專利名稱：機體硬組織或軟組織誘導性支架材料的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于人造牙根植入、人造關節植入、骨板等骨固定支具、替代骨或人造臟器及其保持裝置的機體硬組織或軟組織誘導性支架材料(以下稱為支架材料)。而且，本發明涉及一種細胞·微生物的培養方法、使用有該方法生產來自生物的物質(特別是醫用膠原)的方法、以及用于這些方法的裝置。
背景技術：
專利文獻1特開平11-341號公報專利文獻2特開平8-140996號公報專利文獻3特開2004-67547號公報專利文獻4特開2004-67547號公報以往，作為植入機體用的植入材料，公知的有人造牙根、人造關節等硬組織誘導性植入材料或人造臟器及其保護裝置、皮膚連接物等軟組織誘導性植入材料。在此，人造牙根、人造關節等骨固定支具對作為機體內硬組織的骨組織(成骨細胞、骨細胞)的誘導和生長很重要，人造臟器或其保持裝置或皮膚連接物等對機體內的軟組織(成纖維細胞等)的誘導和生長很重要。作為這種植入材料的金屬材料的鈦和鈦合金，與其他金屬相比，具有機體內的異物反應少的特異親和性，優選使用。
但是，即使在機體內的異物反應少的情況下，這些植入材料植入機體內時，由于在植入材料表面，結締組織類的成纖維細胞等和膠原纖維一起聚集形成包裹組織，所以植入材料不能和骨組織直接接觸，為了誘導骨組織需要花費時間，不實用。另外，由于材料表面即使是粗糙的平面也是二維結構，所以不能與含有上述包裹組織等的軟組織結合。因此，為了使植入材料在機體內堅固地固定，必須使植入材料和機體硬組織或軟組織在短時間內保持更多的機械結合。根據這樣的宗旨正在開發具有與機體硬組織或軟組織機械結合的部位的有各種幾何學結構的植入材料。
在專利文獻1中，公開了用外部表面有多個開口單元的金屬制泡膜結構薄層覆蓋的植入材料。而且，通過在這種泡膜結構薄層的覆蓋部含有被強化了的骨粘固劑，顯示出植入材料和骨的中間的機械性質。
另外，在專利文獻2中公開的是具有將金屬線材在植入材料的下部外周進行多層壓縮卷繞形成的埋入部的植入材料。由于使用這種植入材料是為了增大金屬與成骨細胞的結合部位，而且埋入部的緩沖功能優良，所以即使對于咬合等外力也不易發生斷裂。
但是，發現具有上述幾何學結構的植入材料向成骨細胞的植入材料侵入，無法滿足與細胞成為一體的骨性結合狀態。
本發明人在專利文獻3中記載有“成骨細胞喜好在細纖維構成的幾何學空間中成長，其對不足100μm粗細的鈦纖維集團構成的幾何學空間結構，且寬度為100～400μm的結構顯現出極高的親和性，有著積極的附著特性。”而且，根據這種見解公開的機體硬組織誘導性支架材料是，其由鈦金屬制的桿和機體組織著床空間構成，其中，所述機體組織著床空間是將直徑不足100μm、縱橫比20以上(短軸∶長軸＝1∶20以上)的鈦纖維或鈦基合金纖維通過抱合形成層狀的物質卷繞在上述桿的外周而成的。通過在機體內使用這種專利文獻3的支架材料，在材料和成骨細胞之間形成三維的物理結合，成為極其良好的骨性結合組織。
可是，專利文獻3中具備多孔質的機體組織著床層的植入材料，雖然與成骨細胞的機械結合優良，但是，要求進一步改善其對外力的耐久性、特別是對施加在桿和硬組織形成誘導層之間的接合面上的力、扭轉或剪切等的強度。
發明內容
本發明的目的在于，在維持硬組織(成骨細胞)喜好生長的幾何學空間不變的情況下，提高對于施加在桿和硬組織形成誘導層之間的接合面上的力、特別是扭轉或剪切等的強度。
另外，以往在將以人造心臟為代表的人造臟器植入機體內時，為保持該人造心臟，和人造臟器同時植入容易和機體內組織結合的其他人造物質。本發明的目的還在于，提供一種支架材料及其植入材料，其具有容易誘導軟組織的孔徑，及幾何學空間，可用于成骨細胞以外的各種(有貼壁依賴性)細胞、作為軟組織的皮膚或肌肉。
本發明的機體組織誘導性支架材料(第1發明)的特征在于，具有金屬基材和由設置在該金屬基材外周的金屬線構成的金屬纖維層，上述金屬纖維層的平均孔徑為100～400μm。優選這種支架材料在金屬纖維層的內側具有由金屬線構成的平均孔徑小于100μm的結合層的(第2發明)。另外，優選金屬纖維層的平均孔徑從最內側到最外側以傾斜式或階梯式地變大(第3發明)。
作為上述支架材料的金屬纖維層，可以例舉將通過抱合直徑是5～400μm的金屬線所形成的金屬無紡布固定而成的金屬纖維層(第4發明)。而且，金屬纖維層由直徑5～400μm的金屬線構成，利用其金屬線的抱合度的差或金屬線直徑的差，可以使孔徑以傾斜式或階梯式變大的方式發生變化(第5、6發明)。
而且，通過使直徑5～400μm的金屬線抱合形成上述結合層，通過在該抱合而成的金屬線之間細密地埋入金屬粉或金屬粒子，可以形成平均孔徑小于100μm的結合層(第7發明)。這種金屬粉或金屬粒子的直徑優選為100μm以下(第8發明)。
另外，在金屬纖維層的外周，使用直徑100～2000μm的金屬線，可以形成平均孔徑為100～2000μm的加固層(第9發明)。
這種支架材料的金屬基材可以根據用途將其形狀制成桿狀，也可以在該桿的表面形成相對桿的半徑方向向外側突出的橋桁或突起物(第10發明)。另外，也可以將金屬基材的形狀制成板狀，在該板表面外側形成突出的突起物(第11發明)。
而且，支架材料優選通過將金屬基材和金屬纖維層和/或結合層一起燒結而形成(第12發明)。這種燒結優選利用金屬基材的熔點(Tm·℃)的0.3～0.9倍的溫度進行(第13發明)。但是，也可以用粘合劑將金屬基材和金屬纖維層或結合層粘合(第14發明)。
就支架材料的材質而言，金屬基材和金屬纖維層和/或結合層的材質優選選自鈦、鈦合金、金、金合金中的一種或兩種金屬(第15發明)。金屬纖維層和/或結合層優選用磷灰石生成液進行處理、用含有碳酸磷灰石的羥基磷灰石、其他磷酸鈣化合物進行涂敷(第16發明)。
本發明的機體硬組織或軟組織誘導性支架材料的第兩種方式的特征在于，具有基材和由設置在該基材外周的平均孔徑為100～400μm的多孔質結構體構成的細胞誘導層，其中，所述基材是具有2mm以下的微孔的多孔結構體，至少具有一條伸向中心方向的導入孔，該導入孔和基材的外部通過微孔復雜地連通(第17發明)。
本發明的機體硬組織或軟組織誘導性支架材料的第3種方式的特征在于，具有基材和由設置在該基材外周的平均孔徑為100～400μm的多孔質結構體構成的細胞誘導層，其中，所述基材具有具備中空部的基材本體和填充在該中空部的多孔質三維結構體，其中，所述基材本體具有以連通中空部的方式形成于外面的至少1個以上的外徑在2mm以下的穿孔和以連通中空部的方式形成于外面的比穿孔大的導入孔(第18發明)。另外，在上述中空部，優選配置有支柱(第19發明)。
而且，在本發明的第2或第3種方式的支架材料中，上述細胞誘導層優選通過抱合金屬線而形成(第20發明)。另外，在如上所述涂敷了磷酸鈣化合物而成的和未涂敷磷酸鈣化合物的金屬纖維層和/或結合層上，優選涂敷選自骨形成蛋白等細胞因子、胰島素等激素、干擾素等微量活性物質中的一種或兩種以上(第21發明)。
本發明的機體植入材料的特征在于，具有埋設于機體內，并且在機體周圍表面固定成為一體的上述任一種機體組織誘導性支架材料(第22發明)。另外，這種植入材料優選用于人造牙根、人造關節、骨板等骨固定支具、替代骨、人造臟器或其保持裝置或皮膚連接物(第23發明)。
本發明的支架材料(第1發明)，由于具有平均孔徑為100～400μm的金屬纖維層，因此機體硬組織的誘導和著床性均優良，成骨細胞喜好固定，容易成長。為此，在金屬纖維層中，成骨細胞和支架材料一體化，形成所謂的“協作區域”。
由于這種支架材料在金屬纖維層的內側設置有平均孔徑小于100μm的結合層(第2發明)，因此金屬基材和結合層的密合性優良，可以堅固地粘固。而且，金屬纖維層和金屬基材的粘合強度也因夾有結合層而更堅固。
另外，由于金屬纖維層的平均孔徑從最內側到最外側傾斜式或階梯式地變大而形成(第3發明)，因此在成骨細胞成長后，兩層沒有界面，所以即使對支架材料施加力，也不易斷裂。而且，由于最外側部位的平均孔徑最大，因此細胞容易侵入。
上述金屬纖維層是通過將直徑為5～400μm的金屬線抱合而形成的金屬無紡布卷繞而成的(第4發明)，而且，上述金屬纖維層由直徑5～400μm的金屬線構成，利用該金屬線的抱合度的差或金屬線直徑的差，使平均孔徑傾斜式或階梯式地變大地發生變化(第5、6發明)，制造簡便。例如，通過將由相同直徑的金屬線構成的金屬無紡布或相同直徑的金屬線慢慢卷繞，一邊使力減弱一邊進行抱合而形成、或者將平均孔徑不同的多個金屬無紡布連續卷繞、或者將金屬線或金屬無紡布進行卷繞、或者裝入模具從外部施加不同的壓力來設置抱合度的差，進而將不同直徑的金屬線或由不同直徑的金屬線構成的金屬無紡布以一定的卷繞力進行抱合等。當然也可以是它們的組合。但是并不限定于此。
另外，上述結合層通過使直徑為5～400μm的金屬線抱合而形成，在該抱合而成的金屬線之間，細密地埋入金屬粉或金屬粒子時(第7發明)，由于在金屬基材上設置金屬線前后都可以自由地調整金屬纖維層的平均孔徑，所以其制造容易。另外，通過埋入金屬粉或金屬粒子，可以調整金屬纖維層的平均孔徑，這種金屬纖維層的平均孔徑既可以相同，也可以作成階梯式或傾斜式。
本發明的支架材料在金屬纖維層的外周使用直徑100～2000μm的金屬線，形成平均孔徑為100～2000μm的加固層時(第9發明)，這種加固層成為支架材料整體的骨架，對于扭轉等外力會更堅固。
通過使上述基材的形狀成為桿狀，可以用作人造牙根、人造關節、替代骨，另外，通過將基材的形狀制成板狀，可以用作骨板等骨固定支具、人造臟器或保持裝置。而且，在該桿表面形成相對桿的半徑方向向外側突出的橋桁或突起物時(第10、11發明)，可以提高桿和金屬纖維層對外力特別是扭轉、剪切的接合強度。
通過將上述的支架材料的金屬基材和金屬纖維層和/或結合層一起燒結而形成時(第12發明)，由于金屬基材和金屬線的接合部位以及金屬線之間的抱合部位通過燒結而固定，所以更堅固。這時，優選金屬基材和金屬線是相同種類的金屬。
本發明的支架材料的金屬基材、金屬纖維層和/或結合層的材料是鈦、鈦合金、金、金合金時(第15發明)，優選其機體親和性高。另外，金屬纖維層和/或結合層利用磷灰石生成液進行處理、利用含有碳酸磷灰石的羥基磷灰石、其他磷酸鈣化合物和骨形成蛋白等細胞因子、胰島素等激素、干擾素等微量活性物質進行涂敷時(第16、17發明)，可以在短期內在金屬纖維層內誘導成骨細胞，并可以使其著床。
由于本發明的植入材料具有埋設于機體內、在機體周圍表面固定為一體的上述任一項記載的支架材料(第18發明)，因此可以與機體堅固地固定，防止由施加在金屬基材上的扭轉或剪切等外力引起的金屬基材和金屬纖維層之間的界面的斷裂。
另一發明，醫用膠原對于皮膚、骨、軟骨等所有的組織和臟器的再造·再生醫療是最好的基本原材料。這種醫用膠原由牛的皮膚、骨等提供，現在具有其特性的人造替代品還沒有開發出來。可是，近年來由于出現牛海綿狀腦病(BSE、瘋牛病)的影響，作為最大的醫用膠原供應源的牛的皮膚、骨等的利用日益困難。另外，牛以外的哺乳動物、如豬，也不能否定其患類似疾病的可能性。另外，由于魚類膠原的特性明顯差，所以在大多數情況下不能使用。
因此，嘗試用遺傳工序學的方法制造人膠原，但與以往的牛膠原相比，成本非常高。作為一般的醫用不實用。成本高的原因之一在于，由于大量培養導入了膠原基因的哺乳類細胞時的細胞支承體是平面(塑料平皿)，所以膠原的生產能力受到限制。
在專利文獻4中，作為與人造關節植入、骨修補用植入、人造牙根植入等各種植入一起使用的機體硬組織誘導支架材料，公開了將直徑不足100μm、縱橫比20以上的鈦或鈦基合金纖維抱合形成層狀的物質。而且在專利文獻1中公開了將上述纖維表面用磷灰石生成液進行處理、用含有羥基磷灰石或碳酸磷灰石的磷酸鈣化合物進行涂敷而成的材料。
由這些纖維層構成的支架材料，在由鈦或鈦基合金材料構成的植入材料的周圍卷繞后埋設于機體骨中時，可以在纖維層內部誘導骨組織，形成鈦和骨組織的立體雜合狀態，與骨組織的親合性極高。另外，在以往的聚合物等纖維中，由于發生網眼堵塞變形所以難于采用，陶瓷制品容易發生破損。
本發明的技術課題在于，改良上述二維平板的細胞培養方法，利用與專利文獻1所示的三維支架材料相同的三維結構，提供膠原產生細胞(人成纖維細胞、人成骨細胞等)等細胞的有效培養方法、或產生抗生素和各種醫學上、產業上有用物質的微生物的有效的培養方法、和有效且大量生產來自生物的物質(來自細胞的物質、來自微生物的物質)的方法以及用于這些方法的裝置。
本發明的細胞·微生物的培養方法的特征在于(第2 4發明)，在由抱合了細纖維而成的纖維網構成的培養底盤中，播種貼壁依賴性細胞或微生物，然后在播種后的培養底盤中加入培養液，培養上述細胞或微生物。在這種培養方法中，優選在上述培養底盤的底部或者底部和側面設置不滲透層作成復合層的狀態下，培養細胞或微生物(第25發明)。
另外，優選將上述培養底盤以多片、多層可裝卸的層疊狀態收容在筒狀容器內，并在該容器內使培養液環流(第26發明)。這時，在將培養底盤收容于容器之前，優選通過旋轉培養來培養細胞或微生物(第27發明)。
本發明的來自生物的物質的生產方法的特征在于(第28發明)，用上述任何一種培養方法培養產生指定的來自生物的物質的細胞或微生物，然后將由培養的細胞或微生物得到的來自生物的物質分離·回收。作為上述來自生物的物質，可以例舉膠原等基質蛋白、骨形成蛋白(BMP)等細胞因子、胰島素等激素、干擾素等微量活性物質等醫學上、產業上有用的重組蛋白等，就所用的細胞、微生物而言，可以例舉可制造醫療和產業上有用的重組蛋白的幾乎所有的細胞和微生物(第29發明)。在上述生產方法中，優選回收上述環流的培養液的一部分，回收該培養液中分泌的來自生物的物質(第30發明)。而且，可以利用溶劑或胃蛋白酶等酶處理來溶解上述培養底盤中沉淀的來自生物的物質，并萃取溶解在溶劑中的來自生物的物質(第31發明)。
本發明的培養裝置的特征在于，具有筒狀的容器、由在該內部以層疊狀態裝卸自由地收容的由抱合了細纖維的纖維網組成的多片培養底盤、以及在上述容器內使培養液環流的裝置(第32發明)。在這種培養裝置中，上述細纖維是粗細為1～1000μm、優選100μm以下的鈦、鈦合金、金、金合金等具有機體親和性的金屬制細纖維，上述纖維網優選呈厚度為0.5～10mm、最好是1～3mm的片狀(第33發明)。而且，優選在上述纖維網上用含有碳酸磷灰石的羥基磷灰石、其他磷酸鈣化合物進行涂敷(第34發明)。另外，優選在用磷酸鈣化合物涂敷后再用膠原等基質蛋白進行涂敷(第35發明)。
另外，所述層疊的培養底盤優選分別以載置到支架上的狀態層疊，以使培養底盤之間留有間隙(第36發明)。此時，上述支架由載置培養底盤的薄板環狀底板和從底板周圍豎起的周壁構成，周壁的內面高度優選與培養底盤相同高度乃至比培養底盤稍高(第37發明)。
本發明的來自生物的物質的生產裝置的特征在于，具有上述任何一種培養裝置和從上述培養底盤或培養液中取出來自生物的物質的裝置(第38發明)。
本發明的三維人造模型的制造方法的特征在于，通過如下方法來制造在所述培養底盤中播種第1細胞，接著向播種后的培養底盤中加入培養液培養上述第1細胞，然后，在培養了該第1細胞的培養底盤上播種第2細胞，接著在播種后的培養底盤中加入培養液，培養第1和第2細胞(第39發明)。
另外，根據這種三維人造模型的制造方法，可以制造三維皮膚模型(第40發明)。特別是在這種制造方法中，可以制造上述第1細胞是成纖維細胞，上述第2細胞是上皮細胞的優選的三維皮膚模型(第41發明)。
在本發明的培養方法(第24發明)中，在由抱合了細纖維的纖維網構成的三維培養底盤中播種細胞或微生物，在上述培養底盤中進行培養。因此，支承細胞或微生物的面積大，可以同時培養許多細胞或微生物。在這種培養方法中，在上述培養底盤底部設置不滲透層作成復合層的狀態下培養細胞或微生物時，細胞和微生物不易從培養底盤脫落。所以可以不用通常的振蕩培養，可用培養底盤培養。另外，在將上述培養底盤載置到底面和側面具有不滲透層的內部的狀態下培養細胞或微生物時，細胞或微生物產生(分泌)的活性物質不從培養底盤散落，易留在不滲透層上。由此使細胞或微生物活化(第25、26發明)。
將上述培養底盤以多片、多層可裝卸的層疊狀態收容在筒狀容器內，使培養液在該容器內環流時，可以有效地培養大量的細胞或微生物(第27發明)。在這種培養方法中，在將上述培養底盤收容于容器之前，通過旋轉培養進行細胞或微生物的培養時，在容器內培養前，可以在各自的培養底盤中高密度地培養細胞或微生物。因此，可以培養更大量的細胞或微生物。
本發明的來自生物的物質的生產方法(第28發明)，由于用上述有效的方法培養大量的細胞或微生物，使培養的細胞或微生物中產生來自生物的物質，因此可以有效地分離、回收大量的來自生物的物質。上述來自生物的物質是膠原等基質蛋白、骨形成蛋白(MBP)等細胞因子、胰島素等激素、干擾素等微量活性物質、其他的醫療和產業上有用的重組蛋白時，可以有效地生產大量的物質，在醫療和產業上是有用的(第29發明)。在這種生產方法中，回收一部分的上述環流的培養液、回收分泌到該培養液中的來自生物的物質時，由于可以在培養液的循環的同時進行所產生的物質的回收，所以是高效的(第30發明)。另外，利用溶劑或胃蛋白酶等酶處理溶化沉淀在上述培養底盤中的來自生物的物質，萃取溶解在溶劑中的來自生物的物質時，可以同時回收大量的物質(第31發明)。
本發明的培養裝置使用由抱合了細纖維的纖維網構成的三維培養底盤作為培養底盤(第32發明)。因此，支承細胞和微生物的面積廣，可以同時培養許多細胞和微生物。而且由于是以多層層疊的狀態將培養底盤收容到容器內進行培養，所以即使狹小的空間也可以有效地培養大量的細胞和微生物。
上述細纖維是粗細為1～1000μm的生物親和性高的金屬制細纖維時，構成纖維網的細纖維的生物適應性高(第33發明)。因此，細胞和微生物不易從培養底盤脫落。金屬是鈦、鈦合金、金、金合金時，生物適應性特別高。另外，細纖維的直徑在100μm以下時，與細胞和微生物的接觸變得更密，培養效率提高。而且，將上述纖維網做成厚度是0.5～10mm的薄片時，各纖維網的處理容易，可以提高層疊時的細胞和微生物的密度。尤其是厚度為1～3mm時，機體的支承可靠，且培養液的滲透性高。而且，在上述纖維網上用含有碳酸磷灰石的羥基磷灰石、其他的磷酸鈣化合物進行涂敷時，細纖維的機體適應性會更高(第34發明)。在用上述磷酸化合物進行涂敷之后，進而用生產目標的來自生物的物質的基質蛋白進行涂敷時，可以使細胞、微生物之間的粘合性增大(第35發明)。
上述層疊的培養底盤分別以載置到支架上的狀態層疊，以使培養底盤之間留有間隙時，在培養底盤的表面便于提供新鮮的培養液(第36發明)。因此，可以使細胞和微生物的活性增高，進行高效地培養。
上述支架由載置培養底盤的薄板環狀底板和從底板周圍豎起的周壁構成，周壁內面的高度優選與培養底盤相同高度乃至比培養底盤稍高時，可以分別將培養底盤在每個支架的容器內收容或取出(第37發明)。因此，在將新的培養底盤收容到容器內的作業和培養底盤的交換作業中，培養底盤的操作容易。而且，由于通過支架使各培養底盤之間有間隙，所以可以將新鮮的培養液提供給培養底盤表面的細胞和微生物。
本發明的來自生物的物質的生產方法，由于具有上述任一種培養裝置和取出來自生物的物質的裝置，所以如上所述可以高效且大量地培養細胞和微生物，還可以分離、回收由這些細胞、微生物產生的大量的來自生物的物質(第38發明)。
本發明的三維人造模型的制造方法，通過如下方法來制造，在上述培養底盤中播種第1細胞，接著向播種后的培養底盤中加入培養液培養上述第1細胞，然后，在培養該第1細胞的培養底盤上播種第2細胞，接著在播種后的培養底盤上加入培養液，培養第1和第2細胞，由此，可以制造使第1細胞和第2細胞在培養底盤內成為層結構的三維人造模型(第39發明)。因此，可以生產作為藥物篩選用的三維人造模型。
特別是在這種制造方法中，通過使用成纖維細胞作為上述第1細胞，使用上皮細胞作為上述第2細胞，可以容易地制造三維皮膚模型(第40發明)。另外，通過使用這種制造方法，也可以生產三維皮膚模型(第41發明)。
圖1是表示本發明支架材料的一實施方式的剖面圖。
圖2是表示本發明支架材料的其他實施方式的斜視圖。
圖3是表示本發明支架材料的另一實施方式的斜視圖。
圖4是本發明支架材料在金屬纖維層培養細胞后的顯微鏡照片。
圖5a是表示本發明支架材料的另外其他實施方式的側面剖面圖，圖5b是其正面剖面圖，圖5c是表示其基材的側面圖。
圖6是表示本發明支架材料的又一其他實施方式的側面剖面圖。
圖7是表示本發明支架材料的再一實施方式的側面剖面圖。
圖8是表示本發明支架材料的又另一實施方式的側面剖面圖。
圖9是表示使用圖8的支架材料的治療方法的概略圖。
圖10是將本發明的支架材料與以往公知的支架材料的破壞轉矩進行比較的圖表。
圖11是將本發明的支架材料與以往公知的支架材料的破壞扭轉角進行比較的圖表。
圖12是表示本發明的來自細胞的物質的生產裝置的一實施方式的概略構成圖。
圖13是表示圖12中的支架和培養底盤在安裝前的狀態的斜視圖。
圖14是圖13的支架和培養底盤安裝后的剖面圖。
圖15是表示本發明生產方法的一實施方式的主要部分工序圖。
圖16a和圖16b分別表示本發明培養底盤的其他實施方式的剖面圖。
圖17是表示通過本發明培養方法生產的膠原和通過以往培養方法生產的膠原的生產量的圖表。
具體實施例方式
圖1是表示本發明支架材料的一實施方式的剖面圖，圖2是表示本發明支架材料的其他實施方式的斜視圖，圖3是表示本發明支架材料的另一實施方式的斜視圖，圖4是本發明支架材料在金屬纖維層培養細胞后的顯微鏡照片。需要說明的是，這些實施例公開的是有助于本發明容易進行的具體例，并不是由此限定本發明。
本發明的人造牙根10包括作為金屬基材的桿11、形成于該桿的外周的結合層13、設置于該結合層外周的金屬纖維層14、以及設置在該金屬纖維層外周的對支撐整體的骨架有作用的加固層15。
桿11包括直徑是3～5mm的軀干21和設置在該軀干的上中下部的橋桁22a、22b、22c以及設置在該軀干上下端的凸緣部23a、23b。在上斷凸緣部23a的上面形成有嵌入牙橋基部(無圖示)的嵌入孔24。另外，下端凸緣部23b的下部成為螺紋切削用絲錐以使其容易埋入骨組織。優選桿11的整體長度是7～20mm，橋桁22的高度是0.2～2mm。作為這種桿11優選鈦、鈦合金、金、金合金制的。但是，只要是不銹鋼或鈷-鉻合金等機體親和性高的物質，就沒有特別限定。
結合層13是通過將平均孔徑小于100μm、直徑是5～400μm的金屬線卷繞在桿11外周的橋桁22之間，使其厚度為0.1～2mm而形成的。另外，金屬纖維層14是通過將抱合了平均孔徑是100～400μm、直徑是5～400μm的金屬線的網狀的纖維網(金屬無紡布)卷繞在結合層13的外周，使其厚度為0.3～10mm而形成的。之后，通過和桿一起進行真空燒結，將各金屬線的交點和結合層與桿的接點熔合。這種金屬線和金屬無紡布向金屬基材的固定方法，使用鑄模法。即，預先計算這些金屬線和金屬無紡布進入的體積，從空隙率和線徑計算所使用的金屬線和金屬無紡布的材料的體積及重量等，將其所必須的量擠壓入基材和鑄模之間，計算厚度，在壓力下進行真空燒結。通過將金屬纖維層和結合層的整體厚度設定為0.4～12mm，可以使金屬線構成的纖維網的真空燒結容易進行。這種燒結溫度因金屬線的熔點(Tm·℃)而異，優選為金屬或金屬合金的熔點(Tm·℃)的0.3～0.9倍。例如，使用鈦作為基材和金屬線時，鈦的熔點是1668℃，所以燒結溫度優選為約500～1500℃。
將直徑是100～2000μm的金屬線抱合，以使平均孔徑為100～2000μm，將這種抱合而成的網狀纖維網卷繞在金屬纖維層14上，使其厚度為0.1～5mm，由此形成加固層15。
因為這種加固層15由較粗的金屬線形成，所以有利于支撐整個支架材料的骨架，防止由扭轉或剪切等外力引起的機體與由最外層和中間層構成的金屬纖維層之間的界面的斷裂。
將誘導機體細胞的誘導劑涂敷在各層。作為這種誘導劑例如有含有碳酸磷灰石的羥基磷灰石、其他磷酸鈣化合物等。由此，可以在更短期內實現成骨細胞產生的骨組織和金屬纖維層14一體化的“協作區域”。這時由于加固層的孔徑比金屬纖維層的平均孔徑大，所以不會妨礙骨細胞到金屬纖維層的生長發育。
將如此構成的人造牙根10埋入拔牙而形成的頜骨的埋入部。由此機體細胞通過平均孔徑較大的加固層15到達金屬纖維層14然后到達結合層13。另外，因為金屬纖維層14具有成骨細胞喜好生長的幾何學結構，所以成骨細胞能在短時間內成長發育。這種金屬纖維層14和成骨細胞達到成為一體的骨性結合狀態的時間因人而異，約是1～2個月。
這樣的成骨細胞在各層固定成骨，而且由于參與代謝，因此一直大大有助于骨和該人造牙根10的結合強度。另外，即使施加對桿的咬合外力等外力(壓迫、扭轉、剪切)，由于結合層13的存在也能防止金屬纖維層14和基材之間的界面斷裂。亦即，一旦成骨細胞成長，在機體和金屬纖維層14的各界面就不易發生斷裂。
通過將抱合的金屬線進行真空燒結形成圖1的人造牙根10的各層。可以在桿的軀干外周將直徑小于100μm、和金屬無紡布同質的金屬粉或金屬粒子使用模板進行真空燒結。另外，也可以在桿的外周涂敷環氧粘合劑、紫外線固化型粘合劑等，并卷繞由5～500μm的金屬線構成的纖維網。為了如此形成各層，桿通過結合層13與金屬纖維層14堅固地固定。但將所有的各層用和桿相同種類的金屬或合金的金屬線與桿一起燒結固定在桿上時，最優選通過熔合桿和金屬纖維層可以使其一體化。
圖2的支架材料30包括鈦板31和設置在該上面的金屬纖維層32。該金屬纖維層32是將平均孔徑為100～400μm的金屬無紡布固定在鈦板31上而成的纖維層。將這種支架材料安裝到人造臟器上、埋設于機體內。由此使軟組織在金屬纖維層內成長約1～2個月的時間，并很好地保持人造臟器。
圖3的支架材料35包括圓筒狀鈦桿36和設置在該內外面的平均孔徑是100～400μm的金屬纖維層37a、b。這種支架材料35主要可以作為人造血管，除此之外，可以用作食管、氣管、神經、脊椎的替代管埋設于機體。
圖4所示的照片是表示將細胞MC3T3-E1在平均孔徑為100～300μm的鈦無紡布上培養4周以及6周后的金屬纖維與上述細胞合成的膠原纖維結合的照片。如圖2可知，在僅僅不足1個月的時間里，金屬纖維和膠原纖維就緊密結合，且軟組織被誘導而成長。
圖5a所示的支架材料可用于作為機體硬組織誘導性的人造牙根，這種人造牙根40包括圓柱狀的基材41和設置在該基材外周的細胞誘導層42。
基材41具有形成于上端的凸緣43、在上表面中心沿其柱的軸向中心形成的導入孔44、沿著軸向從側面突出而形成的突起45。另外，基材41是具有2mm以下的微孔45a的多孔結構體，導入孔44和基材外部通過這些微孔復雜地連通。而且在導入孔44的內面形成有內螺紋46，以使其可以和安裝人造牙的上部結構體或橋基(無圖示)卡合。
這種基材在用金屬作為其材料的情況下，通過如下方法來成型，例如，在模具內填充金屬纖維，通過固化、真空燒結而成型；或者可以使熔化的金屬流入模具內，隨著凝固時過飽和氣體原子的析出生成氣泡；或者可以在凝固后調整外形后用穿孔器等穿孔。另外，使用合成樹脂作為基材的材料時，可以通過使加入發泡劑的熔融的合成樹脂流入模具而成型。
細胞誘導層42是平均孔徑是100～400μm的多孔質結構體，以使其與基材的凸緣部43和突起45相接觸的方式而設置。由此，形成即使施加外力細胞誘導層也不容易從基材脫落的構成。另外，這種細胞誘導層42利用磷灰石生成液進行處理，利用含有碳酸磷灰石的羥基磷灰石、其他磷酸鈣化合物及骨形成蛋白等細胞因子、胰島素等激素、干擾素等微量活性物質進行涂敷。由此可以促進機體硬組織的誘導。
例如，將通過使直徑5～400μm的金屬線抱合形成的金屬無紡布卷繞，使孔徑為100～400μm，從而形成這種細胞誘導層42。另外，在使用合成樹脂材料時，可以用模具形成，然后嵌合在基材41上。
這種人造牙根40如下所述安裝在口腔內。首先將骨髓液等注入人造牙根的導入孔44(橋基安裝部)，然后用注射器等將導入孔44內作成正壓，將骨髓液注入到基材41的內部。然后，將人造牙根40埋植在口腔內，在導入孔44中安裝具有外螺紋的套蓋或關閉導入孔44的套蓋，放置一定時間一直到人造牙根40和機體成為一體。這時基材內部的骨髓液通過微孔到達細胞誘導層42。因此，可促進從人造牙根的外部開始的骨的再生。然后，摘下套蓋，洗滌導入孔后，將有外螺紋的橋基安裝到導入孔44。
使用這樣的人造牙根40的治療，和以往的治療操作幾乎沒有變化。可是由于具有由平均孔徑是100～400μm的多孔質結構體構成的細胞誘導層42，且將骨髓注入到導入孔44，使骨髓分布于整個基材，所以利用其骨髓效果的骨的再生速度大大提高。
圖6所示的支架材料用于作為機體硬組織誘導性的人造牙根。這種人造牙根50包括圓柱狀的基材50a和設置在該基材外周的細胞誘導層51。
基材50a筒狀基材本體51a、填充于內部的多孔質三維結構體52、配置于內部的支柱53。
筒狀的基材本體51a在該側面形成有外徑為2mm以下的小孔55。這種基材本體51a通過如下方法來制造，通過在筒狀金屬體的側面穿孔生成基材本體51a，在該基材本體內通過燒結設置支柱53，而且在基材本體內部填充金屬纖維后，通過燒結操作形成多孔質三維結構52。
多孔質三維結構體52沒有特別限定，通過基材本體51a向細胞誘導層51中供給后述填充的骨髓等營養。另外，由于是在三維結構體52的內部導入血管或神經等而形成的，因此可以形成人造牙髓。這種多孔質三維結構體52是通過將具有機體親和性的合成樹脂或金屬纖維充填在基材本體的內部而形成的。
另外，支柱53是為了保持人造牙根整體的強度而配置的。這種支柱也可以使用具有機體親和性的材料。
細胞誘導層51與圖5的細胞誘導層42基本上相同，例如是通過將抱合直徑5～400μm的金屬線所形成的金屬無紡布卷繞成孔徑為100～400μm而形成的。
為了構成這樣的人造牙根50，和圖5的人造牙根40同樣，首先將骨髓液等注入人造牙根的基材本體內部的多孔質三維結構體52，然后用注射器等使基材本體內部呈正壓，使骨髓液平均分布在多孔質三維結構體52內。然后，將人造牙根50埋植于口腔內，在基材的開口安裝套蓋(未圖示)，放置一定時間直到人造牙根50與機體成為一體。這時，和圖5的人造牙根40同樣，填充在基材內部的骨髓液等通過基材本體的穿孔55到達細胞誘導層51。由此進一步促進從內部開始的骨的再生。然后，摘下套蓋，清潔導入孔后，安裝橋基55a。
由于在這種基材的內部具有多孔質三維結構體52，所以形成了用于向該多孔質三維結構體52供給儲存的營養的最短的營養供給途徑(人造牙髓)。另外，利用該人造牙髓，使象牙質的再生、對細菌的免疫反應提高，且人造牙根的長期穩定性得到改善。
圖7所示的人造牙根59是在基材內部沒有設置支柱的人造牙根。其他的構成和圖6的人造牙根50基本上相同。由此，人造牙根59雖然比人造牙根50強度弱，但安裝容易。
圖8所示的支架材料用于機體硬組織誘導性人造關節。這種人造關節60包括圓柱狀的基材61和設置于該基材外周的細胞誘導層62。
另外，基材61包括側面具有外徑2mm以下小孔63a的圓筒狀基材本體63、填充在該基材本體內部的多孔質三維結構體64、沿基材本體63的內部配置的支柱65。在該支柱65的上端形成有人造骨節65a，而且在該支柱65的中部，在基材內形成有沿半徑方向突出的肋65a。另外，在該人造關節65a上可以設置如用虛線所表示的小孔63a。而且，這種用虛線表示的小孔63a可以是更微細的孔。
多孔質三維結構體64與圖6的多孔質三維結構體基本上相同，通過例如將鈦金屬纖維填充到基材本體63內部而形成。作為支柱65的材料使用強度高的機體親和性高的鈦或鈦合金。
這樣構成的人造關節60的配置如圖9a所示。在此，圖9b是正常狀態的關節概略圖。在此，符號66b表示軟骨；符號66c表示致密骨；符號66d表示松質骨和骨髓的混合部位；符號66e表示骨髓。另外，圖9a的符號66是人造關節的托座。該托座66包括扇狀的金屬基材67和設置于其內面的合成樹脂層68以及設置于金屬基材的外面的鈦纖維網構成的金屬纖維層69。由于圖9a所示的機體骨髓A存在于配置了人造關節60的附近，所以該骨髓A從基材下端開口61b被誘導到基材的三維結構體64內。而且，被誘導的骨髓A接著通過基材本體的小孔63a被輸送到整個細胞誘導層62。由此，可以尋求縮短人造關節60的治愈期間。由此，由于如人造關節之類骨再生范圍廣，僅從外部進行骨侵入需要治愈期間，所以重要的是從內部再生，本發明的人造關節60可以是從內部再生的操作。另外，與周圍骨成為一體時，為了向三維結構體內導入、形成血管、神經，可以以相似于以往機體內的結構體進行復原。因此，被再生的細胞誘導層62誘導的骨可以接受來自骨髓的營養，在經過較長時間后骨骼也不會得不到營養。因此，不會發生以往的人造關節中成為問題的人造關節和骨之間的間隙(松動)，沒必要更換人造關節。
實施例[實施例1]制成圖5的人造牙根40。在此，形成于導入孔44的內面的內螺紋沒有形成。基材41是將直徑為80μm的鈦金屬線裝滿模具，進行燒結而成型，以使其凸緣部43的直徑為4mm、導入孔44的直徑為2mm、長度為3mm且平均孔徑為80μm。
另外，細胞誘導層42將由直徑80μm的鈦金屬線抱合形成的金屬無紡布卷繞，以使平均孔徑為200μm。
而且，將鈦桿安裝在導入孔44，通過真空燒結使它們結合制成人造牙根。這樣形成的人造牙根40的基材41相當于本發明的結合層，細胞誘導層42相當于金屬纖維層。
使直徑為80μm的鈦金屬線抱合并卷繞在鈦桿上，使平均孔徑為200μm。將之進行真空燒結制成人造牙根。作為比較例1。
使直徑為80μm的鈦金屬線抱合并卷繞在鈦桿上，使平均孔徑為80μm。將之進行真空燒結制成人造牙根。作為比較例2。
進行這些實施例1和比較例1和2的人造牙根的扭轉破壞實驗。將其破壞轉矩和破壞扭轉角的結果示于圖10和圖11中。從該結果可知，作為本發明的人造牙根的實施例1，即使施加以破壞扭轉約4倍的力也沒有破壞。另外，對實施例1而言，即使使用相對比較例的人造牙根的約10倍的扭轉力，也沒有發現桿與結合層和金屬纖維層之間被破壞。可知其柔軟性顯著提高。
圖12所示的生產裝置70具有柱71、在該圓柱內部以層疊狀態收容的皿狀支架72、收容于各自的支架內的培養底盤73、在柱71內使培養液環流的閉環狀的管路74。在該管路74中，存在可將空氣和新鮮培養基(培養液)混合后進行供給的混合槽75和氣泡除去槽76。
作為上述柱71，例如可使用帶套管的Pharmacia色譜柱等。將套管81圍繞圓柱本體71a的外周，在該套管的下部設置的入口和在上部設置的出口，例如用使37℃的水循環的管路82連接在一起。由此可以使在柱71內填充的培養基保持機體內的溫度。本體71a具有圓筒狀的外周壁83、塞住其上端的上蓋84、塞住其下端的下蓋85，整體以液密狀態結合。外周壁83通常是玻璃制品，但也可以是不銹鋼等金屬制品。作為培養基可以采用通常所使用的培養基的任何一種，例如，可以使用伊格爾(Eagle)氏最小必須培養基以及具有其改良組成的培養基的任何一種。
在柱71的上蓋84上貫通有管狀的出口構件86，該出口構件通過圓板上的固定構件87固定在上蓋84上。在出口構件86的下端固定有保持被層疊的多層支架72的上端的上壓構件88。另一發明，在將管狀入口構件89貫通于下蓋85的同時，用固定構件90固定在下蓋85上。在入口構件89的上端固定有支承層疊的支架72的下端的下壓構件91。
上述上壓構件88連接在用于將使用后的培養基從柱71流出的排出管92的一端，通過出口構件86內排出到外部。另一端開口于混合槽75內的上部空洞(氣體部)75a。出口構件86的上端連接排出管92的一端，在該混合槽75的培養基(液體)75b中，將中間管93的一端浸泡，該中間管的另一端開口于氣泡除去槽76的上部空洞76a。在氣泡除去槽76內的培養基76b中，將環流管94的一端浸泡，經過蠕動型泵(管式泵)95、壓力計96和預熱槽97，通過柱71的入口構件89連接到下壓構件91。
上述排出管92、中間管93和環流管94等作為一個整體構成使培養基在上述柱71中環流的管路74，蠕動型泵95使管路74內的培養基循環。可以說蠕動型泵95起到了機體內的心臟的作用。預熱槽97是為了將送入到柱71內的培養基預先加熱到機體內溫度(如37℃)附近的裝置。
在上述混合槽75的培養基75b中，浸泡供給空氣和二氧化碳氣體的混合氣體的管98的端部。該管通過過濾器99連接用于將空氣和二氧化碳氣體混合的混合器100。在混合器100中，將提供空氣的壓縮機102和用于提供二氧化碳氣體的儲氣瓶103通過軟管或管連接。需要說明的是，符號104是過濾器。
而且，在混合槽75的上部空洞75a中，供給新鮮培養基的管105的一端開口，該管105的另一端浸泡在填充有新鮮培養基106b的新鮮培養基槽106的培養基106b內。新鮮培養基槽106用蓋封閉，通過過濾器107導入外部氣體的管108開口于上部空洞106a。
而且，在本實施方式中，排出管9 2的中間安裝著開關閥(閥門)110，通過管111將回收·監控槽112連接到該閥門110。回收·監控槽112是確認在生產裝置70工作后，在柱71內細胞產生了目的物質、如膠原，用于回收生產的物質的槽。
圖13和圖14分別表示放大的在圖12的柱71中所收容的支架72、在該內部所收容的培養底盤73。支架72是略呈皿狀的構件，呈環狀，在內部設有載置培養底盤73的階梯部114。從支架72的上端到階梯部114的深度D比培養底盤73的厚度深。培養底盤73是播種細胞進行培養的底盤，是通過抱合鈦或鈦合金制的細纖維，形成柵網狀的纖維網而形成的。
為了構成合適的空隙，構成培養底盤73的細纖維的粗細優選200μm以下，特別優選100μm以下。另外，通常使用20μm以上、優選50μm以上的細纖維。細纖維的長度和條數沒有特別限制。需要說明的是，也可以用1條細纖維構成1片培養底盤73。抱合細纖維例如可以用使各細纖維直角交叉成絲網等方法。另外，作成無紡布或織布狀的薄片，也可以按規定的形狀打孔而構成。培養底盤73的厚度是1～2mm左右，直徑因使用的柱(圖12的符號71)的大小而異，通常是10～200mm左右。培養底盤73的重量是1～100g左右。除鈦以外也可以使用鈦合金、不銹鋼、金、金合金等細纖維。在細纖維的狀態下或形成培養底盤73后，在細纖維上涂敷羥基磷灰石、含有碳酸磷灰石的羥基磷灰石等磷酸鈣化合物時，由于其生物適應性提高，細胞(及微生物)容易付著，所以優選。而且，非常優選在其上面預先涂敷以膠原為代表的纖維蛋白等細胞粘著物，進行所謂的“雙重涂敷”。
支架72例如由聚丙烯酰胺等塑料形成。使用聚丙烯酰胺時，具有加工性高的優點。但也可以使用聚丙烯、聚乙烯、苯乙烯等其它塑料。需要說明的是，也可以在由薄環狀板構成的分配器72a上，將外徑相同的較厚的環狀的支架72b疊置接合等來構成。當將培養底盤73疊置放入這種支架72上時，可以在培養底盤73之間留有空隙的狀態下，將許多培養底盤73層疊。因此，在這種狀態下收容于圖12的柱71中時，可以在各自的培養底盤73中接觸培養基，并可以在培養底盤73上將被培養的細胞連續長時間培養。
作為在培養底盤73中培養的細胞，可以使用將培養底盤73作為貼璧而可以培養的貼璧依賴性的，例如成纖維細胞、成骨細胞等產生膠原的細胞、血管內皮細胞、腎上腺皮質細胞等產生腎上腺皮質(激素)的細胞、胰腺細胞等產生胰島素的細胞、在產生血管類細胞因子的分化過程中存在的來自骨髓的血液細胞、肝細胞等產生有用的血液蛋白的細胞等各種產生來自細胞的物質的細胞。但是，圖12的生產裝置70不限于生產來自細胞的物質的情況，也可以用于單純為了培養細胞使其增殖。這種情況下不需要回收·監控槽52。在這種細胞的培養·增殖等不以生產來自細胞的物質為目的的情況下，與其說是生產裝置不如說僅是細胞培養裝置。產生膠原的情況下，培養基優選含有維生素C。為預防牛海綿狀腦病(BSE)也可以使用合成培養基。
在如此培養有細胞(第1細胞)的培養底盤73中，可以從上面播種不同種類的第2細胞并進行培養。由此可以將培養有2層細胞的培養底盤本體作為藥物篩選用的三維人造模型使用。特別是通過作為第1細胞在培養底盤上播種成纖維細胞，作為第2細胞播種上皮細胞并培養，可以制造三維皮膚模型。
在本實施方式中，使用圓板狀的培養底盤73，而在制造這種三維人造模型時，其形狀沒有特別限定。
下面，用圖12的生產裝置70說明從成纖維細胞、成骨細胞等膠原產生細胞生產膠原的方法。對成纖維細胞而言，例如，將缺損了部分的骨、軟骨、牙周組織、神經、筋、韌帶的患者的口腔粘膜等以數mm級進行采樣，用公知的方法使其中含有的成纖維細胞繁殖并使用。需要說明的是，除患者外，在得到提供者同意的基礎上，也可以使用從特定的新生兒的臍帶、年輕成年人的皮下組織等分離出的成纖維細胞并進行繁殖的物質。可以通過來自骨髓的葉間類干細胞等得到成骨細胞。
下面，如圖15所示，將增殖的成纖維細胞和成骨細胞的細胞片115，播種在收容于培養皿116內的培養底盤73中。將培養皿116的培養底盤73預先浸泡在適當的培養基中。接著將培養皿116設置于旋轉培養器中，使其反復旋轉進行給予細胞刺激的旋轉培養。在確認細胞片115在培養底盤73上被培養后，如圖13所示將培養底盤73收容于支架72，將多個支架72疊置后放入圖12的柱71內。所層疊的支架72的個數根據生產的膠原的量的不同而不同，但約為20～50層。
如上所述，在設置了將培養底盤73收容于圖12的柱71內的多個支架72后，使蠕動型泵95工作，使培養基在管路74內循環，從而培養培養底盤73的細胞。使如上所述的37℃的溫水在柱71的套管中循環，使柱71內成為類似于機體內的環境。從上述的壓縮機102向混合槽75中供給空氣，由上述的儲氣瓶103供給二氧化碳氣體。兩者的比例為例如二氧化碳氣體95％(重量％)、空氣5％(重量％)的比例，供給量是0.1～1升/分鐘左右。二氧化碳和空氣的混合氣體從供給用的管98的端部以起泡的方式混合進入培養基。該混合槽75可以說是起到機體的肺的作用。
當混合槽75的液面降低時用虹吸原理從新鮮培養基槽106向混合槽75供給新鮮的培養基。但是，也可以使用泵強制性地供給。供給混合槽75的新鮮環流液的量是0.1～1升/分鐘左右。在此，由于所供給的培養基有供給細胞營養的作用，因此可以說也有作為消化器官的作用。
在上述氣泡除去槽76中，將從混合槽75輸送過來的培養基靜止儲存，由此，在培養基混合槽75中通過起泡將在培養基內混合的二氧化碳和空氣混合之后，使在培養基內不溶解的殘留氣泡上浮到上部空洞內而除去。
通過使如上所述的生產裝置70起作用，使收容于柱71內的培養底盤73分泌膠原。在分泌的膠原中，一部分分泌到培養基中，另一部分在培養底盤73內作為不溶性的膠原而沉淀。在培養基中含有不溶性的膠原和可溶性的膠原，適當地開關閥門110，可以連續地將這些膠原回收到回收·監控槽112中。即通過鹽析法、離子交換法等，可以從回收·監控槽112中將膠原精制分離。
另一發明，將沉淀于培養底盤73內的不溶性膠原從柱71取出，通過將各自的培養底盤73用可溶解膠原的溶劑例如含1M食鹽的中性緩沖液、或者0.5M醋酸或含胃蛋白酶的0.5M醋酸萃取，幾乎可以完全回收。
如上所述，通過使用生產裝置70，培養由患者的口腔粘膜等得到的成纖維細胞，可以連續得到膠原，并可以有效地回收可溶性膠原和不溶性膠原。回收的膠原可用于患者的必要部位的修復治療，例如可用于骨、軟骨、牙周組織、神經、筋、韌帶等的修復治療。另外，即使從患者以外的組織提供者(供體)得到的組織中產生的膠原，也可用于一般的患者的再生治療。
如上所述，在該生產方法中，由于將由三維的抱合了鈦細纖維的纖維網構成的培養底盤73在分別實現分離的同時層疊數十片進行產生，所以與以往的平板法相比可以使產量增大10倍以上，因此，導入了膠原產制基因的細胞當然不用進行基因操作，而可由正常的人細胞制造大量的膠原，并提供安全的再生醫療原料。
在上述實施方式中，對產生膠原的情況進行了說明，而在產生骨形成蛋白(BMP)等細胞因子、胰島素等激素、干擾素等微量活性物質、其他在醫療和產業上有用的重組蛋白等時也可以用基本上相同的方法來生產。另外，對使用人細胞的情況進行了說明，而使用人以外的動物細胞也可以生產其他的來自細胞的物質。此時，只要能確認安全性，就可以在人患的再生醫療和獸醫領域使用。而且，除細胞外，在培養產生有用的來自生物的物質的貼壁依賴性的微生物，或者使該微生物生產出有用的物質時，也可以采用本發明的方法和裝置，并可以得到同樣的效果。
在上述實施方式中，作為培養底盤73直接使用抱合了鈦或鈦合金制的細纖維而以柵網狀構成的纖維網。然而，如圖16a所示，也可以在培養底盤73的下面設置不使培養液、細胞和微生物或這些細胞和微生物產生的活性物質滲透的不滲透層117，作成復合層。這種不滲透層117可以由合成樹脂片材或薄膜、金屬箔、金屬板等形成。另外，除另外設置培養底盤73外，還可以在培養底盤73的下面填充粉末、微珠等，也可以通過設置所謂的產生孔眼堵塞的層而形成。
如上所述，在培養底盤73的下面設置不滲透層117時，細胞和微生物不易從培養底盤73脫落。因此，可以不用通常的振蕩培養，可以用培養底盤進行培養。
而且，如圖16b所示，除了在培養底盤73的底部以外，也可以在該側面設置不滲透層118。這種側面的不滲透層118也可以使用和上述底部的不滲透層117相同的物質。在底部和側面設置不滲透層117、118時，細胞或微生物產生(分泌)的活性物質不從培養底盤散落，較容易留在不滲透層117上。由此使細胞或微生物被活化。
如圖15所示將培養底盤73放入培養皿116中時，或如圖13、14所示放入支架72中時，也可以將培養底盤73中設置有不滲透層117、118的直接一起放入。由此，實現細胞、微生物不容易脫落等效果。可是，將不滲透層117、118相對培養底盤73裝卸自由地構成，放入支架72時，也可以在特定的狀態下卸下。
抱合相當于本發明培養方法所用培養底盤的直徑是50μm的鈦金屬線，使其空隙率為87％，制造鈦纖維網。設定為實施例1。
制造將實施例1的鈦纖維網插入到有底圓筒狀的鈦制的支架中的培養底盤。設定為實施例2。
將用以往公知的平面塑料皿構成的塑料盒作為比較例1。
對這些實施例1、2和比較例1播種成纖維細胞，在培養液中浸泡，培養2周。圖17表示此時由成纖維細胞產生的膠原的生產量。由該圖可知，采用在本發明培養方法中所用的培養底盤(實施例1)進行培養時，膠原的產量比通常的塑料盒提高1.4倍。而且，在安裝有支架的培養底盤(實施例2)中進行培養時，膠原的產量比通常的塑料盒提高1.8倍。
權利要求
1.一種機體硬組織或機體軟組織誘導性支架材料，其具有金屬基材和由設置在該金屬基材外周的金屬線構成的金屬纖維層，所述金屬纖維層的平均孔徑為100～400μm。
2.如權利要求1所述的支架材料，其中，在所述金屬纖維層的內側，具有由金屬線構成的平均孔徑小于100μm的結合層。
3.如權利要求1所述的支架材料，其中，所述金屬纖維層的平均孔徑從最內側到最外側以傾斜式或階梯式地變大。
4.如權利要求1所述的支架材料，其中，所述金屬纖維層是將直徑5～400μm的金屬線通過抱合所形成的金屬無紡布固定而成的。
5.如權利要求3所述的支架材料，其中，所述金屬纖維層由直徑5～400μm的金屬線構成，利用該金屬線的抱合度的差，使平均孔徑以傾斜式或階梯式變大的方式發生變化。
6.如權利要求3所述的支架材料，其中，所述金屬纖維層由直徑5～400μm的金屬線構成，利用該金屬線直徑的差，使平均孔徑以傾斜式或階梯式變大的方式發生變化。
7.如權利要求2所述的支架材料，其中，所述結合層通過使直徑5～400μm的金屬線抱合而形成，在該抱合而成的金屬線之間，細密地埋入金屬粉或金屬粒子。
8.如權利要求7所述的支架材料，其中，所述金屬粉或金屬粒子的直徑是100μm以下。
9.如權利要求1～8中任一項所述的支架材料，其中，在所述金屬纖維層的外周，使用直徑100～2000μm的金屬線，形成平均孔徑為100～2000μm的加固層。
10.如權利要求1～9中任一項所述的支架材料，其中，所述金屬基材的形狀是桿狀，在該桿表面形成有相對桿的半徑方向朝外側突出的橋桁或突起物。
11.如權利要求1～9中任一項所述的支架材料，其中，所述金屬基材的形狀是板狀，在該板表面外側形成有突出的突起物。
12.如權利要求1～11中任一項所述的支架材料，通過將所述金屬基材和所述金屬纖維層和/或結合層一起燒結而形成。
13.如權利要求12所述的支架材料，其中，所述燒結是利用金屬基材的熔點(Tm·℃)的0.3～0.9倍的溫度進行的。
14.如權利要求2所述的支架材料，其中，用粘合劑將所述金屬基材和金屬纖維層或結合層粘合。
15.如權利要求1～14中任一項所述的支架材料，其中，所述金屬基材和金屬纖維層和/或結合層的材質是選自鈦、鈦合金、金、金合金中的一種或兩種金屬。
16.如權利要求1～15中任一項所述的支架材料，其中，所述金屬纖維層和/或結合層利用磷灰石生成液進行處理，利用含有碳酸磷灰石的羥基磷灰石、其他磷酸鈣化合物進行涂敷。
17.一種機體硬組織或機體軟組織誘導性支架材料，具有基材和由設置在該基材外周的平均孔徑為100～400μm的多孔質結構體構成的細胞誘導層，其中，所述基材是具有2mm以下的微孔的多孔結構體，至少具有一條伸向中心方向的導入孔，該導入孔和基材的外部通過微孔復雜地連通。
18.一種機體硬組織或機體軟組織誘導性支架材料，其具有基材和由設置在該基材外周的平均孔徑為100～400μm的多孔質結構體構成的細胞誘導層，其中，所述基材具有具備中空部的基材本體和填充在該中空部的多孔質三維結構體，所述基材本體具有以連通中空部的方式形成于外面的至少1個以上的外徑在2mm以下的穿孔和以連通中空部的方式形成于外面的比穿孔大的導入孔。
19.如權利要求18所述的機體硬組織或機體軟組織誘導性支架材料，其中，在所述中空部配置有支柱。
20.如權利要求17或18所述的機體硬組織或機體軟組織誘導性支架材料，其中，所述細胞誘導層通過抱合金屬線而形成。
21.如權利要求1～20中任一項所述的支架材料，其中，在所述金屬纖維層和/或結合層上，涂敷選自骨形成蛋白等細胞因子、胰島素等激素、干擾素等微量活性物質中的一種或兩種以上。
22.一種機體植入材料，其具有埋設于機體內、并且在機體周圍表面固定成為一體的如權利要求1～21中任一項所述的機體硬組織或機體軟組織誘導性支架材料。
23.如權利要求22所述的機體植入材料，用于選自人造牙根、人造關節、骨板等骨固定支具，替代骨，人造臟器或其保持裝置，皮膚連接物中的一種。
24.一種細胞·微生物的培養方法，為在由抱合了細纖維的纖維網構成的培養底盤中，播種貼壁依賴性細胞或微生物，然后向播種后的培養底盤中加入培養液，培養所述細胞或微生物。
25.如權利要求24所述的細胞·微生物的培養方法，其中，在所述培養底盤的底部設置不滲透層作成復合層的狀態下，培養細胞或微生物。
26.如權利要求25所述的細胞·微生物的培養方法，其中，在所述培養底盤的側面也設置不滲透層，培養細胞或微生物。
27.如權利要求24所述的細胞·微生物的培養方法，其中，將所述培養底盤以多片、多層可裝卸的層疊狀態收容在筒狀容器內，在該容器內使培養液環流。
28.一種來自生物的物質的生產方法，其用權利要求24-27中任一項所述的培養方法對生產規定的來自生物的物質的細胞或微生物進行培養，然后將從培養好的細胞或微生物得到的來自生物的物質進行分離·回收。
29.如權利要求28所述的生產方法，其中，所述來自生物的物質選自膠原等基質蛋白、骨形成蛋白等細胞因子、胰島素等激素、干擾素等微量活性物質、醫學上產業上有用的重組蛋白中的一種或兩種以上。
30.如權利要求29所述的生產方法，其中，回收部分上述環流的培養液，回收分泌到該培養液中的來自生物的物質。
31.如權利要求28所述的生產方法，其中，通過溶劑或酶處理來溶解沉淀于上述培養底盤中的來自生物的物質，并萃取溶解在溶劑中的來自生物的物質。
32.一種培養裝置，具有筒狀的容器、由其內部以層疊狀態裝卸自由地收容的抱合了細纖維而成的纖維網構成的多片培養底盤、以及使培養液在所述容器內環流的裝置。
33.如權利要求32所述的培養裝置，其中，所述細纖維是粗細為1～1000μm的機體親和性高的金屬制細纖維，所述纖維網呈厚度為0.5～10mm的片狀。
34.如權利要求32所述的培養裝置，其中，所述纖維網上涂敷有磷酸鈣化合物。
35.如權利要求34所述的培養裝置，其中，在所述磷酸鈣化合物的涂層上，再涂敷作為生產目的的來自生物的物質的基質蛋白。
36.如權利要求32所述的培養裝置，其中，所述層疊的培養底盤分別以載置到支架上的狀態層疊，以使培養底盤之間留有間隙。
37.如權利要求36所述的培養裝置，其中，所述支架包括載置培養底盤的薄板環狀底板和從底板的周圍豎起的周壁，周壁的內面高度與培養底盤相同乃至比培養底盤稍高。
38.一種來自生物的物質的生產裝置，其具有權利要求32-37中任一項所述的培養裝置和從所述培養底盤或培養液中取出來自生物的物質的裝置。
39.一種三維人造模型的制造方法，通過如下方法來制造在所述培養底盤中播種第1細胞，接著向播種后的培養底盤中加入培養液培養上述第1細胞，然后，在培養了該第1細胞的培養底盤上播種第2細胞，接著向播種后的培養底盤中加入培養液，培養第1和第2細胞。
40.如權利要求39所述的三維皮膚模型的制造方法，其中，所述三維人造模型是三維皮膚模型。
41.如權利要求40所述的三維皮膚模型的制造方法，其中，所述第1細胞是成纖維細胞，所述第2細胞是上皮細胞。
全文摘要
本發明提供一種和成骨細胞的機械結合性較高的、強度高的植入材料。一種機體硬組織誘導性支架材料10，其包括具有軀干部21和橋桁22的桿11、形成于該桿的軀干部的外周的結合層13、形成于該結合層的外周的金屬纖維層14，而且在金屬纖維層14的外周形成有加固層15。該結合層13的平均孔徑小于100μm，金屬纖維層14的平均孔徑是100～400μm。
文檔編號A61C8/00GK101065156SQ20058003640
公開日2007年10月31日 申請日期2005年9月26日 優先權日2004年9月24日
發明者久保木芳德, 關康夫, 鹽田博之 申請人:Hi-Lex株式會社, 久保木芳德