用于診斷微轉移的與抗體綴合的花青染料的制作方法

專利名稱：用于診斷微轉移的與抗體綴合的花青染料的制作方法
技術領域：
本發明涉及花青染料與血管生成特異性結合成分，優選與EB-D纖連蛋白特異性結合成分的綴合物用于診斷微轉移和小的增生性病變，尤其是與血管發生相關的原發性腫瘤、初癌狀態、發育不良、化生、炎性病變如銀屑病、銀屑病關節炎和/或類風濕性關節炎、子宮內膜異位病變和眼病的用途。
背景技術：
光在醫學診斷中的用途近來已受到重視(參見例如BiomedicalPhotonics Handbook(EditorT.Vo-Dinh)，CRC Press)。正在實驗測試多種診斷方法以在各種醫療學科，例如內鏡檢查術、乳房X線照相術、外科或婦科中應用。為此目標，將染料供給組織作為用于熒光診斷和成像的外源造影劑，并且這里尤其是最大吸收和最大熒光光譜范圍在700-900nm范圍內(組織的診斷窗口)的熒光染料已經被用于體內成像。這種波長的光子較少被組織吸收，因此在吸收過程(主要通過氧合血紅蛋白和去氧血紅蛋白)終結光傳輸前滲入組織幾厘米。此外，被引入所述組織中的熒光染料能夠產生吸收，但以更長波長熒光輻射的形式發射所吸收的能量。可以通過光譜分離檢測這種熒光輻射，從而可能定位染料并與染料所結合的分子結構相關聯(這方面還參見Licha，K.(2002)Contrast Agents for Optical Imaging(Review).InTopics in Current Chemistry-Contrast Agents II(EditorW.Krause)，Volume 222，Springer Heidelberg，pp.1-31.)。
來自花青染料類的熒光染料是有希望的代表性種類，并且可以以許多不同的結構范圍合成它們。具體而言，具有吲哚碳菁、吲哚二碳菁和吲哚三碳菁骨架的碳菁具有高消光系數和良好的熒光量子產率(Licha，K.(2002)，見上，及其中引用的文獻)。
為了獲得患病結構和健康組織之間的診斷上的顯著差異，所給予的染料必須在所述兩種組織類型之間產生盡可能高的濃度差。這可以基于腫瘤生理學或形態學性質(血供、分布動力學、延遲消除、血管結構)以及基于腫瘤和血管細胞或相鄰組織的分子性質來實現。對于疾病特異性結構的分子標記而言，可以使用由熒光染料和靶親合(target-affine)分子如蛋白質、肽或抗體組成的綴合物。在注射后，這些綴合物的某些部分結合到分子靶結構如受體、細胞表面結構或基質蛋白上，而未結合的部分在體液中被稀釋或代謝或排泄出體外。以此方式，可能導致更高的濃度差，從而在進行熒光診斷時導致更大的圖像對比(高信噪比)。
已經描述許多疾病如腫瘤(Folkman J.(1974).Symp.Soc.Dev.Biol.3043-52)、關節炎(Colville-Nash PR，Scott DL(1992)Ann.Rheum.Dis.51919-25)、銀屑病(Folkman J.(1972)J.Invest.Dermatol.5940-43)、眼病(Adamis AP等人(1999)Angiogenesis，39-14)與血管發生相關。與血管發生相關的各種疾病綜述于例如Longo R等人(2002)Angiogenesis 5237-56。另一方面，在健康組織中極少發生新血管的形成，其中少數例外包括傷口愈合和子宮內膜組織在月經周期或妊娠過程中的變化。因此，新血管發生成為重要的治療靶和診斷靶。
已經描述了優先存在或僅存在于生長中的血管細胞內或附近的許多分子結構(其綜述參見例如Alessi P等人(2004)Biochim.Biophys.Acta.165439-49以及Nanda A和St.Croix B(2004)Curr.Opin.Oncol.1644-49)，包括內皮細胞上的受體如血管內皮生長因子受體(VEGF-R)和基質蛋白如額外結構域B(ED-B)纖連蛋白。纖連蛋白的ED-B結構域是91個氨基酸的序列，其在小鼠、大鼠和人內相同，其通過可變剪接插入纖連蛋白分子中，已證明其在新血管結構周圍特異性地累積(Castellani等人(1994).Int.J.Cancer 59612-618)。
微轉移是＞0.2mm的惡性細胞內聚叢，＜0.2mm的惡性細胞叢被稱為亞微轉移(Van der Westhuizen N.(2002)Laboratory Report；Rampaul RS等人(2001)Breast Cancer Res.3113-116；Bitterman A.等人(2002)IMAJ 4803-809)。目前僅能在體外用顯微鏡檢測的微轉移可以是生血管或非生血管的。大多數人腫瘤，包括原發性腫瘤和轉移沒有生血管活性地發生，并以直徑0.2至＜2mm的顯微病變在原位存在數月至數年，然后小百分比可能轉變為生血管表型(Folkman J和Becker K(2000)Acad.Radiol.7783-785；Folkman J(2001)Angiogenesis.在Braunwald E等人，Harrison′sTextbook of Internal Medicine，15thEdition，McGraw-Hill，517-530中)。在細胞水平上已確定了人和小鼠腫瘤中生血管轉變的至少四種機理(1)通過刺激鄰近宿主血管床中的新血管化，無血管的原位癌可以募集它們自身的血供-人腫瘤中最常見的過程；(2)來自骨髓的循環前體內皮細胞可能進入生血管病灶；(3)腫瘤可能誘導宿主成纖維細胞和/或腫瘤床中的巨噬細胞過度表達生血管因子(例如血管內皮生長因子(VEGF))；和(4)先存在的血管可以被腫瘤細胞同化(coopted)。生血管轉變還可能包括這些機理的組合(Folkman J(2001)Angiogenesis.In Braunwald E等人，Harrison′sTextbook of Internal Medicine，15thEdition，McGraw-Hill，517-530)。現已廣泛接受，當前生血管分子的作用被抗生血管分子的作用平衡時，“生血管轉變”是“關閉的”，而當凈平衡偏向于血管發生時，則是“開啟的”。已經發現了引發這種轉變的多種信號。血管發生激活物為分子結構例如VEGF家族成員、VEGFR、NRP-1、Ang1、Thie2、PDGF-BB和受體、TGF-β1、endoglin、TGF-β受體、FGF、HGF、MCP-1、整聯蛋白(αvβ3、αvβ5、α5β1)、VE-鈣粘著蛋白、PECAM(CD31)、Ephrins、纖溶酶原激活物、MMP、PAI-1、NOS、COX-2、AC133、趨化因子或Id1/Id3。血管發生抑制劑為分子結構例如VEGFR-1、Ang2、TSP-1、TSP-2、血管生長抑素和相關的纖溶酶原kringles、內皮生長抑素(膠原XVII片段)、血管抑素(Vasostatin)、血小板因子4、TIMP、MMP抑制劑、PEX、Meth-1、Meth-2、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IP-10、IL-4、IL-12、IL-18、促乳素(M，16K)、VEGI、SPARC的片段、骨橋蛋白片段或Maspin(Carmeliet P和Jain RK.(2000)Nature 407249-257；Yancopoulos GD等人(2000)Nature 407242-248；Bergers G.和Benjamin LE(2002)Nature Reviews Cancer 3401-410；Hendrix MJC等人(2002)Nature Reviews Cancer 3411-421)。
Ntziachristos V等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.972767-2772描述了具有吲哚花青綠增強的纖維腺瘤漫射光X線斷層照相術。所分辨的腫瘤是大小超過1cm的原發性腫瘤。
WO 01/23005 A1描述了ED-B特異性抗體和多種染料的綴合物以及它們在描繪腫瘤外周中的用途。沒有教導用這些綴合物可以獲得的空間分辨率。
McDonald D.M.和Choyke P.L(2003)Nat.Med.9713-25綜述了血管發生成像的進展。他們討論了核共振成像(MRI)、計算機X線斷層照相術(CT)、正電子發射X線斷層照相術(PET)、超聲檢查和光學成像如何提供非侵入性方法以獲得動物和人中的血管發生圖像。他們教導，這些方法對保存的組織樣品提供它們最高的分辨率，而臨床方法以低得多的分辨率和特異性提供活組織圖像，并且不能分辨微循環血管。結論是，未來的挑戰包括開發能夠填補這種分辨率缺口并特異性識別生血管血管的新的成像方法。目前沒有這種方法。
發明詳述已知現有技術中難以成像微轉移和新血管化或正在血管化的結構，即主要包括微血管系統的結構或處于發展微血管系統過程中的結構，本發明的發明人驚訝地發現，使用血管發生特異性結合成分(尤其是ED-B纖連蛋白特異性結合成分)和花青染料的綴合物，通過基于光的診斷可以辨別這些結構。這一觀察展現了近紅外熒光成像在新的診斷領域中的用途，所述診斷領域需要檢測小的患病結構。因此，在第一方面，本發明提供通式(I)的綴合物用于制備診斷微轉移和小的增生性病變的診斷劑的用途B-(D)n(I)其中B表示血管發生特異性結合成分，D表示花青染料，且n為1-5。
所述血管發生特異性結合成分與如下結構結合，所述結構優先存在或僅存在于微轉移中，位于新形成的微血管中或其附近，或者所述結構在微血管系統結構生長之前或生長過程中存在。這些分子結構在例如WO96/01653，Alessi P等人(2004)以及Nanda A和St Croix B.(2004)中得到綜述。如上所述，形成微轉移的細胞和小的增生性病變的類似細胞表達血管發生因子和抗血管發生因子，只要血管發生抑制劑抵抗血管發生因子的作用，其就導致血管發生的抑制。一旦血管發生因子的作用占優，它們就導致血管發生的開始。因此，參與調節血管發生的兩種結構，即血管發生激活物和血管發生抑制劑都可以是本發明意義內的血管發生特異性結合成分。血管發生激活物包括但不限于如下分子結構，例如ED-B纖連蛋白(ED-BF)、endoglin(CD105)(Burrows FJ等人(1995)Clin.Cancer Res.11623-1634)、VEGF家族成員、血管內皮生長因子(VEGFR)、NRP-1、Ang1、Thie2、PDGF-BB和受體、TGF-β1、TGF-β受體、FGF、HGF、MCP-1、整聯蛋白(αvβ3、αvβ5、α5β1)、VE-鈣粘著蛋白、PECAM(CD31)、Ephrins、纖溶酶原激活物、MMP、PAI-1、NOS、COX-2、AC133、趨化因子或Id1/Id3。血管發生抑制劑包括但不限于如下分子結構，例如VEGFR-1、Ang2、TSP-1、TSP-2、血管生長抑素和相關的纖溶酶原kringles、內皮生長抑素(膠原XVII片段)、血管抑素、血小板因子4、TIMP、MMP抑制劑、PEX、Meth-1、Meth-2、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IP-10、IL-4、IL-12、IL-18、促乳素(M，16K)、VEGI、SPARC的片段、骨橋蛋白片段或Maspin(CarmelietP和Jain RK(2000)Nature 407249-257；Yancopoulos GD等人(2000)Nature407242-248；Bergers G.和Benjamin LE(2002)Nature Reviews Cancer 3401-410；Hendrix MJC等人(2002)Nature Reviews Cancer 3411-421)。在優選的實施方案中，所述血管發生特異性結合成分包括ED-BF、VEGFR或endoglin。其中ED-BF是特別優選的靶結構。ED-BF是纖連蛋白的剪接變體，也稱為腫瘤胚胎(oncofoetal)纖連蛋白，其在血管發生過程中，在新長成的微血管結構中特異性地形成。
與這些結構結合的成分優選為肽(具有2-50個氨基酸殘基的氨基酸鏈)、蛋白質(具有多于50個氨基酸殘基的氨基酸鏈)、核酸、小分子或糖。
優選的蛋白質或肽是受體的配體，它們優先在或僅在微轉移和/或新近血管化或正在血管化的結構中表達，尤其是血管內皮生長因子(VEGF)和抗體，包括人抗體、人源化抗體和嵌合抗體；包括抗體結合結構域的片段如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Facb；單鏈抗體如單鏈Fvs(scFvs)；和二價抗體(diabodies)。
文獻中已經描述了多種這樣的抗體，包括ED-BF L19和E8(參見VitiF.等人(1999)Cancer Res.59347-352)、EP 0 344 134 B1中描述的可以從保藏在European Collection of Animal Cell Cultures，Porton Down，Salisbury，UK的編號為88042101的雜交瘤獲得的BC-1單克隆抗體或其嵌合變體或人源化變體、WO 97/45544 A1中公開的具有特異性VL和VH序列的針對ED-BF的抗體、WO 99/5857 A2中公開的具有特異性VL和VH序列的針對ED-BF的抗體、WO 01/62800 A1中公開的具有特異性VL和VH序列的針對ED-BF的抗體以及AP38和AP39(Marty C等人(2001)Protein Expr.Purif.21156-64)。在Ebbinghaus C等人(2004)Curr Pharm Des.101537-49中綜述了對ED-BF具有特異性的抗體。所有這些抗體或其抗體結合片段都可以用作本發明的優選用途中的血管發生特異性結合成分。特別優選的抗體是L19、E8、AP38和AP39或包含其片段的結合結構域。
VEGF-R的抗體包括貝伐單抗(AvastinTM，由Genentech and Roche開發的rhumAb-VEGF)、抗VEGFR-1抗體mAb 6.12、全人抗VEGFR-2抗體IMC-2C6和IMC-1121、全人抗VEGFR-3 mAb HF4-3C5(均屬于ImcloneSystems Inc.)和KM-2550(Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd)，一種抗VEGFR-1抗體(Salgaller ML(2003)Current Opinion in Molecular Therapeutics 5(6)657-667)。endoglin的抗體包括SN6h、SN6、SN6a、SN6j、P3D1、P4A4、44G4、GRE、E-9、CLE-4、RMAC8、PN-E2、MAEND3、TEC4、TEC11、A11、8E11。克隆SN6h已經廣泛用于通過免疫組織化學研究endoglin在不同腫瘤實體中的表達(Wikstrm P.等人(2002)The Prostate 51268-275；Li C.等人(2003)Br.J.Cancer 881424-1431；Saad R.S.等人(2004)ModemPathol.17197-203)。已經描述了同一SN6系列的抗體SN6、SN6a和SN6j(She X.等人(2004)Int.J.Cancer 108251-257)。對于抗體克隆P3D1、P4A4、44G4、GRE、E-9、CLE-4、RMAC8、PN-E2、MAEND3、TEC4、TEC11，已經確定了endoglin的結合表位(Pichuantes S.等人(1997)Tissue antigens 50265-276)。對于這些抗體和抗體克隆A11中的一些，已經在來源于人的正常組織和腫瘤組織中研究了endoglin的差異表達(Duff S.E.等人(2003)FASEB J.17984-992)。WO 02/02614公開了其它endoglin特異性抗體，例如scFv C4。在一篇關于針對CD 105的抗體的最近的出版物中，通過免疫組織化學研究了克隆8E11在乳癌患者中對轉移危險的預測(Dales J.P.等人(2004)Br.J.Cancer 901216-1221)。所有這些抗體或其抗體結合片段都可以用作本發明的優選用途中的血管發生特異性結合成分。
本領域公知核酸可以具有特異性結合性質，因此，所述血管發生特異性結合成分也可以是核酸。優選地，這些核酸包括DNA、RNA、適體和PNA，其中特別優選適體。識別特異性結合適體的方法在本領域中是公知的，并且描述于例如WO 93/24508 A1、WO 94/08050 A1、WO 95/07364 A1、WO 96/27605 A1和WO 96/34875 A1中。本文特別參考這些文件中公開的方法，所述方法可以用于識別可用于本發明的血管發生特異性結合適體。在本發明的用途中所用的優選適體特異性識別ED-BF、endoglin或VEGFR。
隨著小分子，即分子量低于1.000g/mol，優選低于500g/mol的非肽非核酸化合物的高通量篩選的出現，已經可能識別具有特定結合性質的小分子。這些小分子同樣可以用作根據本發明可用的綴合物的一個成分。優選的小分子為2，2-二苯基乙胺，已經確定它與ED-BF特異性結合(Scheuermann J.(2002)Isolation of binding molecules to the EDB domain offibronectin，a marker of angiogenesis.Dissertation submitted to Swiss FederalInst，of Technology，Zurich)。
在本發明的優選用途中，所述花青染料選自碳菁、二碳菁和三碳菁。可以使用本領域已知的例如以下文獻中示例的方法進行根據本發明可用的花青染料的合成Hamer F.M.The Cyanine Dyes and Related Compounds，John Wiley and Sons，New York 1964；Ernst LA等人(1989)Cytometry 103-10；Southwick PL等人(1990)Cytometry 11418-430；Lansdorp PM等人(1991)Cytometry 12723-730；Mujumdor RB等人(1993)Bioconjugate Chem.4105-11；Mujumdor SR等人(1996)Bioconjugate Chem.7356-62；FlanaganJH等人(1997)Bioconjugate Chem.8751-56；Keil D等人(1991)Dyes andPigments 1719-27；Terpetschnig E和Lakowicz JR(1993)Dyes and Pigments21227-34；Terpetschnig E等人(1994)Anal.Biochem.217197-204；LindseyJS等人(1989)Tetrahedron 454845-66；Górecki T等人(1996)J.Heterocycl.Chem.33，1871-6；Narayanan N和Patonay G(1995)J.Org.Chem.602391-5，1995；和Terpetschnig E等人(1993)J.Fluoresc.3153-155。其它方法描述于專利公開US 4,981,977；US 5,688,966；US 5,808,044；EP 0 591 820 A1；WO 97/42976；WO 97/42978；WO 98/22146；WO 98/26077；和EP 0 800 831中。
此外，合成了具有其它取代基的吲哚三碳菁并將其偶聯到生物分子上(描述于例如Becker A等人，Photochem.Photobiol.72，234，2000；Licha K等人，Bioconjugate Chem.12，44，2001；Becker A等人，Nature Biotechnol.19，327，2001；Bugaj JE等人，J.Biomed.Optics 6，122，2001；Achilefu S等人，J.Med.Chem.45，2003，2002)。其它實例可見于尤其是公開WO00/61194(“Short-Chain Peptide Dye Conjugates as Contrast Agents forOptical Diagnostics”)、WO 00/71162、WO 01/52746、WO 01/52743和WO01/62156中。用于制備吲哚三碳菁染料的另一種方法是通過4-取代吡啶的簡單方法。通過Zincke反應(Zincke-Knig反應，參見Rmpps ChemieLexikon[Rmpps Chemical Dictionary]，第10版，5067頁)，可以以高收率將各種4-取代吡啶轉化為間位取代的戊烯二醛-二酰苯胺，它是花青染料的前體。
在本發明特別優選的實施方案中，所述花青染料為通式(II)的化合物和這些化合物的藥學可接受的鹽和溶劑合物 其中C表示基團(III)或(IV)
其中標有星號的位置表示與基團A相連的點，C也可以表示基團(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX) 其中R1和R2彼此獨立地表示C1-C4磺烷基鏈，例如磺甲基、磺乙基、正磺丙基、異磺丙基、磺丁基、異磺丁基、仲磺丁基、叔異丁基；或者飽和或不飽和、支鏈或直鏈C1-C50烷基鏈，例如CH3、C2H5、C3H7、C4H9、C5H11、C6H13、C7H15、C8H17、C9H19、C10H21、C11H23、C12H23、C13H27、C14H19、C15H31、C16H33、C17H35、C18H37、C19H39、C20H41、C21H43、C22H45、C23H47、C24H49、C25H51、C26H53、C27H55、C28H57、C29H59、C30H61、C31H63，其任選被0-15個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個氧原子和/或被0-3個羰基，例如1、2或3個羰基取代，和/或被0-5個，例如1、2、3、4、5個羥基取代，或者任選被0-15個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個氧原子和/或被0-3個，例如1、2或3個羰基間斷，和/或可以被0-5個，例如1、2、3、4或5個羥基取代；R3表示B或連接于B的連接基，其中所述連接基是具有多達20個碳殘基的支鏈或直鏈糖鏈，尤其是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基，其被一個或多個-OH、-COOH、-SO3基團取代，和/或任選被-O-、-S-、-CO-、-CS-、-CONH、-NHCO-、NHCSNH-、-SO2-、-PO4--、-芳基-和/或-NH-基團間斷一次或多次(優選2、3、4、5或6次)；R4表示基團-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1或-E1，其中E1和E2彼此獨立地表示氫原子、C1-C4磺烷基鏈，例如磺甲基、磺乙基、正磺丙基、異磺丙基、磺丁基、異磺丁基、仲磺丁基、叔異丁基；飽和或不飽和、支鏈或直鏈C1-C50烷基鏈，例如CH3、C2H5、C3H7、C4H9、C5H11、C6H13、C7H15、C8H17、C9H19、C10H21、C11H23、C12H23、C13H27、C14H19、C15H31、C16H33、C17H35、C18H37、C19H39、C20H41、C21H43、C22H45、C23H47、C24H49、C25H51、C26H53、C27H55、C28H57、C29H59、C30H61、C31H63，其任選被0-15個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個氧原子和/或被0-3個，例如1、2或3個羰基間斷，和/或被0-5個，例如1、2、3、4或5個羥基取代；R5表示氫原子或氟原子、氯原子、溴原子或碘原子、甲基、乙基、丙基或異丙基；b表示數字2或3；且X和Y彼此獨立地表示O、S、＝C(CH3)2或-(CH＝CH)-。
在更優選的實施方案(i)中，根據本發明可用的花青染料為通式(X)化合物和這些化合物的藥學可接受的鹽及溶劑合物
其中C′表示基團(XI)或(XII) 其中標有星號的位置表示與基團A′相連的點，C′也可以表示基團(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)或(XVII) 其中基團(XV)或(XVII)可以任選被C1-C4烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基取代，其中R1′表示C1-C4磺烷基鏈，例如磺甲基、磺乙基、正磺丙基、異磺丙基、磺丁基、異磺丁基、仲磺丁基、叔異丁基；飽和或不飽和、支鏈或直鏈C1-C50烷基鏈，例如CH3、C2H5、C3H7、C4H9、C5H11、C6H13、C7H15、C8H17、C9H19、C10H21、C11H23、C12H23、C13H27、C14H19、C15H31、C16H33、C17H35、C18H37、C19H39、C20H41、C21H43、C22H45、C23H47、C24H49、C25H51、C26H53、C27H55、C28H57、C29H59、C30H61、C31H63，其任選被0-15個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個氧原子和/或被0-3個，例如1、2或3個羰基取代，和/或可以被0-5個，例如1、2、3、4、5個羥基取代，或者任選被0-15個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個氧原子和/或被0-3個，例如1、2或3個羰基間斷，和/或可以被0-5個，例如1、2、3、4或5個羥基取代；或M′-R6′；R2′表示C1-C4磺烷基鏈，例如磺甲基、磺乙基、異磺丙基、磺丁基、異磺丁基、仲磺丁基、叔異丁基、飽和或不飽和、支鏈或直鏈C1-C50烷基鏈，例如CH3、C2H5、C3H7、C4H9、C5H11、C6H13、C7H15、C8H17、C9H19、C10H21、C11H23、C12H23、C13H27、C14H19、C15H31、C16H33、C17H35、C18H37、C19H39、C20H41、C21H43、C22H45、C23H47、C24H49、C25H51、C26H53、C27H55、C28H57、C29H59、C30H61、C31H63，其任選被0-15個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個氧原子和/或被0-3個，例如1、2或3個羰基取代，和/或可以被0-5個，例如1、2、3、4、5個羥基取代，或者任選被0-15個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個氧原子和/或被0-3個，例如1、2或3個羰基間斷，和/或可以被0-5個，例如1、2、3、4或5個羥基取代；或M′-R7′；R3′、R4′、R6′和R7′彼此獨立地表示基團-COOE1′、-CONE1′E2′、-NHCOE1′、-NHCONHE1′、-NE1′E2′、-OE1′、-OSO3E1′、-SO3E1′、-SO2NHE1′或-E1′，其中E1′和E2′彼此獨立地表示氫原子、C1-C4磺烷基鏈，例如磺甲基、磺乙基、異磺丙基、磺丁基、異磺丁基、仲磺丁基、叔異丁基、飽和或不飽和、支鏈或直鏈C1-C50烷基鏈，例如CH3、C2H5、C3H7、C4H9、C5H11、C6H13、C7H15、C8H17、C9H19、C10H21、C11H23、C12H23、C13H27、C14H19、C15H31、C16H33、C17H35、C18H37、C19H39、C20H41、C21H43、C22H45、C23H47、C24H49、C25H51、C26H53、C27H55、C28H57、C29H59、C30H61、C31H63，其任選被0-15個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個氧原子和/或被0-3個，例如1、2、3個羰基間斷，和/或被0-5個，例如1、2、3、4、5個羥基取代；M′表示CH2-CH2或CH2-CH2-CH2；R5′表示-Q′-CH2-R8′；Q′表示C1-C5烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1-二甲基丙基、新戊基，其中C原子任選被O或S取代；或者表示 R8′表示-CO-NH-R9′-R10′、-NH-CS-NH-R9′-R10′或-NH-CO-R9′-R10′，其中R9′選自無支鏈的C2-C13烷基，例如乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基和十三烷基，其中一個或多個，例如1、2、3、4個C原子任選被O或S替代，且R10′為B或連接于B的偶聯基團的殘余部分，且b′表示數字2或3；且X′和Y′彼此獨立地表示O、S、＝C(CH3)2、＝C(C2H5)2、＝C(C3H7)2、＝C(異C3H7)2、＝C(C4H9)2或-(CH＝CH)-。
在根據本發明可用的花青染料的更優選的實施方案(ii)中，R5′、R8′、R9′、R10′、E1′、E2′、M′和Q′具有如上面關于實施方案(i)所述的含義，且A′表示基團(XVI)或(XVII)，其中基團(XVII)可以任選在對位被C1-C4烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、異丁基、仲丁基或叔丁基取代；C′表示基團(XII)；R1′表示M-R6′；R2′表示M-R7′；
R3′、R4′、R6′和R7′彼此獨立地表示SO3H或H，條件是R3′、R4′、R6′和R7′中的至少三個為SO3H，且X′和Y′彼此獨立地表示O、S、＝C(CH3)2、＝C(C2H5)2、＝C(C3H7)2、＝C(異C3H7)2或＝C(C4H9)2，b′為3。
在根據本發明可用的花青染料的更優選的實施方案(iii)中，C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R5′、R6′、R7′、R8′、R9′、R10′、E1′、E2′、X′、Y′和b′具有如上面關于實施方案(i)所述的含義；或者R5′、R8′、R9′、R10′、E1′和E2′具有如上面關于實施方案(i)所述的含義，且C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R6′、R7′、X′、Y′和b′具有如上面關于實施方案(ii)所述的含義，且A′表示式(XVI)的基團；M′表示CH2-CH2；且Q′表示C1-C5烷基，其中C原子任選被O或S取代。
在根據本發明可用的花青染料的更優選的實施方案(iv)中，A′、C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R5′、R6′、R7′、R8′、R9′、R10′、E1′、E2′、M′、X′、Y′和b′具有如上面關于實施方案(i)所述的含義；R5′、R8′、R9′、R10′、E1′、E2′和M′具有如上面關于實施方案(i)所述的含義，且A′、C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R6′、R7′、X′、Y′和b′具有如上面關于實施方案(ii)所述的含義；C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R5′、R6′、R7′、R8′、R9′、R10′、E1′、E2′、X′、Y′和b′具有如上面關于實施方案(i)所述的含義，且A′和M′具有如上面關于實施方案(iii)所述的含義；或者R5′、R8′、R9′、R10′、E1′和E2′具有如上面關于實施方案(i)所述的含義，C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R6′、R7′、X′、Y′和b′具有如上面關于實施方案(ii)所述的含義，且A′和M′具有如上面關于實施方案(iii)所述的含義，且Q′表示C1-C5烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1-二甲基丙基、新戊基。
在根據本發明可用的花青染料的更優選的實施方案(v)中，C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R5′、R6′、R7′、R8′、R9′、R10′、E1′、E2′、M′、X′、Y′具有如上面關于實施方案(i)所述的含義；且R5′、R8′、R9′、R10′、E1′、E2′和M′具有如上面關于實施方案(i)所述的含義，且C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R6′、R7′、X′和Y′具有如上面關于實施方案(ii)所述的含義，且A′表示式(XVII)的基團，b′表示3，且Q′表示 在根據本發明可用的花青染料的更優選的實施方案(vi)中，A′、C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R5′、R6′、R7′、R9′、R10′、E1′、E2′、M′、Q′、X′、Y′具有如上面關于實施方案(i)所述的含義；R5′、R9′、R10′、E1′、E2′、M′和Q′具有如上面關于實施方案(i)所述的含義，且A′、C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R6′、R7′、X′、Y′和b具有如上面關于實施方案(ii)所述的含義；C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R5′、R6′、R7′、R9′、R10′、E1′、E2′、X′、Y′和b′具有如上面關于實施方案(i)所述的含義，A′、M′和Q′具有如上面關于實施方案(iii)所述的含義；或者R5′、R9′、R10′、E1′和E2′具有如上面關于實施方案(i)所述的含義，C′、R1′、R2′、R3′、R4′、R6′、R7′、X′、Y′和b′具有如上面關于實施方案(ii)所述的含義，且A′、M′、Q′具有如上面關于實施方案(iii)所述的含義，且R8′表示CO-B或NH-B。
可以用于本發明的特別優選的吲哚三碳菁染料選自下面表1所列式(XVIII)至(XXXVI)的染料，表1顯示在偶聯至B之前的染料結構，并且包含馬來酰亞胺(順丁烯二酰亞胺)或溴乙酰偶聯基團，所述偶聯基團促進偶聯至含有硫醇基的血管發生特異性結合成分。在所得綴合物中，如果偶聯基團是離去基團，則在一些實施方案中各自的偶聯基團將不再存在，或者其僅有一部分會保留在所述綴合物中，稱為偶聯基團的殘余部分。本領域技術人員將明白，代替下面描述的馬來酰亞胺(順丁烯二酰亞胺)或溴乙酰偶聯基團，其它基團可以在以下結構中取代，包括例如氯乙酰基、碘乙酰基、氯乙酰氨基、溴乙酰氨基、碘乙酰氨基、氯烷基、溴烷基、碘烷基、吡啶基二硫化物和乙烯基磺酰胺，以實現與B的偶聯反應。
表1可以用于偶聯至血管發生特異性結合成分的優選染料
通過花青染料中部的R5偶聯至B的花青染料顯示特別好的量子產率，并且一旦偶聯至血管發生特異性結合成分，所述量子產率令人驚訝地很少降低或者甚至不降低。因此，在本發明中，使用實施方案(i)至(vi)的花青染料和結構(XVIII)至(XXXVI)的特定花青染料是特別優選的。
用于偶聯各花青染料和各血管發生特異性結合成分的適當方法主要取決于所述血管發生特異性結合成分的化學性質。現有技術中已知多種殘基或基團，它們是天然存在的，或者可以被引入各種血管發生特異性結合成分中，所述殘基或基團例如-NH2、-COOH、-SH、-OH等。然后這些基團可以與連接于所述花青染料的基團形成共價鍵，后者對另一基團顯示良好的反應性，導致該兩種成分的偶聯。當然也可能逆轉該順序，即將該可反應的基團連接到所述花青染料上，而將該反應性基團連接到所述血管發生特異性結合成分上。基于這種教導，本領域技術人員能夠為每對花青染料和血管發生特異性結合成分選擇合適的反應性和可反應基團。
許多蛋白質或肽包含硫醇基如半胱氨酸殘基的硫醇基，或者能被修飾以包含硫醇基。因此，如果用于本發明中的綴合物包含肽或蛋白質和花青染料，則優選上述花青染料在偶聯至所述蛋白或肽之前包含硫醇基反應性偶聯基團。硫醇基反應性官能團在本領域中是公知的，并且包括例如馬來酰亞胺(順丁烯二酰亞胺)、氯乙酰基、溴乙酰基、碘乙酰基、氯乙酰氨基、溴乙酰氨基、碘乙酰氨基、氯烷基、溴烷基、碘烷基、吡啶基二硫化物和乙烯基磺酰胺。因此，在優選的實施方案中，在連接至B之前，上述實施方案中的R3或R10′表示這種偶聯基團。如果R3是連接于B的連接基，則所述連接基在偶聯之前包含這種偶聯基團。
對于在偶聯反應過程中不完全被替代的一些偶聯基團，例如在所述偶聯反應中不是離去基團的偶聯基團，所述偶聯基團的一部分可能仍然連接于R3、連接于所述連接基或連接于R10′。可以保留在所述花青染料和所述血管發生特異性結合成分的連接中的這部分被稱為“偶聯基團的殘余部分”。
藥學可接受的鹽可以是任何鹽，只要它與上述花青化合物形成無毒的鹽。實例包括堿金屬鹽如鈉鹽、鉀鹽；堿土金屬鹽如鎂鹽、鈣鹽等；有機銨鹽如三乙銨鹽、三丁銨鹽、吡啶鎓鹽等；氨基酸如賴氨酸、精氨酸的鹽等。優選的鹽是鈉鹽。
在優選的實施方案中，小的增生性病變是與血管發生相關的原發性腫瘤；初癌狀態；發育不良；化生；由于例如銀屑病、銀屑病關節炎、類風濕性關節炎的自身免疫疾病或感染的炎性病變；子宮內膜異位；微病變，優選皮膚微病變和/或眼病。在本發明的優選用途中，將所述綴合物用于體內診斷上述疾病和/或微轉移。
本發明的用途可以用于常規診斷，即用于篩查各所述的疾病。但是，在優選的實施方案中，一旦在用例如標準X-射線操作如乳房X線照相術、全身掃描或MRI診斷疾病后，才使用所述綴合物。然后檢查患者的其它微轉移和/或小的(額外)原發性腫瘤。為了確定最佳治療選擇和/或在一種治療程序(例如藥物、輻射或手術)之前、過程中和/或之后，可以進行這種檢查以更好地評價嚴重程度，例如疾病的階段。如果在一種治療程序之前進行，使用本發明的診斷能夠確定例如是否已經在原發性腫瘤附近形成了微轉移，因而能夠確定，以乳腺癌為例，是需要進行乳房腫瘤切除術還是需要進行乳房切除術。在治療后，使用本發明的診斷能夠評價治療程序的成功性，并確定隨后的治療方案，例如輻射或化療。當在手術操作中使用時，可能例如檢測所述原發性腫瘤周圍的組織如淋巴結中的微轉移。在該實施方案中，使用本發明能夠更完全地在所述操作中除去腫瘤或微轉移。
本發明的用途能夠檢測血管發生初現之前的事件、血管發生初現或血管發生，即已經形成的微血管系統，即使是在其出現在非常小的組織結構中時。在本發明的優選實施方案中，用本發明檢測的微轉移和/或小的增生性病變，尤其是微轉移、初癌狀態、發育不良、化生、子宮內膜異位和/或原發性腫瘤的直徑小于10mm，優選小于8mm，更優選小于6mm，更優選小于5mm，更優選小于4mm，更優選小于3mm，更優選小于2mm，且最優選小于1mm。根據本發明的用途可檢測的微轉移和/或小的增生性病變，尤其是微轉移、初癌狀態、發育不良、化生、炎性病變、子宮內膜異位和/或原發性腫瘤的特別優選的范圍為約10mm至約0.1mm，更優選約10mm至約0.2mm，更優選約8mm至約0.1mm，更優選約8mm至約0.2mm，更優選約6mm至約0.1mm，更優選約6mm至約0.2mm，更優選約5mm至約0.1mm，更優選約5mm至約0.2mm，更優選約4mm至約0.1mm，更優選約4mm至約0.2mm，更優選約3mm至約0.1mm，更優選約3mm至約0.2mm，且最優選約2mm至約0.2mm。
優選地，根據本發明的用途檢測的微轉移為醫原性微轉移、血源性微轉移、空腔微轉移、管腔內微轉移、淋巴微轉移、局部微轉移和/或區域微轉移。
所診斷的微轉移優選源自原發性腫瘤，包括但不限于胃腸道或結腸直腸道的惡性瘤(malignomas)(例如癌、肉瘤)、肝癌、胰腺癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌、睪丸癌、黑素瘤、口腔粘膜發育不良(dysplastic oral mucosa)、侵入性口腔癌(invasive oral cancer)、小細胞和非小細胞肺癌；乳房腫瘤，例如激素依賴性乳癌、非激素依賴性乳癌；過渡型和扁平細胞癌；神經惡性腫瘤，包括成神經細胞瘤、神經膠質瘤、星形細胞瘤、骨肉瘤；軟組織肉瘤；hemangioamas和內分泌腫瘤。根據本發明的用途可檢測的小的原發性腫瘤優選為上述腫瘤中的一種。在特別優選的實施方案中，所述小的原發性腫瘤或所述微轉移為乳房腫瘤，特別是激素依賴性乳癌或非激素依賴性乳癌。
根據本發明的用途可檢測的初癌狀態優選選自皮膚的初癌狀態，尤其是光化性角化病、皮角、光化性唇炎、焦油角化病、砷角化病、x-射線角化病、鮑恩病、鮑恩樣丘疹病、惡性雀斑樣痣、硬化性苔蘚和lichen rubbermucosae；消化道的初癌狀態，尤其是粘膜紅斑、白斑、巴雷特食管、普-文綜合征、腳潰瘍、gastropathia hypertrophica gigantea、邊緣癌(borderlinecarcinoma)、腫瘤性腸息肉、直腸息肉、瓷樣膽囊；婦科初癌狀態，尤其是原位導管癌(CDIS)、宮頸上皮內瘤形成(CIN)、白斑、子宮內膜增生(III級)、外陰營養不良改變、外陰上皮內瘤形成(VIN)、葡萄胎；泌尿道初癌狀態，尤其是膀胱乳頭狀瘤病、凱拉特增殖性紅斑、睪丸上皮內瘤形成(TIN)、白斑；原位癌(CIS)；由慢性炎癥，尤其是膿皮病、骨髓炎、聚合性痤瘡、尋常狼瘡和瘺引起的初癌狀態。
發育不良通常是癌癥的預兆，其主要出現在上皮中；它是非腫瘤細胞生長的最混亂形式，包括單個細胞均勻性的喪失和細胞構造取向(architectural orientation)的喪失。發育不良的細胞通常具有異常巨大的深色染色核，并表現出多形性。當存在慢性刺激或炎癥時，發育不良特征性地發生。可以根據本發明診斷的發育不良疾病包括但不限于無汗性外胚層發育不良、前顏面發育異常(anterofacial dysplasia)、窒息性胸廓發育不良、心-手綜合征(atriodigital dysplasia)、支氣管肺發育不良、大腦發育不良、宮頸結構不良、軟骨外胚層發育不良、鎖顱發育不全、先天性外胚層發育不良、顱面骨干發育不全、顱腕跖骨發育不全、顱干骺發育不全、牙本質發育不全、骨干發育不全、外胚層發育不良、釉質發育不全、腦眼球發育不全、骺發育不全半肢畸形、多發性骨骺發育不良、點狀骨骺發育不良、上皮發育不良、面-指-生殖器發育不良(faciodigitogenital dysplasia)、家族性頜骨纖維性結構不全、家族性白色皺襞性發育不良、肌纖維結構不良、骨纖維性結構不良、紅潤色骨發育不全、遺傳性腎-視網膜發育不良、多汗性外胚層發育不全、少汗性外胚層發育不全、淋巴細胞性(lymphopenic)胸腺發育不全、乳腺發育不良、下頜骨顏面發育不良(mandibulofacial dysplasia)、骨骺端發育不全、蒙迪尼發育不良(Mondini dysplasia)、單骨型(monostotic)纖維結構不良、粘液上皮(mucoepithelial)發育不良、多發性骺發育不全、眼耳脊椎發育不良、眼牙指發育不良、眼脊椎發育不良、牙源性發育不良、眼下頜骨發育不良、根尖周牙骨質發育不良、多骨纖維結構不良、pseudoachondroplastic脊椎骺發育不良、視網膜發育不良、眼及透明隔發育不良、脊椎骺發育不良和ventriculoradial發育不良。
化生是受控細胞生長的形式，其中一種類型的成熟細胞或完全分化的細胞取代另一種類型的成熟細胞。根據本發明可檢測的化生疾病優選選自特發性骨髓外化生、大汗腺化生(apocrine metaplasia)、非典型化生(atypicalmetaplasia)、自身實質性(autoparenchymatous)化生、結締組織化生、上皮化生、腸化生、化生性貧血、化生性骨化、化生性息肉、骨髓外化生、原發性骨髓外化生、繼發性骨髓外化生、鱗狀化生、羊膜鱗狀化生、癥狀性(symptomatic)骨髓外化生和再生性(regenerative)化生。
根據本發明可檢測的眼病優選選自沙眼、早產兒視網膜病變、糖尿病性視網膜病變、新生血管性青光眼和年齡相關性黃斑變性。
炎性病變的特征是許多病理過程，包括但不限于免疫細胞，尤其是T細胞和肥大細胞的浸潤、細胞因子的釋放和細胞增殖。例如，在銀屑病中已證明試圖逃避被免疫細胞破壞的角質形成細胞開始增殖，該過程伴有新血管發生。不希望受任何理論的約束，本發明的發明人相信，這種新血管發生使得能夠使用本發明檢測這些小的病變。根據本發明可檢測的炎性病變可以是對許多刺激或疾病，包括自身免疫疾病的響應，所述自身免疫疾病通常的特征是炎性病變的形成、感染、機械刺激等。一方面，如果明顯的炎癥是可檢測的，則可以將檢測這些小的炎性病變的能力用于更精確地描繪受影響的區域，或者另一方面，可以在其中各疾病的典型癥狀，例如銀屑病的變紅和起鱗屑(scaling)或關節炎的關節疼痛和/或四肢變形還不可檢測的病期更早地診斷炎性疾病的發展。可以用本發明的用途診斷的小的炎性病變優選為發生在選自以下的疾病或病癥中的小的炎性病變類風濕性關節炎、炎性腸病、感染性休克、骨質疏松癥、骨關節炎、神經性疼痛、病毒感染(例如病毒性心肌炎)、細菌感染、胰島素依賴型糖尿病、非胰島素依賴型糖尿病、牙周病、再狹窄、局限性脫發、銀屑病、銀屑病關節炎、急性胰腺炎、同種異體移植物排斥、變態反應、變應性肺炎、動脈粥樣硬化、多發性硬化、惡病質、阿爾茨海默病、中風、克羅恩病、炎性腸病、缺血、充血性心力衰竭、肺纖維化、肝炎、成膠質細胞瘤、吉-巴綜合征和系統性紅斑狼瘡。
子宮內膜異位是婦產科疾病，其定義為子宮內膜組織在子宮腔外的增生。增生的子宮內膜細胞可以散布于整個機體，病期已經在肺和其它器官中發現了子宮內膜病變，就此而言子宮內膜病變的散布類似于微轉移的散布。在本發明的用途的優選實施方案中，所檢測的子宮內膜病變，例如子宮內膜細胞叢(cell cluster)是血源性細胞叢、空腔細胞叢、管腔內細胞叢、淋巴細胞叢、局部細胞叢和/或區域細胞叢。因為本發明方法的靈敏性，可能檢測遠遠小于現有技術中所檢測的子宮內膜病變的子宮內膜病變。用本發明檢測的子宮內膜病變的直徑小于10mm，優選小于8mm，更優選小于6mm，更優選小于5mm，更優選小于4mm，更優選小于3mm，更優選小于2mm，最優選小于1mm。根據本發明的用途可檢測的子宮內膜病變的特別優選的范圍為約10mm至約0.2mm，更優選約8mm至約0.2mm，更優選約6mm至約0.2mm，更優選約5mm至約0.2mm，更優選約4mm至約0.2mm，更優選約3mm至約0.2mm，最優選約2mm至約0.2mm。
對所述綴合物的劑量沒有特別的限制，只要所述劑量能夠檢測最終要診斷的位置即可。根據要使用的化合物的種類、年齡、體重和靶器官或組織等對其進行適當調整。通常劑量為0.002-100mg/kg體重，優選0.005-10mg/kg體重，更優選0.01-2mg/kg體重，且最優選0.02-1mg/kg體重。
按照已知方法實施本發明的熒光成像方法，病期可以為每個要給予的綴合物適當地確定每個參數如激發波長和要檢測的熒光波長，以獲得最佳的成像和分辨率。從給予所述綴合物到通過所述熒光成像方法確定病變的時間消耗取決于所述綴合物和給藥靶而變。例如，當將所述綴合物用于腫瘤成像時，流逝時間通常將在給藥后約2至120小時的范圍內，優選為給藥后約2至約10小時。當流逝時間太短時，熒光太強以至于不能清楚地分辨血管發生組織和非血管發生組織(低信噪比)。用于所述熒光成像方法的裝置在本領域中是公知的，并且描述于例如EP 0 868 143、EP 1 146 811A1、EP 1 408 824 A2、EP 1 409 995 A1和EP 1 410 330 A2。
如上所述，本發明還可以與手術操作聯合使用，因此可以用外科顯微鏡、顯微鏡、放大鏡等進行熒光的檢測。這些裝置可以用于多種手術操作中，包括切開操作和內窺鏡操作。還可能將本發明與通常用于常規篩查癌癥的裝置和操作如結腸鏡檢查術和胃鏡檢查術聯合使用。
附圖簡述

圖1在給予物質后6h，染料綴合物在隔膜Capan-1微轉移中的效力。上圖A表示原始圖像，而下圖B表示反轉的圖像。白色和黑色的點或區域分別表示微轉移。兩幅圖像都包括指示cm尺寸比例的尺子。
圖2在給予物質后24h，實驗性子宮內膜異位病變的體外成像實施例。圖A顯示原始圖像，而圖B顯示反轉的圖像。兩幅圖像都包括指示cm尺寸比例的尺子。
圖3在給予物質6h后，皮膚自發性微小病變的體內成像實施例。圖A顯示原始圖像，而圖B顯示反轉的圖像。兩幅圖像都包括指示cm尺寸比例的尺子。
實施例實施例1-16合成具有馬來酰亞胺基的吲哚三碳菁染料實施例13，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}-乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XVIII) a)1-(2-磺酸乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸，內鹽將10g(0.04mol)2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(Bioconjugate Chem1993，4，105)、6.8g(0.04mol)2-氯乙磺酰氯和4.2g(0.04mol)三乙胺在200ml乙腈中回流6小時。抽濾掉沉淀物并干燥。收率5.0g(理論值的35％)。Anal Biochem 1994，217，197b)3-吡啶-4-基-丙酸叔丁酯在0℃下，將在50ml THF中的20g(89mmol)叔丁基-P，P-二甲基磷酰基乙酸酯滴加到3.9g(98mmol)氫化鈉(60％，在礦物油中)在250ml THF中的懸浮液中。在0℃下攪拌1小時后，滴加10g(93mmol)吡啶-4-甲醛在50ml四氫呋喃中的溶液，并將反應混合物在0℃下攪拌1小時，在室溫下攪拌18小時。通過過濾除去所沉淀的固體，并蒸發濃縮溶液。在加熱下將殘余物溶于異丙醇中，濾除不溶部分，并將溶液冷卻至0℃進行結晶。濾除所產生的固體，與己烷一起攪拌，過濾并干燥。在150ml乙醇中，用0.15g 10％鈀/活性炭將中間產物(15.3g)氫化6小時。濾除晶體，蒸發濃縮溶液，并在硅膠(流動溶劑為乙醚)上過濾殘余物。獲得13.0g淺黃色的油(理論值的71％)。
c)3-[2-(叔丁氧羰基)乙基]戊烯二醛-二酰苯胺-氫溴酸鹽將10g(48mmol)3-吡啶-4-基-丙酸叔丁酯在150ml乙醚中的溶液與8.9g(96mmol)苯胺混合，然后在0℃下與5.4g(48mmol)溴化氰在2ml乙醚中的溶液混合。在0℃下攪拌3小時后，濾除所產生的紅色固體，用醚洗滌，并真空干燥。收率20.3g(理論值的92％)d)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(2-羧基乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽將1.0g(2.2mmol)3-[2-(叔丁氧羰基)乙基]-戊烯二醛-二酰苯胺-氫溴酸鹽(實施例1c))和1.5g(4.4mmol)1-(2-磺酸乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(實施例1a))在20ml乙酸酐和5ml乙酸中的懸浮液與0.75g(9.1mmol)乙酸鈉混合，并在120℃下攪拌1小時。冷卻后，將它與乙醚混合，濾除所沉淀的固體，并通過色譜法純化(RP-C18-硅膠，流動溶劑水/甲醇)，將產物凍干(0.5g)。通過將中間產物在4ml二氯甲烷/1ml三氟乙酸中攪拌1小時裂解保護基。在蒸發濃縮和色譜法純化(RP-C18-硅膠，流動溶劑水/甲醇)后，獲得0.45g(理論值的23％)的藍色凍干物。
e)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽將0.4g(0.45mmol)實施例1d)的標題化合物和45mg(0.45mmol)三乙胺溶于10ml二甲基甲酰胺中，在0℃下與0.15g(0.45mmol)TBTU混合，并攪拌10分鐘。然后，添加0.17g(0.68mmol)N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽(Int J Pept Protein Res 1992，40，445)和68mg(0.68mmol)三乙胺在0.5ml二甲基甲酰胺中的溶液，并將其在室溫下攪拌1小時。在添加10ml乙醚后，離心除去固體，干燥并通過色譜法純化(RP-C18-硅膠，梯度水/甲醇)。
收率0.30g藍色凍干物(理論值的65％)。
元素分析計算值C 47.24 H 4.26 N 5.51 S 12.61 Na 6.78實測值C 47.74 H 4.47 N 5.40 S 11.99 Na 7.02實施例23，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(2-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)己基]氨基甲酰基}乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XIX)
與實施例1e)類似，從0.4g(0.45mmol)實施例1d)的標題化合物和0.21g(0.68mmol)N-(6-氨基己基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽(Int J Pept ProteinRes 1992，40，445)進行合成。收率0.38g藍色凍干物(理論值的81％)。
元素分析計算值C 49.25 H 4.79 N 5.22 S 11.95 Na 6.43實測值C 48.96 H 4.92 N 5.32 S 11.88 Na 6.56實施例33，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(2-{[13-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4，7，10-三氧雜十三烷基]氨基甲酰基}乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XX) 與實施例1e)類似，從0.4g(0.45mmol)實施例1d)的標題化合物和0.28g(0.68mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧雜十三烷基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽(Int J Pept Protein Res 1992，40，445)進行合成。收率0.27g藍色凍干物(理論值的51％)元素分析計算值C 48.97 H 5.05 N 4.76 S 10.89 Na 5.86實測值C 49.22 H 5.16 N 4.62 S 10.67 Na 5.66實施例43，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(4-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}-丁基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XXI)
a)(3-叔丁氧羰基-丙基)-三苯基-溴化鏻在-40℃下，將50g(0.30mol)4-溴丁酸在400ml THF中與187g(0.89mol)三氟乙酸酐逐滴混合。在-40℃下攪拌30分鐘后，在1小時內滴加400ml叔丁醇/30ml THF。在室溫下攪拌16小時后，將反應混合物傾入冰冷的碳酸鈉溶液中，用乙醚將水相萃取三次，用硫酸鈉干燥有機相，并蒸發濃縮。將殘余物在真空中蒸餾(沸點72℃/0.9mbar；收率41g)。通過將41g(0.18mol)中間產物、44.6g(0.17mol)三苯基膦和32.5g(0.36mol)碳酸氫鈉在250ml乙腈中加熱回流20小時來進行形成膦鹽的反應。將反應混合物過濾，蒸發濃縮，并通過與乙醚一起攪拌使殘余物結晶。收率58.5g(相對于4-溴丁酸為理論值的40％)白色固體。
b)5-吡啶-4-基-戊酸叔丁酯在-40℃下在無空氣的環境中，在20分鐘內將14g(28mmol)(3-叔丁氧羰基-丙基)-三苯基-溴化鏻(實施例4a))在100ml無水THF中的溶液與17.5ml(28mmol)丁基鋰(1.6M，在己烷中)混合，并在-40℃下攪拌1小時。滴加2.78g(26mmol)4-吡啶甲醛在20ml THF中的溶液，并在室溫下攪拌16小時，然后傾入冰水中，用乙醚將水相萃取三次，用硫酸鈉干燥有機相，并蒸發濃縮。在色譜法純化(硅膠，流動溶劑己烷/乙酸乙酯)后，獲得的產物是E，Z-混合物(在1H-NMR后為4∶1；5.0g)。為了氫化雙鍵，將中間產物溶于200ml甲醇中，并在氫氣中和室溫下與100mg PtO2催化劑一起攪拌。在過濾和蒸發濃縮后，獲得黃色的油。收率4.9g(理論值的74％)。
c)3-[4-(叔丁氧羰基)丁基]戊烯二醛-二酰苯胺-氫溴酸鹽將4.0g(17mmol)5-吡啶-4-基-戊酸叔丁酯在35ml乙醚中的溶液與3.2g(34mmol)苯胺混合，然后在0℃下與1.9g(17mmol)溴化氰在8ml乙醚中的溶液混合。在0℃下攪拌3小時后，濾除所產生的紅色固體，用醚洗滌，并真空干燥。收率7.8g(理論值的95％)。
d)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(4-羧基丁基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽與實施例1d)類似，從實施例4c)的標題化合物(2.5mmol)和1-(2-磺酸乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(5mmol)進行合成。收率0.85g(理論值的37％)藍色凍干物。
e)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(4-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}-丁基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽與實施例1e)類似，從0.4g(0.43mmol)實施例4d)的標題化合物進行合成。收率0.31g(理論值的69％)藍色凍干物。
元素分析計算值C 48.27 H 4.53 N 5.36 S 12.27 Na 6.60實測值C 48.01 H 4.44 N 5.56 S 12.10 Na 6.81實施例53，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(4-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)己基]氨基甲酰基}丁基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XXII)
與實施例1e)類似，從0.4g(0.43mmol)實施例4d)的標題化合物和0.20g(0.66mmol)N-(6-氨基己基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽進行合成。收率0.35g藍色凍干物(理論值的74％)。
元素分析計算值C 50.17 H 5.03 N 5.09 S 11.65 Na 6.26實測值C 49.83 H 4.89 N 5.34 S 12.05 Na 6.42實施例63，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(4-{[13-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4，7，10-三氧雜十三烷基]氨基甲酰基}丁基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XXIII) 與實施例1e)類似，從0.4g(0.43mmol)實施例1d)的標題化合物和0.30g(0.72mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧雜十三烷基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽進行合成。收率0.27g藍色凍干物(理論值的52％)。
元素分析計算值C 49.83 H 5.27 N 4.65 S 10.64 Na 5.72實測值C 49.45 H 5.19 N 4.66 S 10.85 Na 5.80
實施例73，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}己基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XXIV) a)(3-叔丁氧羰基-戊基)-三苯基-溴化鏻如實施例4a)中所述進行制備，其中中間產物6-溴己酸叔丁酯以粗產物反應。從50g 6-溴己酸獲得79g產物(理論值的69％)，為粘稠無色的油。
b)7-吡啶-4-基-庚酸叔丁酯如實施例4b)中所述進行制備。從25g(48.7mmol)(3-叔丁氧羰基-戊基)-三苯基-溴化鏻(實施例7a)獲得7.5g 7-吡啶-4-基-庚酸叔丁酯(理論值的65％)，為黃色的油。
c)3-[6-(叔丁氧羰基)己基]戊烯二醛-二酰苯胺-氫溴酸鹽將5.0g(19mmol)7-吡啶-4-基-庚酸叔丁酯在30ml乙醚中的溶液與3.6g(38mmol)苯胺混合，然后在0℃下與2.1g(19mmol)溴化氰在5ml乙醚中的溶液混合。在0℃下攪拌2.5小時后，濾除所產生的紅色固體，用醚洗滌，并真空干燥。收率8.9g(理論值的91％)。
d)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-羧基己基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽與實施例1d)類似，從實施例7c)的標題化合物(3mmol)和1-(2-磺酸乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(6mmol)進行合成。收率1.5g(理論值的54％)藍色凍干物。
e)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}己基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽與實施例1e)類似，從0.4g(0.43mmol)實施例7d)的標題化合物進行合成。收率0.31g(理論值的69％)藍色凍干物。
元素分析計算值C 49.25 H 4.79 N 5.22 S 11.95 Na 6.43實測值C 48.98 H 4.86 N 5.12 S 11.76 Na 6.77實施例83，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)己基]氨基甲酰基}己基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XXV) 與實施例1e)類似，從0.5g(0.53mmol)實施例7d)的標題化合物和0.23g(0.75mmol)N-(6-氨基己基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽進行合成。收率0.42g藍色凍干物(理論值的70％)。
元素分析計算值C 51.05 H 5.27 N 4.96 S 11.36 Na 6.11實測值C 50.74 H 5.55 N 4.76 S 11.38 Na 6.35
實施例93，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-{[13-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4，7，10-三氧雜十三烷基]氨基甲酰基}己基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XXVI) 與實施例1e)類似，從0.5g(0.53mmol)實施例7d)的標題化合物和0.44g(1.06mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧雜十三烷基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽進行合成。收率0.24g藍色凍干物(理論值的37％)。
元素分析計算值C 50.64 H 5.48 N 4.54 S 10.40 Na 5.59實測值C 50.30 H 5.56 N 4.34 S 10.15 Na 5.73實施例103，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}-3-氧雜-戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XXVII)
a)3-氧雜-6-(4-吡啶基)己酸叔丁酯將75g(0.4mol)3-(4-吡啶基)-1-丙醇在400ml甲苯/50ml THF中的溶液與10g四丁基硫酸銨和350ml 32％氫氧化鈉溶液混合。然后滴加123g(0.68mol)溴乙酸叔丁酯，并在室溫下攪拌18小時。分離有機相，并用乙醚將水相萃取三次。用NaCl溶液洗滌合并的有機相，用硫酸鈉干燥，并蒸發濃縮。在色譜法純化(硅膠∶流動溶劑己烷∶乙酸乙酯)后，獲得56g產物(理論值的41％)，為褐色的油。
b)3-[4-氧雜-5-(叔丁氧羰基)戊基]戊烯二醛-二酰苯胺-氫溴酸鹽將5.0g(20mmol)3-氧雜-6-(4-吡啶基)己酸叔丁酯在60ml乙醚中的溶液與3.7g(40mmol)苯胺混合，然后在0℃下與2.2g(20mmol)溴化氰在8ml乙醚中的溶液混合。在0℃下攪拌1小時后，與50ml乙醚混合，并濾除所產生的紅色固體，用醚洗滌，并真空干燥。收率8.5g(理論值的85％)紫色固體。
c)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-羧基-4-氧雜己基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽將3.0g(6mmol)3-[2-(叔丁氧羰基)乙基]-戊烯二醛-二酰苯胺-氫溴酸鹽(實施例10b))和4.2g(12mmol)1-(2-磺酸乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(實施例1a))在50ml乙酸酐和10ml乙酸中的懸浮液與2.5g(30mmol)乙酸鈉混合，并在120℃下攪拌50分鐘。在冷卻后，將它與乙醚混合，濾除所沉淀的固體，在丙酮中吸收性地沉淀，并在高真空下干燥。在色譜法純化(RP-C18-硅膠，流動溶劑水/甲醇)后，在真空中除去甲醇，并凍干，立即獲得標題化合物。收率2.3g(理論值的41％)藍色凍干物。
d)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}-3-氧雜-戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽與實施例1c)類似，從1.0g(1.1mmol)實施例10c)的標題化合物進行合成。收率0.85g(理論值的73％)藍色凍干物。
元素分析計算值C 47.54 H 4.46 N 5.28 S 12.09 Na 6.50實測值C 47.97 H 4.65 N 5.10 S 12.02 Na 6.68實施例113，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)己基]氨基甲酰基}-3-氧雜-戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XXVIII) 與實施例1e)類似，從0.5g(0.55mmol)實施例10c)的標題化合物和0.23g(0.75mmol)N-(6-氨基己基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽進行合成。收率0.42g藍色凍干物(理論值的68％)。
元素分析計算值C 49.46 H 4.96 N 5.01 S 11.48 Na 6.17實測值C 48.95 H 5.21 N 5.22 S 11.23 Na 6.60實施例123，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[13-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4，7，10-三氧雜十三烷基]氨基甲酰基}-4-氧雜戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XXIX)
與實施例1e)類似，從0.5g(0.55mmol)實施例10c)的標題化合物和0.46g(1.06mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧雜十三烷基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽進行合成。收率0.34g藍色凍干物(理論值的56％)。
元素分析計算值C 49.17 H 5.20 N 4.59 S 10.50 Na 5.65實測值C 49.34 H 5.32 N 4.45 S 10.28 Na 5.56實施例133，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-[4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}乙基)-苯氧基]環己-1-烯-3-亞基)亞乙基]-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XXX) a)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-氯-環己-1-烯-3-亞基)亞乙基]-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽將5.0g(14.4mmol)1-(2-磺酸乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(實施例1a))和2.6g(7.2mmol)N-[(3-(苯胺基亞甲基)-2-氯-1-環己烯-1-基)亞甲基]苯胺鹽酸鹽(Aldrich Company)與2.5g(30mmol)無水乙酸鈉一起在100ml甲醇中回流1小時，冷卻，與150ml乙醚混合，并攪拌過夜。抽吸掉沉淀物，干燥，并通過色譜法純化(硅膠，梯度二氯甲烷/甲醇)。收率3.8g(理論值的58％)藍色固體。
b)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-[4-(2-羧基乙基)苯氧基]環己-1-烯-3-亞基)亞乙基]-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽將在30ml二甲基甲酰胺中的0.37g(2.2mmol)3-(4-羥基苯基)丙酸與0.18g(4.5mmol)氫化鈉(60％礦物油分散體)混合。在室溫下攪拌30分鐘后，將它冷卻到0℃，滴加2.0g(2.2mmol)實施例12a)的標題化合物在100ml二甲基甲酰胺中的溶液，并在室溫下攪拌2小時。用干冰終止混合物的反應，并在真空中除去溶劑。將殘余物溶于甲醇中，與200ml醚一起攪拌，并濾除所沉淀的固體。進行色譜法純化(硅膠，梯度乙酸乙酯/甲醇)。收率1.9g藍色固體(理論值的83％)。
c)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-[4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}乙基)-苯氧基]環己-1-烯-3-亞基)亞乙基]-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽如實施例1e)所述，在三乙胺存在下，使0.1mg(0.10mmol)實施例12b)的標題化合物與TBTU和N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽反應，并通過色譜法純化所獲得的產物。收率93mg藍色凍干物(理論值的81％)。
元素分析計算值C 51.21 H 4.47 N 4.88 S 11.16 Na 6.00實測值C 51.50 H 4.55 N 4.95 S 10.93 Na 6.15實施例143，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-[4-(2-{[6-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)己基]氨基甲酰基}乙基)-苯氧基]環己-1-烯-3-亞基)亞乙基]-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XXXI) 與實施例1e)類似，從0.7g(0.68mmol)實施例14a)的標題化合物和0.53g(1.22mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧雜十三烷基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽進行合成。收率0.56g藍色凍干物(理論值的68％)。
元素分析計算值C 48.27 H 4.53 N 5.36 S 12.27 Na 6.60實測值C 48.01 H 4.44 N 5.56 S 12.10 Na 6.81實施例153，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-[4-(2-{[13-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4，7，10-三氧雜十三烷基]氨基甲酰基}乙基)苯氧基]環己-1-烯-3-亞基)亞乙基]-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XXXII) 與實施例1e)類似，從0.7g(0.68mmol)實施例14a)的標題化合物和0.59g(1.36mmol)N-(13-氨基-4，7，10-三氧雜十三烷基)馬來酰亞胺-三氟乙酸鹽進行合成。進行兩次色譜法純化。收率0.67g藍色凍干物(理論值的75％)。
元素分析計算值C 52.29 H 5.16 N 4.28 S 9.79 Na 5.27實測值C 51.88 H 5.40 N 4.34 S 9.53 Na 5.68實施例163，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-[4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}乙基)-苯氧基]-5-叔丁基-環己-1-烯-3-亞基)亞乙基]-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XXXIII) a)N-[(3-(苯胺基亞甲基)-2-氯-5-叔丁基-1-環己烯-1-基)亞甲基]苯胺鹽酸鹽在0℃下，將6.7ml(73.4mmol)磷酰氯滴加到8ml二甲基甲酰胺中。然后滴加5.0g(32.4mmol)4-叔丁基環己酮在30ml二氯甲烷中的溶液，并將反應混合物回流攪拌3小時。在冷卻至0℃后，緩慢滴加6g(64.8mmol)苯胺在5.5ml乙醇中的溶液，將混合物傾至200g冰上，并在攪拌下添加5ml濃鹽酸。濾除所沉淀的固體，用醚洗滌，并干燥。收率6.8g(理論值的50％)紅色固體。
b)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-氯-5-叔丁基環己-1-烯-3-亞基)亞乙基]-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽將5.0g(14.4mmol)1-(2-磺酸乙基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚-5-磺酸(實施例1a))和3.0g(7.2mmol)N-[(3-(苯胺基亞甲基)-2-氯-5-叔丁基-1-環己烯-1-基)亞甲基]苯胺鹽酸鹽(實施例16a))于2.5g(30mmol)無水乙酸鈉一起在100ml甲醇中回流1.5小時，冷卻，與200ml乙醚混合，并攪拌過夜。抽濾掉沉淀物，干燥并通過色譜法純化(硅膠，梯度二氯甲烷/甲醇)。收率4.7g(理論值的68％)藍色固體。
c)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-[4-(2-羧基乙基)苯氧基]-5-叔丁基環己-1-烯-3-亞基)亞乙基]-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽如實施例13b)所述，從2.0g(2.1mmol)實施例16b)的標題化合物進行反應。收率1.5g(理論值的66％)。
d)3，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-[4-(2-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-氨基甲酰基}乙基)-苯氧基]-5-叔丁基-環己-1-烯-3-亞基)亞乙基]-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽如實施例13c)所述，從1.0g(0.92mmol)實施例16c)的標題化合物進行反應。通過色譜法用RP C-18硅膠純化兩次(流動溶劑乙腈/水)。收率0.24g(理論值的22％)。
元素分析計算值C 52.82 H 4.93 N 4.65 S 10.64 Na 5.72實測值C 52.23 H 5.20 N 4.31 S 10.30 Na 6.15實施例17-19合成具有溴乙酰胺基團的吲哚三碳菁染料實施例173，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[6-(溴乙酰氨基)己基]氨基甲酰基}-4-氧雜戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XXXIV)
a)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{(6-氨基己基)氨基甲酰基}-4-氧雜戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽與實施例1e)類似，從0.5g(0.55mmol)實施例10c)的標題化合物和0.15g(0.70mmol)N-boc-己二胺(Fluka)進行合成。通過色譜法純化反應產物(RP C18-色譜法，梯度甲醇/水)，并且在凍干后，在冰冷卻下將它在2ml三氟乙酸/8ml二氯甲烷中攪拌15分鐘。在真空中旋轉后，將殘余物溶于甲醇，用乙醚沉淀，并分離。收率0.26g藍色固體(理論值的41％)。
b)3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(5-{[6-(溴乙酰氨基)己基]氨基甲酰基}-4-氧雜戊基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽在5ml二甲基甲酰胺中，將0.26g(0.23mmol)實施例18a)的標題化合物冷卻到-20℃，與28mg(0.28mmol)三乙胺和0.10g(0.46mmol)溴乙酰溴在0.2ml二甲基甲酰胺中的溶液混合。在最高0℃下攪拌5小時后，通過添加乙醚沉淀產物，并通過重復從二甲基甲酰胺/乙醚中再沉淀和隨后的干燥獲得產物。收率0.23g(理論值的86％)藍色固體。
元素分析計算值C 45.63 H 4.87 N 4.84 S 11.07 Na 5.96實測值C 45.13 H 4.66 N 4.67 S 10.83 Na未測定實施例183，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(3-{[3-(溴乙酰氨基)丙基]氨基甲酰基}-乙基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XXXV) 與實施例17類似，從實施例1d)的標題化合物(0.5g；0.56mmol)和N-boc-丙二胺進行合成。所有階段的收率0.22g(理論值的37％)。
元素分析計算值C 43.70 H 4.33 N 5.23 S 11.96 Na 6.43實測值C 43.21 H 4.14 N 5.53 S 10.89 Na未測定實施例193，3-二甲基-2-[2-(1-{[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]亞乙烯基}-2-[4-(2-{[3-(溴乙酰氨基)丙基]氨基甲酰基}乙基)-苯氧基]環己-1-烯-3-亞基)亞乙基-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(式XXXVI) 與實施例17類似，從實施例13b)的標題化合物(0.5g；0.49mmol)和N-boc-丙二胺進行合成。所有階段的收率0.31g(理論值的53％)。
元素分析計算值C 47.88 H 4.52 N 4.65 S 10.65 Na 5.73實測值C 48.04 H 4.43 N 4.69 S 10.72 Na 5.84
實施例20-23合成與生物分子的綴合物及所述綴合物的光物理特性實施例20用實施例1-16的標題化合物標記BSA(牛血清白蛋白)一般規程在每種情況下，將5mg(0.074μmol)BSA(Sigma Company)在5ml磷酸鹽緩沖液(0.1 M Na2HPO4/NaH2PO4，pH6.8)中的溶液與0.74μmol實施例1-16的標題化合物(0.5mg/ml在PBS中的貯備液)混合，并在25℃下溫育30分鐘。通過凝膠色譜法純化綴合物(柱Sephadex G50，直徑1.5cm，Pharmacia，洗脫劑PBS)。
實施例21用實施例17-19的標題化合物標記BSA一般規程在每種情況下，將5mg(0.074μmol)BSA(Sigma Company)在5ml磷酸鹽緩沖液(0.1M硼酸鹽緩沖液，pH8.5)中的溶液與1.10μmol實施例17-19的標題化合物(0.5mg/ml在PBS中的貯備液)混合，并在25℃下溫育5小時。通過凝膠色譜法純化綴合物(柱Sephadex G50，直徑1.5cm，Pharmacia，洗脫劑PBS)。
實施例22用實施例1-16的標題化合物標記抗ED-B-纖連蛋白scFv抗體AP39(單鏈片段)AP39是具有C-末端半胱氨酸的scFv，并以摩爾質量為約56000g/mol的共價S-S二聚體存在(Curr.Opin.Drug Discov.Devel.2002 Mar；5(2)204-13)。通過還原二硫橋，產生具有可接近的SH基團的兩個單體(摩爾質量28000g/mol)。
一般規程將AP39在PBS中的0.3ml溶液(濃度0.93mg二聚體/ml)與60μl三(羧乙基)膦(TCEP)在PBS中的溶液(2.8mg/ml)混合，并在25℃和氮氣下溫育1小時。通過在NAP-5柱上進行凝膠過濾來分離過量的TCET(洗脫劑PBS)。通過光度法測定所獲得的AP39單體(OD280nm＝1.4)量為230-250μg(體積0.5-0.6ml)。將溶液與0.03μmol實施例1-16的標題化合物(0.5mg/ml在PBS中的貯備液)混合，并在25℃下溫育30分鐘。通過在NAP-5柱上進行凝膠色譜法來純化綴合物(洗脫劑PBS/10％甘油)。通過親和色譜法(ED-B-纖連蛋白樹脂)測定綴合物溶液的免疫活性(J.Immunol.Meth.1999，231，239)。所得綴合物的免疫活性＞80％(在綴合前AP39的免疫活性＞95％)。
實施例23用實施例17-19的標題化合物標記抗ED-B-纖連蛋白scFv抗體AP39(單鏈片段)一般規程將0.3ml AP39在PBS中的溶液(濃度0.93mg二聚體/ml)與60μl三(羧乙基)膦(TCEP)在PBS中的溶液(2.8mg/ml)混合，并在25℃和氮氣下溫育1小時。通過在NAP-5柱上進行凝膠過濾來分離過量的TCET(洗脫劑50mmol硼酸鹽緩沖液，pH8.5)。通過光度法測定所獲得的AP39單體(OD280nm＝1.4)量為230-250μg(體積0.5-0.6ml)。將溶液與0.06μmol實施例17-19的標題化合物(0.5mg/ml在PBS中的貯備液)混合，并在25℃下溫育4小時。通過在NAP-5柱上進行凝膠色譜法純化綴合物(洗脫劑PBS/10％甘油)。通過親和色譜法(ED-B-纖連蛋白樹脂)測定綴合物溶液的免疫活性(J.Immunol.Meth.1999，231，239)。所得綴合物的免疫活性＞75％(在綴合前AP39的免疫活性＞95％)。
實施例24不同染料結構和AP39的靶特異性綴合物的光物理性質和免疫活性(ELISA)通過光度法并基于短波吸收肩峰(約690-710nm)消光系數為75000 Lmol-1cm-1確定生物分子負載程度(染料對生物分子摩爾比)；用抗體吸收(抗CD105 IgG)為OD280nm＝1.4進行計算。用SPEX fluorolog(校正燈和檢測器的波長依賴性靈敏度)相對于吲哚花青綠確定熒光量子產率(在DMSO中Q＝0.13，J Chem.Eng.Data 1977，22，379，Bioconjugate Chem.2001，12，44)。
通過ELISA測量免疫活性，并描述與靶(ED-B-纖連蛋白)結合的生物分子相對于在與實施例1-19的樣品染料綴合前未標記生物分子AP39的百分比。結果總結于下面表2中。
表2
實施例25用染料標記抗CD105抗體(抗Endoglin IgG)和光物理性質的確定本實施例描述針對靶CD105(endoglin)的不同生物分子類型(全長IgG抗體)。
染料合成用于綴合至抗體的染料是3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-羧基-4-氧雜己基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(實施例10c)。通過在室溫下，在二甲基甲酰胺中，使該染料與5當量N-羥基琥珀酰亞胺、4當量N，N′-二環己基碳二亞胺反應5h而將其轉化為相應的N-羥基琥珀酰亞胺酯。在用乙醚沉淀后，將粗產物直接用于與抗CD105抗體綴合。
標記反應用0.17μmol上述N-羥基琥珀酰亞胺酯(0.2mg/mL在蒸餾水中的貯備液)處理1ml抗體抗CD105 IgG在磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4)中的溶液(濃度為1mg/mL)，并在25℃想溫育5小時。通過凝膠色譜法進行純化(NAP10即用型脫鹽柱，洗脫劑PBS)，得到10μmol/ml染料濃度/1.4μmol/ml抗體濃度的溶液。
如上所述測量理化性質，并示于下面表3中。
表3
實施例26帶有Capan-1腫瘤的裸鼠中的微轉移成像將在培養物中亞鋪滿(subconfluently)生長的Capan-1腫瘤細胞胰蛋白酶化，離心并再懸浮于PBS中。在用錐蟲藍染色并計算細胞濃度后，將細胞懸浮液的濃度設置為3×107ml。將所述細胞懸浮液在冰上冷卻直到使用。麻醉三只雌性裸鼠(NMRI裸鼠，體重24-25g)，在腹部切口后，將30μl(1×106細胞/動物)細胞懸浮液囊下接種到每只動物的胰腺中。每只動物接受0.05μmol/kg體重(1.3mg/kg體重)的包括實施例10，即結構如式XXVII所示的花青染料的物質，其已經按照實施例22的方法被綴合到EB-DF抗體AP39上。在可觸知清楚的腫瘤生長的時間點(在腫瘤細胞植入后約12至14周)靜脈內給予該物質。在給予物質后6小時處死動物，并用強化CCD相機在體外拍攝包含微轉移的腸系膜的熒光信號。通過用波長為740nm的近紅外光照射腸系膜來激發所述物質的熒光，用激光二極管(0.5W輸出)產生所述近紅外光。數字化地貯存熒光圖像。然后，用低倍率顯微鏡(Stemi2000-C，Fa.Carl Zeis)評價微轉移的大小。從0.5至2.0mm直徑范圍的微轉移和從更大的腸系膜轉移接收熒光信號，并使其與顯微評價相對應。基于實施例在圖1中顯示了染料綴合物的效力。
實施例27裸鼠中小的子宮內膜異位病變的體外成像通過手術在4只NMRI裸鼠中誘導子宮內膜異位。用腹膜內注射賽拉嗪/氯胺酮(體積比2∶10，1ml/kg體重)將所述小鼠麻醉。通過2cm中線切口打開腹部，并將兩個人子宮內膜異位組織樣品(樣品大小約1mm3)固定到腹腔每側上的腹膜上。在誘導子宮內膜異位后9天，在所有小鼠中進行成像。為了成像，2只小鼠靜脈內接受0.05μmol/kg體重(1.3mg/kg b.w.)的實施例20的綴合物(AP39+結構如式XXVII所示的實施例10的標題化合物)。其它兩只小鼠接受從BSA和3，3-二甲基-2-{7-[3，3-二甲基-5-磺酸-1-(2-磺酸乙基)-3-H-吲哚鎓-2-基]-4-(6-羧基-4-氧雜己基)庚-2，4，6-三烯-1-亞基}-1-(2-磺酸乙基)-2，3-二氫-1H-吲哚-5-磺酸三鈉，內鹽(實施例10c)合成的對照綴合物。在給予物質后24小時處死所有動物，并用強化CCD相機體外拍攝包含子宮內膜異位病變的腹膜熒光信號。通過用波長為740nm的近紅外光照射包含子宮內膜異位病變的腸系膜來激發所述物質的熒光，用激光二極管(0.5W輸出)產生所述近紅外光。數字化地貯存熒光圖像。在用實施例20的綴合物(AP39+結構如式XXVII所示的實施例10的標題化合物)處理的兩只小鼠的子宮內膜異位病變中都觀察到了清楚的熒光信號增強，而在用對照物質處理的小鼠中并未觀察到。包含病變的熒光的大小小于2mm。基于代表性實施例在圖2中顯示了染料綴合物的效力。
實施例28裸鼠中皮膚的自發性微小病變的體內成像在兩只NMRI裸鼠中觀察多個自發性微小皮膚病變。每只小鼠靜脈內接受0.05μmol/kg體重(1.3mg/kg b.w.)的實施例20的綴合物(AP39+結構如式XXVII所示的實施例10的標題化合物)。在給予物質后6小時，在麻醉的小鼠中進行成像。用吸入麻醉劑異氟烷(Isofluran Curamed，CuramedPharma GmbH，Karlsruhe，Germany)誘導短時間麻醉。通過二極管激光器激發所述物質的熒光(激發波長742nm)，并用強化CCD相機檢測熒光。數字化地保存熒光圖像。然后，用低倍率顯微鏡(Stemi 2000-C，Fa.Carl Zeis)評價微小病變的大小。從小至小于＜1mm的微小病變接收到了熒光信號。基于代表性實施例在圖3中顯示了所述染料綴合物的效力。
不需要進一步的說明，相信本領域技術人員使用前面的描述能夠最大范圍地利用本發明。因此，下列的優選具體實施方案將理解為僅僅是說明性的，并非以任何方式限制本發明的剩余部分。
除非另有說明，在前面的實施例中，所有的溫度都是未校正的攝氏度，并且所有份和百分比都是按重量計。
本文引用的所有申請、專利和公開的全部內容都被引入本文作為參考。
通過取代本發明前面實施例中常規或具體描述的反應物和/或操作條件，可以同樣成功地重復前面的實施例。
從前面的描述中，本領域技術人員能夠容易地確定本發明的基本特征，在不背離本發明精神和范圍的情況下，他們能夠對本發明做出各種改變和修改以將本發明用于各種用途和情況。
權利要求
1.通式(I)的綴合物用于制備診斷微轉移或小的增生性病變的診斷劑的用途B-(D)n(I)其中B表示血管發生特異性結合成分，D表示花青染料，且n為1-5。
2.權利要求1的用途，其中所述血管發生特異性結合成分針對纖連蛋白的ED-B結構域(ED-BF)、endoglin、血管內皮生長因子受體(VEGFR)、VEGF家族成員、NRP-1、Ang1、Thie2、PDGF-BB和受體、TGF-β1、endoglin、TGF-β受體、FGF、HGF、MCP-1、整聯蛋白(αvβ3、αvβ5、αvβ1)、VE-鈣粘著蛋白、PECAM(CD31)、Ephrins、纖溶酶原激活物、MMP、PAI-1、NOS、COX-2、AC133、趨化因子、Id1/Id3、VEGFR-1、Ang2、TSP-1、TSP-2、血管生長抑素和相關的纖溶酶原kringles、內皮生長抑素(膠原XVII片段)、血管抑素、血小板因子4、TIMP、MMP抑制劑、PEX、Meth-1、Meth-2、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IP-10、IL-4、IL-12、IL-18、促乳素(M，16K)、VEGI、SPARC的片段、骨橋蛋白片段或Maspin。
3.權利要求1或2的用途，其中所述血管發生特異性結合成分選自肽、蛋白質、核酸、小分子和糖。
4.權利要求1-3之一的用途，其中所述蛋白質選自抗體、抗體片段和單鏈抗體。
5.權利要求1-4之一的用途，其中所述抗體選自L19、E8、AP38和AP39。
6.權利要求1-5之一的用途，其中所述核酸選自DNA、RNA、適體和PNA。
7.權利要求1-6之一的用途，其中所述小分子是2，2-二苯基乙胺。
8.權利要求1-7之一的用途，其中所述花青染料選自碳菁、二碳菁和三碳菁。
9.權利要求1-6之一的用途，其中所述花青染料是具有通式(II)的化合物和這些化合物的鹽和溶劑合物 其中C表示基團(III)或(IV) 其中標有星號的位置表示與基團A相連的點，C也可以表示基團(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX) 其中R1和R2彼此獨立地表示C1-C4磺烷基鏈或飽和或不飽和、支鏈或直鏈C1-C50烷基鏈，其任選被0-15個氧原子和/或被0-3個羰基取代，和/或被0-5個羥基取代，或者任選被0-15個氧原子和/或被0-3個羰基間斷，和/或可以被0-5個羥基取代；R3表示B或連接于B的連接基，其中所述連接基是具有多達20個碳殘基的支鏈或直鏈糖鏈，其被一個或多個-OH、-COOH、-SO3基團取代，和/或任選被-O-、-S-、-CO-、-CS-、-CONH、-NHCO-、NHCSNH-、-SO2-、-PO4--、-芳基-和/或-NH-基團間斷一次或多次；R4表示基團-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1或-E1，其中E1和E2彼此獨立地表示氫原子、C1-C4磺烷基鏈、飽和或不飽和、支鏈或直鏈C1-C50烷基鏈，其任選被0-15個氧原子和/或被0-3個羰基羰基間斷，和/或被0-5個羥基取代；R5表示氫原子或氟原子、氯原子、溴原子或碘原子、甲基、乙基、丙基或異丙基；b表示數字2或3；且X和Y彼此獨立地表示O、S、＝C(CH3)2或-(CH＝CH)-。
10.權利要求1-8之一的用途，其中所述花青染料是具有通式(X)的化合物和這些化合物的鹽及溶劑合物 其中C′表示基團(XI)或(XII) 其中標有星號的位置表示與基團A′相連的點，并且C′也可以表示基團(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)或(XVII) 其中基團(XV)或(XVII)可以任選被C1-C4烷基取代，其中R1′表示C1-C4磺烷基鏈；飽和或不飽和、支鏈或直鏈C1-C50烷基鏈，其任選被0-15個氧原子和/或被0-3個羰基取代，和/或可以被0-5個羥基取代，或者任選被0-15個氧原子和/或被0-3個羰基間斷，和/或可以被0-5個羥基取代；或M′-R6′；R2′表示C1-C4磺烷基鏈；飽和或不飽和、支鏈或直鏈C1-C50烷基鏈，其任選被0-15個氧原子和/或被0-3個羰基取代，和/或可以被0-5個羥基取代，或者任選被0-15個氧原子和/或被0-3個羰基間斷，和/或可以被0-5個羥基取代；或M′-R7′；R3′、R4′、R6′和R7′彼此獨立地表示基團-COOE1′、-CONE1′E2′、-NHCOE1′、-NHCONHE1′、-NE1′E2′、-OE1′、-OSO3E1′、-SO3E1′、-SO2NHE1′或-E1′，其中E1′和E2′彼此獨立地表示氫原子、C1-C4磺烷基鏈、飽和或不飽和、支鏈或直鏈C1-C50烷基鏈，其任選被0-15個氧原子和/或被0-3個羰基間斷，和/或被0-5個羥基取代；M′表示CH2-CH2或CH2-CH2-CH2；R5′表示-Q′-CH2-R8′；Q′表示C1-C5烷基，其中C原子任選被O或S取代，或者表示 R8′表示-CO-NH-R9′-R10′、-NH-CS-NH-R9′-R10′或-NH-CO-R9′-R10′，其中R9′選自無支鏈的C2-C13烷基，其中C原子任選被O或S替代，且R10′為B或連接于B的偶聯基團的殘余部分，且b′表示數字2或3；且X′和Y′彼此獨立地表示O、S、＝C(CH3)2、＝C(C2H5)2、＝C(C3H7)2、＝C(異C3H7)2、＝C(C4H9)2或-(CH＝CH)-。
11.權利要求10的用途，其中A′表示基團(XVI)或(XVII)，其中基團(XVII)可以任選在對位被C1-C4烷基取代；C′表示基團(XII)；R1′表示M-R6′；R2′表示M-R7′；R3′、R4′、R6′和R7′彼此獨立地表示SO3H或H，條件是R3′、R4′、R6′和R7′中的至少三個為SO3H，且X′和Y′彼此獨立地表示O、S、＝C(CH3)2、＝C(C2H5)2、＝C(C3H7)2、＝C(異C3H7)2或＝C(C4H9)2，b′為3。
12.權利要求10或11的用途，其中A′表示式(XVI)的基團；M′表示CH2-CH2；且Q′表示C1-C5烷基，其中C原子任選被O或S取代。
13.權利要求10-12之一的用途，其中Q′表示C1-C5烷基。
14.權利要求10或11的用途，其中A′表示式(XVII)的基團，b′表示3，且Q′表示
15.權利要求10-14之一的用途，其中R8′表示CO-B或NH-B。
16.權利要求1-15之一的用途，其中所述小的增生性病變選自小的原發性腫瘤、初癌狀態、發育不良、化生、炎性病變、子宮內膜異位和/或眼病。
17.權利要求1-16之一的用途，用于體外診斷。
18.權利要求1-17之一的用途，其中在治療程序之前、過程中和/或之后診斷所述微轉移和/或所述小的增生性病變。
19.權利要求1-18之一的用途，其中所述微轉移和/或所述小的增生性病變的直徑小于10mm，優選小于8mm。
20.權利要求1-18之一的用途，其中所述微轉移和/或所述小的增生性病變的直徑小于6mm，優選小于5mm。
21.權利要求1-18之一的用途，其中所述微轉移和/或所述小的增生性病變的直徑小于4mm，優選小于3mm。
22.權利要求1-18之一的用途，其中所述微轉移和/或所述小的增生性病變的直徑為2.0-0.2mm。
23.權利要求1-22之一的用途，其中所述微轉移為醫原性微轉移、血源性微轉移、空腔微轉移、管腔內微轉移、淋巴轉移、局部微轉移和/或區域微轉移。
24.權利要求1-22之一的用途，其中所述初癌狀態選自皮膚的初癌狀態，尤其是光化性角化病、皮角、光化性唇炎、焦油角化病、砷角化病、x-射線角化病、鮑恩病、鮑恩樣丘疹病、惡性雀斑樣痣、硬化性苔蘚和lichenrubber mucosae；消化道的初癌狀態，尤其是粘膜紅斑、白斑、巴雷特食管、普-文綜合征、腳潰瘍、gastropathia hypertrophica gigantea、邊緣癌、腫瘤性腸息肉、直腸息肉、瓷樣膽囊；婦科初癌狀態，尤其是原位導管癌(CDIS)、宮頸上皮內瘤形成(CIN)、白斑、子宮內膜增生(III級)、外陰營養不良改變、外陰上皮內瘤形成(VIN)、葡萄胎；泌尿道初癌狀態，尤其是膀胱乳頭狀瘤病、凱拉特增殖性紅斑、睪丸上皮內瘤形成(TIN)、白斑；原位癌(CIS)；由慢性炎癥，尤其是膿皮病、骨髓炎、聚合性痤瘡、尋常狼瘡和瘺引起的初癌狀態。
25.權利要求1-22之一的用途，其中所述化生選自特發性骨髓外化生、大汗腺化生、非典型化生、自身實質性化生、結締組織化生、上皮化生、腸化生、化生性貧血、化生性骨化、化生性息肉、骨髓外化生、原發性骨髓外化生、繼發性骨髓外化生、鱗狀化生、羊膜鱗狀化生、癥狀性骨髓外化生和再生性化生。
26.權利要求1-22之一的用途，其中所述發育不良選自無汗性外胚層發育不良、前顏面發育異常、窒息性胸廓發育不良、心-手綜合征、支氣管肺發育不良、大腦發育不良、宮頸結構不良、軟骨外胚層發育不良、鎖顱發育不全、先天性外胚層發育不良、顱面骨干發育不全、顱腕跖骨發育不全、顱干骺發育不全、牙本質發育不全、骨干發育不全、外胚層發育不良、釉質發育不全、腦眼球發育不全、骺發育不全半肢畸形、多發性骨骺發育不良、點狀骨骺發育不良、上皮發育不良、面-指-生殖器發育不良、家族性頜骨纖維性結構不全、家族性白色皺襞性發育不良、肌纖維結構不良、骨纖維性結構不良、紅潤色骨發育不全、遺傳性腎-視網膜發育不良、多汗性外胚層發育不全、少汗性外胚層發育不全、淋巴細胞性胸腺發育不全、乳腺發育不良、下頜骨顏面發育不良、骨骺端發育不全、蒙迪尼發育不良、單骨型纖維結構不良、粘液上皮發育不良、多發性骺發育不全、眼耳脊椎發育不良、眼牙指發育不良、眼脊椎發育不良、牙源性發育不良、眼下頜骨發育不良、根尖周牙骨質發育不良、多骨纖維結構不良、pseudoachondroplastic脊椎骺發育不良、視網膜發育不良、眼及透明隔發育不良、脊椎骺發育不良和ventriculoradial發育不良。
27.權利要求1-22之一的用途，其中所述炎性病變由選自以下的疾病或病癥引起類風濕性關節炎、炎性腸病、感染性休克、骨質疏松癥、骨關節炎、神經性疼痛、病毒感染、細菌感染、胰島素依賴型糖尿病、非胰島素依賴型糖尿病、牙周病、再狹窄、局限性脫發、銀屑病、銀屑病關節炎、急性胰腺炎、同種異體移植物排斥、變態反應、變應性肺炎、動脈粥樣硬化、多發性硬化、惡病質、阿爾茨海默病、中風、克羅恩病、炎性腸病、缺血、充血性心力衰竭、肺纖維化、肝炎、吉-巴綜合征和系統性紅斑狼瘡。
28.權利要求1-22之一的用途，其中所述子宮內膜異位包括血源性細胞叢、空腔細胞叢、管腔內細胞叢、淋巴細胞叢、局部細胞叢和/或區域細胞叢。
29.權利要求1-22之一的用途，其中所述眼病選自沙眼、早產兒視網膜病變、糖尿病性視網膜病變、新生血管性青光眼和年齡相關性黃斑變性。
全文摘要
本發明涉及花青染料與血管發生特異性結合成分，優選與EB－D纖連蛋白特異性結合成分的綴合物用于診斷微轉移和小的增生性病變，尤其是與血管發生相關的原發性腫瘤、初癌狀態、發育不良、化生、炎性病變，例如銀屑病、銀屑病關節炎和/或類風濕性關節炎、子宮內膜異位病變和眼病的用途。
文檔編號A61K47/48GK101022835SQ200580031908
公開日2007年8月22日 申請日期2005年7月22日 優先權日2004年7月22日
發明者米夏埃爾·席爾納, 凱·利查, 彼得·豪夫, 克里斯廷·佩利茨 申請人:舍林股份公司