Fsh的純化方法

專利名稱：Fsh的純化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及促卵泡激素(FSH)的純化領域。
背景技術：
促卵泡激素(FSH)是一種屬于促性腺激素類的可注射的蛋白質。FSH用于女性和男性病人的不孕和生殖紊亂的治療。
天然狀態(tài)下，F(xiàn)SH產生于垂體腺。作為藥用，F(xiàn)SH可以重組產生(rFSH)，或者可以從絕經后的婦女尿中分離得到(uFSH)。
FSH用于女性病人在輔助生殖技術(ART)中誘導排卵(OI)和控制性超排卵(COH)。在一典型的誘導排卵治療療程中，病人在大約6到12天內每天給予FSH或其變異體注射(大約75到300IU FSH/日)。在一種典型的控制性超排卵治療療程中，病人在大約6到12天內每天給予FSH或其變異體注射(大約150-600IU FSH/日)。
FSH也用于誘導精子減少的男性病人的精子產生。在促性腺激素分泌不足的性腺機能減退的男性病人中，用150IU FSH每周3次并結合2,500IU hCG每周兩次的療程已經成功地使精子數量得以提高[Burgues等人；Subcutaneous self-administration of highlypurified follicle stimulating hormone and human chorionicgonadotrophin for the treatment of male hypogonadotrophichypogonadism. Spanish Collaborative Group on MaleHypogonadotrophic Hypogonadism；Hum.Reprod.；1997，12，980-6]。
因為FSH在治療生殖紊亂中的重要性，所以最好提供高純度和高比活性的FSH。FSH治療需要重復注射。高度純化的FSH制劑可以皮下給藥，病人也可以自己給藥，因此大大方便和依從了病人。
Lynch等人所述為一種人垂體FSH的純化方法[The extraction andpurification of human pituitary follicle-stimulating hormone andluteinising hormone；Acta Endocrinologica，1988，288，12-19]。該方法包括陰離子和陽離子交換層析、免疫親和提取以及尺寸排阻層析。該方法所得垂體FSH的比活性為4,990(免疫測定)IU/mg，包括16IU/mgLH在內。用干重或于溶液中在280nm的光譜下吸收來測定蛋白質含量(假定A2801cm時1g/l等于1)。
WO 98/20039(IBSA Institut Biochimique SA)敘述一種人尿FSH純化方法，原材料為尿提取物，也稱為人絕經期促性腺激素(hMG)。該方法用DEAE型的弱堿性陰離子交換樹脂進行離子交換層析，然后在有一蒽醌衍生物作為配體的樹脂上進行親和層析。據稱，該方法得到的尿FSH不含LH，其比活性為6,870(免疫測定)IU/mg。假定1mg/ml蛋白質水溶液在277nm時光密度為0.62的情況下，在路徑長度為1cm的石英比色管中測定蛋白質含量。
WO 00/63248(Instituto Massone SA)敘述一種人尿中包括的FSH的促性腺激素純化方法。該方法包括以下步驟一強陽離子烴基硫酸型樹脂的離子交換層析、一強陰離子樹脂的離子交換層析以及疏水作用層析(HIC)。據報道，所得的FSH制劑的比活性為8,400IU/mg(Steelman-Pohley methodAssay of the follicle stimulatinghormone based on the augmentation with human chorionicgonadotrophin； Endocrinology；1953，53，604-616)和每75IU FSH少于1 IU LH生物活性(rat semihal vesicle weight gain methodVanHell H，Matthijsen R&GA Overbeek；Acta Endocrinol，1964，47，409)。用Lowry方法測定蛋白質含量[O.H.Lowry et al.，J.Biol.Chem.，1951，193，265]。
US 5,990,288(Musick等人)敘述一種生物樣品中的FSH的純化方法，如人垂體腺或人絕經后的尿。該方法采用在Fractogel EMDSO3-650M上的陽離子交換層析，然后在Mimetic orange 1樹脂上的染料親和層析，最后在Bakerbond Wide Pore HI-Propyl樹脂上的疏水作用層析。據稱，該方法所得人垂體FSH的比活性為7,066 IU(免疫測定)/mg和LH少于1 IU(免疫測定)/mg，以及尿FSH的比活性為6,298IU(免疫測定)/mg和LH少于3 IU(免疫測定)/mg。蛋白質含量用吸收光譜法在280nm測定(假定A2801cm時1g/l等于1)。
Chiba等人[Isolation and partial characterisation of LH，F(xiàn)SHand TSH from canine pituitary gland；Endocrinol.J.，1997，44，205-218]敘述一種包括FSH的犬垂體促性腺激素純化技術，該純化技術采用伴刀豆球蛋白(Con)A親和層析、疏水作用層析(HIC)和Cu++固定金屬離子層析。據報道，用FSH放射性受體測定方法測定生物活性和用BioRad蛋白質試劑盒(BioRad Laboratories CA USA)測定蛋白質含量，所得到的FSH的比活性為2.17IU/g蛋白質。
WO 88/10270(Instituto di Ricerca Cesare Serono SPA)敘述一種人尿中的FSH的純化方法。該方法包括免疫層析，采用以雙乙烯砜與Sepharose 4B結合的FSH-特異的固定單克隆抗體，然后進行反相HPLC。所得到的FSH不含LH和其他尿蛋白，并比活性為6,200 IU/mg(凍干粉末)(Steelman-Pohley方法)。該制劑為首次的FSH制劑，因其高純度，而適合皮下注射。
因此需要開發(fā)新的FSH或FSH變異體的純化方法。具體地說，需要避免使用成本高的免疫親和層析步驟的純化方法。
發(fā)明簡述本發(fā)明的目的是提供一種重組FSH或重組FSH變異體純化新方法。
本發(fā)明首先提供了一種起始材料為含有未加工FSH的液體的重組人FSH或FSH變異體的純化方法，其包括以下步驟(1)染料親和層析；(2)疏水作用層析，和；(3)反相層析；可以以任何順序進行。
附圖簡述

圖1所示為本發(fā)明，也就是包括以下步驟的純化方法●染料親和層析，●疏水作用層析，●反相層析，圖2所示為本發(fā)明的一特定實施例，也就是包括以下步驟的純化方法流程圖●超濾/滲濾，●陰離子交換層析，●染料親和層析，●疏水作用層析，●反相層析，●陰離子交換層析，●納米過濾，●超濾/滲濾；縮寫本發(fā)明的描述中采用以下縮寫DF滲濾
FSH促卵泡激素；r-FSH重組促卵泡激素；hFSH人促卵泡激素；r-hFSH重組人促卵泡激素BV柱床體積DEAE二乙基氨基乙基ELISA酶聯(lián)免疫測定DAC染料親和層析IMAC固定金屬離子層析OD光密度HIC疏水作用層析HPLC高效液相層析IRMA免疫放射測定KD或kD千道爾頓HCP宿主細胞蛋白，用于表達FSH的宿主細胞蛋白IPC過程控制中IEF等電聚焦PES聚醚砜RP-HPLC反相高效液相層析Q FF在Q瓊脂糖凝膠FF上的陰離子交換RT室溫UF超濾WFI注射用水發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種起始材料為含有未加工FSH的液體的重組人FSH或FSH變異體的純化方法，所述的方法包括以下步驟(1)染料親和層析；(2)疏水作用層析；和(3)反相層析；以上步驟可按任何順序進行。
本發(fā)明的純化方法可以得到高純度的重組FSH料，其可配制成最后的藥物，如Gonal-F(Serono)。它有不用免疫親和層析得到高純度的產物的優(yōu)點。作為本發(fā)明，純化的起始材料未加工的FSH在于含有重組FSH的細胞培養(yǎng)的收獲物。
在一較佳實施例，在根據本發(fā)明的純化方法的一些或全部步驟中包括抗氧化劑或游離氨基酸或具有抗氧化和凈化作用的二肽。更精確地說，抗氧化劑存在于用于純化和/或濃縮和/或過濾rhFSH的任何緩沖液中?？寡趸瘎┓乐惯^程中FSH氧化。較佳的抗氧化劑是L-蛋氨酸。所用的L-蛋氨酸濃度較佳為或大約10-100mM?？寡趸瘎┑钠渌影╰-丁基-4-甲氧基-酚、2，6-二(1，1-二甲基乙基)-4-甲基酚；雙偏亞硫酸氫鉀或鈉、重亞硫酸鈉。游離氨基酸和有抗氧化和凈化作用的二肽的例子是組氨酸、氨基乙磺酸、甘氨酸、丙氨酸、肌肽、鵝肌肽、1-甲基組氨酸或其組合物。
通常首先凈化起始材料，然后并選擇地在第一層析步驟收集之前濃縮(如，用超濾)和/或緩沖液交換(如，通過一滲濾步驟)。
在層析步驟中，可用聚合物基和瓊脂糖基的樹脂。也可以用膜層析，其中樹脂用功能化膜取代。
本發(fā)明的3個純化步驟(也就是染料親和層析、疏水作用層析和反相層析)在下文中詳細描述。
染料親和層析步驟(1)本發(fā)明的方法包括染料親和層析步驟(1)。在一較佳實施例，用具有本領域技術人員公知的染料化合物作為固定化配體的樹脂進行染料親和層析，即汽巴龍藍F3G-A。術語“固定化”為本領域技術人員所理解，其意為在與樹脂作化學連接的意義上衍生該配體。特別優(yōu)選的樹脂是藍瓊脂糖凝膠FF(Amersham Biosciences Inc.)。藍瓊脂糖凝膠FF的技術特征如下

可理解為，該方法也可以用有相似特性的其他樹脂。其他樹脂包括Toyopearl AF-blue-hc-650m(Tosoh Bioscience)、Toyopearl SuperButyl550、Toyopearl Phenyl 650、Blue Cellthru BigBead(Sterogene)、SwellGel Blue(Pierce)、汽巴克羅姆藍3GA-瓊脂糖凝膠100(Sigma)、Affi-Gel Blue(BioRad)、Econo-Pac blue cartridges(Bio-Rad)、藍瓊脂糖凝膠HP(Amersham)、汽巴龍藍3GA(Sigma)。
染料親和層析的洗脫步驟較佳用磷酸鹽緩沖液，特別優(yōu)選磷酸鈉。洗脫液的pH值較佳為大約6.0至11.5，更佳為大約6.5至8，特別優(yōu)選大約7.0。另外的適當維持pH值為7.0的緩沖液包括如下MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、BES、MOPS、TES、HEPES。染料親和層析的洗脫緩沖液較佳含有一種鹽增加傳導性，較佳是NaCl。
在一特別優(yōu)選實施例，在染料親和層析步驟(平衡、洗滌和洗脫)中接觸產物的緩沖液含有抗氧化劑，如L-蛋氨酸?？寡趸瘎┑钠渌影╰-丁基-甲氧基苯酚、2，6-二(1，1-二甲基乙基)-4-甲基苯酚；雙偏亞硫酸氫鉀或鈉、重亞硫酸鈉。
疏水作用層析步驟(2)所述的方法也包括疏水作用層析(2)。在一較佳實施例中，疏水作用層析用如Toyopearl丁基650M的樹脂進行(來自Tosoh Biosep公司)。
可以理解的是，步驟(2)也可以用其他有相似特性的樹脂進行?？蛇x擇的樹脂是快速苯基瓊脂糖凝膠6(low sub)；快速苯基瓊脂糖凝膠6(high sub)；快速丁基瓊脂糖凝膠4；快速辛基瓊脂糖凝膠4；高效苯基瓊脂糖凝膠；SOURCE 15ETH；SOURCE 15ISO；SOURCE 15PHE，這些樹脂都來自Amersham Biosciences(800)526-3593；(參見www.amershambiosciences.com)。其他樹脂還有Hydrocell C3或C4；Hydrocell Phenyl，來自BioChrom Labs公司(812)234-2558；(參見www.biochrom.com)。
在傳導性高的緩沖液中達到HIC樹脂的結合，傳導性高是通過添加鹽獲得(例如NaCl、(NH4)2SO4或Na2SO4)。在疏水作用層析步驟中的洗脫較佳降低流動相的傳導性(降低鹽的濃度)，緩沖液pH值大約在6至8，較佳大約在6.5至7.5，最好大約在7。特別優(yōu)選的系統(tǒng)包括pH值大約為7的磷酸鈉緩沖液，以及硫酸銨。其他緩沖液在上文中提及。
在一特別優(yōu)選實施例，HIC的步驟(2)(平衡、洗滌、洗脫)中接觸產物的緩沖液包括抗氧化劑，如L-蛋氨酸，其他抗氧化劑在上文中提及。反相層析步驟(3)本發(fā)明的方法也包括反相層析步驟(RPC)(3)。RPC較佳用如SOURCE 30RPC的樹脂進行(來自Amersham Biosciences)。可以理解的是，步驟(3)也可用本領域熟練技術人員公知的有相似特性的其他樹脂進行。
層析較佳在弱堿性pH緩沖的流動相進行，例如大約為pH7-8.5，較佳大約為7.5或7.6。在一較佳實施例，緩沖液是醋酸銨。其他適當的pH值大約為7.6的緩沖液包括BES、MOPS、磷酸鹽、TES、HEPES。在這個步驟中用到的緩沖溶液也包括有機調節(jié)劑，其濃度在層析步驟(上柱、洗滌、洗脫和再生)的不同相進行調節(jié)。在一較佳實施例，有機調節(jié)劑是易溶于水的有機溶劑，較佳是醇(如甲醇、乙醇等)。最好是2-丙醇(異丙醇)。
在一特別優(yōu)選實施例，RPC的步驟(3)(平衡、洗滌、洗脫)中接觸產物的緩沖液包括抗氧化劑，如L-蛋氨酸，其他抗氧化劑在上文中提及?？蛇x擇的其他純化步驟0-離子交換層析除三種主要純化步驟外—以上略述—本發(fā)明還可以包括其他純化步驟。
在一實施例，本發(fā)明的純化方法包括進行離子交換層析的初步步驟(0)，較佳用強陰離子交換樹脂，特別優(yōu)選季銨樹脂，如Q瓊脂糖凝膠FF(來自Amersham Biosciences)，其有如下特性離子交換類型強陰離子總容量(mmol/ml)0.18-0.25排阻限(球蛋白)4×106顆粒形式球形，直徑45-165μm顆粒結構交聯(lián)瓊脂糖，6％pH操作穩(wěn)定性2-12pH清洗穩(wěn)定性1-14在25℃ 1巴15cm柱床高度，XK 50/30柱的線性流速400-700cm/h另外，所述的離子交換樹脂步驟(0)可用如Fractogel EMD TMAEHICAP(來自Merck KGaA，Darmstadt Germany)的樹脂，或有如下特性的樹脂

離子交換層析步驟較佳在弱堿性緩沖液中進行(如，大約7.2到9.0，或大約8.0到9.0，最好大約為8.5)。適合的緩沖液包括，例如，硼酸緩沖液、三乙醇胺/亞氨基二乙酸Tris、醋酸銨、三(羥甲基)甲基甘氨酸、N-二(羥乙基)甘氨酸、TES、HEPES、TAPS。最好是pH值大約為8.5的硼酸鈉。通過加入較佳為NaCl的鹽以增大流動相的傳導性可從離子交換樹脂中進行洗脫。在一特別優(yōu)選的實施例，在離子交換層析(平衡、洗滌、洗脫)中接觸產物的緩沖液含有抗氧化劑，較佳是L-蛋氨酸。其他抗氧化劑在上文中提及。
因此在一較佳實施例中，本發(fā)明的方法包括如下步驟(0)陰離子交換層析，較佳在強陰離子交換樹脂上進行，[較佳是季銨樹脂，如，Q瓊脂糖凝膠FF或Fractogel EMDTMAE]；(1)染料親和層析[較佳在藍瓊脂糖凝膠FF上]；(2)疏水作用層析[較佳在Toyopearl丁基650M上]；(3)反相層析[較佳在Source 30 RPC上]。
可選擇的其他純化步驟(-1)-超濾/滲濾在進行離子交換層析(0)之前，可進行超濾步驟，以濃縮未加工的FSH。超濾(或滲濾)較佳用大約為3-10kD，最好是8kD的截止膜?？蛇x擇的其他純化步驟(4)-陰離子交換層析在另一較佳實施例，本發(fā)明的方法還可以包括第二次陰離子交換層析(4)。樹脂較佳為Fractogel EMD TMAE HICAP(來自Merck KGaA，Darmstadt Germany)，或有如上文提及的相似特性的樹脂?；蛘叩诙侮庪x子交換層析可在Q瓊脂糖凝膠FF或有如上文提及的相似特性的樹脂上進行。
陰離子交換層析、染料親和層析、疏水作用層析(HIC)、反相層析和第二次陰離子交換層析可以以任何順序進行，盡管較佳先進行陰離子交換層析。剩下染料親和層析、疏水作用層析(HIC)、RPC和可選擇的第二次陰離子交換層析的步驟可以任何順序進行，盡管較佳以如下順序進行(0)陰離子交換層析，(1)染料親和層析，(2)疏水作用層析(HIC)，(3)反相層析RPC，和(4)第二次陰離子交換層析。
可選擇的其他純化步驟(5)-超濾/滲濾在另一較佳實施例，以上層析步驟之后(特別是反相層析步驟之后)，F(xiàn)SH樣品經受一濃縮步驟。所述的步驟較佳用超濾結合滲濾得到有所需組合物的散裝產物。超濾(或滲濾)較佳用大約為3-10kD，最好是8kD的截止膜。
在一特別優(yōu)選實施例中，以下步驟以如下順序進行
(-1)超濾(較佳選用大約為8kD的截止膜)(0)陰離子交換層析(較佳為Q瓊脂糖凝膠FF柱)；(1)染料親和層析(較佳用藍瓊脂糖凝膠FF柱)；(2)疏水作用層析(HIC)(較佳用丁基650M柱)；(3)反相層析(RPC)(較佳用Source 30 RPC柱)(4)陰離子交換層析，強堿性陰離子交換樹脂(較佳用TMAEhicap柱)(5)超濾(較佳用5kD的截止膜)。
可能需要將FSH樣品進行納米過濾，特別是作為病毒清除步驟；也就是說，減少FSH制劑的來自細胞培養(yǎng)中的病毒或類病毒顆粒污染風險。納米過濾可以在純化過程中的任何步驟中進行，然而，特別優(yōu)選在第二次離子交換層析之后，或在反相層析之后或疏水作用層析之后進行納米過濾。可以進行多于一次的納米過濾，如進行兩次納米過濾。
在一特別優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的方法包括以下步驟(-1)超濾(較佳選用大約為8kD的截止膜)(0)陰離子交換層析(較佳用Q瓊脂糖凝膠FF)；(1)染料親和層析(較佳用藍瓊脂糖凝膠FF)；(2)疏水作用層析(HIC)(較佳用丁基650M)；(3)反相層析(RPC)(較佳用Source 30 RPC)；(4)陰離子交換層析，強堿性陰離子交換樹脂(較佳用TMAEhicap)；(4’)納米過濾；(5)超濾(較佳用5kD的截止膜)。
本發(fā)明的優(yōu)點是純化方法沒有高價免疫親和層析步驟，提供高純度高特異生物活性的FSH。還有，本發(fā)明的純化FSH不含因為免疫親和層析而加入的不需要的雜質(如，從樹脂上濾去的免疫球蛋白)。
貯存/凍干法從如上所述的純化過程中得到的含有純化的FSH的液態(tài)組合物可以按原來樣子冷凍貯存，或者在純化之后，洗脫物進行凍干(“冷凍-干燥”)，去掉溶劑。
所得到的液體或凍干產品稱為“FSH總料”。
FSH配方本發(fā)明的FSH或FSH變異體或根據本發(fā)明的方法純化的FSH或FSH變異體可以制成注射劑，可肌肉注射或皮下注射，較佳皮下注射。FSH配方可以凍干，在這種情況下，在注射之前則要將它溶解在水里作注射。FSH配方也可以是一種液體配方，在這種情況下，不需要任何溶解，可以直接注射。
FSH配方可以是單劑量或多劑量。如果是多劑量，較佳含有抑菌劑，如苯甲醇、間甲酚、百里酚或酚，較佳為苯甲醇或間甲酚。單劑量配方也可以含有一種抑菌劑。
本發(fā)明的FSH可以與已知賦形劑和穩(wěn)定劑一起配制，如蔗糖和甘露醇。也可以含有抗氧化劑，如蛋氨酸。更可以含有一種表面活性劑，如TWEEN(較佳為TWEEN 20)，或者聚醚(較佳為聚醚F68)。
在一個特別優(yōu)選的多劑量配方里，由本發(fā)明的方法所生產的FSH通過溶于水再與蔗糖、磷酸鹽緩沖液(pH7)、聚醚F68、蛋氨酸和間甲酚或苯甲醇配制成注射劑。
一特別優(yōu)選的用于皮下或肌肉注射的重組FSH液體多劑量配方如下


適應癥本發(fā)明的FSH適用于需要FSH的各種治療。特別適用于控制輔助生殖技術中的誘導排卵、控制性超排卵和精子減少癥治療中的皮下給藥。它可以與其他促性腺激素如LH和hCG一起結合使用，也可以與增加對FSH反應的化合物如克羅米酚，以及芳香酶抑制劑如阿納托唑、來曲唑、法倔唑和YM-511一起使用。
序列SEQ ID NO.1人糖蛋白α亞單位；SEQ ID NO.2hFSHβ亞單位SEQ ID NO.3hFSHβ亞單位變異體1SEQ ID NO.4hFSHβ亞單位變異體2SEQ ID NO.5hFSHβ亞單位變異體3本文中所用的促卵泡激素，或者FSH是指作為全長成熟蛋白質提出的人FSH(hFSH)。FSH是一個含有人糖蛋白α亞單位和人FSHβ亞單位的二聚體。人糖蛋白α亞單位的蛋白質序列為SEQ ID NO.1，人FSHβ亞單位的蛋白質序列為SEQ ID NO.2。
所用術語“重組”指通過重組DNA技術而產生的FSH制劑(參見例如WO85/01958)。用重組技術表達FSH的方法的一個實施例是，用編碼FSHα亞單位和β亞單位的DNA序列轉染真核細胞，如在EP 0211894和EP 0487512中所述，不管在一個載體還是在兩個載體上均有一亞單位，每個亞單位都有一單個啟動子。編碼FSH的DNA可以是一個cDNA或其含有內含子。用重組技術生成FSH的方法的另一個實施例是用同源重組技術以有效連接的方式把一異源調節(jié)片段插入到編碼FSH的一個或兩個亞單位的內生序列中，如歐洲專利號EP 0505500(Applied ResearchSystems ARS Holding NV)所述。一些WO 99/57263(TranskaryoticTherapies)中所公開的方法也可以考慮，其中一個亞單位異源插入細胞，而另一個亞單位經同源重組插入一個異源調節(jié)片段以激活基因組序列而表達。本發(fā)明的方法可以用于純化以上所述任何一種方法所表達的FSH。
“重組細胞”的表達指經插入一個異源DNA而產生的細胞，包括以上所提到的任何一種遺傳操作方法。
FSH較佳由含有編碼人糖蛋白α亞單位和FSHβ亞單位的一個或多個載體的DNA轉染中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中重組產生。編碼α亞單位和β亞單位的DNA可以在相同的或不同的載體中出現(xiàn)。
“FSH變異體”的表達指包含一些在氨基酸序列、糖基化模式或在亞單位之間的連接與人FSH不同但呈現(xiàn)FSH活性的分子。例子包括CTP-FSH，即一種長效的經修飾的重組FSH，其由野生型α亞單位和雜交β亞單位構成，其中hCG的羧基末端肽在FSHβ亞單位的C末端融合，如LaPolt等人；Endocrinology；1992，131，2514-2520；或Klein等人；Development and characterization of a long-acting recombinanthFSH agonist；Human Reprod.2003，18，50-56]所述。還包括單鏈CTP-FSH，一種單鏈分子，其由如下序列(從N末端到C末端)構成

其中βFSH表示FSHβ亞單位，βhCG CTP(113-145)表示hCG羧基末端肽，αFSH表示FSHα亞單位，如Klein等人所述[Pharmacokinetics and pharmacodynamics of single-chainrecombinant human follicle-stimulating hormone containing thehuman chorionic gonadotrophin carboxyterminal peptide in therhesusmonkey；Fertility & Sterility；2002，77，1248-1255]。FSH變異體的其他實施例包括具有在α亞單位和/或β亞單位中所引入的糖基化位點的FSH分子，如在WO 01/58493(Maxygen)中所示，以及亞單位之間有S-S鍵的FSH分子，如在WO 98/58957中所示。FSH變異體的其他實施例包括含有FSH序列和hCG或LH序列的嵌合分子，如在WO91/16922和WO 92/22568中所述的那些。
這里所指的FSH變異體也包括短于SEQ ID NO.2的全長成熟蛋白質的β亞單位的羧基末端缺失。在SEQ IDS NO.3、4和5中有人FSHβ亞單位的羧基末端缺失。可以理解為β鏈的羧基末端變異體與一個已知的α亞單位形成二聚體，由此形成一個FSH變異異源二聚體。
在一個優(yōu)選實施例中，在含血清或不含血清的培養(yǎng)基中，F(xiàn)SH在CHO細胞中重組產生。
在一個優(yōu)選實施例中，根據本發(fā)明的方法產生的純化的FSH適用于皮下給藥，病人可以自身給藥。
“未加工的重組FSH”的表達指在采取任何層析步驟之前表達FSH的重組細胞中的細胞培養(yǎng)上清液。該表達包括了上清液未加工的形式(從細胞中分離)，也包括濃縮的和/或過濾的和/或超濾的上清液。
與FSH活性相關的術語“生物活性”是指一種FSH制劑引起與FSH相關的生物反應的能力，如在Steelman-Pohley測定中得到的卵巢重量[Assay of the follicle stimulating hormone based on theaugmentation with human chorionic gonadotrophin；Endocrinology；1953，53，604-616]，或者女性病人的卵泡生長。女性病人的卵泡生長可以通過超聲波估算，如，根據在刺激后第8天平均直徑大約有16mm的卵泡數量。生物活性可經一種對于FSH可接受的標準來估算。
可以測定在FSH制劑中LH的含量，如，用LH特定的免疫測定法，如Delfia hLH Spec(Wallac Oy，Turku，F(xiàn)inland)。
關于FSH的“比活性”術語指以IU表示的制劑的生物活性除以蛋白質重量，IU根據公認的FSH的生物測定法如Steeelman Pohley生物測定法測出，蛋白質重量根據一種總蛋白含量的測定法來測定，如Lowry測定法[O.H.Lowry，N.J.Rosebrough，A.L.Farr and R.J.Randall(1951)J.Biol.Chem.193265；Hartree E.E.(1972).Anal.Biochem.48422；J.R.Dulley and P.A.Grieve(1975)Anal.Biochem.64136]，Bradford測定法[Bradford，M.M.(1976)Anal.Biochem.72，248]，或者在280nm的吸收值測定。
本發(fā)明的FSH的比活性較佳為大于或大約8000IU/mg，更佳為大于或大約9000IU/mg，再佳為大于或大約10000IU/mg，最佳為大于或大約14000IU/mg，其中生物活性用Steelman-Pohley測定法測定，而蛋白質含量用SE-HPLC測定。
在純化過程的各個階段可以分析FSH樣品的純度，例如，用以下列出的技術r-hFSH定量/游離α亞單位/純度/氧化形式RP-HPLC如上所述，F(xiàn)SH是一個雜二聚體糖蛋白，含有一個α亞單位和一個β亞單位。這些亞單位可以解離，這可以通過游離α亞單位在樣品中的數量來監(jiān)測。另外，F(xiàn)SH亞單位可以氧化，氧化的污染物用RP-HPLC定量，游離亞單位用SDS-PAGE估算。
r-hFSH定量免疫測定FSH在樣品中的含量可以用對FSH有特異性的免疫測定來測量，如，DELFIA FSH免疫測定。
總蛋白Bradford測定，Lowry測定，280nm的吸收值任何蛋白制劑中，總蛋白含有可以用如Bradford測定、Lowry測定、280nm的吸收值等技術來測定。
異構重整形式IEF
如上所述，F(xiàn)SH是一種糖蛋白，有多個在兩個亞單位不同位置上結合的低聚糖殘基。低聚糖殘基可以有不同程度的支鏈，或有唾液酸殘基加帽。唾液酸殘基帶負電荷(在中性pH值的時候)。不同加帽和有不同等電點(PI)的物種混合物一起導致異種。這可以用基于電荷的分離技術等如電聚焦(IEF)來評估。
宿主細胞蛋白(HCP)宿主細胞蛋白可用ELISA測定分析。例如，抗體可用一種沒有FSH基因的宿主細胞培養(yǎng)的“模擬培養(yǎng)”。
實施例本發(fā)明將通過兩個實施例來說明。
圖1和圖2闡明了所述的兩個實施例的相應流程。所得到的純化的r-hFSH稱為“r-hFSH總料”。
實施例1(參見圖1)步驟(1)在藍瓊脂糖凝膠上進行的染料親和層析FSH純化起始材料從含有重組FSH的細胞培養(yǎng)收集物制備，也就是說，在含血清或在不含血清的培養(yǎng)液中，在CHO細胞重組產生的FSH。染料親和層析柱(藍瓊脂糖凝膠FF樹脂)首先與pH值為8.5的含有L-蛋氨酸的低傳導性緩沖液平衡。然后在樹脂上直接加入含有FSH的液體。裝填之后，未結合樹脂的始料用平衡緩沖液沖洗出來。最后FSH用pH值為7.0的含有NaCl和L-蛋氨酸的磷酸鈉緩沖液沖洗而洗脫出來?？傁闯鲆褐苯舆M入下一步驟。本步驟在2-8℃下進行。
步驟(2)在Toyopearl丁基650M上進行的疏水作用層析(HIC)將從步驟(1)的藍瓊脂糖凝膠FF上的洗出液裝填到Toyopearl丁基650M柱上，與pH值為7.0的含有硫酸銨和L-蛋氨酸的磷酸鈉緩沖液平衡。未結合樹脂的物料用平衡緩沖液沖洗出來。FSH用同樣的緩沖液(但其中所含硫酸銨的濃度較低)洗脫出來。洗出液直接進入下一步驟。本步驟在室溫下進行。
步驟(3)在Source 30 RPC上的反相層析HIC洗出液(從步驟(2)而來)首先加入IPA(異丙醇)進行調節(jié)。Source30 RPC柱與pH值為7.6的含有L-蛋氨酸和2-丙醇的醋酸銨緩沖液以等同于調節(jié)的裝填料的濃度一起平衡。將未結合的裝填料用平衡緩沖液沖洗出來后，樹脂用pH值為7.6的含有L-蛋氨酸和濃度增加的2-丙醇的醋酸銨緩沖液洗滌。FSH最后用繼續(xù)增加濃度的2-丙醇洗脫出來?？傁闯鲆鹤詈笤跀嚢柘掠肔-蛋氨酸水溶液稀釋?？傁♂屢哼M入下一步驟。本步驟在室溫下進行。
經過以上步驟，純化因素-也就是說FSH在純化樣品中的純度對FSH在起始材料(未加工的FSH)中的純度比例-大約為40.000。
實施例2(參見圖2)步驟(-1)濃縮的r-hFSH超濾/滲濾所有操作都在冷藏條件下(2-8℃)進行。待純化的形成起始材料的未加工FSH來自含有重組FSH的細胞培養(yǎng)收集物。
凈化未加工r-hFSH通過一0.5μm寬的過濾器過濾(如Pall Profile II過濾器或等同物)。
超濾凈化了的未加工液首先通過10KD的聚醚砜膜進行超濾濃縮。濃縮的保留物然后在至少5倍滲濾體積的硼酸鹽緩沖液中進行滲濾，該硼酸鹽緩沖液含有L-蛋氨酸作為抗氧化劑，pH值為8.6。測量保留物的傳導性和pH值以監(jiān)測滲濾過程。然后在系統(tǒng)排水之前進一步濃縮保留物。最后超濾裝置用滲濾緩沖液沖洗，沖洗液與復原的保留物混合?？傄哼M入下一步驟。
過濾濃縮產物通過0.2μm的聚醚砜過濾膜(或等同物)過濾。
步驟(0)在Q瓊脂糖凝膠FF上的陰離子交換層析將過濾后的液體加到一強陰離子交換(Q瓊脂糖凝膠FF)樹脂上，與pH值為8.5的含有L-蛋氨酸的硼酸鈉緩沖液平衡。裝填后，用平衡緩沖液漂洗層析柱，將所有未結合的裝填料沖洗出來。然后用pH值為8.5的含有NaCl(增加傳導性)和L-蛋氨酸(作為抗氧化劑)的硼酸鈉緩沖液洗脫層析柱。收集的總洗出液進行染料親和層析。
步驟(1)在藍瓊脂糖凝膠上的染料親和層析染料親和層析柱(藍瓊脂糖凝膠FF樹脂)首先與來自Q瓊脂糖凝膠FF樹脂的洗脫緩沖液平衡。得到的洗出液直接加到樹脂上。裝填后，未結合的裝填料用平衡緩沖液沖洗出來。FSH最后用pH值為7.0的含有NaCl和L-蛋氨酸的硼酸鈉沖洗層析柱而洗脫出來?？傁闯鲆褐苯舆M入下一步驟。本步驟在2-8℃下進行。
步驟(2)在Toyopearl丁基650M上進行的疏水作用層析將藍瓊脂糖凝膠FF上的洗出液裝填到Toyopearl丁基650M柱上，與pH值為7.0的含有硫酸銨和L-蛋氨酸的磷酸鈉緩沖液平衡。未結合樹脂的材料用平衡緩沖液沖洗出來。FSH用同樣的緩沖液(但其中硫酸銨的濃度較低)洗脫出來。洗出液直接進入下一步驟。本步驟在室溫下進行。
步驟(3)在Source 30 RPC上的反相層析HIC洗出液(從步驟(2)而來)首先加入IPA(異丙醇)進行調節(jié)。Source30 RPC柱與pH值為7.6的含有L-蛋氨酸和2-丙醇的醋酸銨緩沖液以等同于調節(jié)的裝填料的濃度一起平衡。將未結合的裝填料用平衡緩沖液沖洗出來后，樹脂用pH值為7.6的含有L-蛋氨酸和濃度增加的2-丙醇的醋酸銨緩沖液洗滌。FSH最后用濃度進一步增加的2-丙醇洗脫出來。總洗出液最后在攪拌下用L-蛋氨酸水溶液稀釋?？傁♂屢哼M入下一步驟。本步驟在室溫下進行。
步驟(4)在Fractogel EMD TMAE hicap樹脂上的陰離子交換層析Fractogel EMD TMAE hicap層析柱首先與pH值為8.5的含有L-蛋氨酸的硼酸鈉緩沖液平衡。RPC后的材料(來自步驟(3))稀釋后裝填上柱。將未結合的裝填料用平衡緩沖液沖洗出來。FSH從鹽濃度以線性增加的柱中洗脫出來。本步驟在2-8℃下進行。
步驟(4’)納米過濾來自Fractogel EMD TMAE hicap步驟(4)的洗出液直接加到一20nm納米過濾裝置，以3巴的氮氣壓進行納米過濾。過濾物進入下一步驟。本步驟在2-8℃下進行。
步驟(5)總料超濾經過納米過濾的FSH材料通過一5KD聚醚砜膜進行切向流濃縮。當保留物達到起始體積的一半時，材料通過WFI滲濾進行緩沖液交換。
樣品純度這些純化步驟后的FSH樣品純度測定如下

樣品的生物活性用Steelman-Pohley卵巢重量增加方法測量純化的r-hFSH生物活性?？梢杂蒙锘钚猿杂肧E-HPLC法測定的FSH含量來計算比活性。如下所示。
最后總料比活性通常在10000到17000IU/mg之間。根據實施例2的方法得到的兩個實施例的最后總料FSH的值如表1所示。
表2本發(fā)明純化的r-hFSH總料比活性

權利要求
1.一種重組人FSH或FSH變異體的純化方法，其特征在于，所述的純化方法包括使含有FSH的液體經受以下步驟，但順序可隨意(1)染料親和層析；(2)疏水作用層析；和(3)反相層析。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(1)中的染料親和層析采用具有固定化汽巴龍藍F3G-A的樹脂。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的步驟(1)中染料親和層析采用的樹脂是藍瓊脂糖凝膠FF。
4.如權利要求1至3中的任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述的步驟(1)中的染料親和層析采用pH值為或大約為6.5至11.5的磷酸鈉緩沖液作為洗脫液。
5.如權利要求1至4中的任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述的步驟(2)的疏水作用層析(HIC)采用Toyopearl丁基650M或有類似性質的樹脂。
6.如權利要求1至5中的任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述的步驟(2)的疏水作用層析(HIC)采用磷酸鈉/硫酸銨作為洗脫液。
7.如權利要求1至6所述的任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述的步驟(3)的反相層析采用Source 30 RPC作為樹脂。
8.如權利要求1至7中的任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述的步驟(3)的反相層析采用含有2-丙醇的醋酸銨作為洗脫液。
9.如權利要求1至8中的任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述的步驟以如下順序進行；(1)染料親和層析；(2)疏水作用層析；和(3)反相層析。
10.如權利要求1至9中的任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括陰離子交換層析步驟(0)。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述的陰離子交換層析步驟在步驟(1)、(2)和(3)之前進行。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述的步驟以如下順序進行(0)陰離子交換層析；(1)染料親和層析；(2)疏水作用層析；和(3)反相層析。
13.如權利要求10、11或12所述的方法，其特征在于，所述步驟(0)的陰離子交換層析采用Q瓊脂糖凝膠FF樹脂或Fractogel EMD TMAEHiCap樹脂。
14.如權利要求10至13中的任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述步驟(0)的離子交換層析采用硼酸鹽緩沖液作為洗脫液。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述的硼酸液緩沖液pH值為8.5或大約8.5。
16.如權利要求10至15中的任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括陰離子交換層析步驟(4)的第二步驟。
17.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述的陰離子交換層析步驟(4)的第二步驟在步驟(1)、(2)和(3)之后進行。
18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述的方法步驟以如下順序進行(0)陰離子交換層析；(1)染料親和層析；(2)疏水作用層析；(3)反相層析；和(4)陰離子交換層析。
19.如權利要求16至18中的任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述的第二次陰離子交換層析步驟(4)采用Fractogel EMD TMAE HiCap樹脂或Q瓊脂糖凝膠FF樹脂。
20.如權利要求16至19中所述的方法，其特征在于，所述的第二次陰離子交換層析步驟(4)采用硼酸鹽緩沖液和增加NaCl濃度梯度。
21.如權利要求16至20中的任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述的方法包括在第二次陰離子交換層析步驟(4)之后的納米過濾步驟(4’)。
22.如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述的方法包括在納米過濾步驟(4’)之后的超濾步驟(5)。
23.如權利要求1至22中的任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述的任何洗脫液和/或緩沖液均含有抗氧化劑，具體是指L-蛋氨酸。
24.一種人重組FSH的純化方法，其特征在于，所述的方法包括使FSH經受以下步驟(-1)超濾；(0)在Q瓊脂糖凝膠FF上用硼酸鹽/NaCl、L-蛋氨酸，pH值8.5或大約為8.5作為洗脫液進行陰離子交換層析；(1)經洗脫步驟(0)之后，在藍瓊脂糖凝膠FF上進行染料親和層析步驟，以磷酸鹽、NaCl、L-蛋氨酸，pH值為7或大約為7作為洗脫液；(2)經洗脫步驟(1)之后，在Toyopearl丁基650M上進行疏水作用層析步驟，以磷酸鹽、硫酸銨、L-蛋氨酸，pH值為7或大約為7作為洗脫液；(3)經洗脫步驟(2)之后，在Source 30 RPC上以醋酸銨、L-蛋氨酸、2-丙醇，pH值為7.6或大約為7.6作為洗脫液進行反相層析步驟；(4)經洗脫步驟(3)之后，在FractogelEMD TMAE hicap樹脂上用硼酸鹽、L-蛋氨酸、pH值為8.5或大約為8.5，和NaCl進行陰離子交換層析步驟；(4’)經洗脫步驟(4)之后進行納米過濾；以及(5)經步驟(4’)滲透之后進行超濾。
25.一種重組人FSH或FSH的變異體，其特征在于，所述的重組人FSH或FSH的變異體通過權利要求1至24的中的任一權利要求所述的方法得到。
26.一種藥物組合物，其特征在于，所述的組合物包括如權利要求25所述的人FSH或FSH變異體以及藥學上可接受的賦形劑。
27.如權利要求26的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括如權利要求25所述的FSH、聚醚68、蔗糖、蛋氨酸、間甲酚和一pH值為7.0或大約為7.0的水溶性磷酸鹽緩沖液。
28.如權利要求25的重組人FSH或FSH變異體在制備治療生殖力異常的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及起始材料為未加工的FSH的重組人FSH或FSH變異體的一種純化方法，其包括以下步驟1.染料親和層析；2.疏水作用層析；和3.反相層析。
文檔編號A61K38/04GK101087805SQ200580037591
公開日2007年12月12日 申請日期2005年11月8日 優(yōu)先權日2004年11月9日
發(fā)明者P·瓦拉克斯, P·溫格, A·斯坦利, L·德勒格蘭吉, L·卡珀尼 申請人:阿雷斯貿易股份有限公司