B7－h1和癌癥的診斷、預后和治療方法

專利名稱：B7－h1和癌癥的診斷、預后和治療方法
技術領域：
本發明涉及表達于癌組織的免疫分子，尤其是涉及一種對所述免疫分子在腫瘤細胞和腫瘤浸潤白細胞內表達的評估。
背景技術：
癌癥開始和發展的重要決定因素是癌細胞具有逃避宿主免疫系統的能力。例如，存在于癌癥組織中的不足、不適當或抑制性的免疫分子能限制宿主對癌癥產生免疫應答的能力。
美國專利號6,803,192和待審美國申請序列號09/649,108、10/127,282和10/719,477和國際申請號US/02/32364在此完整引入以供參考。

發明內容
本發明部分基于在腎細胞癌(RCC)病人中發現的死亡風險與表達共刺激人糖蛋白B7-H1的腫瘤細胞和/或腫瘤中白細胞的數量成正比。這里采用的術語“B7-H1”指來自任何哺乳動物種的B7-H1，術語“hB7-H1”指人B7-H1。美國專利號6,803,192和待審美國申請序列號09/649,108進一步詳細描述了B7-H1多肽和核酸，其公開內容在此完整引入以供參考。
本發明提供一種基于癌癥組織細胞的B7-H1表達來診斷帶有或可能患某種組織癌癥的方法，預測免疫療法成功的方法，預后的方法，及治療方法。腫瘤中的白細胞有時候在這里指“腫瘤浸潤白細胞”或“浸潤腫瘤的白細胞”。
更特別地，本發明提供一種在個體中診斷癌癥的方法。本方法包括(a)提供被懷疑有或可能會發生此種組織癌癥的個體的組織樣本，所述樣本包括測試細胞，所述測試細胞為組織細胞或浸潤組織的白細胞；和(b)評估所述測試細胞是否表達B7-H1，當一些或所有測試細胞表達B7-H1時說明個體患癌。
B7-H1表達的評估能通過檢測B7-H1多肽或mRNA來進行。B7-H1多肽能通過，例如用與B7-H1多肽結合的抗體接觸組織樣本或組織樣本中所含的測試細胞來檢測。合適的檢測B7-H1多肽的方法可以包含不限于，熒光流式細胞分析技術(FFC)或免疫組織學。B7-H1 mRNA能通過例如采用能與B7-H1 mRNA雜交(如通過原位雜交)的核酸探針與組織樣本接觸或通過反轉錄酶-聚合酶鏈反應來檢測。所述組織可以是任何器官或解剖學系統的組織，并且可以包括但不限于肺、表皮、結締、血管、肌肉、神經、骨骼、淋巴、前列腺、子宮頸、乳房、脾、胃、腸、口腔、食道、子宮、卵巢或睪丸組織。所述組織也可以是腎臟組織。個體可以是人等哺乳動物。
本發明的其它方面是一種鑒定免疫療法的候選者的方法。本方法包括(a)提供帶有此種組織癌癥的個體的組織樣本，其中組織樣本含有測試細胞，所述測試細胞為癌細胞或腫瘤浸潤白細胞；和(b)評估組織樣本中測試細胞表達B7-H1的水平，當在測試細胞中檢測不到B7-H1表達或測試細胞表達的B7-H1低于測試細胞表達B7-H1的免疫-抑制閾值水平時，個體很有可能能從免疫療法中獲益。
B7-H1水平能通過采用，例如，任何所述診斷方法檢測B7-H1多肽或mRNA來評估。所述組織可以是任何器官或解剖系統的組織，并且可以包括但不限于、肺、上皮、關節、血管、肌肉、神經、骨骼、淋巴、前列腺、子宮頸、乳房、脾、胃、腸、口腔、食道、子宮、卵巢或睪丸組織。所述組織也可以是腎臟組織。個體可以是像，如，人這樣的哺乳動物。所述癌癥可以是任何癌癥，并且包括，如，腎細胞癌。
在另一個實施例中，本發明提供了一種決定癌癥患者預后的方法。本方法包括(a)提供帶有此種組織癌癥的個體的組織樣本，所述組織樣本包括測試細胞，所述測試細胞為組織細胞或腫瘤浸潤白細胞；和(b)評估組織樣本中表達B7-H1的測試細胞的水平，其中如果在測試細胞表達B7-H1的水平是預兆水平，或超過預兆水平，相比測試細胞表達B7-H1水平低于預兆水平的個體更有可能死于癌癥。所述預兆水平是根據本領域公知的統計學臨床分析(如，本文描述的)獲得的預確定值。對B7-H1的評估可以通過采用任何一種本領域公知方法，包括例如上述診斷方法和免疫療法來檢測B7-H1多肽或B7-H1 mRNA來得到。組織樣本可是是任何組織，并且可以包括例如任何上述的組織。組織的提供者能夠是如人這樣的哺乳動物。
本發明的另一個方面是治療方法。本方法包括(a)鑒定患癌的個體，其中一些或所有癌細胞或一些或所有癌細胞的腫瘤浸潤白細胞表達B7-H1；和(b)給個體遞送能干擾B7-H1與其受體發生相互作用的藥劑。所述藥劑能與B7-H1或B7-H1的一類受體，例如，PD-1受體結合。所述藥劑可以是與B7-H1或B7-H1受體結合的抗體抗體片段(如，Fab’，F(ab’)2，或單鏈Fv(scFv)片段)；可溶性B7-H1或B7-H1的可溶性功能片段；可溶性B7-H1受體或其可溶性功能片段。只要有需要，藥劑能夠在施用一種或多種免疫調節因子、生長因子、或抗血管生成因子之前，同時，或之后施用。此類免疫調節因子、生長因子、和抗血管生成因子包括但不限于白介素(IL)-1到25、干擾素-γ(IFN-γ)、干擾素-α(IFN-α)、干擾素-β(IFN-β)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(G-CSF)、血管內皮抑制素(endostatin)、血管生成抑制素(angiostatin)、和血小板反應蛋白(thrombospondin)。施用所述藥劑和/或一種或多種免疫調節細胞因子、生長因子、或或抗血管生成因子可以是全身的(如靜脈內)或局部的，如在外科手術過程中直接注射或灌輸入含有癌細胞和/或腫瘤浸潤白細胞的組織內。所述癌癥可以是不限于，血癌、神經癌、黑素瘤、乳癌、肺癌、頭頸癌、胃腸癌、肝癌、胰腺癌、腎癌、泌尿生殖器癌、骨癌、或血管癌。
本發明的另一方面是一種抑制B7-H1在腫瘤細胞或腫瘤浸潤白細胞中表達的方法。本方法包括(a)鑒定一個癌癥患者，所述癌癥包括表達B7-H1的靶細胞，所述靶細胞為腫瘤細胞或腫瘤浸潤白細胞；和(b)在靶細胞中引入(i)與B7-H1轉錄子雜交的反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸抑制B7-H1在細胞中的表達；或(ii)B7-H1干擾RNA(RNAi)。所述引入步驟可以包括對個體施用反義寡核苷酸或RNAi并由靶細胞攝取所述寡核苷酸或RNAi。可選地，所述引入步驟可以包括對個體施用并由細胞攝取核酸，該核酸包含和反義寡核苷酸互補的核苷酸序列可操作性相連的轉錄調節元件(TRE)的核酸，在細胞內該核苷酸序列的轉錄產生反義寡核苷酸。而且，所述引入步驟可以包括對個體施用并由細胞攝取核苷酸(a)從該核苷酸能在多個TRE的指導下轉錄RNAi的有義鏈和反義鏈；或(b)根據所述核苷酸，在單個TRE的指導下能轉錄RNAi的有義鏈和反義鏈。
所述組織樣本可以是肺、上皮、結締、血管、肌肉、神經、骨骼、淋巴、前列腺、宮頸、乳房、脾、胃、腸、口腔、食道、皮膚、肝臟、膀胱、甲狀腺、胸腺、腎上腺、腦、膽囊、胰腺、子宮、卵巢或睪丸組織。所述組織也可以是腎臟組織。所述組織癌癥可以是任何癌癥，并且包括如腎細胞癌。
所述個體可以是哺乳動物并包括例如人、非人類靈長類動物(如猴)、馬、奶牛(或公牛)、豬、綿羊、山羊、貓、兔子、豚鼠、倉鼠、大鼠、或沙鼠。
這里采用的“干擾B7-H1與B7-H1受體之間的相互作用”指(a)完全阻斷B7-H1與B7-H1受體之間的物理相互作用，使B7-H1分子與其受體之間基本上沒有物理相互作用，或(b)改變B7-H1分子與其受體之間的相互作用，使得物理相互作用不能遞送信號到含有B7-H1和/或B7-H1受體的細胞，或遞送實質上不影響細胞抗癌活性的信號。
“多肽”和“蛋白質”交替使用，并指代任何氨基酸的肽鍵連接鏈，不論其長度或翻譯后修飾。對本發明有益的多肽包括各種與野生型多肽相同但最多有50(如不超過45；40；35；30；25；20；19；18；17；16；15；14；13；12；11；10；9；8；7；6；5；4；3；2；或1)個保守取代的差別的變體多肽序列。所有必需的是變體多肽有至少20％(如，至少25；30％；35％；40％；45％；50％；60％；70％；80％；85％；90％；93％；95％；96％；97％；98％；99％；99.5％；99.8％；99.9％；或100％或更多)的野生型多肽的活性。保守取代典型包括在如下組內的取代甘氨酸和丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，和亮氨酸；天(門)冬氨酸和谷氨酸；天(門)冬酰胺，谷酰胺，絲氨酸，和蘇氨酸；賴氨酸，組氨酸，和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。
這里使用的“腫瘤浸潤白細胞”可以是T-淋巴細胞(如CD8+T淋巴細胞和/或CD4+T淋巴細胞)，B淋巴細胞，或其它骨髓品系細胞(包括粒性白細胞(嗜中性粒細胞，嗜曙紅細胞，嗜堿性細胞))、單核細胞、巨噬細胞、樹狀細胞(dendriticcells)(如，交錯樹狀細胞)、組織細胞，和自然殺傷細胞。
除非有其它定義，這里使用的所有技術和科學術語與本發明所屬領域中普通技術人員的通常理解相一致。如發生沖突，以本說明書包括定義為準。盡管與這里描述的相似或雷同的方法和材料可以在實踐或驗證本發明時采用，下文描述了優選方法和材料。所有出版物、專利申請、專利和其它這里提到的參考文獻都完整引入以供參考。這里公開的材料，方法，和實施例均僅為說明性的而非用于限定。
本發明的其它特征和優點將在后面通過附圖和權利要求來描述。


圖1是一系列免疫染色(使用hB7-H1特異抗體)的顯微照片(400X放大倍率)有高腫瘤細胞hB7-H1表達的RCC樣本(圖1A)；有高白細胞hB7-H1表達的RCC樣本(圖1B)；在腫瘤細胞或白細胞中均未檢測到hB7-H1表達的RCC樣本(圖1C)；和在近端小管中未檢測到hB7-H1表達的正常腎臟樣本(圖1D)。
圖2是一系列線圖，顯示從196個個體中采集透明細胞RCC樣本用于分析，得到的hB7-H1表達與RCC死亡之間的關聯性。
圖2A顯示腫瘤或hB7-H1表達與RCC死亡(風險率2.91；95％CI[置信區間]1.39-6.13；p＝0.005)之間的關聯性。腎切除術后1、2、和3年的癌癥特異性生存率(帶有標準誤差[SE]，括號內表示仍在危險中的人數)為對帶有≥10％腫瘤hB7-H1表達的樣本的個體而言，分別為87.8％(4.1％，53)，72.3％(6.0％，30)，和63.2％(7.2％，11)；而帶有＜10％腫瘤hB7-H1表達的樣本的個體，分別為93.6％(2.3％，95)，88.4％(3.4％，48)，和88.4％(3.4％，19)；圖2B顯示調整過評分的白細胞hB7-H1表達與死于RCC(風險率3.58；95％CI1.74-7.37；p＜0.001)之間的關聯性。癌癥特異性1，2，和3年生存率(SE，仍在危險中的人數)為對具有白細胞hB7-H1表達分數≥100的樣本的個體而言，分別為83.5％(6.2％，26)，63.9％(9.2％，13)，和53.6％(10.2％，5)；而帶有白細胞hB7-H1表達分數＜100的樣本的個體，分別為93.5％(2.1％，122)，86.2％(3.3％，65)，和84.8％(3.5％，25)。
圖2C顯示高聚集腫瘤內hB7-H1表達與死于RCC的關聯性(風險率4.53；95％CI1.94-10.56；p＜0.001)。癌癥特異性1，2，和3年生存率(SE，仍在危險中的人數)為對于帶有高聚集腫瘤內hB7-H1表達的樣本的個體而言，分別為87.0％(3.8％，61)，70.0％(5.8％，32)，和61.9％(6.8％，13)；而對同時具有＜10％腫瘤和＜100白細胞(低聚集腫瘤內表達)hB7-H1表達的樣本的個體而言，分別為94.9％(2.2％，87)，91.9％(3.1％，46)，和91.9％(3.1％，17)。
圖3是對全長未成熟hB7-H1的氨基酸序列(SEQ ID NO1)的描述，即hB7-H1包含大約22氨基酸的前導肽；圖4是對編碼全長未成熟B7-H1的cDNA的核苷酸序列(SEQID NO2)的描述；圖5是對全長未成熟鼠B7-H1的氨基酸序列(SEQID NO3)的描述；圖6是對編碼全長未成熟鼠B7-H1的cDNA的核苷酸序列(SEQID NO4)的描述。
具體實施例方式
本發明公開了具有表達共刺激糖蛋白hB7-H1水平升高的腫瘤細胞和/或腫瘤浸潤白細胞的腎細胞癌(RCC)病人中，死于RCC的風險增加。而且，腫瘤細胞和/或腫瘤浸潤白細胞hB7-H1表達水平增高與更具侵略性的腫瘤相關，并且這種關聯性甚至持續到控制RCC進程的常規預測因子之后，包括例如腫瘤、結、轉移(TNM)階段；原始腫瘤尺寸；核分級(nuclear grade)；和組織學的腫瘤壞死。
B7-H1在正常未激活哺乳動物細胞中的表達主要(如果不是獨有的)限制于巨噬細胞品系的細胞，并且提供可能的調節T細胞活性的共刺激信號源。相反，腫瘤細胞內B7-H1的異常表達有可能損害T細胞的功能和生存，導致宿主抗癌免疫力缺陷。
發明人發現人RCC腫瘤表達hB7-H1。特別是發現腎細胞癌(RCC)腫瘤和白細胞RCC腫瘤均表達hB7-H1。相反地，腎皮層近端小管，也就是被認為是透明細胞腫瘤的發源地，不表達hB7-H1。
采集來自196位2000和2002年間在獲得Mayo臨床腎切除術登記處(Mayo ClinicNephrectomy Registry)用放射腎摘除術或單側的保留腎單位手術治療透明細胞RCC病人的臨床樣本。免疫組織學檢測和定量檢測樣本中的hB7-H1表達揭示腫瘤樣本顯示腫瘤內hB7-H1高表達的病人(由腫瘤細胞單獨，白細胞單獨，或腫瘤和/或白細胞合并獲得)有更具侵略性的腫瘤，并且處于明顯增加的死于RRC的風險中。
增加的腫瘤細胞hB7-H1和腫瘤浸潤白細胞hB7-H1(高聚集腫瘤內hB7-H1)的組合比表達hB7-H1的腫瘤細胞單獨或腫瘤浸潤白細胞單獨更強烈預示病人的結果。高聚集腫瘤內hB7-H1表達水平也與區域性淋巴結牽連、遠距離轉移、進級核分級、和組織性腫瘤壞死的存在顯著相關。
由于能削弱激活的腫瘤特異性T細胞的功能和存活率，腫瘤細胞(如，RCC細胞)或浸潤白細胞表達的B7-H1與癌癥(如RCC)患者體內普遍觀察到的免疫抑制相關，并能作為宿主對用于治療晚期癌癥的免疫療法的反應的關鍵決定因素(如，IL-2，IL-12，IFN-α，接種疫苗或T細胞過繼性療法)。這增加了對癌癥患者施用能干擾B7-H1與其受體(如，PD-1)之間的相互作用的藥劑作為一種免疫療法的可能性，尤其對先前由于腫瘤內高水平表達B7-H1，從而對其它免疫治療模式沒有反應或幾乎沒有反應的那些病人。
這些發現為下面描述的本發明的方法提供了支持。
診斷方法本發明提供一種在個體中診斷癌癥的方法。所述方法包括(a)提供被懷疑有，或可能將來會有此種組織癌癥的個體的組織樣本，所述樣本包括測試細胞，所述測試細胞為組織細胞或浸潤組織的白細胞；和(b)評估所述測試細胞是否表達B7-H1。一些或所有測試細胞表達說明個體患有癌。由于大量癌細胞都在表面上表達B7-H1，本發明的方法對診斷任何此類癌癥都特別有效。測試細胞可以是，例如，乳腺細胞、肺細胞、結腸細胞、胰腺細胞、腎細胞、胃細胞、肝細胞、骨骼細胞、血細胞(如淋巴樣細胞、粒細胞、單核細胞或巨噬細胞)、神經組織細胞、黑素細胞、卵巢細胞、睪丸細胞、前列腺細胞、子宮頸細胞、陰道細胞、膀胱細胞、或其它任何這里列出的細胞。而且，測試細胞可以是含有任何上面列出的細胞的相關組織中出現的白細胞。組織浸潤的淋巴細胞可以是T細胞(CD4+T細胞和/或CD8+T細胞)或B淋巴細胞。此類白細胞也可以是嗜中性粒細胞、嗜曙紅細胞、嗜堿細胞、單核細胞、巨噬細胞、組織細胞、或自然殺傷細胞。個體可以是哺乳動物并且包括，例如，人類、非人類靈長類(如、猴子、狒狒、或大猩猩)、馬、母牛(或公牛)、豬、綿羊、山羊、貓、家兔、豚鼠、倉鼠、大鼠、沙鼠、或小鼠。
如這里描述的，本發明提供許多診斷優點和用途。本發明的方法中，可評估B7-H1多肽和/或mRNA水平。評估組織樣本中的B7-H1水平來診斷，或來確定獲得樣本的個體中癌的存在。
在組織樣本中檢測多肽的方法是本領域公知的。例如，與B7-H1特異性表位結合的抗體(或其片段)能用來評估組織樣本來源的測試細胞是否表達B7-H1。此類抗體可是是單克隆或多克隆抗體。這類實驗中，抗體本身或與之結合的二抗能被可檢測標記。或者抗體能與生物素偶聯，并且可用可檢測標記的親和素(一種與生物素結合的多肽)檢測生物素化抗體的存在。這些本領域技術人員熟知的方法(包括“多層夾心實驗”)的組合能用于提高方法的靈敏度。這類蛋白檢測實驗(如，ELISA或Western印跡)中的一些能應用于細胞裂解物，其它(如免疫組織學方法或熒光流式細胞分析技術)能應用于組織學切片或未裂解的細胞懸液。所述組織樣本可以是，如、肺、上皮、關節、血管、肌肉、神經、骨骼、淋巴、前列腺、子宮頸、乳房、脾、胃、腸、口腔、食道、皮膚、肝臟、膀胱、甲狀腺、胸腺、腎上腺、腦、膽囊、胰腺、子宮、卵巢或睪丸組織。
檢測組織樣本中mRNA的方法是本領域已知的。例如，可裂解細胞并可用各種方法檢測裂解物中或來自裂解物的純化或半純化的RNA中的mRNA，這些方法包括而不限于采用可檢測標記的基因特異性DNA或RNA探針(如，Northern印跡實驗)的雜交實驗和使用適當的基因特異性寡核苷酸引物的定量或半定量RT-PCR方法。可選地，定量或半定量的原位雜交實驗能通過，例如，組織切片或未裂解細胞懸液，和可檢測(如，熒光或酶)標記的DNA或RNA探針來實現。另外的定量mRNA的方法包括RNA保護實驗(RPA)和SAGE。
評估B7-H1表達(RNA和/或多肽)的方法可以是定量的，半定量的，或定性的。因此，如，B7-H1表達水平可以定為一離散值。例如，采用定量RT-PCR手段時，B7-H1 mRNA的表達水平可以通過將從定量實驗得到的檢測信號與已知濃度的下列檢測信號關聯而數值化。檢測信號為(a)B7-H1核酸序列(如，B7-H1 cDNA或B7-H1轉錄子)；或(b)含有編碼B7-H1的核酸序列的RNA或DNA的混合物。可選地，B7-H1表達水平可以采用任何一種本領域公知的半定量/定量系統來估計。因此，B7-H1在細胞或組織樣本中的表達水平可以被表述成例如，(a)“極好的”，“好的”，“令人滿意的”，“不令人滿意的”，和/或“少的”中的一個或多個；(b)“非常高”，“高”，“平均”，“低”，和/或“非常低”的一個或多個；或(c)“++++”，“+++”，“++”、“+”、“+/-”、和/或“-”中的一個或多個。當需要時，B7-H1在來自個體的組織中的表達水平可以被表述成與來自下列組織的B7-H1的表達相關(a)已知未患癌的個體組織(如，對側腎或肺，或未牽連的淋巴結)；或(b)來自一個或多個已知未患感興趣的癌的個體的對應組織，優選已知未患任何癌。
評估標記量的方法依賴于標記的屬性并且是本領域公知的。適當的標記包括但不限于，放射性核素(如，125I，131I，35S，3H，或32P)，酶(如，堿性磷酸酶，辣根過氧化物酶，熒光素酶，或β-半乳糖苷酶)，熒光團或蛋白質(如，熒光素，若丹明，藻紅蛋白，綠色熒光蛋白(GFP)，或藍色熒光蛋白(BFP))，或發光團(如，Quantum Dot公司，Palo Alto，CA提供的QdotTM微粒)。其它可用實驗包括定量免疫沉淀反應或補體結合實驗。
本發明的診斷實驗中，當來自個體的表達B7-H1的測試細胞的比例高于對照值，診斷個體患有癌。所述對照值可以是如(a)在已知未患癌的個體對應組織中表達B7-H1的細胞的比例(如，對側腎或肺，或無關的淋巴結)；或(b)來自一個或多個其它已知未患感興趣的癌，優選已知未患任何癌的個體的對應組織中表達B7-H1細胞的比例。
本發明的方法可以單獨使用或與其它診斷癌癥的方法一同使用。例如，需要或優選的情況下，可以在評估其它有用的診斷癌癥標記的分子水平之前、當時、或之后測量癌癥或被懷疑是癌癥組織的樣本的測試細胞中表達B7-H1的水平。此類診斷標記可以是不限于腫瘤相關抗原(TAA)。有關的TAA包括而不限于癌胚抗原(CEA)、MAGE(黑素瘤抗原)1-4、6和12、MUC(粘液素)(如，MUC-1，MUC-2，等)、酪氨酸酶、MART(黑素瘤抗原)、Pmel 17(gp100)、GnT-V內含子序列(N-乙酰葡糖胺轉移酶V內含子V序列)、PSA(前列腺特異性抗原)、PSMA(前列腺特異性膜抗原)、PRAME(黑素瘤抗原)、β-連環蛋白，MUM-1-B(黑素瘤遍在變異基因產物)、GAGE(黑素瘤抗原)1、BAGE(黑素瘤抗原)2-10、c-ERB2(HER2/neu)、EBNA(EB病毒核抗原)1-6、gp75，人乳頭瘤病毒(HPV)E6和E7、p53m肺抗性蛋白(LRP)、Bcl-2、Ki-67、和VHL(vonHippel-Lindau)基因。
鑒定有可能從免疫療法中獲益的癌癥患者的方法本發明的另一方面是一種鑒定免疫療法的候選者的方法。本方法包括提供來自患所述組織癌癥的個體的組織樣本。所述組織樣本包含測試細胞，所述測試細胞為癌細胞或腫瘤浸潤白細胞。評估表達B7-H1的組織樣本中的測試細胞的水平，由此當B7-H1表達在測試細胞中檢測不到，或少于測試細胞表達B7-H1的免疫抑制閾值水平時，個體更可能從免疫療法中獲益。
所述免疫抑制閾值水平是相關表達B7-H1的測試細胞的預定水平。當來自感興趣的癌癥患者體內的測試細胞含有的表達B7-H1的細胞水平少于表達B7-H1細胞的免疫抑制閾值水平時(針對相應癌癥預先決定)，個體相較患同種癌癥但相應測試細胞含有的表達B7-H1的細胞水平等于、或大于所述免疫抑制閾值水平的個體更可能從免疫療法中獲益。所述免疫抑制閾值水平可以由進行本領域公知的，如本文所述的統計學診斷分析而得到。
評估測試細胞是否表達B7-H1的方法與上面在描述診斷方法時提到的一樣。此類方法，也如上面描述的，可以是定量、半定量、或定性方法。
“免疫療法”可以是主動免疫療法或被動免疫療法。對于主動免疫療法而言，治療依賴通過施用免疫應答調節劑，在體內刺激內源宿主免疫系統對腫瘤的應答。這類免疫應答調節劑將在下面描述。
對被動免疫療法而言，治療包括遞送帶有確定腫瘤免疫反應性的藥劑(如免疫效應細胞或抗體)，它們能直接或間接介導抗腫瘤效應，而不必需依賴完整的宿主免疫系統。免疫效應細胞的例子包括白細胞，如前面討論過的腫瘤浸潤白細胞、T淋巴細胞(如CD8+細胞殺傷性T淋巴細胞和/或CD4+T輔助淋巴細胞)、殺傷細胞(如自然殺傷細胞和淋巴因子活化殺傷細胞)、B細胞和抗原遞呈細胞(如樹枝狀細胞和巨噬細胞)。
免疫療法也可以是一種或多種下面描述的方法(在“治療方法”和“抑制B7-H1表達的方法”中)。
預后方法在另一個實施例中，本發明要求確定癌癥患者預后的方法。本方法包括(a)提供患有此種組織癌癥的個體的組織樣本，所述組織樣本包括測試細胞，所述測試細胞為癌細胞或腫瘤浸潤白細胞；和(b)評估組織樣本中表達B7-H1的測試細胞的水平。當測試細胞的預兆水平，或超過預兆水平表達B7-H1，此個體比測試細胞表達B7-H1水平低于預兆水平的個體更有可能死于此種癌癥。所述預兆水平是由本領域公知的統計學臨床分析得到的預定值，如本文描述的那些。
因此例如，當癌癥個體的測試細胞含有顯著水平的B7-H1表達細胞，但卻少于表達B7-H1的細胞的預兆水平(針對相應的癌癥預先決定)時，癌癥患者相較患有同種癌癥但它對應測試細胞不含有可檢測的表達B7-H1細胞的患者更有可能死于這種癌癥。另一方面，當癌癥患者的測試細胞含有超過預兆水平的表達B7-H1的細胞時，癌癥患者相較患有同種癌癥但對應測試細胞不含有可檢測到的表達B7-H1的細胞或表達B7-H1的細胞水平低于表達B7-H1的細胞的預兆水平的患者，更有可能死于此種癌癥。而且，對于那些在適當的測試細胞群中表達B7-H1的細胞水平高于預兆水平的癌癥患者，死于這種癌癥的機會可能與測試細胞群中表達B7-H1的細胞的水平成正比。
這里使用的“評估測試細胞是否表達B7-H1”或“評估組織樣本中測試細胞表達B7-H1的水平”能通過任何上述方法來決定。預后方法通常是定量的或半定量的。
個體可以是任何在“診斷方法”中所列出的并且癌癥可以是如下任何一種腎癌、血癌(如、白血病或淋巴瘤)、神經癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、頭和頸癌、胃腸癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖器癌、骨癌、或血管癌。
治療方法本發明也包括一種治療方法。本方法可以包括(a)確定患癌的個體，其中一些或所有癌細胞或一些或所有癌的腫瘤浸潤白細胞表達B7-H1；和(b)給個體遞送能干擾B7-H1與其一類受體發生相互作用的藥劑。這些方法可以在任何上述方法之后或單獨進行。所述藥劑可以是抗體或抗體片段，如與B7-H1結合的Fab’，F(ab’)2，或scFv片段。所述藥劑也可以是可溶性B7-H1或可溶性B7-H1的功能片段；B7-H1的可溶性受體或其可溶性功能片段；與B7-H1受體(如PD-1受體)結合的抗體或抗體片段。所述PD-1受體在美國專利號6,808,710中有更具體的描述。其公開內容在此完整引入以供參考。
在一個實施例中，藥劑本身被施用于個體。通常藥劑會被懸浮于藥物學上可接受的載體(如，生理鹽水)中，口腔給藥或通過靜脈(i.v.)滴注，或皮下、肌肉內、膜內、腹膜內、直腸內、陰道內、鼻內、胃內、氣管內、或肺內注射。藥劑可以，例如，直接遞送到免疫應答位置，如受侵襲組織或器官或脾臟區域內的淋巴結。所需劑量根據選擇的給藥途徑；配方的性質；病人疾病的情況；病人體型、體重、表面積、年齡和性別；施用的其它藥物；和主治醫生的判斷來確定。合適的劑量范圍是0.0001-100.0mg/kg。根據可得的各種不同化合物和不同給藥途徑的不同效率就能預見所需劑量差異很大。例如，口腔給藥預期比通過i.v.注射需要更高劑量。這些劑量水平的差異能通過用于優化的標準經驗途徑進行調整，這對本領域技術人員而言很容易理解。給藥可以是單次或多次(如，2-，3-，4-，6-，8-，10-，20-，50-，100-，150-，或更多次)。將所述化合物封裝在合適的遞送載體(如，聚合物微顆粒或可植入裝置)能增加遞送效率，尤其是對口腔遞送。
可選地，當藥劑是多肽時，含有編碼多肽的核酸序列的多核苷酸能被遞送到哺乳動物的合適細胞中。編碼序列的表達可被指向個體體內任何細胞。然而，表達優選被指向在接近排放受感染組織或器官的淋巴組織的細胞內或附近。編碼序列的表達可被指向例如包含癌癥組織的細胞(如，腫瘤浸潤白細胞和腫瘤細胞)或免疫相關細胞，如B細胞，巨噬細胞/單核細胞，或交錯樹狀細胞內。這可以通過例如使用本領域公知的聚合的生物可降解的微粒或微膠囊遞送裝置和/或組織或細胞特異性抗體來實現。
另一種實現核酸攝取的方法是采用能通過標準方法制備的脂質體。所述載體能單獨摻入所述遞送載體或與組織特異性抗體一同摻入。可選地，可以制備一種由質粒或其他與多-L-賴氨酸通過靜電或共價力結合的載體組成的分子。多-L-賴氨酸與能與靶細胞上受體結合的配體結合[Cristiano等(1995)，J.Mol.Med.73479]。可選地，組織特異性尋靶可以通過采用本領域公知的組織特異性轉錄調節因子(TRE)來實現。遞送“裸DNA”(如，不含遞送載體)到肌肉內、皮層內或皮下部位是另外一種實現體內表達的方法。
在對應的多核苷酸(如，表達載體)內，編碼感興趣的多肽并帶有起始甲硫氨酸和任選的靶向序列的核苷酸與啟動子或增強子-啟動子組合可操作性連接。短氨基酸序列能作為信號指導蛋白質到達特異性細胞內區室。此類信號序列在美國專利號5,827,516中具體描述，其公開內容在此完整引入以供參考。
增強子提供在時間，位置，和水平方面的特異性表達。與啟動子不同，在有啟動子的情況下，當離轉錄起始位點距離不同時，增強子也能起作用。增強子也可以位于轉錄起始位點的下游。為了使編碼序列位于啟動子控制下，必須將肽或多肽的翻譯閱讀框的轉錄起始位點置于啟動子下游(3’)的1-50個核苷酸之間。表達載體的編碼序列與轉錄終止區可操作性連接。
合適的表達載體包括質粒和病毒載體，如皰疹病毒、逆轉錄病毒、痘苗病毒、減毒痘苗病毒、金絲雀痘病毒，腺病毒和關腺伴隨病毒等。
多核苷酸可以藥物學上可接受的載體給藥。藥物學上可接受的載體是生物相容載體，適用于對人類施用，如生理鹽水或脂質體。治療有效量是所述多核苷酸能在接受治療的個體內產生藥學有益結果的量(如減少癌細胞增殖)。如醫學領域公知的，任何一位病人的劑量都由許多因素所決定，包括病人的體型、身體表面積、年齡、要施用的特定化合物、性別、給藥時間和途徑、綜合健康、和同時施用的其它藥物。劑量會變，但施用多核苷酸的優選劑量是大約106到1012個所述多核苷酸分子的拷貝。該劑量如需要能重復施用。給藥途徑可以是任何上述列出的途徑。
此外，所述方法可以是體外過程，包括提供一種重組細胞，或細胞子代，它來自個體并在體外被一個或多個核酸轉染或轉化，該核酸編碼一個或多個能干擾B7-H1和B7-H1受體相互作用的因子，從而使細胞表達該因子；并且對個體施用細胞。所述細胞可以從癌組織中獲得(如，腫瘤細胞和/或腫瘤浸潤白細胞)或優選來自待施用細胞的個體內或另一個個體的非癌組織。所述細胞的供體和受體可以擁有同樣的主要組織相容性復合物(MHC；人體內的HLA)單元型。最優選所述供體和受體是純合基因型雙胞胎或是同樣的個體(如，是自體同源的)。所述重組細胞也可以施用于與重組細胞沒有或僅有一個、兩個、三個、或四個共有MHC分子的受體，如在當受體是嚴重免疫受損的情況下，在僅可得錯配細胞，和/或僅要求或需要短期存活的重組細胞的情況下。
藥劑的功效可以通過體外和體內試驗來評估。簡單地，可以測試藥劑的如下能力，例如，(a)抑制B7-H1和B7-H1受體之間的相互作用，(b)抑制癌細胞的生長，(c)誘導癌細胞凋亡，或(d)致使癌細胞對白細胞(如，淋巴細胞和/或巨噬細胞)產生的細胞介導的免疫應答更敏感。對體內研究而言，藥劑可以例如被注射進動物體內(如小鼠癌癥模型)然后評估它對癌癥的效果。基于所述結果，可以確定合適的劑量范圍和給藥途徑。
如貫穿本申請使用的，術語“抗體”指通過各種本領域公知的方法中的任一種產生的完整抗體(如IgM、IgG、IgA、IgD或IgE)分子。所述抗體可以是多克隆或單克隆抗體。對本發明也有益的是由非-人源(如，小鼠、大鼠、沙鼠或倉鼠)抗體制得的嵌合抗體和人源化抗體。這里采用的術語“抗體片段”指抗原結合性片段，如Fab、F(ab’)2、Fv和單鏈Fv(scFv)片段。scFv片段是單個多肽鏈，它同時包括衍生出scFv的抗體的重鏈和輕鏈可變區。
含有分子的結合域的抗體片段可通過現有技術產生。例如F(ab’)2片段可以通過胃蛋白酶消化抗體分子制成；Fab片段可以通過還原F(ab’)2片段的二硫鍵或通過對抗體分子進行木瓜蛋白酶和還原劑處理來制備。見例如，NationalInstitutes of Health，1 Current Protocols In Immunology，Coligan等編2.8，2.10(Wiley Interscience，1991)。scFv片段可以通過，例如在美國專利號4,642,334中描述的方法制得，所述美國專利在此完整引入以供參考。
嵌合和人源化單克隆抗體可以通過本領域公知的重組DNA技術來制成，例如，采用在Robinson等，國際專利出版物PCT/US86/02269；Akira等，歐洲專利申請184,187；Taniguchi，歐洲專利申請171,496；Morrison等，歐洲專利申請173,494；Neuberger等，PCT申請WO86/01533；Cabilly等，美國專利號4,816,567；Cabilly等，歐洲專利申請125,023；Better等，(1988)Science 240，1041-43；Liu等(1987)J.Immunol.139，3521-26；Sun等(1987)PNAS 84，214-18；Nishimura等(1987)Canc.Res.47，999-1005；Wood等(1985)Nature 314，446-49；Shaw等(1988)J.Natl.Cancer Inst.80，1553-59；Morrison，(1985)Science 229，1202-07；Oi等(1986)BioTechniques 4，214；Winter，美國專利號5,225,539；Jones等(1986)Nature 321，552-25；Veroeyan等(1988)Science 239，1534；和Beidler等(1988)J.Immunol.141，4053-60種描述的方法。
這里使用的，B7-H1受體的“功能片段”指B7-H1受體的片段，所述片段比野生型成熟B7-H1受體小，并且有至少10％(如至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或至少100％或更多)的B7-H1的野生型成熟受體與B7-H1結合的能力。這里采用的，B7-H1的“功能片段”指野生型成熟B7-H1多肽片段，所述片段比野生型成熟B7-H1多肽更小，并且有至少10％(如，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或至少100％或更多)的野生型成熟B7-H1與B7-H1受體結合的能力。測試和比較分子間相互結合的能力的方法是本領域公知的。
這里采用的，術語“可溶性”將本發明使用的受體與其結合于細胞膜的對應物區分開來。可溶性受體或受體的可溶性功能片段可能包含例如，胞外(配體結合)結構域，但缺乏使受體保持在細胞表面的跨膜區域。制備可溶性受體或其片段的方法是本領域公知的，并且包括例如，在合適的宿主細胞/表達載體系統中表達編碼受體胞外域的DNA片段。
這里使用的術語“治療”，指對患癌(或懷疑患癌)個體施用藥劑，目的是治療，減輕，緩解，補救，預防，或改善疾病、疾病的癥狀、疾病繼發的疾病階段、或疾病的易患病體質。治療劑(或組合物)的“有效量”是能在治療個體內產生藥學上有益結果的藥劑(或組合物)的量。本發明的方法可以單獨作用或與其它藥物或療法同時作用。
這里使用的，“預防”可以指完全預防疾病的癥狀，延遲疾病癥狀的出現，或減輕后來發展的疾病癥狀的嚴重性。這里采用的“治療”可以指完全消除疾病的癥狀或減輕疾病癥狀的嚴重性。
抑制B7-H1表達的方法本發明的另一個方面是抑制B7-H1在腫瘤細胞或腫瘤浸潤白細胞中的表達。本方法包括(a)鑒定一個癌癥患者，所述癌癥包括表達B7-H1的靶細胞，所述靶細胞為腫瘤細胞或腫瘤浸潤白細胞；和(b)在靶細胞中引入(i)與B7-H1轉錄子雜交的反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸在細胞中抑制B7-H1的表達；或(ii)B7-H1干擾RNA(RNAi)。這些方法可以在任何上面描述的方法后使用，或不與任何上述方法一起作用。
因此，如上所述，異常B7-H1表達損傷腫瘤-特異性T細胞的功能和存活，有可能通過抑制B7-H1的細胞內表達，以及通過干擾B7-H1與其受體的相互作用，來恢復抗-腫瘤免疫應答。因此，所述方法可能對治療和/或預防任何這里所述的癌癥有益。本方法可以用于，例如治療RCC。
反義化合物通常用來通過例如直接干擾靶mRNA分子的翻譯，或通過RNAse-H介導降解靶mRNA，通過干擾mRNA的5’加帽，通過由封閉5’帽來防止翻譯因子與靶mRNA結合，或通過抑制mRNA聚腺苷酸化而干擾蛋白質表達。干擾蛋白質表達由反義化合物與它的靶mRNA雜交開始。選擇用來與反義化合物相互作用的感興趣的靶mRNA的特異性靶位點。從而，例如為了調節多聚腺苷酸化，優選的位于mRNA靶上的靶位點是聚腺苷酸化信號或聚腺苷酸化位點。為了降低mRNA的穩定性或降解，不穩定化序列為優選的靶位點。一旦確定一個或更多靶位點，選擇與靶位點充分互補(如，在生理學條件下并具有充分特異性的充分雜交)的寡核苷酸來獲得期待效果。
與本發明有關的術語“寡核苷酸”指RNA、DNA、或兩者的擬物的寡聚物或多聚物。所述術語包括由天然存在的核堿基、糖和核苷間共價(骨架)鍵組成的寡核苷酸。RNA和DNA的正常聯接或骨架是3’到5’的磷酸二酯鍵。所述術語還指完全由(或含有部分)非天然存在的組分的寡核苷酸，它和僅含天然存在組分的寡核苷酸的功能相似。此類修飾取代的寡核苷酸通常因為所期待的性質，例如，增強的細胞攝取量(cellular uptake)、增強的靶序列親合力、和增加的核酶存在下的穩定性而優于天然存在的寡核苷酸。對于擬物，核堿基(嘧啶或嘌呤)結構通常被保存，但(1)糖或被修飾或被其它組分取代，和/或(2)核堿基間連接鍵被修改。一類證明為非常有益的核酸擬物稱作蛋白質核酸(PNA)。在PNA分子內，糖骨架被含有酰胺的骨架，特別是氨基乙基甘氨酸骨架所替換。堿基被保留并與骨架的酰胺部分的氮雜(aza)氮原子直接相連。PNA和其它本發明中有用的擬物在美國專利號6,210,289中詳細描述，所述公開在此完整引入以供參考。
本發明中使用的反義寡聚物通常由大約8到大約100(如，大約14到大約80或大約14到大約35)核堿基(或該處為天然存在的核堿基的核苷)組成。
反義寡核苷酸本身能被引入含有編碼能被引入細胞的反義寡核苷酸的核序列(可以與TRE連接)的細胞或表達載體。在后面的例子中，由表達載體產生的寡核苷酸是RNA寡核苷酸并且所述RNA寡核苷酸完全由天然存在的組分所組成。
當施用反義寡核苷酸時，它們可懸浮在藥物學上可接受的運載體(如，生理鹽水)內，并在與干擾B7-H1與B7-H1受體之間相互作用的藥劑的上述相同條件下施用。
當對個體施用含有編碼反義寡核苷酸的核序列(可以與TRE連接)的表達載體時，編碼序列的表達可被靶向個體體內腫瘤浸潤白細胞的腫瘤細胞，這是通過任何一種如上描述的針對表達能干擾B7-H1與B7-H1受體相互作用的多肽的載體的細胞-或組織-靶定技術而實現的。
與B7-H1 DNA同源的雙鏈干擾RNA(RNAi)也可以用來減少B7-H1在腫瘤細胞和/或腫瘤浸潤白細胞的表達。見，如，Fire等(1998)Nature 391806-811；Romano和Masino(1992)Mol.Microbiol.63343-3353；Cogoni等(1996)EMBO J.153153-3163；Cogoni和Masino(1999)Nature 399166-169；Misquitta和Paterson(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.961451-1456；和Kennerdell和Carthew(1998)Cell 951017-1026。所有這些文章的公開內容都在此完整引入以供參考。
能通過采用本領域公知方法的化學合成和酶連接反應分別構建RNAi的有義和反義RNA鏈。例如，每條鏈可以采用天然存在的核苷酸或各種修飾的核苷酸來化學合成，這些核苷酸設計用于增加分子的生物穩定性或增加有義和反義鏈形成的二倍體的物理穩定性，例如，硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。有義或反義鏈也可用表達載體生物學產生，其中在表達載體中目標B7-H1序列(全-長或片段)已經以有義或反義方向亞克隆。有義和反義RNA鏈可以在遞送dsRNA到細胞之前進行體外退火。可選地，退火可以在有義和反義鏈相繼遞送到腫瘤細胞和/或腫瘤浸潤白細胞之后在體內發生。
雙鏈RNAi干擾也可以通過將多核苷酸引入腫瘤細胞和/或腫瘤浸潤白細胞而實現，有義和反義RNA可以在單獨啟動子的指導下從該多核苷酸轉錄出來，或從該多核苷酸能在單個啟動子的指導下轉錄出同時含有有義和反義序列的單個RNA分子。
應該理解某些藥物和小分子也可以用來抑制B7-H1在腫瘤細胞和/或腫瘤浸潤白細胞中的表達。
本領域的技術人員能夠認識到就上面描述的反義方法而言，RNAi、藥物和小分子方法可以是體外或體內的。而且，遞送的方法和條件與針對反義寡核苷酸的那些一樣。
在上述任何一種抑制B7-H1與B7-H1受體相互作用以及抑制B7-H1表達的方法中，可使用一種或多種藥劑(如，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，15，18，20，25，30，40，50，60，70，80，100，或更多)包括例如，抑制化合物、反義寡核苷酸、RNAi、藥物或小分子(或編碼它們的載體)。
而且，此類藥劑可以與一種或多種(如，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，15，18，20，25，30，40，50，60，70，80，100，或更多)輔助藥劑共同作用，包括免疫調節細胞因子、生長因子、抗血管生成因子、免疫原性刺激因子、和/或對任何這些具有特異性的抗體。此類輔助藥物能在遞送任何上述列出的藥劑之前，同時，或之后施用。
免疫調節細胞因子、生長因子和抗血管生成因子的例子包括但不限于白介素(IL)-1到25(如，IL-2，IL-12，或IL-15)，干擾素-γ(IFN-γ)，干擾素-α(IFN-α)，干擾素-β(IFN-β)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，粒細胞巨噬細胞克隆刺激因子(GM-CSF)，粒細胞巨噬細胞克隆刺激因子(G-CSF)，內皮抑制素，血管生成抑制素，和血小板反應蛋白(thrombospondin)。免疫調節細胞因子、生長因子、抗血管生成因子包括幫助，如抑制感染(如，標準抗微生物抗生素)，抑制T細胞活化，或抑制T細胞活化后果的物質。例如，當希望減少Th1-型免疫應答(如，在DTH反應中)時，可使用細胞因子，像白介素(IL)-4、IL-10、或IL-13或對IL-12或干擾素-γ(IFN-γ)等細胞因子特異性的抗體。可選地，當希望抑制Th2-型免疫應答(如，在即發型超敏反應)時，可使用IL-12或干擾素-γ這樣的細胞因子或對IL-4、IL-10或IL-13特異性的抗體作為輔助藥劑。同樣感興趣的是針對前炎性細胞因子和趨化因子，如IL-1、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，巨噬細胞炎性蛋白(MIP)-1、MIP-3α、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、上皮中性粒細胞活化肽-78(ENA-78)、可誘導干擾素-γ蛋白-10(IP10)、Rantes以及任何其它在這里描述的合適的細胞因子或趨化因子有特異性的抗體(或任何上述抗體片段或衍生物)。
在一些實施例中，可能希望通過施用一種或多種免疫應答調節劑來提高個體的免疫應答。此類免疫應答調節劑除了上述的任何免疫調節細胞因子、生長因子、和血管生長因子以外，還包括能通過表達于T細胞表面的抗原特異性T細胞受體(TCR)遞送的免疫原性刺激因子。更普遍地，但非必須，此類刺激因子以TCR特異性抗原的形式提供。雖然此類抗原通常是蛋白質，它們也可以是碳水化合物、脂類、核酸或組分為2種或更多這些分子類型的雜交分子，如糖蛋白或脂蛋白。然而，免疫原性刺激因子也可以由其他激動性TCR配體，如對TCR組分特異性的抗體(如，TCRα-鏈或β-鏈可變區)或對TCR結合的CD3復合物特異性的抗體提供。用作免疫原性刺激因子的抗原包括位于例如，抗原遞呈細胞(APC)(如，樹狀細胞(DC)、巨噬細胞、單核細胞或B細胞)上的同種抗原(如，MHC同種抗原)。感興趣的DC是交錯DC而非濾泡狀(follicular)DC；濾泡狀DC遞呈抗原到B細胞。方便起見，交錯DC在這被稱為DC。從組織如血液、骨髓、脾或淋巴結中分離DC的方法是本領域公知的，正如從此類組織中的前體細胞中體外產生它們的方法一樣。
也可以作為免疫原性刺激因子的是衍生自它們(見下面)的多肽抗原和肽表位。未加工的多肽被APC加工成肽表位并以與APC表面的MHC分子形成分子復合物的形式被遞送到反應性T細胞。有用的免疫原性刺激因子還包括一類抗原，如，腫瘤細胞或受所感興趣的感染性微生物感染的細胞的裂解物。還可用預先接觸(如，通過共培養)抗原多肽，此類多肽的肽表位或腫瘤(或感染細胞)的裂解物的APC(如DC)作為免疫原性刺激因子。此類APC也可以通過與癌細胞或所感興趣的感染細胞一起培養來用抗原“引發”；所述癌癥或感染細胞可選地在引發培養之前進行輻射或加熱(如煮沸)。而且，APC(特別是DC)可以是用總RNA，mRNA，或單獨編碼TAA的RNA來“引發”。
可選地，免疫原性刺激因子以細胞形式提供(如，腫瘤細胞或產生所感興趣抗原的被感染細胞)。而且，免疫原性刺激因子可以以通過融合APC(如，DC)與腫瘤細胞或感興趣的感染性細胞得到的雜合細胞的形態來提供[Gong等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.97(6)2716-2718；Gong等(1997)自然醫藥3(5)558-561；Gong等(2000)J.Immunol.165(3)1705-1711]。
同樣可以用作免疫原性刺激因子的是與衍生自抗原(如腫瘤-相關抗原或由感染微生物產生的抗原)的抗原性肽表位的熱休克蛋白[Srivastava(2000)NatureImmunology 1(5)363-366]。感興趣的熱休克蛋白包括但不限于糖蛋白96(gp96)、熱休克蛋白(hsp)90、hsp70、hsp110、葡萄糖調節的蛋白170(grp170)和鈣網蛋白。免疫原性刺激因子可以包括一種或多種(如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，更多)分離自腫瘤細胞的熱休克蛋白。此類腫瘤優選但非必需來自同樣的個體，其中(i)對個體遞送干擾B7-H1與B7-H1受體相互作用的藥劑(ii)體內腫瘤細胞或腫瘤浸潤白細胞內B7-H1的表達受抑制。腫瘤細胞也可以來自例如另外一個患有同樣或相關腫瘤類型的個體。可選地，熱休克蛋白可以分離自表達由感興趣的腫瘤細胞得到的轉錄體的哺乳動物細胞。
如上面指出的，本發明中用到的免疫原性刺激因子可以是種類廣泛的腫瘤細胞，被腫瘤細胞、雜合細胞“引發”的APC、或TAA(見上)、此類TAA的肽表位、和被TAA或其肽表位“引發”的APC中的任何一種。這里使用的，“TAA”是一種腫瘤細胞表達的并且(a)質量上與在正常細胞內表達的對應物有差別，或(b)在腫瘤細胞中表達水平高于在正常細胞中的分子(如蛋白質分子)。因此，TAA可能區別于(如，當分子是蛋白時，為一個或更多氨基酸殘基)，或可能同于正常細胞中表達的對應物。優選地是不被正常細胞所表達的。可選地，它在腫瘤細胞中的表達水平至少為在腫瘤細胞中的正常部位的2-倍更高(如，2-倍，3-倍，5-倍，10-倍，20-倍，40-倍，100-倍，500-倍，1,000-倍，5,000-倍，或15,000-倍更高)。相應的TAA包括但不限于任何上面列出地TAA。
施用藥劑和/或一種或多種輔助藥劑可以是全身性的(如，靜脈內)或局部，如在外科手術時給藥注射或灌注到含有癌細胞和/或腫瘤浸潤白細胞的組織。施用也可以采用這里引用的任何路徑，劑量，和時間表。
而且，應該理解上面描述的方法可用于和與本領域公知的各種其他治療形態中任何一個結合使用，例如但不限于化學療法、免疫療法、放射療法，或基因治療。
在抑制B7-H1與B7-H1受體的方法，以及抑制B7-H1的方法中，癌癥可以是任何這里列出的癌癥并且包括，如，腎細胞癌。個體可以是哺乳動物并包括，例如，人類，非人類靈長類(如，猴子，狒狒，或黑猩猩)，馬，母牛(或公牛)，豬，綿羊，山羊，貓，突，豚鼠，倉鼠，大鼠，沙鼠，或小鼠。
如下實施例是用來舉例說明，非限制本發明。
實施例實施例1.材料和方法選擇患者獲得梅奧醫學中心公共評估管理委員會(Mayo Clinic Institutional Review Board)認可后，從Mayo臨床腎切除術登記處確定429位2000和2002年間用放射腎摘除術或單側的保留腎單位手術治療的429個偶發的透明細胞RCC病人。由于RCC亞類的病理特征和病人結果差異，所有分析都僅限定到僅患透明細胞RCC病人，這是最普通的RCC亞類[Cheville等(2003)Am.J.Surg.Pathol.27612-624]。由于hB7-H1-特異性單克隆抗體5H1(如下)能重復染色新鮮冰凍的但未石蠟固定的組織[Dong等(2002)Nature Med.8793-800]，根據新鮮-冷凍組織的可得性選擇病人。
病理特征檢測的病理特征包括組織學亞型，腫瘤尺寸，原始腫瘤階段，區域性淋巴結牽連，和腎切除的遠距離轉移(2002 TNM)，核分級，和組織學腫瘤壞死。由沒有預先知道病人結果的泌尿科病理學家仔細研究樣本的顯微切片。根據國際抗癌聯盟，美國癌癥聯合會，和海德爾堡指導方針對組織學亞型進行分類[Storkel等(1997)Cancer 80987-989；Kovacs等(1997)J.Pathol.183131-133]。采用標準化標準分配核級[Lohse等(2002)Am.J.Clin.Pathol.118877-886]。組織學腫瘤壞死定義為出現任何顯微可見的凝固的腫瘤壞死。像透明化、出血和纖維化這樣的退行性改變不認為是壞死。
免疫組織化學染色腫瘤標本來自RCC腫瘤和正常腎皮層樣本的冷凍切片(5μm厚)安放于Superfrost Plus載玻片上，風干，并用冰冷的丙酮固定。切片用Dako自動染色器(Autostainer)和Dako Cytomation標記聚合物(EnVision+)HRP檢測試劑盒TM(Dako；Carpinteria，加利福尼亞)染色。載玻片用H2O2封閉10分鐘，接下來與初級抗-B7-H1抗體在室溫下保溫30分鐘。然后在室溫下在載玻片上加入偶聯有辣根過氧化物酶的二級試劑(山羊抗-小鼠免疫球蛋白)，15分鐘后與顯色劑-底物共保溫10分鐘。最后，切片用改良的Schmidt氏蘇木精反染色3分鐘。本實驗中采用的初級抗體是5H1，一種小鼠抗-hB7-H1單克隆抗體[Dong等(2002)Nature Med.8793-800]。本實驗中良性腎腫瘤和外周T細胞沒有被染色。hB7-H1染色的陽性組織對照是人扁桃體組織。無關的同種型匹配的抗體用來作為非特異性染色的對照。
hB7-H1表達的量化沒有預先知道病人結果的泌尿科病理學家得出結論，對hB7-H1陽性染色的腫瘤細胞和白細胞的百分數定量為5-10％的增加。評估白細胞浸潤程度并記錄為不存在、，病灶(離散狀淋巴聚集)、中等的，或顯著的。代表白細胞hB7-H1表達的調整后的評分由hB7-H1陽性染色的白細胞百分數乘以淋巴浸潤程度(0＝不存在，1＝病狀，2＝中等的，3＝顯著的)計算得到。
統計方法采用卡方(Chi-square)、Fisher精確和Wilcoxon級別和實驗(rank sum test)來評估病理特征和hB7-H1表達之間的比較。癌癥特異性存活用Kaplan-Meier方法來估計。隨訪調查的持續時間算成自腎切除手術日起，至死亡或最后一次隨訪之日。死亡原因由死亡證明書或醫生信件決定。用hB7-H1的陽性染色細胞百分比對觀察到的存活和由Cox比例風險回歸模型(正式名稱為Martingale殘數)預期的存活之間的差異的散布圖(scatter plots)確定hB7-H1表達的可能分離點[Therneau等(2000)Modeling Survival DataExtending the Cox Model，，第1版(Springer-Verlag，Ann Arbor)，頁87-92]。采用一元Cox比例風險回歸模型和每次調整原始腫瘤階段、區域淋巴結牽連、遠距離轉移、腫瘤尺寸、核分級和組織學腫瘤壞死這些特征之一之后，估計這些分離點與死于RCC之間的聯系。還對hB7-H1表達與死于RCC之間的關系調節了梅奧醫學中心SSIGN(階段，尺寸，分級和壞死)分數，這是特別針對透明細胞RCC病人得到預兆復合分數[Frank等(2002)J.Urol.1682395-2400]。統計學分析采用SAS軟件包(SAS研究院，卡里，北卡羅萊納州)來進行并且P值＜0.05被認為統計上顯著。
實施例2.提供新鮮冷凍組織樣本的RCC病人的存活在符合本實驗的429位病人中，196(46％)能提供用于實驗室研究的新鮮-冷凍組織。有新鮮-冷凍組織的病人比沒有的病人具有更大的腫瘤(平均腫瘤尺寸6.0cm對5.0cm；p＝0.008)。然而，沒有其它研究的特征在這兩組間有顯著差異。進一步，癌癥-特異性存活在有和沒有新鮮-冰凍組織的病人之間沒有統計學上顯著的差異(p＝0.314)。
最后一輪隨訪時，196位研究病人中39位死了，包括30位在腎切除后平均1.1年(范圍0-2.5)死于透明細胞RCC的病人。在這157位在最后一輪隨訪時仍然存活的病人中，平均隨訪持續時間為2.0年(范圍0-4.1)。估計的癌癥一特異性生存率(標準誤差，仍然存在風險的個數)在腎切除后第1，2，和3年時分別為91.4％(2.1％，148)，81.8％(3.3％，78)，和77.9％(3.8％，30)。
實施例3.hB7-H1存RCC腫瘤細胞中的表達與病人結果的相關性對196個透明細胞RCC樣本的免疫組織學染色揭示，要么RCC腫瘤細胞不表達hB7-H1，要么RCC腫瘤細胞和/或RCC腫瘤浸潤白細胞表達不同程度的hB7-H1(表1和2，以及圖1)。而且，腎皮層中近端小管被認為是RCC腫瘤的發源地，在所研究的20個正常腎皮層樣本中都不表達hB7-H1(圖1)。
研究的196個樣本中針對hB7-H1陽性染色的腫瘤細胞的比例如表1所示。腫瘤hB7-H1表達對每個病人的預期死亡風險的散布圖說明10％的分離點對這些數據而言是合適的。有73(37.2％)位病人的樣本具有≥10％的腫瘤細胞hB7-H1表達。
表1.196個透明細胞RCC樣本中腫瘤hB7-H1表達的百分數

表2.在196個透明細胞RCC樣本中白細胞hB7-H1表達的調整后的分數

*白細胞浸潤程度記為0＝不存在，1＝以病灶存在，2＝中等存在，或者3＝顯著存在。
用單變量，并且調節TNM階段、腫瘤尺寸、核級和組織學腫瘤壞死之后的腫瘤hB7-H1表達與死于RCC的關聯如表3所示。使用單變量，有≥10％腫瘤hB7-H1表達樣本的病人死于RCC的概率接近3倍于有＜10％表達的樣本的病人(風險率2.91；95％CI1.39-6.13；p＝0.005；圖2A)。在多變量分析中，即使在調整了原始腫瘤階段、遠距離轉移或原始腫瘤尺寸之后，有≥10％腫瘤hB7-H1表達樣本的病人仍然更顯著可能死于RCC。
表3.在196個透明細胞RCC樣本中hB7-H1表達與死于RCC之間的關聯

*風險率表示單變量地或經過多變量調整后，在列出的特征情況下死于透明細胞RCC的風險。
例如，即使在調整原始腫瘤尺寸(p＝0.005)之后，有≥10％腫瘤hB7-H1表達樣本的病人死于RCC的概率是有＜10％表達的樣本的病人的2.9倍。
白細胞hB7-H1表達調整后的分數如表2所示。有40(20.4％)個樣本調整后的白細胞hB7-H1分數為100或更高(本質上中等或顯著白細胞浸潤，具有至少50％白細胞hB7-H1染色陽性)，這看起來是檢測并說明該特征與病人結果之間關聯的合理分離點。白細胞hB7-H1表達與死于RCC的關聯如表3所示。使用單變量，具有調整后的白細胞hB7-H1分數≥100的樣本的病人死于RCC的概率為具有分數＜100的樣本的病人的3.6倍(風險率3.58；95％CI 1.74-7.37；p＜0.001；圖2B)。即使在對于TNM階段、原始腫瘤尺寸核分級或組織學腫瘤壞死調節之后，具有顯示白細胞hB7-H1表達高水平的樣本的病人顯著地更可能死于RCC。
由于用單變量和隨后多變量調節，得到腫瘤和白細胞hB7-H1表達都與病人結果顯著相關，將這兩個特征組合起來進行評估。有87(44.4％)個樣本有≥10％的腫瘤hB7-H1表達或者有調整后的白細胞hB7-H1表達分數≥100(如，高聚集腫瘤內hB7-H1表達)。樣本中26(13.3％)個同時具有兩種特征。相反地，109(55.6％)個樣本的腫瘤hB7-H1表達＜10％，并且白細胞hB7-H1表達＜100(即，低聚集腫瘤內hB7-H1表達)。這種組合特征與死于RCC的關聯如表3所示。使用單變量，帶有高聚集腫瘤內hB7-H1表達的樣本的病人死于RCC的概率為同時帶有＜10％腫瘤表達和＜100白細胞表達的樣本的病人的4.5倍(風險率4.53；95％CI 1.94-10.56；p＜0.001)。在調整梅奧醫學中心SSIGN分數之后，帶有高聚集腫瘤內hB7-H1表達的樣本的病人死于RCC的概率仍然是帶有低聚集腫瘤內hB7-H1的病人的超過2倍，盡管差異并不統計學上顯著(風險率2.19；95％CI 0.91-5.24；p＝0.079)。然而，在一次對TNM階段、原始腫瘤尺寸、核級和組織學腫瘤壞死中一個特征調整之后，帶有高聚集腫瘤內hB7-H1表達的樣本的病人顯著的更可能死于RCC。我們也研究了腫瘤和白細胞hB7-H1表達的組合與研究的病理學特征之間的關聯。高聚集腫瘤內hB7-H1表達水平與區域淋巴結牽連，遠距離轉移、高核分級和組織學腫瘤壞死的存在顯著相關(表4)。
表4.在196個透明細胞RCC樣本中腫瘤和白細胞hB7-H1表達與病理特征的關聯


已經描述了本發明的數個實施例。然而，應該理解可以在不背離本發明精神和范圍的前提下進行各種修改。由此，其他的實施方式也屬于權利要求的范圍內。
權利要求
1.一種確定癌癥患者預后的方法，該方法包括(a)提供患有該組織癌癥的個體的組織樣本，所述組織樣本包括測試細胞，所述測試細胞為癌細胞或腫瘤浸潤白細胞；和(b)評估組織樣本中表達B7-H1的測試細胞的水平，當表達B7-H1的測試細胞水平是預兆水平，或超過預兆水平，所述個體比測試細胞表達B7-H1水平低于預兆水平的個體更有可能死于此種癌癥。
2.如權利要求1所述的方法，所述評估包括檢測B7-H1多肽。
3.如權利要求2所述的方法，所述檢測包括將與B7-H1多肽結合的抗體與組織樣本進行接觸。
4.如權利要求2所述的方法，所述檢測包括熒光流式細胞分析技術(FFC)。
5.如權利要求2所述的方法，所述檢測包括免疫組織學檢測。
6.如權利要求1所述的方法，所述評估包括檢測B7-H1 mRNA。
7.如權利要求6所述的方法，所述檢測包括使樣本和與B7-H1 mRNA雜交的核酸探針接觸。
8.如權利要求6所述的方法，所述檢測包括反轉錄聚合酶鏈反應。
9.如權利要求6所述的方法，所述檢測包括原位雜交。
10.如權利要求1所述的方法，所述組織選自肺、表皮、結締、血管、肌肉、神經、骨骼、淋巴、前列腺、子宮頸、乳房、脾、胃、腸、口腔、食道、皮膚、肝臟、膀胱、甲狀腺、胸腺、腎上腺、腦、膽囊、胰腺、子宮、卵巢和睪丸組織。
11.如權利要求1所述的方法，所述組織是腎組織。
12.如權利要求1所述的方法，所述組織癌癥是腎細胞癌。
13.如權利要求1所述的方法，所述個體是哺乳動物。
14.如權利要求13所述的方法，所述哺乳動物是人類。
15.一種診斷方法，所述方法包括(a)提供被懷疑有，或可能會發生組織癌癥的個體的組織樣本，所述樣本包括測試細胞，所述測試細胞為組織細胞或浸潤所述組織的白細胞；和(b)評估所述測試細胞是否表達B7-H1，當一些或所有測試細胞表達時，表示個體患癌。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述評估包括檢測B7-H1多肽。
17.如權利要求16所述的方法，所述檢測方法包括將與B7-H1多肽結合的抗體與組織樣本進行接觸。
18.如權利要求16所述的方法，所述檢測包括熒光流式細胞分析技術(FFC)。
19.如權利要求16所述的方法，所述檢測包括免疫組織學檢測。
20.如權利要求15所述的方法，所述評估包括檢測B7-H1 mRNA。
21.如權利要求16所述的方法，所述檢測包括使與B7-H1 mRNA雜交的核酸探針與樣本接觸。
22.如權利要求16所述的方法，所述檢測方法包括反轉錄聚合酶鏈反應。
23.如權利要求16所述的方法，所述檢測方法包括原位雜交。
24.如權利要求1 5所述的方法，所述組織選自肺、表皮、結締、血管、肌肉、神經、骨骼、淋巴、前列腺、子宮頸、乳房、脾、胃、腸、口腔、食道、皮膚、肝臟、膀胱、甲狀腺、胸腺、腎上腺、腦、膽囊、胰腺、子宮、卵巢和睪丸組織。
25.如權利要求15所述的方法，所述組織是腎組織。
26.如權利要求15所述的方法，所述個體是哺乳動物。
27.如權利要求26所述的方法，所述哺乳動物是人類。
28.一種鑒定免疫療法的候選者的方法，所述方法包括(a)提供帶有組織癌癥的個體的組織樣本，所述組織樣本包括測試細胞，所述測試細胞為癌細胞或腫瘤浸潤白細胞；和(b)評估所述測試細胞在組織樣本中表達B7-H1的水平，當在測試細胞中檢測不到B7-H1表達或測試細胞表達的B7-H1低于免疫抑制性閾值時，個體很有可能能從免疫療法中獲益。
29.如權利要求28所述的方法，其中所述評估包括檢測B7-H1多肽。
30.如權利要求29所述的方法，所述檢測包括使與B7-H1多肽結合的抗體與組織樣本進行接觸。
31.如權利要求29所述的方法，所述檢測包括熒光流式細胞分析技術(FFC)。
32.如權利要求29所述的方法，所述檢測包括免疫組織學。
33.如權利要求28所述的方法，所述評估包括檢測B7-H1 mRNA。
34.如權利要求29所述的方法，所述檢測方法包括使與B7-H1 mRNA雜交的核酸探針與樣本接觸。
35.如權利要求29所述的方法，所述檢測方法包括反轉錄聚合酶鏈反應。
36.如權利要求29所述的方法，所述檢測方法包括原位雜交。
37.如權利要求28所述的方法，所述組織選自由肺、表皮、結締、血管、肌肉、神經、骨骼、淋巴、前列腺、子宮頸、乳房、脾、胃、腸、口腔、食道、皮膚、肝臟、膀胱、甲狀腺、胸腺、腎上腺、腦、膽囊、胰腺、子宮、卵巢和罩丸組織。
38.如權利要求28所述的方法，所述組織是腎組織。
39.如權利要求28所述的方法，所述組織癌癥是腎細胞癌。
40.如權利要求28所述的方法，所述個體是哺乳動物。
41.如權利要求40所述的方法，所述哺乳動物是人類。
42.一種治療方法，所述方法包括(a)鑒定患癌的個體，其中一些或所有癌細胞或一些或所有癌細胞的腫瘤浸潤白細胞表達B7-H1；和(b)給個體遞送能干擾B7-H1與B7-H1受體發生相互作用的藥劑。
43.如權利要求42所述的方法，所述藥劑含有抗體，或其片段。
44.如權利要求42所述的方法，所述藥劑與B7-H1結合。
45.如權利要求42所述的方法，所述藥劑與B7-H1受體結合。
46.如權利要求45所述的方法，所述受體為PD-1.
47.如權利要求44所述的方法，所述藥劑是B7-H1的重組可溶性受體。
48.如權利要求43所述的方法，所述抗體片段選自Fab’片段、F(ab’)2片段和單鏈Fv(sFv)片段。
49.如權利要求42所述的方法，進一步包含對個體施用一種或多種免疫調節細胞因子、生長因子或抗血管生成因子。
50.如權利要求49所述的方法，所述免疫調節細胞因子、生長因子或抗血管生成因子選自白介素(IL)-1到25、干擾素-γ(IFN-γ)，干擾素-α(IFN-α)，干擾素-β(IFN-β)，干擾素-γ(IFN-γ)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(G-CSF)、血管內皮抑制素、血管生成抑制素和血小板反應蛋白。
51.如權利要求42所述的方法，所述癌癥選自由血癌、神經癌、黑素瘤、乳癌、肺癌、頭及頸癌、胃與腸癌、肝癌、胰腺癌、腎癌、泌尿生殖器癌、骨癌、和血管癌組成的組中。
52.如權利要求42所述的方法，所述癌癥是腎細胞癌。
53.一種抑制B7-H1在腫瘤細胞或腫瘤浸潤白細胞中表達的方法，所述方法包括(a)鑒定一個癌癥患者，所述癌癥包括表達B7-H1的靶細胞，所述靶細胞為腫瘤細胞或腫瘤浸潤白細胞；和(b)在靶細胞中引入(i)與B7-H1轉錄子雜交的反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸在細胞中抑制B7-H1的表達；或(ii)B7-H1干擾RNA(RNAi)。
54.如權利要求53所述的方法，所述引入步驟包括對個體施用反義寡核苷酸或RNAi并由靶細胞攝取所述寡核苷酸或RNAi。
55.如權利要求53所述的方法，所述引入步驟包括對個體施用并由細胞吸收核酸，所述核酸包含與反義寡核苷酸互補的核苷酸序列相連的轉錄調節元件(TRE)，所述核苷酸序列在細胞內轉錄產生反義寡核苷酸。
56.如權利要求53所述的方法，所述引入步驟包括對個體施用并由細胞攝取核酸，從所述核酸(a)可在單獨TRE的指導下，轉錄RNAi的有義鏈和反義鏈；或(b)在單個TRE的指導下，同時轉錄RNAi的有義鏈和反義鏈。
57.如權利要求53所述的方法，所述個體是哺乳動物。
58.如權利要求57所述的方法，所述哺乳動物是人類。
59.如權利要求53所述的方法，所述癌癥是腎細胞癌。
60.如權利要求53所述的方法、所述組織癌癥選自選自由肺、表皮、結締、血管、肌肉、神經、骨骼、淋巴、前列腺、子宮頸、乳房、脾、胃、腸、口腔、食道、皮膚、肝臟、膀胱、甲狀腺、胸腺、腎上腺、腦、膽囊、胰腺、子宮、卵巢和睪丸組織。
全文摘要
本發明公開了一種通過在有或懷疑有癌癥的個體組織中評估B7－H1表達的診斷方法，施用能干擾B7－H1－受體相互作用的藥物的治療方法，選擇能從癌癥免疫療法中獲益的候選個體的方法，和抑制B7－H1表達的方法。
文檔編號A61K39/395GK101084438SQ200580041568
公開日2007年12月5日 申請日期2005年10月6日 優先權日2004年10月6日
發明者L·程, S·E·斯壯姆, E·D·權 申請人:梅約醫學教育與研究基金會