昆蟲，例如Sf9以及哺乳動物細胞，例如CHO或COS-7。有很多可被每種宿主利用的表達載體，只要上述載體和宿主能夠生產抗微生物肽，本發明并不局限于它們中的任何一種。大腸桿菌中的克隆和表達的載體和步驟可在例如下述文獻中找到Sambrook等(《分子克隆實驗室手冊》，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1987)和Ausubel等(《當代分子生物學方法》，Greene出版公司，1995)。
最后，可從血漿、血液、各種組織等中純化肽。上述肽可以是內源性的，或由酶或化學性消化純化蛋白質后得到。例如，肝素結合蛋白可被胰酶消化，所得到的抗微生物肽可以進一步大規模地分離純化。
編碼抗微生物肽的DNA序列被導入至對于宿主適宜的合適的表達載體中。在優選的實施方案中，該基因被克隆至一個載體中以構建一個融合蛋白。為了便于肽序列的分離，將對化學斷裂(例如CNBr)或酶斷裂(例如V8蛋白酶、胰蛋白素)敏感的氨基酸用于交聯肽與融合伴侶。例如在大腸桿菌中表達時，融合伴侶優選為指導形成包涵體的常規的細胞內蛋白質。在這種情況下，下述斷裂被用于釋放最終的產物，且并不需要肽復性。在本發明中，含有融合蛋白伴侶與肽基因的DNA盒可被插入至表達載體中。優選的情況是，表達載體為包含誘導型或結構型啟動子的質粒，以便于插入的DNA序列能有效地轉錄。
可采用傳統的轉染技術，例如鈣介導技術、電穿孔技術或其它被本領域內的專業人員熟知的技術將表達載體導入至宿主中。
編碼抗微生物肽的序列可由某種天然來源例如哺乳動物細胞、現有的cDNA、基因組克隆或合成的序列衍生而來。可以采用下述方法通過使用擴增引物的PCR輔助擴增抗微生物肽，該擴增引物衍生于抗微生物DNA模板的5’和3’端，并且根據載體的克隆位點選擇典型地插入限制性內切酶位點。如果需要，翻譯的啟始和終止密碼子可以被工程化至引物序列中。編碼抗微生物肽的序列可以被優化密碼子，以促進在特定宿主中的表達，前提是選擇密碼子時考慮最終被治療的哺乳動物。因此，舉例來說，如果該抗微生物肽在細菌中被表達，該密碼子為細菌而優化。
表達載體可以含有啟動子序列，以促進所導入的抗微生物肽的表達。如果需要，還可引入調節序列，例如一個或多個增強子、核糖體結合位點、轉錄終止信號序列、分泌信號序列、復制起點、選擇性標記等序列。調節序列可操作性地相互連接以允許轉錄和后續的翻譯。如果需要在細菌內表達抗微生物肽，調節序列應被設計成可在細菌中使用，并被本領域的專業人員所熟知。可廣泛性地獲得適合的啟動子，例如結構性和可誘導性的啟動子，包括來自T5、T7、T3、SP6噬菌體、以及trp、lpp、和lac操縱子的啟動子。
如果含有抗微生物肽的載體需要在細菌中表達，復制起點的可為下述例子中的任一種產生高拷貝數的起點、或產生低拷貝數的起點，例如f1-Ori和col E1Ori。
優選地，質粒中包含至少一種在宿主中有功能的可選擇性標記，該選擇性標記允許轉化的細胞被鑒定和/或者選擇性地生長。適合細菌宿主的選擇性標記基因包括青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四環素抗性基因、卡那霉素抗性基因以及本領域內熟知的其它基因。
在細菌中表達的質粒的例子包括pET表達載體pET3a、pET11a、pET12a-c和pET15b(可從Novagen，Madison，Wis.獲得)。低拷貝數載體(例如pPD100)在對大腸桿菌宿主有毒性的肽的有效的過表達中使用(Dersch等，FEMS Microbiol.Lett.12319，1994)。
合適的宿主的例子為細菌、酵母、昆蟲及哺乳動物細胞。不過，通常情況下使用例如大腸桿菌這樣的細菌。
可通過常規的分離手段分離表達的抗微生物肽，例如親合、分子排阻或離子交換層析色譜、HPLC等。其它的純化技術可以在下述文獻中找到《生化學家指南應用生物化學的原理和技術》(A Biologist’s Guide to Principles and Techniques of Practical Biochemistry)(eds.Wilson和Golding、Edward Arnold、London)、或《當代分子生物學方法》(Current Protocols in Molecular Biology)(JohnWiley & Sons，Inc)。
相應地，人皮膚肥大細胞在受到純化的人C3a因子(300nM～600uM范圍，Kubota Y.J Dermatol.1992 1919-26)的刺激后分泌組氨酸。由聚集的IgG和C3a介導的人肥大細胞的刺激性活化導致添加性脫顆粒。這些數據支持下述機制肥大細胞(MC)在多種炎性皮膚疾病中作為引發炎癥的成分起作用。因此，此處公開的抗微生物肽可以作為肥大細胞活化抑制劑，并可起到與它們的抗微生物的效果相對應的新型的抗炎分子的作用。
另外，本發明涉及包含如上所述的抗微生物肽以及藥學上允許的緩沖液、稀釋液、載體、佐劑或賦形劑的藥物組合物。添加的化合物可以被包含于組合物中。它們包含例如EDTA、EGTA或谷胱甘肽等螯合劑。上述抗微生物/藥物組合物可通過本領域內已知的方式進行制備，前提是可以獲得足夠的儲存穩定性以及適合于對人類和動物進行給藥。該藥物組合物可以通過例如冷凍干燥、噴霧干燥或噴霧冷卻等方法制成凍干粉。
“藥學上可接受”指一種非毒性的材料，它不降低活性成分例如上述抗微生物肽的生物學活性的效力。這樣的藥學上可接受的緩沖液、載體或賦形劑在本領域內是被熟知的(參見Remington’sPharmaceutical Sciences)，18th版，A.R.Gennaro，Ed.，Mack出版社(1990)、以及handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd版，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press(2000))。
術語“緩沖液”指含有酸堿混合物以建立pH穩定為目的的水溶液。緩沖液的例子可例舉Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸鹽、碳酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乙醇酸鹽、乳酸鹽、硼酸鹽、ACES、ADA、酒石酸鹽、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、甲次砷酸鹽、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO和TES。
術語“稀釋劑”指用于在藥物組合物的制備中用于稀釋上述肽的水性或非水性溶液。稀釋液可以為下述物質的一種到多種鹽溶液、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(例如紅花油、玉米油、花生油、棉花籽油或芝麻油)。
術語“佐劑”指任何添加到劑型中用于增加肽的生物學活性的化合物。佐劑可以為下述物質的一種或多種具有不同陰離子的鋅、銅或銀鹽，例如但不局限于具有不同酰基化合物的氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸鹽、亞硫酸鹽、氫氧化物、磷酸鹽、碳酸鹽、乳酸鹽、乙醇酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽、酒石酸鹽和乙酸鹽。
賦形劑可以為下述物質的一個到多個碳水化合物、多聚物、脂類或礦物質。碳水化合物的例子包括添加至組合物中用于例如改善冷凍干燥特性的乳糖、蔗糖、甘露糖和環糊精。多聚物可例舉淀粉、纖維素酯、纖維素羧甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、羥乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、藻酸鹽、角叉藻膠、透明質酸以及它們的衍生物、不同水解程度的聚丙烯酸、聚磺酸鹽、聚乙二醇/聚乙烯氧化物、氧化聚乙烯/氧化聚丙烯共聚物、聚乙烯醇/聚乙烯乳酸酯以及聚乙烯吡咯烷酮以及它們的所有的不同的分子量的狀態，上述物質被添加至組合物中用于實現例如粘度控制、生物粘合性或保護脂類不受化學或分解蛋白的降解。脂類可例舉出出于和多聚物相似的理由而添加至組合物中的脂肪酸、磷脂類、單-、雙-、或三甘油酯、神經酰胺、神經鞘脂類、糖酯類、它們的所有的具有不同長度和飽和度的酰基鏈、蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、氫化蛋黃卵磷脂和氫化大豆卵磷脂。礦物質可例舉出為了獲得減少脂類積蓄或期望的染色特性等效果而添加至化合物中的滑石、氧化鎂、氧化鋅和氧化鈦。
載體的特性取決于給藥途徑。一種給藥途徑為局部給藥。例如，對于局部給藥，優選的載體為含有活性肽的乳化的膏狀物質，但還可以使用其它的普通載體例如某種基于礦脂/礦物和基于蔬菜的油膏、以及聚合物凝膠、液晶相或微乳液。
發明的一個特定的具體實施方案涉及抗微生物或藥物組合物，其包含例如下述的鹽部分單價的鈉、鉀、二價的鋅、鎂、銅和鈣。上述特定組合物的pH的范圍可以從大約4.5到大約7.0，例如5.0、5.5、6.0或6.5。
組合物可以含有一個或多個肽，例如在抗微生物/藥物組合物中有1、2、3或4種不同的肽。通過采用不同的肽的組合，其抗微生物效果可以被提高，并且/或該微生物對該抗微生物藥物發生抵抗和/或耐受的可能性將被降低。
如果肽處在含有一種如上所述的鹽和/或pH的范圍為大約4.5到大約7.0內的組合物中，通過鹽的加入和/或特定的pH范圍的選擇，該肽將變得有活性，例如獲得一種增強的效果。
該肽的鹽可以是一種與無機酸形成的酸加成物，例如鹽酸、硫酸、硝酸、溴氫酸、磷酸、高氯酸、硫氰酸、硼酸等等，或者下述有機酸甲酸、乙酸、鹵代乙酸、丙酸、乙醇酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、葡萄糖酸、乳酸、丙二酸、延胡索酸、氨基苯甲酸、苯甲酸、苯乙烯酸、對甲苯磺酸、萘磺酸、對氨基苯磺酸等等。可以添加所有具有相應的陰離子的無機鹽，例如單價的鈉、鉀、或二價的鋅、鎂、銅或鈣，用于提高抗微生物組合物的生物學活性。
本發明的抗微生物/藥物組合物還可以在脂質體形式中，在其中除了添加其它的藥學上可接受的載體以外，該肽還與例如脂類等兩親性分子型藥劑相組合，該兩性分子型藥劑以聚集為微囊、不溶性的單層結構以及液晶狀態的形式存在。適用于脂質體劑型的脂類包括，但不局限于單甘油酯、雙甘油酯、硫脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂角苷、膽汁酸等。這樣的脂質體劑型的制備方法可以在例如US4,235,871中找到。
本發明的抗微生物/藥物組合物還可以為生物可降解微球的形式。脂肪族聚酯，例如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、PLA和PGA的共聚物(PLGA)或聚(己內酯)(PCL)、以及聚酐類目前已被作為生物可降解聚合物廣泛的應用于微球的生產中。上述微球的制備方法可以在US5,851,451和EP0213303中找到。
本發明的抗微生物/藥物組合物還可以為聚合物凝膠的形式，此處的聚合物可以為淀粉、纖維素酯、纖維素羧甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、羥乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、藻酸鹽、角叉藻膠、透明質酸以及它們的衍生物、不同水解程度的聚丙烯酸、聚磺酸鹽、聚乙烯醇/聚乙烯氧化物、氧化聚乙烯/氧化聚丙烯共聚物、聚乙烯醇/聚乙烯乳酸酯、以及聚乙烯吡咯烷酮，它們被用于使含有上述肽的溶液增稠。
或者，該抗微生物肽還可以被溶解于鹽溶液、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(例如紅花油、玉米油、花生油、棉花籽油或芝麻油)、黃蓍膠和/或不同的緩沖液中。上述藥物組合物也可包含離子以及確定的pH以增強抗微生物肽類的作用。
本發明的抗微生物/藥物組合物可以采用例如滅菌等通常的制藥學操作，和/或包含通常的佐劑，例如防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、緩沖液、填充劑等如本說明書中其它地方所公開的物質。
本發明的抗微生物/藥物組合物可以局部給藥或整體給藥。給藥途徑包括局部、眼部、鼻腔、背部、口腔、非腸道的(靜脈注射、皮下注射而肌肉注射)、口服、非腸道、陰道和直腸。另外還可以采用植入式的給藥方式。適合的抗微生物制劑形式為例如顆粒劑、粉劑、片劑、包衣片劑、(微)囊、栓劑、糖漿劑、乳劑、微乳化劑、被定義為光學各向同性的熱力學穩定的系統包括水、油和表面活性劑、液晶相；被定義為特征是在長范圍有規則但短范圍內無規則的系統(例如片層、六邊形及立方體相，連續的水或油中的一種)；或它們的分散的形式、凝膠、油膏、分散物、混懸物、膏、氣霧劑、滴丸劑或安培瓶中的可注射溶液、以及活性成分緩釋的制劑，上述劑型中賦形劑、稀釋劑、佐劑或載體按照上面所述的通常的方法使用。該藥物組合物還可以被提供到繃帶、膏藥或縫合線等中。
該藥物組合物應以治療有效量施用給患者。“治療有效量”指對于被給藥的疾病足夠產生期望的效果的劑量。精確的劑量根據化合物的活性、給藥的方式、病癥的本質和嚴重程度、患者的年齡和體重的不同而不同。藥物的給藥可以通過個體化劑量單位或幾個較小劑量單位的單次給藥形式進行，也可以通過在特定的間隔期給予分配好的劑量的多次給藥的形式進行。
本發明的藥物組合物還可以單獨給藥，或與其他治療藥物例如抗菌劑、抗真菌劑、抗病毒劑和抗寄生蟲劑等抗生素類或防腐劑組合給藥。具體可例舉出青霉素、頭孢菌素、碳頭孢烯類、頭霉素、碳青霉烯類、單環內酰胺類、氨基糖苷類、糖肽類、喹諾酮類、四環素類、大環內酯類和氟喹諾酮類。防腐劑包括碘酒、銀、銅、洗必泰、聚己縮胍及其他的雙胍類、脫乙酰殼多糖、醋酸及過氧化氫。這些藥物可以被加入至藥物組合物中作為其一部分，或者分開給藥。
本發明的對象涉及人類及其他的哺乳動物二者，例如馬、狗、貓、牛、豬、駱駝及其它。因此上述方法既適用于人類的治療也適用于獸醫治療。適合上述治療的目標可通過早已建立的感染的特點進行鑒定，例如發燒、puls、微生物的培養等。可以被抗微生物肽治療的感染包括由微生物所引起或導致的感染。微生物的例子包括細菌(例如革蘭氏陽性、革蘭氏陰性細菌)、真菌(例如酵母或霉菌)、寄生蟲(例如原生動物、線蟲、絳蟲和吸蟲)、病毒、朊病毒。上述這些分類中的特定的微生物是眾所周知的(參考Davis等，《微生物學》，第3期增刊版，Harper&Row，1980)。感染包括但不局限于慢性皮膚潰瘍、傷口和燒傷傷口的急性感染、感染性皮膚濕疹、膿皰病、特應性皮炎、痤瘡、外耳炎、陰道感染、脂溢性皮炎、口腔感染和牙周炎、假絲酵母性擦爛、結膜炎和其它眼部感染以及肺炎。
相應地，抗微生物/藥物組合物還可以用于燒傷、術后或皮膚外傷后的預防性治療。該藥物組合物還可被含有在用于儲存或與人身體接觸的治療用外用材料，例如隱形眼鏡、整形外科移植物、導尿管中。
另外抗微生物/藥物組合物還可以用于下述病癥的治療特應性皮炎、膿皰病、慢性皮膚潰瘍、傷口和燒傷傷口的急性感染、痤瘡、外耳炎、真菌感染、肺炎、脂溢性皮炎、假絲酵母性擦爛、咽喉假絲酵母感染、眼部感染(細菌性結膜炎)、鼻腔感染(包括MRSA支架)。
抗微生物/藥物組合物還可以用于清潔劑溶液中，例如鏡頭消毒液以及儲存液，或被用于預防與泌尿道尿管的使用和中央靜脈導管接觸導致的細菌感染。
另外，抗微生物組合物還可以用于膏藥、粘合劑、縫合線、或在傷口敷料中使用，以預防外科手術后的感染。
抗微生物肽類還可以用于聚合物、紡織品等中以建立抗菌表面，或者該抗微生物/藥物組合物還可補充于化妝品、個人護理品(肥皂、香波、牙膏、抗痤瘡用品、防曬霜、棉球、尿布等)中。
本發明還涉及多肽的用途，該多肽顯示與SEQ ID NO2相比至少70％、80％、90％或95％甚至更高的同源性，且如上所定義的C3a多肽或抗微生物肽，或如上所定義的抗微生物/藥物組合物被用于制備用于預防、抑制、減少或殺滅選自細菌、病毒、寄生蟲、真菌和酵母的微生物的抗微生物組合物，本發明還涉及該多肽在治療和診斷中的用途。
最后，本發明還涉及治療患有微生物感染或有過敏癥狀的哺乳動物的方法，該方法包含如上所述的對患者給予治療有效量的藥物組合物。
實施例實施例1潛在取代位置的預測AGADIR是基于螺旋-卷曲變換理論的算法，其被用于預測形成螺旋的傾向(Lacroix E，Viguera AR and Serrano L.(1998)，Elucidating the folding problem of α-heliceslocal motifs，long-range electrostatics，ionic-strength dependence andprediction of NMR parameters，J Mol Biol，284，173-191)。通過將肽的序列輸入至EMBL WWW門戶鏈接到AGADIR服務(http://www.embl-heidelberg.de/Services/serrano/agadir/agadir-start.html)進行計算。
輸入的參數如下自由C末端，自由N末端，pH7.4，溫度278K，離子強度0.15M。兩親性通過螺旋環圖表進行測算。
一個建模以適應α-螺旋構象的關于CNY21的結構研究顯示該分子的N末端部分具有明顯的兩親性(圖2和6)。另外，Arg9和Gln10上的側鏈可以與Glu6的側鏈形成氫鍵，并且Arg13的側鏈可與Gln10上的側鏈形成氫鍵，使螺旋穩定。
眾所周知，在α-螺旋的末端的特定位置存在氨基酸偏好(Richardson JS and Richardson DC.(1988)Amino acid preferencesfor specific locations at the ends of α-helices，Science，240，1648-1652)。AGADIR研究了CNY21上不同N-帽殘基(N-capresidue)的影響(由AGADIR預測的螺旋內容顯示于肽序列之后)。
CNYITELRRQHARASHLGLAR 4.83-NYITELRRQHARASHLGLAR 13.58-SYITELRRQHARASHLGLAR 14.57-GYITELRRQHARASHLGLAR 4.85-TYITELRRQHARASHLGLAR 4.47-VYITELRRQHARASHLGLAR 3.16GNYITELRRQHARASHLGLAR 4.97可以看出僅有C末端的Cys的刪除以及有Asn或Ser中任一個作為N帽殘基對螺旋傾向有深刻的影響。進而，還有報道抗微生物肽類對N末端的Gly具有位置保守性(Tossi A，Sandri L，GiangasperoA.(2000)，Amphipathic，alpha-helical antimicrobial peptides，Biopolymers，55，4-30)。此處用Gly代替N末端的Cys幾乎沒有影響。
通過假設2位置的Asn作為N帽殘基起作用，對在N帽+3的位置上的不同的殘基的研究顯示有對Glu或Asp的偏好傾向。
CNYITELRRQHARASHLGLAR 4.83CNYISELRRQHARASHLGLAR 3.84CNYINELRRQHARASHLGLAR 3.29CNYIQELRRQHARASHLGLAR 2.03CNYIMELRRQHARASHLGLAR 2.81CNYIDELRRQHARASHLGLAR 11.64CNYIEELRRQHARASHLGLAR 14.68CNYIGELRRQHARASHLGLAR 2.42CNYIKELRRQHARASHLGLAR 1.76CNYIRELRRQHARASHLGLAR 2.08CNYIHELRRQHARASHLGLAR 1.44CNYIYELRRQHARASHLGLAR 2.87CNYIFELRRQHARASHLGLAR 2.29CNYIWELRRQHARASHLGLAR 3.15CNYIPELRRQHARASHLGLAR 1.27該偏好是由于形成了一個稱為“帽盒”(capping box)相互相反(reciprocal)的骨架-側鏈氫鍵的相互作用(Harper ET and RoseGD，(1993)，Helix stopsignals in proteins and peptidesThecapping box，Biochemistry，32，7605-7609)。該基序的進一步分析顯示在CNY21中，在位置2對Asn、Ser或Thr的其中一個的偏好，以及在位置5對Glu和Asp的偏好。
CNYITELRRQHARASHLGLAR 4.83CNYIEELRRQHARASHLGLAR 14.68CNYIDELRRQHARASHLGLAR 11.64CSYITELRRQHARASHLGLAR 4.94CSYIEELRRQHARASHLGLAR 18.89CSYIDELRRQHARASHLGLAR 13.90CTYITELRRQHARASHLGLAR 3.19CTYIEELRRQHARASHLGLAR 14.81CTYIDELRRQHARASHLGLAR 11.57同樣此處的N末端Cys的刪除增加了尤其是具有NXXE和SXXE帽基序的肽的螺旋性。
-NYITELRRQHARASHLGLAR 13.58-NYIEELRRQHARASHLGLAR 27.33-NYIDELRRQHARASHLGLAR 20.18-NYINELRRQHARASHLGLAR 6.37-NYIHELRRQHARASHLGLAR 3.26-NYIQELRRQHARASHLGLAR 4.39-SYITELRRQHARASHLGLAR 14.57-SYIEELRRQHARASHLGLAR 32.01-SYIDELRRQHARASHLGLAR 24.58-SYINELRRQHARASHLGLAR 6.76-SYIHELRRQHARASHLGLAR 3.50-SYIQELRRQHARASHLGLAR 4.95-TYITELRRQHARASHLGLAR 4.47-TYIEELRRQHARASHLGLAR 22.89-TYIDELRRQHARASHLGLAR 16.54-TYINELRRQHARASHLGLAR 4.61-TYIHELRRQHARASHLGLAR 2.21-TYIQELRRQHARASHLGLAR 3.46有時螺旋被N帽的+4位置的疏水性殘基穩定化。研究此的目的還在于觀察負電荷是否可被清除。
CNYITELRRQHARASHLGLAR 4.83CNYITALRRQHARASHLGLAR 4.51CNYIEELRRQHARASHLGLAR 14.68CNYIEALRRQHARASHLGLAR 15.57CNYIELLRRQHARASHLGLAR 16.61-NYITELRRQHARASHLGLAR 13.58-NYIEELRRQHARASHLGLAR 27.33-NYIEALRRQHARASHLGLAR 9.57-NYIELLRRQHARASHLGLAR 7.31螺旋通常被作為C帽殘基的Gly或在C帽+1位置上的Pro所終止(Richardson JS and Richardson DC.(1988)Amino acidpreferences for specific location at the ends ofα-helices，Science，240，1648-1652)。CNY21在自身的C末端具有一個Schellman結構域(Prieto J and Serrano L，(1997)，C-capping andhelix stabilityThe Pro C-capping motif，J Mol Biol，274，276-288)，該結構域被i位置的Gly、i-4和i+1的位置上的一個疏水性殘基或i-2位置上的Ala的指紋圖譜所鑒定。
CNYITELRRQHARASHLGLAR 4.83CNYITELRRQHARLSHLGLAR 5.02CNYITELRRQHARASALGLAR 5.86CNYITELRRQHARLSALGLAR 6.53進一步，可以通過優化肽中的疏水性殘基之間的間隔有效地增加螺旋含量(helix content)。尤其是已知亮氨酸之間的i、i+3或i、i+4間隔可以使螺旋穩定化，最后一個間隔期提供了最強的相互作用(Luo P，Baldwin RL.(2002)Origin of the different strengthsof the(i，i+4)and(i，i+3)leucine pair interactions in helices，Biophys Chem.96，103-108)。在CNY21的N末端，Tyr3與Leu7最易于發生i，i+4相互作用。如下面可以看到的，通過插入亮氨酸到位置8、11、12和16，在CNY21中該螺旋含量從5％增加至50％。
CNYITELRRQHARASHLGLAR 4.83CNYITELLRQHARASHLGLAR 10.59CNYITELRRQLARASHLGLAR 15.15CNYITELRRQHLRASHLGLAR 5.09CNYITELRRQHARASLLGLAR 5.91CNYITELLRQLARASHLGLAR 31.64CNYITELLRQLLRASHLGLAR 39.43CNYITELRRQLARASLLGLAR 17.90CNYITELRRQLLRASLLGLAR 22.22CNYITELLRQLARASLLGLAR 35.71CNYITELLRQLLRASLLGLAR 47.49CNY21的兩性分子結構并不是最優選的(圖2和6)。通過用一個疏水性殘基取代Arg8、His11和Ser15，以及用一個親水性帶電殘基取代His16和Leu17，此類帶有正電荷的氨基酸增加了肽的凈正電荷，將會優化CNY21的兩性分子特征。
CNYITELLRQHARASHLGLAR 10.59CNYITELLRQLARASHLGLAR 31.64CNYITELLRQLARALHLGLAR 47.29CNYITELRRQHARASHKGLAR 5.07CNYITELLRQLARALHKGLAR 48.70CNYITELRRQHARASKLGLAR 6.01CNYITELLRQHARASKLGLAR 12.70CNYITELLRQLARASKLGLAR 36.26CNYITELLRQLARASKKGLAR 37.53CNYITELLRQLARASQKGLAR 36.48CNYITELLRQLARASEKGLAR 32.67CNYITELLRQLARALKKGLAR 57.55CNYITELLRQLLRALKKGLAR 64.98最后，通過組合如上所述的不同的取代，將有可能設計這樣一種CNY21的變異體，其具有增加的螺旋性和理想的兩親性。如具有T5E、H11L、A12L、S15L、H16L和L17R的取代的肽所例證的情況所示，僅通過六個取代，就有可能使螺旋性從5％增加超過70％。圖3中示出該CNY21變異體的螺旋環投影圖。
CNYIEELLRQLARALHKGLAR 58.71CSYIEELLRQLARALHKGLAR 61.84CSYIEELLRQLLRALLKGLAR 76.45CNYIEELRRQLARALHKGLAR 51.32CNYIEELRRQLLRALHKGLAR 57.97CSYIEELRRQLARALHKGLAR 55.59CSYIEELRRQLLRALLKGLAR 73.55CSYIEELRRQLLRALLRGLAR 74.12CNYIEELRRQLLRALLKGLAR 71.47CNYIEELRRQLLRALLRGLAR 72.04CNYIEELLRQLLRALKKGLAR 70.57CSYIEELLRQLLRALKKGLAR 72.02CSYIEELLRQLLRALKRGLAR 72.40所有在CNY21肽的不同位置上的可選的取代總結于表1中。
表1增加CNY21螺旋性的氨基酸取代

作為陰性對照的肽CNY21R-S和CNY21H-P應該比CNY21具有更少的螺旋性。這些肽也被確切地預測到具有很低的螺旋含量。顯示出更強的抗菌活性的CNY21H-K和CNY21H-L肽具有更高的預測到的螺旋性，這與更大的形成α-螺旋構象的傾向將提高效力的假說是一致的。
CNY21CNYITELRRQHARASHLGLAR 4.83CNY21R-S CNYITELSSQHASASHLGLAR 0.60CNY21H-P CNYTTELRRQPARASPLGLAR 1.91CNY21H-K CNYITELRRQKARASKLGLAR 9.72CNY21H-L CNYITELRRQLARASLLGLAR 17.90實施例2抗微生物肽類由Innovagen AB，Ideon，SE-22370，Lund，Sweden合成下述肽CNY21；CNYITELRRQHARASHLGLAR，CNY20；CNYITELRRQHARASHLGLA，CNY21R-S；CNYITELSSQHASASHLGLAR，CNY20R-S；CNYITELSSQHASASHLGLA，CNY21H-LCNYITELRRQLARASLLGLAR，CNY21H-K；CNYITELRRQKARASKLGLAR，CNY21H-P；CNYITELRRQPARASPLGLAR。通過質譜分析確定(MALDI.TOF Voyager)這些肽的純度(＞95％)以及分子量。
微生物將最初從慢性靜脈潰瘍中獲得的糞腸球菌2374、大腸桿菌37.4、假單胞綠膿桿菌27.4、以及從患有特應性濕疹的患者身上獲得的白色假絲酵母BM 4435用于試驗中。
實施例3由C3a衍生的CNY21肽的抗菌效果圖1A顯示CNY21對糞腸球菌2374(-●-)，以及對假單胞綠膿桿菌27.1(-□-)的殺菌效果。細菌在Todd-Hewitt(TH)培養基中被培養至對數生長期中期。細菌在10mM Tris，pH7.4，含有5mM葡萄糖的溶液中被洗滌和稀釋。細菌(50μl；2×106cfu/ml)在37℃下溫育2小時，得到濃度在0.03～60μM范圍內的合成肽。為了定量細菌的活性，溫育混合物的系列稀釋物被涂板至TH瓊脂板上，然后在37℃下溫育過夜，之后測定菌落形成單位。
圖1B顯示CNY21在不同緩沖液中的存活計數分析；10mM TrispH7.4(-●-)和10mM MES pH5.5(-□-)，二者都含有0.15M NaCl。假單胞綠膿桿菌27.1(2×106cfu/ml)與濃度處于0.03～6μM范圍內的肽一起溫育，體積為50μl。
實施例4CNY變異體的放射擴散檢測分析大致按照前人所述的方法(Andersson et al.，Eur J Biochem，2004，2711219-1226)進行放射擴散檢測(RDA)。簡而言之，將細菌(假單胞綠膿桿菌27.1)在10ml的全濃度(3％w/v)的胰化酪蛋白大豆培養液(TSB)(Becton-Dickinson，Cockeysville，MD)中培養至對數生長中期。用pH7.4的10mM Tris洗滌一次該微生物。4×106細菌cfu或1×105真菌cfu被加入至5ml底層瓊脂糖凝膠中，該凝膠含有0.03％(w/v)TSB、1％(w/v)低電滲型(Low-EEO)瓊脂糖(Sigma，St Louise MO)以及終濃度為0.02％(v/v)的吐溫20(Sigma)。該底層凝膠被倒入一個直徑85mm的有蓋培養皿中。瓊脂糖固化后，打出4mm直徑的孔，每孔中加入6μl待測樣品。培養板在37℃下溫育3小時以使肽擴散。底層凝膠被5ml熔化的上層覆蓋(在dH2O中的6％TSB和1％Low-EEO瓊脂糖)。37℃下18～24小時的溫育后，肽的抗微生物活性可通過每個孔周圍的干凈區域來觀察。以100μM的濃度測試了合成肽以確定其抗菌效果(圖8)。CNY21；CNYITELRRQHARASHLGLAR，CNY20；CNYITELRRQHARASHLGLA，CNY21R-S；CNYITELSSQHASASHLGLAR，CNY20R-S；CNY-ITELSSQHASASHLGLA，CNY21H-LCNYITELRRQLARASLLGLAR，CNY21H-KCNYITELRRQKARASKLGLAR，CNY21H-PCNYITELRRQPARASPLGLAR。CNY21H-P變異體(此處未示出)未顯示任何抗微生物活性。
實施例5CNY-變異體的抗真菌效果將真菌(C.albicans，白色假絲酵母)在10ml的全濃度(3％w/v)的胰化酪蛋白大豆培養液(TSB)(Becton-Dickinson，Cockeysville，MD)中培養至對數生長中期。用pH7.4的10mM Tris洗滌一次該微生物。1×105真菌cfu被加入至5ml底層瓊脂糖凝膠中，該凝膠含有0.03％(w/v)TSB、1％(w/v)低電滲型(Low-EEO)瓊脂糖(Sigma，St LouiseMO)以及終濃度為0.02％(v/v)的吐溫20(Sigma)。該底層凝膠被倒入一個直徑85mm的有蓋培養皿中。瓊脂糖固化后，打出4mm直徑的孔，每孔中加入6μl待測樣品。培養板在37℃下溫育3小、時以使肽擴散。底層凝膠被5ml熔化的上層覆蓋(在dH2O中的6％TSB和1％Low-EEO瓊脂糖)。28℃下18～24小時的溫育后，肽對于白色假絲酵母的抗微生物活性可通過每個孔周圍的干凈區域來觀察(圖9)。結果以三個重復樣品的平均值表示。CNY21；CNYITELRRQHARASHLGLAR，CNY21H-K；CNYITELRRQKARASKLGLAR，CNY21H-L；CNYITELRRQLARASLLGLAR，CNY20R-S；CNYITELSSQHASASHLGLA，CNY21R-S；CNYITELSSQHASASHLGLAR，CNY21H-P；CNYITELRRQPARASPLGLAR。
實施例6抗微生物肽的溶血效果通過在540nm處檢測血紅蛋白的釋放以測定溶血活性。簡而言之，血紅細胞的混懸液(在10％的PBS中)與同體積的肽(在PBS中)溫育。混合物在37℃下溫育1小時后離心。測定上清液的光吸收。通過加入占血紅細胞混懸液等同體積的2％的Triton X100實現100％的溶血。對CNY變異體的研究顯示很小或沒有溶血性效果(圖10)。作為對比的抗微生物肽LL-37在60μM下引起大約6％的溶血。
實施例7CNY-變異體時真核細胞膜的影響研究了對人類HaCaT角化細胞細胞株的細胞膜穿透效果。在96孔板中的匯合細胞培養與肽一同溫育6小時，測定了乳酸脫氫酶的釋放。與抗微生物肽LL-37相比，所研究的CNY變異體未釋放任何LDH(圖11)。
實施例8CNY21的肝素結合測試了肽的肝素結合活性。肽被應用于硝酸纖維素膜上(Hybond，Amersham Bioscience)。膜被封閉1小時(PBS，pH7.4，0.25％吐溫20，3％牛血清白蛋白)，并在相同的緩沖液中與放射標記的肝素溫育1個小時。加入未標記的多糖(肝素，2mg/ml)用于結合競爭。洗滌膜(3×10min，在PBS中，pH7.4，0.25％的吐溫20)。使用Bas2000放射顯影系統(富士)使放射活性可視化。未標記肝素(6mg/ml)抑制了與125I-肝素CNY21的結合。
實施例9CNY21變異體與脂雙層結構的結合測試了肽與脂雙層結構的結合，結果導致孔洞的形成和肽在脂質膜中形成二級結構。研究的脂質膜包括兩性離子的膜(含有磷脂酰膽堿)和陰離子的膜(含有磷脂酰膽堿和磷脂酸的混合物)。脂類膜在無水硅酸中沉淀，使用橢圓光度法直接監測10mM Tris，pH7.4的肽的結合。脂類膜還以脂質體的形式進行了制備，由同樣的脂類在同樣的緩沖液中通過擠壓和重復的冷凍-溶化，結果形成了直徑為150nm的單室脂質體。在上述脂質體中的孔洞形成通過下述方法測定在脂質體中含有羧基熒光素，然后在脂質體中添加肽以后出現了熒光強度的增加。進一步，肽類在脂質體脂膜中形成的二級結構通過圓二色譜進行測定。結果顯示CNY21兩性離子和陰離子的脂類膜上，并且CNY21顯示比CNY21R-S更高的結合傾向。另外，CNY21變異體導致了孔洞的形成以及脂質體的泄漏，其效力的順序為CNY21H-L≈CNY21H-K＞CNY21＞CNY21H-P≥CNY21R-S。另外，圓二色譜(CD)顯示肽在脂質體的脂類膜中形成了螺旋結構，其程度為同樣的按順序降低。
實施例10肽肽來自Sigma-Genosys，由肽合成平臺制備(PEPscreen，CustomPeptide Libraries，SigmaGenosys)。產量為約大約1～6mg，肽鏈長度為20個氨基酸。對上述肽進行了MALDI-ToF質譜分析。20聚物的粗產物平均純度大約為61％。肽被制成凍干粉并儲存于96孔管架中。在進行生物學測定之前，將PEP篩選肽用dH2O(5mM母液)稀釋，并儲藏于-20℃。該儲藏溶液被用于后續的實驗。
微生物大腸桿菌37.4分離株最初獲自患有慢性靜脈潰瘍的患者，金黃色葡萄球菌分離株BD14312獲自患有特應性皮炎的患者。金黃色葡萄球菌ATCC29213和白色假絲酵母ATCC90028均獲自Lund醫學院的臨床細菌學部。
放射擴散檢測基本如前人所述(Lehrer et al.，J Immunol Methods 137，167-173，1991，Andersson et al.，Eur J Biochem 271，1219-1226，2004)，細菌在10ml的全濃度(3％w/v)的胰化酪蛋白大豆培養液(TSB)(Becton-Dickinson，Cockeysville，MD)中被培養至對數生長中期。該微生物被pH7.4的10mM Tris洗滌一次。4×106細菌菌落形成單元被加入至15ml底層瓊脂糖凝膠中，該凝膠含有0.03％(w/v)TSB、1％(w/v)低電滲(EEO)瓊脂糖(Sigma，St Louis MO)以及終濃度為0.02％(v/v)的吐溫20(Sigma)。該底層凝膠被倒入一個直徑144mm的有蓋培養皿中。瓊脂糖固化后，打出4mm直徑的孔，每孔中加入6μl待測樣品。培養板在37℃下溫育3小時以使肽類擴散。底層凝膠被15ml熔化的上層覆蓋(在dH2O中的6％TSB和1％Low-EEO瓊脂糖)。37℃下18～24小時的溫育后，肽的抗微生物活性可通過每個孔周圍的干凈區域來觀察。
實施例11溶血檢測EDTA-血以800g離心10分鐘，然后去除血漿和淡黃色的表層。真核細胞被洗滌三次并重懸于pH為7.4的5％的PBS中。然后細胞在肽的存在下(60μM)在連續的轉動下在37℃溫育1小時。將2％的Triton X-100(Sigma Aldrich)作為陽性對照。然后樣品以800g離心10分鐘。在λ540nm處測定血紅蛋白的釋放的吸光度，在圖表中被表示為Triton X-100誘導的溶血的百分數(％)。
實施例12螺旋形成的預測AGADIR是基于螺旋-卷曲變換理論的算法，其被用于預測形成螺旋的傾向(Lacroix et al.，J Mol Biol，284，173-191，1998)。通過將肽的序列輸入至EMBL WWW門戶鏈接的AGADIR服務進行計算(http://www.embl-heidelberg.de/services/serrano/agadir/agadir-start.html)。輸入的參數如下自由C末端，自由N末端，pH7.4，溫度278K，離子強度0.15M。
由實施例10～12獲得的結果基于實施例1中定義的標準，設計和合成了幾種帶有凈的正電荷、具有更高的螺旋性和提高的兩親性的變異體。為了定量地測試盡可能多的不同的變異體，采用了如前所述的PEP篩選文庫。由于PEP篩選文庫只適用于20個殘基的肽，CNY21的C末端精氨酸殘基被省略。使用兩種臨床分離株假單胞綠膿桿菌15159和大腸桿菌37.4，在RDA檢測中比較CNY20變異體“CNYINYITELRRQHARASHLGLA”與CNY21。得到了使用100μM的肽(n＝9)的假單胞綠膿桿菌的下述數據；平均值；CNY215,00，SD；0,81，SEM 0,27.CNY 20平均值；6,02，SD；0,59，SEM；0,20.大腸桿菌；CNY21平均值6,02，SD 0,93，SEM；0,31，CNY20平均值；8,03，SD；1,22，SEM，0,41。因此，CNY20與CNY21比較未發現有活性的降低。通過改變N-帽、N-帽+3和N-帽+4位置(表1，實施例1)，設計了序號為2～17的肽類以提高螺旋性。對于21～30的肽，則通過改變亮氨酸之間的間隔以提高螺旋性(表1，實施例1)。通過取代肽31～43的在位置8、11、15、16和17的氨基酸，兩親性分子性結構被進一步增加(表1，實施例1)。對于44-56的肽，通過組合如前所述的取代獲得了優化的兩親性和增加的螺旋。最后，為了在獲得穩定的螺旋性和改善的兩親性的同時提高正電荷，設計了肽57～74。
生物學測試的結果表示在表1中。在被設計為通過N-帽和C-帽基序的穩定化而提高螺旋性的前面的20個肽中，相對來說，較少的肽顯示出了任何關于抗微生物效果的提高。只有凈正電荷+3的肽顯示出明顯提高的RDA值(例如肽編號14)。這些肽均無溶血作用。更為疏水性的肽編號21～30顯示出了相似的效果。肽編號27～30未包含在試驗對象中。具有優化的兩親性結構的肽類顯示出更高的RDA值(肽39、40、42和43)。然而被預測具有高螺旋含量的肽編號42和43也同時表現出較高的溶血活性。具有組合取代以使螺旋性最大化的肽44～56中的大多數均顯示出較高的溶血性。由于穩定性問題研究中排除了肽編號51和53。肽編號47顯示了較高的抗微生物效果，同時具有低的溶血活性。肽57～74中，除了肽編號73以外均有溶血性，其原因可能是由于它們較高的凈電荷和螺旋性。值得一提的是，具有該系列中最高的凈電荷的肽編號73，卻顯示出非常顯著的抗金黃色葡萄球菌和假絲酵母的效果，并且顯示出低的溶血活性。
未觀察到凈電荷或螺旋性與大腸桿菌RDA之間的明顯的相關性。觀察到凈電荷和較高預測的螺旋性與溶血活性之間有較低的相關性。另一方面，金黃色葡萄球菌和假絲酵母的RDA則與凈電荷有著很強的相關性。具有高正的凈電荷的肽表現出很高的抗微生物活性(圖4)。
需要說明的是，具有高預測螺旋性和高抗微生物活性的肽表現出非常不同的溶血活性。例如，肽編號39和47表現出低溶血活性，而肽編號42和43則具有很強的溶血性。特別是，肽39和42只有一個氨基酸的差別肽42在位置15有一個由亮氨酸取代絲氨酸的附加的取代。在溶血活性方面的巨大差別可能反映出肽42形成了一個更優化的兩親性螺旋的事實(圖5)。同樣的理由也適用于肽43和47。肽43的精氨酸8被亮氨酸所取代(圖5)。
第二代CNY20肽以及它們的活性首次PEP篩選中的變異體中有四種在RDA值中顯示出對于大腸桿菌很高的抗微生物活性，同時顯示了較低的溶血性，而且含有不完美的兩親性螺旋。因此，設計了另外的具有使兩親性肽的結構性組織出現斷點(break)的氨基酸取代的變異體。所述肽的凈電荷保持在+2和+3附近，且還被設計為具有相對較高的(但并非過度高)的螺旋含量(20～60％)。
設計了新的在N末端區域(140～146)、C末端區域(147～160)、或中間區域(161～168)處具有兩親性裂的變異體。附加的肽含有較高的正的凈電荷(169～171)，較高的疏水性(172～177)，具有乙酰化或酰胺化的N-和C-末端(179～181)，或包含所有的D-氨基酸(182～184)(表2)。
為了提高肽的C末端的兩親性，在位置11和15處實施用亮氨酸取代極性氨基酸(圖6和4)。進一步，在位置16和17實施用賴氨酸取代疏水性氨基酸(圖6和7)。為了提高肽的N末端的兩親性，在位置8和11實施用用亮氨酸進行取代(圖6和7)。在中間區域具有兩親性斷點的肽均在位置11處具有帶正電荷的精氨酸和賴氨酸，并在位置8和15具有疏水性的亮氨酸，以及在位置17具有一個賴氨酸。上述所有的變異體均在位置5處有一個由蘇氨酸到谷氨酸鹽的取代，該取代通過如實施例1中所述的使帽基序穩定化而用于提高螺旋性。
幾乎所有測試的肽都顯示了對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的顯著的抗微生物效果。未觀察到在N-末端和C-末端或中間區域具有兩親性斷點的不同的肽組之間有明顯的差異。不過，結果提示在中間區域具有斷點的肽對于金黃色葡萄球菌具有稍強一點的抗微生物效果。具有更高凈電荷的肽也顯示出更好的抗微生物活性。在N-末端和C-末端的乙酰化和酰胺化的影響很微小，D-氨基酸肽類顯示出與由L-氨基酸構成的肽類相似的抗微生物活性。在位置5處具有谷氨酸鹽的肽類與在此位置沒有進行取代的肽類相比，并不具有更強的抗微生物活性。有可能凈電荷降低超過了螺旋性的穩定帶來的影響。
具有很好的抗微生物活性的肽在位置5處含有蘇氨酸或谷氨酸，在位置8處含有精氨酸，賴氨酸或亮氨酸，在位置11處具有亮氨酸，精氨酸或賴氨酸，在位置12處具有丙氨酸或亮氨酸，在位置14處具有丙氨酸或亮氨酸，在位置15處具有絲氨酸、亮氨酸、精氨酸或賴氨酸，在位置16處具有組氨酸或賴氨酸，在位置17處具有亮氨酸或賴氨酸。特別是肽編號140、146和160顯示出對于大腸桿菌很高的抗微生物活性，肽編號160、161和165顯示出對于金黃色葡萄球菌很高的抗微生物活性，肽編號158、160和171對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均顯示出很高的抗微生物活性。而且，上述結果顯示具不完美的兩性結構、以及較高的凈電荷的肽類對于金黃色葡萄球菌和假絲酵母屬的微生物具有較強活性。
綜上所述，上述研究顯示在CNY20肽的精確限定的位置上的少量氨基酸的取代可以提高抗微生物活性并同時保持較低的溶血活性，這使得上述肽類具有比原來的肽更高的治療指數。較高的凈電荷、形成α-螺旋構象的傾向性以及并不完美的兩親性的組合，是實現上述目的的關鍵因素。對于CNY20肽，在位置8、11、15及17上的取代被證明是非常必要的。
表1CNY變異體對于大腸桿菌37.4、金黃色葡萄球菌BD14312、金黃色葡萄球菌ATCC29213、假絲酵母ATCC90028的活性，以及溶血活性的測定。抗微生物效果與抑制區域的大小一致(單位mm)，溶血性以總溶血性的％表示。Agadir值按照實施例1中的方法進行計算。



除了大腸桿菌的值為六次測試的平均值外，所有的值均為不同的3次測試的平均值。有*標記的肽由于可溶性問題被排除在研究對象之外。
表2第二代PEP篩選CNY20變異體。使用大腸桿菌37.4和金黃色葡萄球菌ATCC29213進行RDA分析。抗微生物效果與抑制區域的大小一致(單位mm)，溶血性以總溶血性的％表示。Agadir值按照實施例1中的方法進行計算。


序列表<110>Dermagen AB公司<120>新型抗微生物肽<130>P5856003<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>PRT<213>人<400>1Cys Asn Tyr Ile Thr Glu Leu Arg Arg Gln His Ala Arg Ala Ser His1 5 10 15Leu Gly Leu Ala Arg20<210>2<211>77<212>PRT<213>人<400>2Ser Val Gln Leu Thr Glu Lys Arg Met Asp Lys Val Gly Lys Tyr Pro1 5 10 15Lys Glu Leu Arg Lys Cys Cys Glu Asp Gly Met Arg Glu Asn Pro Met20 25 30Arg Phe Ser Cys Gln Arg Arg Thr Arg Phe Ile Ser Leu Gly Glu Ala35 40 45Cys Lys Lys Val Phe Leu Asp Cys Cys Asn Tyr Ile Thr Glu Leu Arg50 55 60Arg Gln His Ala Arg Ala Ser His Leu Gly Leu Ala Arg65 70 7權利要求
1.一種包含SEQ ID NO1所示序列或其類似物的肽在制備用于減少和/或殺滅微生物的、或微生物感染的預防性治療的抗微生物的組合物中的用途，其中所述肽與SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的不同在于其中至少一個選自C1、N2、T5、E6、R8、R9、H11、A12、R13、A14、S15、H16、L17、G18以及A20中的氨基酸殘基被取代。
2.權利要求1所述的肽的用途，其中所述的取代選自C1G、N2S、N2T、N2K、T5E、T5D、T5N、E6A、E6V、E6L、E6I、E6M、E6F、E6Y、E6W、R8A、R8V、R8L、R8I、R8M、R8W、R8K、R9K、H11A、H11V、H11L、H11I、H11M、H11K、H11R、H11W、A12L、R13K、A14V、A14L、A14I、A14M、S15A、S15V、S15L、S15I、S15M、S15T、S15N、S15Q、S15K、S15R、S15W、H16K、H16R、H16A、H16V、H16L、H16I、H16M、L17K、L17R、L17A、L17V、L17I、L17M、G18W和A20R。
3.權利要求2所述的肽的用途，其中所述的取代選自N2S、N2K、T5E、T5D、T5N、E6A、E6V、E6L、E6I、E6M、E6F、E6Y、E6W、R8A、R8V、R8L、R8I、R8M、R8K、R8W、H11A、H11V、H11L、H11I、H11M、H11K、H11R、H11W、A12L、A14L、S15A、S15V、S15L、S15I、S15M、S15T、S15N、S15Q、S15K、S15R、S15W、H16K、H16R、H16A、H16V、H16L、H16I、H16M、L17K、L17R、L17A、L17V、L17I、L17M、G18W和A20R。
4.權利要求1～3中任一項所述的肽的用途，其中所述肽與SEQ IDNO1所示的氨基酸序列有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個氨基酸殘基的不同。
5.權利要求1～4中任一項所述的肽的用途，其中至少一個選自C1、N2、T5、E6、R8、R9、H11、A12、R13、A14、S15、H16、L17、G18和A20中的氨基酸殘基從SEQ ID NO1所示的氨基酸序列中被刪除。
6.權利要求5所述的肽的用途，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個氨基酸殘基被刪除。
7.權利要求1～6中任一項所述的肽的用途，其中所述肽與一個或多個氨基酸殘基、其他肽或其它物質相連接。
8.權利要求1～7中任一項所述的肽的用途，其中所述肽與大約1～大約100個附加氨基酸殘基相連接，例如大約5～大約50個氨基酸殘基。
9.權利要求1～8中任一項所述的肽的用途，其中肽通過酰胺化、酯化、酰化、乙酰化、PEG化或烷基化而修飾。
10.權利要求1～9中任一項所述的肽的用途，其中抗微生物組合物是含有藥學上允許的緩沖液、稀釋劑、載體、佐劑或賦形劑的藥物組合物。
11.權利要求10所述的肽的用途，其中所述組合物含有鹽。
12.權利要求11所述的肽的用途，其中所述的鹽選自單價的鈉、鉀；或二價的鋅、鎂、銅或鈣。
13.權利要求12所述的肽的用途，其中所述的鹽為二價的鋅。
14.權利要求10～13中任一項所述的肽的用途，其中所述藥物組合物的pH的范圍為約4.5～約7.0。
15.權利要求1～14中任一項所述的肽的用途，其中所述抗微生物或藥物組合物含有在權利要求1～9中限定的1、2、3或4種不同的多肽的混合物。
16.權利要求1～15中任一項所述的肽的用途，其中所述抗微生物或藥物組合物含有一種或多種抗生素和/或防腐藥劑。
17.權利要求16所述的肽的用途，其中所述藥劑選自下述物質青霉素、頭孢菌素、碳頭孢烯類、頭霉素、碳青霉烯類、單環內酰胺類、氨基糖苷類、糖肽類、喹諾酮類、四環素類、大環內酯類、氟喹諾酮類、碘酒、銀、銅、洗必泰、聚己縮胍、雙胍類、脫乙酰殼多糖、醋酸及過氧化氫。
18.權利要求1～17中任一項所述的肽的用途，其中所述抗微生物或藥物組合物具有下述劑型顆粒劑、粉劑、片劑、包衣片劑、膠囊劑、栓劑、糖漿劑、可注射劑型、乳劑、凝膠、油膏、混懸物、膏、氣霧劑、滴丸劑。
19.與SEQ ID NO2所示序列具有至少70％的同源性的多肽在制備用于降低或殺滅微生物的抗微生物的組合物中的用途。
20.權利要求19所述的多肽在制備用于降低或殺滅微生物的抗微生物的組合物中的用途，其中，所述多肽與SEQ ID NO2所示序列具有80％、90％或95％的同源性。
21.權利要求1～20中任一項所述的肽的用途，其中所述微生物選自細菌、病毒、寄生蟲、真菌和酵母。
22.權利要求21所述的肽的用途，其中所述微生物選自革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌，例如糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、大腸桿菌(Eschericia coli)、假單胞綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、奇異變形菌(Proteus mirabilis)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、病毒、寄生蟲、真菌和酵母，例如白色假絲酵母(Candida albicans)、近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)。
23.權利要求1～22中任一項所述的肽的用途，其中所述抗微生物或藥物組合物被包含于繃帶、膏藥、縫合線、肥皂、棉球、尿布、香波、牙膏、抗痤瘡用品、防曬霜、紡織品、粘合劑、傷口敷料、清潔溶液或植入物中。
24.權利要求1～23中任一項所述的肽的用途，其中所述抗微生物組合物用于治療選自下述的疾病燒傷的預防性治療、外科術后或皮膚外傷后治療、特應性皮炎、膿皰病、慢性皮膚潰瘍、傷口和燒傷傷口的急性感染、痤瘡、外耳炎、真菌性感染、肺炎、脂溢性皮炎、假絲酵母性擦爛、假絲酵母性陰道炎、咽喉假絲酵母性感染、眼部感染和鼻腔感染。
25.一種治療患有微生物感染的哺乳動物的方法，包括對患者施用治療有效量的權利要求10～22中任一項所述的藥物組合物。
26.權利要求25所述的治療哺乳動物的方法，其中所述哺乳動物選自人、馬、狗、貓、牛、豬和駱駝。
全文摘要
本發明涉及肽在制備用于抗微生物的組合物中的用途，所述的肽至少有一個氨基酸殘基被取代以提高該抗微生物肽的效力。該組合物可用作抗微生物，例如細菌、病毒、真菌、寄生蟲以及酵母的藥物組合物。
文檔編號A61P31/04GK101068563SQ200580041601
公開日2007年11月7日 申請日期2005年11月17日 優先權日2004年11月17日
發明者A·施密特興, M·馬爾姆斯滕, B·沃爾澤 申請人:德瑪根股份公司