專利名稱：：含cmv/r-核酸構建體的抗aids疫苗的制作方法含CMV/R-核酸構建體的抗AIDS疫苗相關申請的交叉引用本申請要求了2004年7月16日提交的第60/588,378號美國臨時專利申請和同時待審的PCT申請PCT/US2004/030284(2004年9月15曰提交)和PCT/US2005/12291(2005年4月12日提交)的優先權和權益。在此引入這些申請的每一申請的全部的公開內容。
技術領域：
本申請涉及疫苗領域。更特別地，本申請涉及預防人免疫缺陷病毒(fflV)的多質粒疫苗。狄支持的致謝本公開的各個方面是用政府支持進行的。政府擁有本發明的某些權利。
背景技術：
：全世界四千多萬人被HIV-1感染并且每天估計有14，000新感染病例。自從1981年鑒定了第一例AIDS以來，超過250萬人死于HIV/AIDS(CDC，MM『及Mw6.Morto/52:1145-1148,2003;UNAIDS，2003ReportontheGlobalAIDSEpidemicExecutiveSummary,2004》全斜目關的HIV-1疫苗的開發對于控制HIV/AIDS全球流行是至關重要的。高轉錄錯誤率和頻繁重組的結合導致HIV-1病毒抹中存在顯著量的遺傳多樣性，并為選擇病毒抗原提出了挑戰。HIV遺傳性變異的其它潛在影響為每個個體內的高突變率，這為從表位特異的免疫應答中逃離的病毒創造了才幾會且為基于T細胞的疫苗途徑提出了特別挑戰(Altfield等人，丄Wra/"77:12764-12772,2002;Bhardwaj等人，MzAMW.,9:13-14，2003;Brander等人，C臟.Opz".7mm歸/,11:451-459,1999;Letvin等人，Ato.Afed,9:861-866，2003)。已探究了引起對HIV-1的有效免疫性的多種疫苗策略。在這些策略中，通過編碼HIV蛋白抗原的基因的質粒DNA的免疫法是有希望的疫苗途徑(Mascola等人，O^r.0/z>2.7mmw"o/，13:489-494,2001;Nabel，GJ.,7Vflft/M,410:1002-1007，2001)。基于基因的免疫法促進宿主細胞合成和病毒抗原的表達及細胞細胞質中生理性翻譯后加工和折疊。因此，DNA免疫法在動物模型中引起對多種免疫原的CD4+和CD8+T淋巴細胞應答(Graham，B.S.,7eu^/^/.,53:207-221，2002;Rollmanetal.,77^"11:1146-1154，2004;Barouchetal.，腸"ce,290:486-492，2000;Subbramanianetal.，F/ro/,77:10113-10118，2003;Mascolaetal.,Wra/，79:771-779，2005)。相對于其它載體輸送系統，通過DNA質粒疫苗載體輸送病毒抗原具有潛在的優點，特別是沒有抗載體免疫性。盡管許多例子顯示DNA免疫法在小鼠和非人的靈長美中存在疫苗誘導的預防(Rollmanetal.,7%er"11:1146-1154,2004;Donnellyetal.，MzZ.1:583-587，1995)，但是，其在人體內只顯示出有限的免疫原性。證實在抗原-初始型(antigen-nai've)人類中具有免疫原性的第一個DNA疫苗是由Biojecto^輸送的、表達來自惡性癡原蟲的環子孢子抗原的構建體。在此研究中，僅在效應物的體外擴張后檢測到CD8+CTL應答(Wangetal.,Sc/ewce，282:476-480,1998)。另一才艮導描述了由不同的無針注射裝置，PowdeijectTM,輸送的表達乙型肝炎表面抗原的DNA質粒在抗原-初始型人類中誘導抗體以及疫苗-特異性T細胞應答(Royetal.,F"acc/"e,19:764-778，2000)。在HIV-感染的和HIV-未感染的個體中測試(MacGregoretal.,丄/"/ec/.Zfe.，178:92-100，1998)的表達HIV-1Env和Rev蛋白的DNA質粒疫苗與不良反應不相關，但是只觀察到散在的淋巴組織增生和抗體應答(MacGregoretal.，/"/e".181:406，2000;MacGregoretal.，卻&16:2137-2143,2002)。本公開描述了疫苗組合物，該疫苗組合物通過提供對應于人免疫缺陷病毒1的多進化枝和病毒抹的重要的免疫原性表位的HIV抗原的強烈表達，引起廣語的抗HIV的免疫性。本發明的前述及其它目的、特征和優點通過參考附圖的如下詳細說明更顯而易見。概述本公開涉及編碼HIV抗原的核酸構建體。這些核酸構建體能夠引起抗HIV多種變體的免疫應答，并適于治療性(例如，預防性)給藥。在免疫原性組合物的情況下，將多種核酸組合，每一核酸編碼HIV抗原性多肽，例如，不同的HIV抗原性多肽(例如，Gag、Pol和Nef)。單個的免疫原性組合物包括編碼HIV的多進化枝和病毒林的抗原性多肽的核酸構建體，該HIV的多進化枝和病毒抹為例如Gag、Pol或Nef的多進化枝或病毒抹，或者Gag、Pol和Nef上的多進化枝或病毒林。因此，當向個體給藥時，所述組合物引起抗在人類中流行的多種進化枝或病毒抹的免疫應答。還描述了使用所述組合物的方法。這類方法包括例如，為了引起抗HIV的多種進化枝或病毒^K的免疫應答，將包括所公開的核酸構建體的組合物向個體給藥。可將所述組合物單獨地，或與另外的免疫原性組合物聯合給藥。本發明的前述及其它目的、特征和優點通過參考附圖的如下詳細說明更顯而易見。附圖的簡要說明圖l為多進化枝、多價HIV疫苗組合物的示意圖。圖2是質粒VRC4401的示意圖。圖3是質粒VRC4409的示意圖。圖4是質粒VRC4404的示意圖。圖5^t粒VRC5736的示意圖。圖6是質粒VRC5737的示意圖。圖7是質粒VRC5738的示意圖。圖8A示意表示具有不同轉錄調節序列的抗原性表達構建體。圖8B是顯示不同構建體的相對表達的Western印跡圖。鼠中CD4+和CD8+T細胞應答的條形圖。圖10A、10B和10C為說明在用具有CMV/R轉錄控制序列或CMVIE轉錄控制序列的核酸構建體免疫的小鼠中抗HIVGag、Pol和Nef抗原的相對免疫應答的條形圖。圖11A、11B和11C為說明在用不同疫苗組合物免疫的短尾猴獼猴中抗HIVGag、Pol、Nef和Env抗原的相對免疫應答的條形圖。圖12A、12B和12C為說明在使用不同疫苗組合物的短尾猴獼猴的免疫接種后，產生抗HIV免疫應答時程的條形圖。圖13為說明在用VRC-HIVDNA016-00-VP免疫的人中，通過細胞內細胞因子染色(ICS)測定的細胞免疫應答的一系列的條形圖。序列表的筒要說明SEQIDNOs:1-6分別表示VRC-HIVDNA016-00-VP質粒4401、4409、4404、5736、5737和5738。這些質粒中每一質粒是表達單一的HIV抗原性多肽的核酸構建體。SEQIDNOs:7-15表示嵌合Env質粒。SEQIDNOs:16-19表示腺病毒載體。SEQIDNOs:20-25分別表示示例性的Gag、Pol、Nef、進化枝AEnv、進化枝BEnv和進化枝CEnv多肽。SEQIDNO:26表示CMV/R轉錄調節序列。詳細說明本公開涉及適于用作預防性HIV-1疫苗的核酸構建體。相對于現有的HIV疫苗候選物，本文公開的組合物的具體實例提供了兩個顯著優點。這類組合物表現了增加的表達和免疫原性，并能夠引起抗HIV的多種趨異病毒林的免疫應答。所述疫苗包括不同核酸構建體的混合物，并被設計成產生Gag、Pol、Nef和EnvHIV-1蛋白以引起廣泛的抗人體感染中分離出的多種HIV-1亞型的免疫應答。最典型地，將所述核酸結合在質粒載體內。多質粒疫苗的示例性臨床實施方案被指定為WC-HIVDNA016獸VP。本文所公開的示例性疫苗的開發原理是將gflg、po/和"e/基因^t在分別的核酸構建體內，例如質粒，而不是具有一個產生融合蛋白免疫原的構建體，先前開發的HIV疫苗就是此種情況。在示例性實施方案中，該核酸構建體已被修飾以在體內增加免疫原性蛋白產物的產生。所述修飾包括1)改變結合在這些質粒內的啟動子和/或2)向gag基因中加入68個氨基酸(例如，在VRC4401(僅Gag蛋白)質粒中)。然而，先前的HIV疫苗質粒最通常使用巨細胞病毒(CMV)即早期啟動子以調節編碼抗原性多肽的多核苷酸序列的轉錄，在本文公開的核酸構建體中，將編碼免疫原性HIV多肽的核芬酸序列與稱為CMV/R的啟動子可操作性連4妻。該CMV/R啟動子先前在公開的第20040259825號美國專利申請中進行了描述，在此引入其全部的公開內容。只要包括對應于多進化枝和/或病毒林的抗原，本文公開的核酸構建體可結合本質上編碼任何HIV抗原性多肽的多核苷酸序列。參照共同指定為VRC-HIVDNA016-00-VP疫苗組合物的核酸構建體的具體實例，詳細地描述了該組合物。圖1中描述了此示例性實施方案。所述疫苗組合物VRC-HIVDNA016-00-VP包括6個閉環的質粒DNA大分子，VRC4401、VRC4409、VRC4404、VRC5736、VRC5737和VRC5738,該質粒DNA大分子可例如以相等濃度(mg/mL)組合。VRC4401編碼進化枝BHIV-IGag結構核心蛋白，該核心蛋白包殼病毒RNA并存在高度的保守域。VRC4409編碼進化枝B聚合酶(Pol)，其也是高度保守的，以及VRC4404編碼進化枝BNef，輔助蛋白，在天然感染中增加了強烈的抗該輔助蛋白的T細胞應答。通過引入影響蛋白酶、逆轉錄酶和整合酶活性的區域變化，將表達HIV-1Pol的DNA質粒進行了修飾以減少潛在的毒性。將在HIV-1we/基因內的豆蔻酰化位點中的兩個M酸刪除以消除I類MHC和由Nef蛋白引起的CD4+下調。未對Gag的氨基酸序列進行修飾。其它三種質粒表達來自HIV-1的三種病毒抹，VRC5736(進化枝A)、VRC5737(進化枝B)和VRC5738(進化枝C)的修飾的、截短的包膜糖蛋白(g/ol45)的合成形式。用于產生編碼Env的DNA質粒的序列源于病毒的三種HIV-1CCR5趨向的病毒4朱。已將這些基因修飾以改進免疫原性，這已在小鼠和猴子中證實。將所述疫苗設計為對廣泛的HIV-1病毒抹引發免疫應答。在特別實例中，含Gag、Pol、Nef和Env互補DNA(cDNAs)的質粒用于將相關插入片段亞克隆在質粒DNA表達載體內，該載體使用CMV/R啟動子和牛生長激素多腺苷酸化序列。使用序列合成產生了表達HIV-1基因的所有質粒，從而增加基因表達，該序列是為通過使用通常在人中發現的密碼子破壞限制蛋白表達的病毒RNA結構而設計的。用1型人T-細胞白血病病毒(HTLV-1)長末端重復(LTR)的5'-非翻譯HTLV-lR-U5區替代CMV即早期區1增強子的翻譯增強子區，以進一步優化基因表達。通常在含卡那霉素選擇性培養基的細菌細胞培養中產生所述DNA質粒。在所有這類情況中，細菌細胞生長都依賴于由該質粒DNA的一部分編碼的耐卡那霉素蛋白的細胞表達。在含有所述質粒的細菌細胞生長后，/人細胞組分中純化出該質粒DNA。在特別實例中，所述Gag質粒(VRC4401)為5886個核苷酸對長度并具有約3.9MDa的分子量；所述Pol質粒(VRC4409)為7344個核苷酸對長度并具有約4.8MDa的分子量；所述所述進化枝A、B和CEnv質粒(VRC5736、5737和5738)分別為6305、6338和6298核香酸長度，并均具有約4.2MDa的分子量。因此，本公開一方面涉及能夠引起抗HIV的免疫應答的組合物。例如，當單獨或與至少一種另外的免疫原性組合物聯合給藥時，本公開的組合物能夠引起抗HIV的保護性免疫應答。本領域內的技術人員應當理解暴露于抗原后產生免疫應答的能力是復雜的細胞和體液處理的作用，并且不同的個體具有不同的對免疫刺激應答的能力。據此，本文公開的組合物能夠在免疫活性個體中引起免疫應答，即該個體通過產生基本正常的免疫應答，在生理上能夠對免疫刺激進行應答，例如，該免疫應答包括產生特異性地與該免疫刺激相互作用的抗體，和/或產生具有特異性地與該免疫刺激相互作用的受體的功能性T細胞(CD4+和/或CD8+T細胞)。還應理解，有HIV感染的特殊作用是使先前的免疫活性個體免疫缺陷。因此，關于如下討論的治療方法，通常期望的是在暴露于HIV之前將所述組合物向個體給藥(即，預防性，例如，作為疫苗)或者是暴露于HIV后某一時間的治療性的給藥，但是在此期間，該個體能夠對諸如抗原性多肽的刺激產生免疫應答。所述組合物包括多種(即兩種、三種、四種、五種、六種或甚至更多種)不同的核酸構建體。通常存在該不同核酸構建體中每一個核酸構建體的多拷貝。不同核酸構建體中每一核酸構建體包括編碼HIV抗原性多肽的多核苦酸序列，該多核芬酸序列與能夠在系統或局部給藥后在個體細胞內指引其表達的轉錄調節序列可操作性地連接。在所述核酸構建體中，包括編碼mv的多于一種(多種)進化枝或病毒抹的抗原性多肽的多核苷酸序列。因此，所述組合物包括多種核酸構建體，多種核酸構建體中至少兩種引入了編碼來自不同進化枝或病毒抹的HIV抗原性多肽的多核苷酸序列。通常，所述組合物包括編碼來自至少三種不同進化枝或病毒株的HIV抗原性多肽的核酸構建體。在一實施方案中，所述組合物包括多種單獨的核酸構建體，每一核酸構建體包括與CMV/R轉錄控制序列可操作性連接的編碼HIV抗原性多肽的多核苷酸序列。在一實例中，所述CMV/R轉錄控制序列具有SEQIDNO:26的序列。在另一實施方案中，所述組合物包括多種單獨的核酸構建體，每一核酸構建體包括編碼單一的HIV抗原性多肽的多核苷^列。在某些實施方案中，所述核酸構建體為質粒。所述組合物通常包括含有編碼HIVGag多肽的多核苷酸序列的第一核酸構建體、含有編碼HIVPol多肽的多核苷酸序列的第二核酸構建體，含有編碼HIVNef多肽的多核香酸序列的第三核酸構建體，和含有編碼HIVEnv多肽的多核苦酸序列的至少一種另外的核酸構建體。所述組合物還可包括一種或多種另外的含有編碼不同HIV進化枝或病毒抹的Env多肽的多核苷^列的核酸構建體。例如，所述第一核酸構建體能夠包括編碼進化枝BGag多肽的多核苷酸序列，第二核酸構建體能夠包括編碼進化枝BPol多肽的多核苷IM^列，以及第三核酸構建體能夠包括編碼進化枝BNef多肽的多核苷^列。或者，第一、第二和第三核酸構建體能夠包括編碼諸如進化枝A或進化枝C等等不同進化枝的Gag、Pol和Nef多肽的多核香酸序列。例如，所述組合物可包4舌如下核酸構建體包含編碼與SEQIDNO:20具有至少約95%序列同一性的Gag多肽的多核苷酸序列的核酸構建體；包含編碼與SEQIDNO:21具有至少約95%序列同一性的Pol多肽的多核苷酸序列的核酸構建體和/或包含編碼與SEQIDNO:22具有至少約95%序列同一性的Nef多肽的多核苷酸序列的核酸構建體。在一實施方案中，所述免疫原性組合物包括具有編碼SEQIDNO:20的Gag多肽的多核苷酸序列的第一核酸構建體，具有編碼SEQIDNO:21的Pol多肽的多核苷酸序列的第二核酸構建體，和具有編碼SEQIDNO:22的Nef多肽的多核苷酸序列的第三核酸構建體。例如，所述組合物可包括如下核酸構建體包含與SEQIDNO:1的第1375-2883位具有至少95%序列同一性的多核普酸序列的核酸構建體；包含與SEQIDNO:2的第1349-4357位具有至少95%序列同一性的多核苷酸序列的核酸構建體和/或包含與SEQIDNO:3的第1392-2006位具有至少95%序列同一性的多核香酸序列的核酸構建體，或具有通過一個或多個簡并密碼子的替代與該提及序列不同的多核苷酸序列。在一實施方案中，所述組合物包括由SEQIDNO:l、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3(質粒VRC4401、VRC4409和VRC4404)表示的核酸構建體，或與其具有至少95%序列同一性的構建體。另外，所述組合物可包括編碼來自不同進化枝或病毒抹的Env多肽的多種核酸構建體。例如，該組合物能夠包括含有編碼進化枝AEnv多肽的多核苷酸序列的第一另外的核酸構建體，含有編碼進化枝BEnv多肽的多核香酸序列的第二另外的核酸構建體和含有編碼進化枝CEnv多肽的多核苷酸序列的第三另外的核酸構建體。通常，因為進化枝A、B和C共同地在世界范圍內的HIV感染中占最高比例，所以使用進化枝A、進化枝B和進化4支CEnv多肽。4旦是，本領域4支術人員應理解可產生包含來自HIV進化枝或病毒抹的任意組合的Env多肽的組合物。在某些實施方案中，所述免疫原性組合物包括如下核酸構建體含有編碼與SEQIDNO:23有至少95。/。序列同一性的進化枝AEnv多肽的多核苷酸序列的第一另外的核酸構建體；含有編碼與SEQIDNO:24有至少95%序列同一性的進化枝BEnv多肽的多核香酸序列的第二另外的核酸構建體；和/或編碼與SEQIDNO:25有至少95%序列同一性的進化枝CEnv多肽的多核苷酸序列的第三另外的核酸構建體。在一實施方案中，所述組合物包括如下核酸構建體具有編碼SEQIDNO:23的進化枝AEnv多肽的多核普酸序列的第一另外的核酸構建體；具有編碼SEQIDNO:24的進化枝BEnv多肽的多核苷酸序列的第二另外的核酸構建體；和具有編碼SEQIDNO:25的進化枝CEnv多肽的多核苷酸序列的第三另外的核酸構建體。例如，所述免疫原性組合物能夠包括如下核酸構建體與SEQIDNO:4的第1392-3272位具有至少約95%同一性的多核芬酸序列的核酸構建體；與SEQIDNO:5的第1384-3312位具有至少約95%同一性的多核苷酸序列的核酸構建體和/或與SEQIDNO:6的第1392-3272位具有至少約95%同一性的多核苷酸序列的核酸構建體。在一實施方案中，所述免疫原性組合物包括SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核酸構建體(分別為質粒VRC5736、5737和5738)，或具有至少95%序列同一性的構建體，或通過簡并密碼子的替代與該提及序列不同的構建體。因此，在某些實施方案中，所述免疫原性組合物包括具有編碼Gag多肽的多核苷酸序列的第一核酸構建體、具有編碼Pol多肽的多核苦*列的第二核酸構建體、具有編碼Nef多肽的多核苷酸序列的第三核酸構建體、具有編碼進化枝AEnv多肽的多核苷酸序列的第四核酸構建體、具有編碼進化枝BEnv多肽的多核苷酸序列的第五核酸構建體和具有編碼進化枝CEnv多肽的多核苷酸序列的第六核酸構建體。在一這種實施方案中，第一核酸構建體編碼與SEQIDNO:20具有至少95%序列同一性的多肽，第二核酸構建體編碼與SEQIDNO:21具有至少95%序列同一性的多肽；第三核酸構建體編碼與SEQIDNO:22具有至少95%序列同一性的多肽；第四核酸構建體編碼與SEQIDNO:23具有至少95%序列同一性的多肽；第五核酸構建體編碼與SEQIDNO:24具有至少95%序列同一性的多肽和第六核酸構建體編碼與SEQIDNO:25具有至少95%序列同一性的多肽。在實施方案中，所述免疫原性組合物包括6種核酸構建體，其中一種或多種核酸構建體與SEQIDNO:l的第1375-2883位；SEQIDNO:2的第1349-4357位;SEQIDNO:3的第1392-2006位；SEQIDNO:4的第1392-3272位；SEQIDNO:5的第1384-3312位和SEQIDNO:6的第1392-3272位具有至少95%同一性。例如，所述組合物能夠包括具有SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的多核苷酸序列的6種核酸構建體(分別位質粒VRC4401、VRC4409、VRC4404、VRC5736、VRC5737和VRC5738)，或具有至少95%序列同一性的構建體，或通過簡并密碼子的替代與所提及序列不同的構建體。當在免疫原性組合物中被組合時，所述核酸構建體可以基本相等的重量比(大約1:1:1:1:1:1的比例)組合。在某些情況中，所述組合物包括核酸構建體，每一該構建體編碼單一進化枝或病毒抹的HIV抗原性多肽。在其它情況中，包括引入編碼嵌合Env多肽的多核苷酸序列的核酸構建體是有用的。因此，在某些實施方案中，所述核酸構建體可編碼與SEQIDNOs:7-15之一編碼的多肽具有至少95。/。同一性的嵌合Env多肽。通常，當組方向個體給藥時，所述組合物還可包括藥物可接受的載體或賦形劑，例如，水性載體，如磷酸鹽緩沖液(PBS)或其它中性的生理鹽溶液。所述組合物還可包括佐劑或其它免疫刺激性分子。所述組合物可一次或多次向個體給藥以引起免疫應答。例如，所述組合物可每隔至少約28天或如邏輯關系或治療關系所指示的在不同間隔時多次給藥。因此，本乂^開的特征包括用于HIV感染的治療性或預防性治療的藥物組合物或藥物。還特別地關注本文/>開的組合物在用于HIV感染的治療性或預防性治療的藥物的制備中的用途。上文公開的關于組合物的任何限制或制劑適用于其用于或作為治療HIV感染的藥物。本公開的另一方面涉及通過將上述的組合物向人類個體給藥來引起抗HIV的免疫應答的方法。當向免疫活性給體給藥時，所述組合物能夠引起抗HIV的多種進化枝或病毒林的免疫應答。例如，在一實施方案中，所述方法涉及將包括多個不同核酸構建體的組合物給藥，每一該核酸構建體包括與CMV/R轉錄控制序列可操作地連接的編碼HIV抗原性多肽的多核苷酸序列。在另一實施方案中，所述方法涉及將包括多個不同核酸構建體的組合物給藥，每一該核酸構建體包括編碼單一的HIV抗原性多肽的多核苷酸序列。在某些實施方案中，所給藥的核酸構建體是質粒。的確，任一上述組合物在本文公開的方法中均適于向人類個體給藥。可將一個劑量或多個劑量的所述組合物向個體給藥以引起具有所要特征的免疫應答，該免疫應答包括產生HIV特異性抗體、或產生與HIV反應的功能性T細胞。在某些實施方案中，將所述組合物肌肉內給藥，例如釆用無針輸送裝置給藥。或者，可將所述組合物通過諸如靜脈內、經皮膚、鼻內、口服(或通過其它粘膜)的其它途徑給藥。在一些實施方案中，所述方法還涉及將編碼HIV抗原性多肽的病毒載體給藥或者與一種或多種已述的核酸構建體聯合給藥。在某些情況中，該病毒載體是腺病毒載體(例如復制缺陷型腺病毒載體)。例如，可將一個劑量或多個劑量的"引發劑"組合物(如上述公開的)向個體給藥，隨后將一個劑量或多個劑量的包括編碼HIV抗原性多肽的多種腺病毒載體在內的"加強劑"組合物給藥。在某些實施方案中，所述腺病毒載體編碼一種或多種的與該引發劑組合物中前給藥的HIV抗原性多肽是完全相同的HIV抗原性多肽。示例性重組腺病毒載體如SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18和SEQIDNO:19所示。當然，還可使用可替代的腺病毒載體，例如編碼與這些序列之一編碼的多肽有至少約95%序列同一性的多肽的腺病毒載體，或與這些序列之一享有至少約95%序列同一性的腺病毒載體。在另一方面，;^/>開關注分離的或重組的核酸，該核酸包括與CMV/R轉錄調節序列可操作地連接的編碼HIV抗原性多肽的多核苷酸序列。例如，這種核酸可以是質粒或病毒載體。該多核芬酸序列可編碼HIVGag多肽、HIVPol多肽、HIVNef多肽或HIVEnv多肽。在一些實例中，所述核酸構建體編碼的HIV多肽只是分離的或重組的核酸編碼的HIV抗原。這些核酸編碼的示例性多肽由SEQIDNOs:20-25表示，并包括與SEQIDNOs:20-25氨基酸序列具有至少95%同一性的序列。例如，這種核酸可包括與SEQIDNO:l的第1375-2883位；SEQIDNO:2的1349-4357位；SEQIDNO:3的1392-2006位；SEQIDNO:4的1392-3272位；SEQIDNO:5的1384-3312位或SEQTDNO:6的1392-3272位具有至少95%同一性的多核苷酸序列，可將任一序列與CMV/R轉錄調節序列操作地連接。例如，該CMV/R轉錄控制序列可以與SEQIDNO:26具有至少95%序列同一性、這類核酸的示例性實施方案包括分別由SEQIDNOs:l-6表示的質粒VRC4401、VRC4409、VRC4404、VRC5736、VRC5737和VRC5738。在其它實施方案中，所述核酸包括編碼引入多種HIV進化枝或病毒抹的至少一個亞序列的嵌合HIV多肽的多核苷酸序列。例如，該嵌合HIV多肽可以是包括不同HIV進化枝或病毒抹的亞序列在內的嵌合Env多肽。這類核酸的實例包括SEQIDNOs:7-15，以及基本上類似的多核芬酸序列，例如與SEQIDNOs:7-15之一具有至少約95。/o序列同一性的序歹'J，或一個或多個簡并密碼子已相互替代的多核苷酸序列。或者，所述核酸可包括與轉錄調節序列而不是與CMV/R轉錄調節區(例如，CMV即早期啟動子增強子或如下討論的其它啟動子和/或強化劑增強子)可操作地連接的編碼嵌合HIVEnv多肽的多核苷酸序列。嵌合Env多肽也是本^開的特征。在下文具體的主題標題中提供了另外的技術細節。為了更容易地理解本/>開的多種實施方案，提供具體術語的下列解釋。術語除非另有解釋，本文所用的所有技術術語和科學術語具有與本公開所屬領域內普通技術人員通常所了解的含意相同的含意。在分子生物學中普通術語的定義可在BenjaminLewin,GenesV，由OxfordUniversityPress出版，1994(ISBN0-19-854287-9);Kendrew等人(eds.),五"cyc/o/7ec^'ao/A/o/ecw/ar5z'o/ogy，由BlackwellScienceLtd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9);和RobertA.Meyers(ed.),Mo/ecw/w5z'o/ogy5z'ofecAwo/ogy.,aCompreAe"w'veZ>esA:及^rewce，由VCHPublishers,Inc.出版，1995(ISBN1-56081-569-8)中找到。單數的術語"a"、"an"和"the"除非上下文清楚地表示否則包括復數指示物。相似地，詞語"或者"除非上下文清楚地表示否則應包括"和"。術語"多個"指兩個或更多。還應理解給定的核酸或多肽的所有堿基大小或氨基酸大小以及所有的分子量或分子質量值是近似值，且提供用于描述。盡管可在本公開的實踐或試驗中使用相似的或等同于本文所描述的方法和材料，下文描述了適合的方法和材料。術語"包含"是指"包括"。縮略語"e.g.(如)"是源于拉丁語exem///gra"'a(例如)，并本文用于表示非限制性例子。因此，縮略語"如"是與術語"例如"是同義的。為了更容易的評述本公開的多種實施方案，提供特殊術語的下列解釋佐劑用于增強抗原性的介質(vehicle);例如抗原被吸附在其上的礦物(明礬、氫氧化鋁、-岸酸鋁)的混懸液；或油包水型乳液，其中抗原溶液被乳化于油中(MF-59，弗氏不完全佐劑)，有時包括被殺死的分枝桿菌(弗氏完全佐劑)以進一步增強抗原性(抑制抗原的降解和/或引起巨噬細胞的流入)。佐劑還包括免疫刺激性分子，如細胞因子、共刺激分子，和例如免疫刺激性DNA或RNA分子，如CpG寡核苷酸。抗原可在動物體內刺激抗體產生或T細胞應答的化合物、組合物或物質，包括被注入、吸收或引入動物體內的組合物。術語"抗原"包括所有相關的抗原表位。"抗原性多肽，，是可刺激諸如T細胞應答或抗體應答的免疫應答的多肽。"表位"或"抗原決定簇"指B細胞和/或T細胞應答的在抗原上的位點。在一實施方案中，當表位以與MHC分子連同存在時，T細胞對該表位應答。表位可由連續氨基酸或由通過抗原性多肽的三級折疊并列的非連續氨基酸形成。暴露于變性溶劑時，由連續氨基酸形成的表位通常能夠保留，而用變性溶劑處理時，通常失去通過三級折疊形成的表位。表位通常包括以獨特的空間構象存在的至少3個氨基酸、且更通常包括至少5個、約9個或約8-10個氨基酸。測定表位的空間構象的方法包括，例如，x-射線衍射晶體分析法和多維核磁共振光譜法。抗體免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特異性結合抗原(與抗原免疫應答)的抗原結合部位的分子。天然存在的抗體(例如，IgG、IgM、IgD)包括四個多肽鏈，通過二硫4建互連的兩個重鏈(H)和兩個輕鏈(L)。短語"抗體應答"指抗抗原的免疫應答，包括分泌對抗原特異的抗體。抗體應答是通過抗原(或表位)與B細胞表面上的B細胞受體(膜結合的IgD)相互作用開始的B細胞介導的免疫應答。B細胞受體被其同源抗原刺激并結合后，該B細胞分化為分泌抗原特異性免疫球蛋白以產生抗體應答的漿細胞。"中和抗體"是結合病毒上的表位來例如在噬菌斑中和分^f中測定的抑制感染和/或復制的抗體。cDNA(互補DNA):缺乏內在的非編碼區段(內含子)和決定轉錄的調節序列的一類DNA。cDNA通常在實驗室中由從細胞中提取的信使RNA通過反轉錄來合成。在制備包括編碼HIV抗原性多肽的多核苷酸序列在內的核酸構建體的上下文中，可例如由HIVRNA基因組(或基因組片斷)通過反轉錄或擴增(例如，通過聚合S^I反應，PCR)來制備cDNA。宿主細胞細胞，可在其中繁殖諸如多核普酸載體或病毒載體的多核苷酸并表達其DNA。該細胞可以是原核的或真核的。該術語還包括個體宿主細胞的任何子代。應理解所有子代可以不與其親代細胞完全相同，因為在復制過程可發生突變。但是，當使用術語"宿主細胞"時包括這種子代。因此，可將本文描述的核酸構建體引入宿主細胞內，在該宿主細胞中可表達其多核香酸序歹'J(包括編碼HIV抗原性多肽的多核苦^*列)。免疫應答諸如B細胞、T細胞或單核細胞的免疫系統細胞對刺激的應答。在某些情況下，該應答對特定抗原是特異的(即，"抗原特異性應答")。在某些情況下，免疫應答是T細胞應答，如CD4+應答或CD8十應答。或者，該應答是B細胞應答，并導致特異抗體的產生。"保護性免疫應答"是抑制病原體(如HIV)的有害功能或活性、減少由該病原體引起的感染，或減輕因感染該病原體引起的癥狀(包括死亡)的免疫應答。可例如通過空斑減少分析或ELISA中和分析(NELISA)中抑制病毒復制或空斑形成，或通過在實驗性系統中體內測定對病毒激發的抵抗力來測定保護性免疫應答。免疫原性組合物包含病原生物的至少一種表位的組合物，當給予免疫活性個體時，其i秀導可測的CTL反應，或i秀導可測的B細胞應答(例如，產生特異性結合該表位的抗體)，或者誘導兩者。因此，免疫原性組合物為能夠在免疫活性個體中引起免疫應答的組合物。例如，免疫原性組合物可以包括編碼HIV抗原性多肽的一個或多個免疫原性表位的分離的核酸構建體(例如質粒或病毒載體)，該HIV抗原性多肽可用來表達表位(并因此可以用于引起抗該多肽或由病原體表達的相關多肽的免疫應答)。對于體外應用，所述免疫原性組合物可由分離的核酸、蛋白質或肽組成。對于體內應用，所述免疫原性組合物通常包括在藥物可接受的載體或賦形劑和/或諸如佐劑的其它試劑中表達免疫原性抗原表位的核酸或病毒。可通過本領域公認的分析容易地測試免疫原性多肽(例如HIV抗原)或編碼該多肽的核酸的誘導CTL或抗體應答的能力。藥物可接受的載體和/或藥物可接受的賦形劑所用的藥物可接受的栽體或賦形劑是常規的。E.W.Martin的及em/wgtow，s尸/^rmflcew"ca/Sde"cas(雷明頓制藥學)，MackPublishingCo.,Easton，PA,第15版(1975)描述了適用于本文所公開的多肽和多核苷酸的藥物輸送的組合物和制劑。一般而言，所述載體的性質依賴于所使用的特殊給藥方式。例如，腸胃外給藥制劑經常包含可注射的液體，該可注射的流體包括藥物及生理可接受的液體，例如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、葡萄糖水溶液、甘油或其它類似物作為介質。對于固體組合物(例如粉劑、丸劑、片劑或膠嚢形式)，常規的無毒固體載體包括，例如藥品級的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸鎂。除了生物中性的載體外，欲給藥的藥物組合物可以包含小量的無毒輔料，例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑，及pH緩沖劑等等，例如醋酸鈉或山梨醇單月桂酸酯。"治療有效劑量"是用于在個體內達到預期效應的組合物的量。例如，可以為抑制病毒(或其它病原體)復制，或預防或可測定地改變病毒(或其它病原體)感染的外在癥狀的所必需的組合物量。當向給體給藥時，通常使用達到靶組織濃度(例如，在淋巴細胞中)的劑量，該劑量已表現出獲得體外作用。抑制或治療疾病抑制HIV感染指抑制由暴露于人類免疫缺陷病毒引起的疾病的全部發展。例如，抑制HIV感染指減輕由于感染該病毒而產生的癥狀，例如在已知已暴露于該病毒的人中預防癥狀的發展，或在暴露于該病毒的個體中減少病毒負載或病毒感染。"治療"指改善或抑制或避免與個體感染了病毒相關的疾病或病理學狀態的病征或癥狀的治療性或預防性干預。個體活的多細胞脊推動物生物，包括人和獸醫學個體的種類，包括人和非人類動物。在關于HIV的臨床情況中，個體通常是人。免疫活性個體通常是能夠對抗原刺激產生基本正常的免疫應答的個體。T細胞對免疫應答至關重要的白細胞。T細胞包括，但不限于CD4+T細胞和CD8+T細胞。CD4+T淋巴細胞是在其表面上攜帶稱為CD4的標記的免疫細胞，例如"輔助"T細胞。這些細胞液稱為輔助T細胞，幫助編排包括抗體應答和殺傷性T細胞應答在內的免疫應答。CD8+T細胞攜帶CD8標記，并包括具有細胞毒性功能或"殺傷性"效應子功能的T細胞。轉導或轉染轉導細胞是例如通過分子生物技術已將核酸分子引入其內的細胞。如本文所用，術語引入或轉導包括可將核酸分子引入這類細胞的所有技術，該技術包括用質粒載體進行轉化，用病毒載體進行轉染和通過電穿孔術、脂質轉染法和基因槍加速來引入棵露DNA。疫苗疫苗是在個體內引起預防性或治療性免疫應答的藥物組合物。在某些情況中，該免疫應答是保護性免疫應答。通常，疫苗引起對病原體抗原的抗原特異性免疫應答。在本公開的上下文中，所述疫苗引起抗HIV的免疫應答。本文描述的疫苗包括編碼HIV抗原的諸如質粒或病毒栽體的核酸構建體。栽體引入宿主細胞內的核酸分子，從而產生被轉化的宿主細胞。載體可包括允許其在宿主細胞內復制的核酸序列，如復制起始區。載體還可包括在一種或多種可選擇的標記基因和本領域內公知的其它遺傳元件。術語栽體包括質粒、線性核酸分子和諸如腺病毒載體和腺病毒的病毒載體。術語腺病毒載體本文用來指包括在宿主細胞內產生病毒顆粒的腺病毒的一種或多種組分的核酸。這種顆粒可以能夠感染和復制一輪或多輪或可以是例如由突變引起的復制缺陷。腺病毒包括編碼至少一部分組裝病毒的核酸。因此，在許多情況下，該術語可互換使用。編碼HIV抗原的核酸構建體本公開關注包括編碼人免疫缺陷病毒-1("HIV-1"或簡言之"HIV")抗原性多肽的多核苷酸序列的核酸構建體。術語多核苷酸或核酸序列指至少IO個堿基長度的核苷酸的聚合形式。所述核苷酸可以是核糖核普酸、脫氧核糖核苷酸或任一種核苷酸的修飾形式。該術語包括單鏈或雙鏈形式的DNA。在本乂>開中，該核酸構建體是"重組"核酸。重組核酸是具個在5'端及一個在3'端)。通常通過化學合成，或更通常地例如通過基因工程技術將分離的核酸片斷進行人工操作來實現人工重組。在某些情況中，所述核酸是"分離的，，核酸。"分離的"核酸(以及類似地，分離的蛋白)已從天然存在該核酸的生物體細胞中其它生物組分中基本上分離或純化，該其它生物組分例如其它染色體的和染色體外的DNA和RNA、蛋白質和細胞器。已被"分離的"核酸和蛋白質包括通過標準純化方法純化的核酸和蛋白。該術語還包括通過在宿主細胞內重組表達制備的核酸和蛋白以及化學合成的核酸。"HIV抗原性多肽"或"HIV抗原"可包括能夠在免疫活性的哺乳動物體內引起免疫應答的任何蛋白質HIV分子或其部分。"HIV分子"是人免疫缺陷病毒的一部分的分子，由人免疫缺陷病毒的核酸序列進行編碼，或衍生于或合成性地基于任一這類分子。編碼引起免疫應答的HIV抗原的核酸的給藥優選地導致抗HIV的保護性免疫。在這點上，對HIV的"免疫應答"是對任何一種或多種HIV抗原的免疫應答。合適的HIV抗原的實例包括所有的或部分的HIVGag、Pol、Nef或Env蛋白。在該病毒中，Gag蛋白是病毒衣殼的組分。Pol多蛋白提供了逆轉錄酶(RT);整合酶(IN)和蛋白酶(PR)功能，其將病毒RNA反轉錄為整合在宿主細胞的染色體內的雙鏈DNA,并分別將gag-pol衍生的蛋白剪切成功能性多肽。Nef多肽是參與確定該病毒感染后的病原性的負調節因子。Env蛋白是參與將病毒附著并融合進靶細胞的包膜蛋白。本領域內技術人員理解可改變多肽的功能性性質(例如，刪除)，而未改變該多肽的抗原性質。每一Gag、Pol、Nef或Env的免疫原性變體或片段也是可包括在本文公開的免疫原性組合物內的HIV抗原性多肽。免疫原性變體包括例如與SEQIDNOs:20-25具有至少90%、95%或98%序列同一性的變體，或其免疫原性片段。本文公開的核酸疫苗可包括SEQIDNOs:1-19、或者編碼SEQIDNOs:20-25所示的HIV抗原或與SEQIDNOs:20-25具有至少90%、95%或98%序列同一性的HIV抗原的序列。合適的Env蛋白是本領域內公知的，并包括，例如gpl60、gpl20、gp41和gpl40。HIV的任何進化枝對抗原選擇是恰當的，包括HIV進化枝A、B、C等等。因此，應理解以下HIV抗原的任意一種或者組合可用在所發明的方法中HIV進化枝Agpl40、Gag、Pol、Nef和/或Env;HIV進化枝Bgpl40、Gag、Pol、Nef和/或Env蛋白；以及HIV進化枝Cgpl40、Gag、Pol、Nef和/或Env蛋白。盡管詳細描述了關于Gag、Pol、Nef和/或Env蛋白的所述組合物和方法，但是能夠在哺乳動物體內誘導免疫應答的任何HIV蛋白或其部分可用在所發明的方法中。來自HIV進化枝A、B、C的HIVGag、Pol、Nef和/或Env蛋白以及編碼這類蛋白的核酸序列以及操作和將這類核酸序列插入載體的方法是公知的(參見，侈寸:i口,HIVSequenceCompendium,DivisionofAIDS,NationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseases,2003,HIVSequenceDatabase(在世界范圍的網i止是hiv國web.lanl.gov/content/hiv-db/mainpage.html)，Sambrook等人，Mo/ecw/wC/om'"g,aZaZorato^Ma聰a/(分子克隆，實-驗手冊)，第二版，ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1989，和Ausubel等人，CWre"Z尸rotoco/sz>z5z'o/ogy(分子生物學的當前方案)，GreenePublishingAssociatesandJohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.,1994》Gag、Pol、Nef和Env多肽序列在本領域內是^厶知的，且多數氛基酸序列可從公眾易接近的諸如GENBANK⑧的數據庫中獲得。例如，對應鏈HXB2的氨基酸序列的Gag多肽由GENBANK⑧登錄號K03455序列表示。對應鏈NL4-3的氨基^列的Pol和Nef多肽由GENBANK⑧登錄號M19921表示。示例性Env多肽，例如，對應進化枝A、B和C的Env多肽分別由ENBANK⑧登錄號U08794、K03455和AF286227表示。由本文公開的核酸構建體編碼的特定的示例性序列由SEQIDNOs:20-25表示，分別對應Gag、Pol、Nef、進化枝AEnv、進化枝BEnv和進化枝CEnv。這些示例性多肽的某些多肽已被功能修飾(如在實施例中進一步詳細表明)但是仍保留了天然存在蛋白的重要的抗原特性。不需要全部的、完整的HIV蛋白產生免疫應答。實際上，HIV蛋白的大多數抗原表位在大小上相對較小。因此，HIV蛋白的片段(例如，表位或其它抗原片段)，例如本文公開的HIV蛋白的任何片段可用作HIV抗原。HIVGag、Pol、Nef和/或Env蛋白的抗原片段和表位以及編碼這類抗原片段和表位的核酸序列是公知的(參見，例如，HIVImmunologyandHlV/SrVVaccineDatabases(HIV免疫學和HIV/SIV疫苗數據庫)，第一巻，DivisionofAIDS,NationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseases,2003)。當引入在構建體內的多核苦酸序列包括一個或多個開放閱讀框時，則認為該核酸構建體"編碼"抗原，當該開放閱讀框被細胞轉錄和翻譯過程識別和活化時，其產生組成該抗原的氨基酸序列。如果HIV抗原包含不同的抗原性M酸序列，則它們是"不同的"。當提及多種不同的HIV抗原時，兩種或多種不同的HIV抗原可以是任何HIV抗原，如兩種或多種(或三種、或四種、或五種、或六種、或更多種)本文/>開的HIV抗原。不同的HIV抗原性多肽可以是兩種或多種來自不同HIV蛋白的抗原性多肽，該HIV蛋白是由HIV基因組中的不同基因編碼的蛋白(例如，HIVGag多肽與HIVPol多肽不同，其與HIVNef多肽不同，其還與HIVEnv多肽不同)。因此，Gag、Pol、Nef和Env是不同的HIV蛋白或抗原性多肽。或者，如果不同的HIV抗原性多肽是由來自HIV的不同病毒抹或進化枝的同源基因組區段(或基因)編碼，則該HIV抗原性多肽是不同的。因此，進化枝AEnv多肽與進化技BEnv多肽不同，與進化枝CEnv多肽不同等等。關于本文公開的免疫原性(例如，疫苗)組合物，兩個或多個不同的HIV抗原包括來自兩種或多種不同的HIV進化枝或病毒抹的HIV抗原，例如來自三種或多種不同的HIV進化枝(例如，進化枝A、B和C)或來自同一進化枝的兩種或多種變體HIV病毒株。與將哺乳動物的免疫系統暴露于僅僅單一的HIV抗原中相比，將該免疫系統暴露于不同HIV抗原的"雞尾酒"中可引起更廣泛的和更有效的免疫應答。因此，多種單獨的核酸構建體可包括相同進化枝或病毒林(例如，全部為進化枝B)的多種編碼的多肽或不同進化枝或病毒;^朱的(例如，一些為進化枝A的，另一些為進化枝B的)編碼的多肽，每一該核酸構建體包含編碼單一的HIV抗原性多肽的多核普酸序列，其中該多個核酸構建體編碼多種抗原性多肽或多種HIV進化枝或病毒抹。在一些特別公開的實施方法案種，所述組合物包括多種不同的核酸構建體。該核酸構建體包括與轉錄控制序列可操作地連接的編碼單一的(不超過一次)HIV抗原的多核苷酸序列，以及該單一的HIV抗原對于不同的核酸構建體是不同的。在特別實例中，該不同核酸構建體的不同的單一HIV抗原是相同進化枝或病毒抹的不同的編碼的多肽，但是還可包含由不同構建體表達的、與共享相同進化枝或病毒株的編碼的多肽不同的進化枝或病毒抹的不同的編碼的多肽。例如，編碼相同進化枝或病毒抹的HIV抗原的不同核酸構建體可以是分別編碼Gag、Pol和Nef的三種單獨的構建體，該Gag、Pol和Nef作為僅由每一該構建體表達的HIV抗原，且每一Gag、Pol和Nef是相同進化枝或病毒林的(例如，所有為進化枝B的)。另外，在一些實施方案中，所述組合物還可包括編碼不同進化枝或病毒抹的Env抗原的多個單獨的核酸構建體。例如，至少三個單獨的構建體獨立地編碼作為其僅有的被編碼的HIV抗原的進化枝AEnv、進化枝BEnv和進化枝CEnv。例如，核酸構建體可包含編碼單一HIV抗原性多肽的多核苷酸序列。在本文提供的具體實例中，所述核酸構建體編碼單一的Gag多肽，單一的Pol多肽、單一的Nef多肽或單一的Env多肽。例如，所述核酸構建體可包含編碼諸如進化枝BGag多肽(例如，SEQIDNO:20的氨基酸序列)的單一的Gag多肽的多核香酸序列；編碼諸如進化枝BPol多肽(例如，SEQIDNO:21)的單一的Pol多肽的多核苷酸序列；編碼諸如進化枝BNef多肽(例如，SEQIDNO:22)的單一的Nef多肽的多核苦酸序列；或編碼諸如進化枝A、進化枝B或進化枝CEnv多肽(例如，SEQIDNO:23、SEQIDNO:24和SEQIDNO:25)的單一的Env多肽的多核苷酸序列。編碼這些多肽的示例性核酸構建體分別由SEQIDNOs:1-6表示。可選擇地，核酸構建體可包括編碼HIV抗原性多肽的多核苷酸序列，該HIV抗原性多肽包含多種進化枝或病毒;f朱的亞序列，即為"嵌合的"HIV多肽。嵌合的HIV抗原性多肽可包括兩種或多種進化枝或病毒株的亞序列，例如三種或更多種不同的進化枝或病毒^^的亞序列。例如，嵌合的HIVEnv多肽可包含進化枝AEnv多肽的一種或多種亞序列與進化枝BEnv多肽的一種或多種亞序列和/或進化枝CEnv多肽的一種或多種亞序列的組合，或者與具有不同氨基酸序列的、HIV的不同進化枝A病毒抹(或病毒抹類)的一種或多種亞序列的組合。類似地，進化枝B和CEnv多肽的亞序列可以與其它進化枝和/或病毒抹的亞序列組合。包含嵌合的Env多肽的核酸構建體由SEQIDNOs:7-15表示。通常，編碼所述HIV抗原性多肽的所述核酸構建體是質粒。但是，其它載體(例如，病毒載體，噬菌體、翻粒等等)可用于復制所述核酸。在本公開中，所述核酸構建體通常是表達載體，該表達載體含有促進宿主中所插入的遺傳序列的有效轉錄的啟動子序列。該表達載體通常包含復制起點，啟動子，以及允許轉化細胞表型選擇的特異的核酸序列。在示例性的核酸構建體中，將所述編碼序列可操作地連接使其處于人巨細胞病毒(CMV)即早期(IE)增強子/啟動子的轉錄控制下，該即早期增強子/啟動子已被修飾為包含來自1型人T-細胞白血病病毒(HTLV-1)的長末端重復(LTR)的R區的調節序列。該轉錄調節序列被指定為"CMV/R"或"CMV/R啟動子"。該CMV/R轉錄調節序列(或者稱為"轉錄控制序列")以5，至3，方向包含CMVIE增強子/啟動子；HTLV-1R區；以及CMVIE3'內含子的123tt對(bp)片段。該CMV/R轉錄調節序列給予在其控制下可操作連接的HIV抗原基本上增強的表達和改進的細胞免疫應答。示例性CMV/R由SEQIDNO:26表示。但是，可使用保留調節特性或已被修飾以增強表達的、包含與SEQIDNO:26具有至少約90%或95%或98%同一性的轉錄調節區的轉錄控制序列。更通常地，可將編碼HIV抗原性多肽的多核苷酸序列與引入至宿主細胞后能夠引發所述核酸表達的任何啟動子和/或增強子操作地連接。啟動子是指導核酸轉錄的核酸控制序列。啟動子包含(可以)鄰近轉錄起始位點的必要的核酸序列，例如II型聚合酶啟動子(TATA元件)的情況。啟動子還可包含可位于距轉錄起始位點有數千個堿基對遠的遠端增強子或阻抑物元件。包括組成型和誘導型兩種啟動子(參見，例如，Bitter等人,/"^^y附o/ogy153:516-544,1987)。啟動子的具體的非限制性例子包括源于哺乳動物細胞的基因組的啟動子(例如，金屬硫蛋白啟動子)或來自哺乳動物病毒的啟動子(例如，可使用細胞巨化病毒即早期基因啟動子、逆轉錄病毒長末端重復；^泉病毒晚期啟動子；痘苗病毒7.5K啟動子)。還可使用由重組DNA或合成技術產生的啟動子。當將第一核酸序列與第二核酸序列處于功能關系時，可將該第一核酸序列與該第二核酸序列可才喿作地連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄或表達，則可將該啟動子與該編碼序列可操:作地連接。為了產生這類核酸構建體，將編碼HIV抗原性多肽的多核苷酸序列插入合適的表達載體內，該表達載體例如為使用所述CMV/R啟動子和牛生長激素多腺苷酸化序列以調節表達的質粒表達栽體。該CMV/R啟動子由用1型人T-細胞白血病病毒(HTLV-1)長末端重復(LTR)的5，-非翻譯HTLV-1R-U5區替代CMV即早期1區增強子(CMV-IE)的翻譯增強子區組成以優化基因表達。該HIV-1多核苷酸序列通常被修飾以優化在人細胞中的表達。將該質粒表達載體引入至細菌細胞內，例如在卡那霉素選擇性培養基中的培養中生長的大腸桿菌。在所有情況中，細菌的細胞生長依賴于由一部分該質粒DNA編碼的耐卡那霉素蛋白的細胞表達。在含有所述質粒的細菌細胞生長后，將該質粒DNA從細胞組分中純化出來。產生編碼HIV抗原性多肽的多核苷酸序列和在體外操作它們的方法是本領域內技術人員公知的，并可參見上述引用的Sambrook和Ausubel。除了編碼本文7>開的由SEQIDNOs:20-25所示多肽的多核苷酸序列外，例如本文/〉開的SEQIDNOs:1-6(以及編碼由SEQIDNOs:7-15所示的嵌合的Env多肽的核酸和編碼由SEQIDNOs:16-19所示的腺病毒載體的核酸)、所述核酸構建體可包含編碼基本上與SEQIDNOs:20-25相似的多肽的變體多核苷^列(例如，基本上與SEQIDNOs:1-6和/或SEQIDNOs:16-19相似的多核苷酸序列)。類似地，所述核酸構建體可包含編碼基本上與SEQIDNOs:7-15編碼的多肽相似的嵌合型多肽的多核苷酸。氨基酸(和多核苷酸)序列之間的相似性以序列之間的相似性方式表達，或另外指序列同一性。序列同一性通常以同一性(或相似性)百分比的方式測定；百分比越高，則兩個序列的一級結構越相似。通常，兩個氨基酸序列的一級結構越相似，則由折疊和裝配產生的高級結構越相似。HIV抗原性多肽的變體(例如，特定進化枝的多肽)可具有一個或小量的氨基酸缺失、添加或替代，但是其氨基酸(和通常其多核苷酸序列)依然享有非常高百分比的同一性。就相互不同的亞型的變體來說，保持其全部的抗原特征。相反，不同進化枝的HIV抗原享有較少的序列同一性和/或是相互不同的，因此其抗原特征不再是同一的。因此，所述核酸構建體可包含編一性的多肽的多核香酸，或者可包含與一種或多種SEQIDNOs;l-19具有至少約90%或95%或98%序列同一性的多核苷酸和/或通過簡并密碼子的替代與這些序列之一不同的多核芬酸。測定序列同一性的方法是本領域公知的。多種方案和比對公式在如下文獻中描述SmithandWaterman,A/v.Ma仇2:482,1981;NeedlemanandWunsch,A/io/.5/o/.48:443,1970;HigginsandSharp,Gewe73:237，1988;HigginsandSharp,5:151，1989;CorpetWa/,M/c/ezcv4。V/siasearcA16:10881，1988;和PearsonandLipman,尸rac.Mz//.yicfld.Sd.固85:2444,1988。Altschuletal，淑匿Ge威6:119,1994提供了序列比對方法和同源'f生i十算的詳細i寸論。BasicLocalAlignmentSearchTool(NCBI基本局部比對探索工具)(BLAST)(Altschul&a/.,Mo/.歷o/.215:403，1990)可從包括theNationalCenterforBiotechnologyInformation(國立生物技術信息中心)(NCBI,Bethesda，MD)和因特網在內的多種來源中得到，用于與序列分析方案blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx相關聯。在因特網上的NCBI網站上獲得如何使用該方案來測定序列同一性的說明。兩核酸之間的序列相似性的另一標記是雜交的能力。兩個核酸序列越相似，則它們雜交的條件越嚴緊。雜交條件的嚴緊性是序列依賴的，且在不同的環境參數下是不同的。因此，導致特定嚴緊度的雜交條件將通常，雜交的溫度和雜交緩沖液的離子強度(尤其是Na+和/或MgW濃度)決定雜交的嚴緊性，雖然漂洗時間也影響嚴緊性。通常，在確定的離子強度和pH中，所選擇的嚴緊條件是比特定序列的熱熔點(Tm)低約5。C至20。C。該Tm是(在確定的離子強度和pH中)50%的把序列雜交至優先配對的探針上的溫度。核酸雜交的條件和嚴緊性的計算可例如在如下文獻中找至!]:Sambrook&a/，Afo/ea//arC7om力g..爿丄a60ratoA7Mawwa/，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,2001;Tijssen，/^6rWz加'o"附/A.M/c/e/c爿"V/尸raZes，尸aW/:7%eo7朋^A^wc/e/c爿c/diVe/ara^ow，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,ElsevierScienceLtd.,NY,NY，1993和Ausubela/.幼oW尸ratoco/sMo/ecw/ar歷0/0g7，第四版，JohnWiley&Sons,Inc.,1999。對了本公開的目的，"嚴緊條件"包含如果在雜交分子和耙序列之間存在少于25%的不匹配才發生雜交的條件。"嚴緊條件"可分解至更精確定義的特定的嚴緊性水平。因此，如本文所用的，"輕度嚴緊性"條件是具有多于25%序列不匹配的分子不雜交的條件；"中度嚴緊性"條件是具有多于15%不匹配的分子不雜交的條件；"高嚴緊性"的條件是具有多于10%不匹配的序列不雜交的條件。"非常高嚴緊性"的條件是具有多于6%不匹配的序列不雜交的條件。相反，在"低嚴緊性條件"下雜交的核酸包括具有更少序列同一性的核酸，或僅在該核酸的短亞序列上具有序列同一性的核酸。例如，核酸構建體可包含在高嚴緊性或非常高嚴緊性或甚至更高嚴緊性條件下與編碼任一SEQIDNOs:20-25的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列。類似地，該核酸構建體可在這類條件下與任一SEQIDNOs:l-19雜交。因此，除了編碼由SEQIDNOs:20-25所示的特定氨基酸序列的多核苷酸以外，例如由密碼子優化的SEQIDNO:sl-19構建體所示的那些多核苷酸，用于所述疫苗組合物的所述核酸構建體可包含具有高百分比序列同一性的多核苷酸序列，例如，在高嚴緊性或非常高嚴緊性(或甚至更高嚴緊性)條件下與這些序列之一雜交的多核苷酸序列。在天然存在的或突變的HIV病毒林中發現的在一個或多個位置處的密碼子組合也包含在本文公開的核酸構建體內。本領域的技術人員可易于鑒別眾多HIV多核香酸序列，且確定可改變哪個核苷酸而基本上不改變所編碼的多肽的氨基酸內容。另外，編碼具有少量氨基酸增加、缺失或替代的變體的多核苷酸序列也包含在本文描述的核酸構建體內。通常，任何氨基酸增加、缺失和/或替代均位于不改變所述抗原表位且不干擾折疊或其它翻譯或翻譯后過程的位置。最通常地，任何氨基酸替代是保守的氨基酸替代。例如，變體多核苦酸序列可編碼具有一個或兩個或三個或四個或五個或多個氨基酸增加、缺失或替代的HIV抗原性多肽。特定氨基酸的保守變體是本領域內公知的，并可例如M1中所歹寸的組中選擇。表l:保守性氨基酸替代原始的殘基保守性替代^免疫原性組合物聯合應用的所述核酸構建體，例如由SEQIDNOs:1-6示例性描述的核酸構建體可用于提供引起廣譜的抗HIV免疫應答的免疫原性組合物。該核酸構建體的具體組合本文稱為VRC-HIVDNA016-00-VP，且包含分別對應SEQIDNOs:1-6的所述質粒VRC-4401、VRC-4409、VRC-4404、VRC-5736、VRC5737和VRC畫5738。包含編碼不同HIV抗原的兩種或多種核酸構建體的所述組合物通常由包含多種核酸構建體的組合物來提供，每一核酸構建體編碼單一的HIV抗原。集合起來，該兩種或多種核酸構建體編碼來自多于一種進化枝或病毒株的抗原，例如來自兩種或更多種進化枝或病毒抹的抗原、或來自三種或更多種進化枝或病毒林的抗原。在某些情況中，所述組合物包含編碼具有多于一種進化枝或病毒抹的亞序列的嵌合的HIV抗原的多核芬酸序列。為了臨床目的，諸如在制備所述疫苗中使用的質粒和宿主大腸桿菌菌才朱的所有核酸構建體由如下文獻中的有關部分來表4i:"Pointsto32Asn;GinL叫ValHe;ValArg;Gin;GIuLeu;lieMet;Leu;TyrThrSerTyrTip;Phelie;LeusLGGsAAAAAACGGW5nh2LMPSP5TTVConsiderintheProductionandTestingofNewDrugsandBiologicalsProducedbyRecombinantDNATechnology"(由重組DNA技術產生的新藥物和生物劑的產生和測試中的關注點)(1985),the"Supplement:NucleicAcidCharacterizationandGeneticStability，，(增補4亥酸表征和遺傳穂、定性)(1992)，和"PointstoConsiderinHumanSomaticCellTherapyandGeneTherapy"(人體細胞治療和基因治療中的關注點)(1991，1998),"PointstoConsideronPlasmidDNAVaccinesforPreventiveInfectiousDiseaseIndications"(適于預防傳染病適應癥的質粒DNA疫苗)(1996)。另外對于臨床試-驗和用途，才艮據currentGoodManufacturingPractices(現行優良生產管理規范)(cGMP)的方式產生所有組合物。因此，在一實施方案中，所述免疫原性組合物是VRC-HIVDNA016-00-VP，6種組分的多進化枝質粒DNA疫苗，表達來自進化枝BHIV-1的Gag、Pol和Nef蛋白和來自進化枝A、B和C的Env糖蛋白。該組合物適于HIV的預防性治療，即作為預防的HIV-1疫苗。該疫苗已被設計為引起抗來自許多種HIV-1病毒林的多種蛋白的免疫應答。該疫苗在兩個顯著方面與先前的多進化枝疫苗組合物不同。首先，先前的組合物依賴于編碼Gag-Pol-Nef融合蛋白的單一質粒。在本文Z/^開的特定實例中，這些三個蛋白^皮分散在三個單獨編碼Gag(VRC4401)、Pol(VRC4409)和Nef(VRC4404)的不同質粒內。另外，與該先前的融合蛋白組合物相比，在gag基因中增加了68個氨基酸。第二，所述啟動子被修飾為包含1型人T-細胞白血病病毒(HTLV-1)長末端重復(LTR)的5，-非翻譯的HTLV-1R-U5區，而不是包含在先前構建體中使用的CMV即早期1區增強子的翻譯增強子區的一部分。例如，用含有CMV/R轉錄調節區的質粒向非人類的靈長類進行接種與用未修飾的CVMIE啟動子/增強子序列構建的質粒進行接種相比，引起更高和更一致的HIV-1特異性細胞免疫應答。將VRC-HIVDNA016-00-VP設計為引起抗來自許多種HIV-1病毒抹的多種蛋白的免疫應答。該疫苗產品是由編碼HIV-1進化枝BGag-Pol融合蛋白的初期的HIV-1DNA質粒產品(VRC-4302;BB-IND9782)進化的。證實在小動物中免疫原性蛋白表達的臨床前研究，以及正在進行的I期臨床試驗表明迄今為止在測試劑量下無安全性問題。該VRC-HIVDNA016-00-VP疫苗(BB-IND10681)在產品概念上擴展至包含來自HIV-1多種亞型(進化枝)的蛋白，并將疫苗組分的數量增加以包含高度免疫原性調節蛋白(Nef)，和能夠在獼猴體內產生免疫應答修飾的包膜糖蛋白。根據在獼猴和小鼠中實施的臨床前免疫原性研究以及由四種質粒和兩種另夕卜的Gag-Pol-Nef表達質粒組成的疫苗產品(VRC-HIVDNA006-00-VP)的臨床前安全性研究，選擇該四種質粒的產品，VRC-HIVDNA009-00-VP進行臨床試驗。才艮據這些質粒產品的生物安全性測試，以及在該候選疫苗VRC-HIVDNA009-00-VP(BB-IND10681)和VRC-HIVDNA016-00-VP之間的高度的同源性，確定該六種質粒疫苗對人臨床試驗是安全的。治療方法本文描述的編碼HIV抗原性多肽的核酸構建體例如聯合用作適用于治療方案、例如預防方案(如疫苗)的藥物組合物(藥物)，以及向個體(例如，人類個體)給藥以引起抗HIV的一種或多種進化枝或病毒抹的免疫應答。例如，在注射HIV之前，可將本文描述的組合物向人類(或非人類)個體給藥以抑制由該病毒引起的感染或抑制病毒復制。因此，可將上述藥物組合物向個體給藥以引起抗HIV的預防性免疫應答。為了引起免疫應答，將治療有效(例如，免疫有效)劑量的所述核酸構建體向諸如人類(或非人類)個體的個體給藥。"治療有效量"是化學組合物(例如，核酸構建體或載體)在進行治療的個體中用于達到預期效應的量。例如，其可以是表達足夠量的抗原以引起抗體應答或T細胞應答所需要的量，或者是抑制或預防由病毒引起的感染或病毒復制所需要的量，或者是預防、減輕或改善由病毒感染引起的癥狀所需要的量。當向給體給藥時，通常使用到達靶組織或達到為獲得體外作用根據經驗確定的全身濃度的劑量。本領域內技術人員無需進行過多試驗就可確定這種劑量。在實施例中詳細描述了示例性劑量。包括HIV編碼核酸構建體在內的藥物組合物可通過本領域技術人員公^p的4壬^r方式來給藥(參見Banga，A"77^ra/ew//c尸e/^cfey中的"ParenteralControlledDeliveryofTherapeuticPeptidesandProteins，"(治療性肽和蛋白的腸胃外控制輸送)，TechnomicPublishingCo.，hie,Lancaster,PA,1995;DouglasB.Lowrie和RobertG.Whalen(Eds.)的DiV/iF"acc/wes:McAo^s朋d尸ratoco/s(MethodsinMolecularMedicine),HumanaPress,2000)，例如通過肌肉內、皮下或靜脈內注射給藥，但是甚至考慮口服、鼻內或肛門給藥。在一實施方案中，給藥是通過皮下或肌肉內注射實現的。制備可給藥組合物的實際方法是本領域技術人員公知的或顯而易見的，并在諸如RemingtonsPharmaceuticalSciences(雷明頓制藥學),第19版,MackPublishingCompany,Easton，Pennsylvania,1995年的出版物中更詳細地描述。諸如本文公開的初始物(primer)或強化劑(booster)組合物的所述核酸構建體的合適制劑包括可含有抗氧化劑、緩沖液和抑菌劑的水溶液和非水溶液、等滲無菌溶液，可包含助懸劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑和防腐劑的含水無菌混懸液和非水無菌混懸液。所述制劑可提供在諸如安瓿和小瓶的單位劑量或多次劑量密封容器中，并可在冷凍干燥(凍干)條件下貯存，只需要在使用前即刻加入諸如水的無菌液體載體。可由無菌粉劑、顆粒劑和片劑制備臨時溶液和混懸液。優選地，所述載體為緩沖鹽溶液。更優選地，將在所述發明方法中使用的組合物組方以Y更在給藥前保護所述核酸構建體使其免于被破壞。例如，可將所述組合物組方以減少所述腺病毒載體在諸如玻璃器皿、注射器或針的用于制備、貯存或給藥所述表達載體的裝置上損失。可將所述組合物組方以降低所述組分的光敏感性和/或溫度敏感性。為此目的，所述組合物優選含有諸如上述液體載體的藥物可接受液體載體和選自如下的穩定劑聚山梨醇酯80、L-精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及其組合。這種腺病毒載體組合物的應用將延長該載體的貯存期限、便于給藥和增加所述發明方法的有效性。含腺病毒載體的組合物的制劑還在如下專利中描述第6,225,289、6,514,943號美國專利、第2003/0153065Al號美國專利申請7>開和第WO00/34444號國際專利申請公開。還可將腺病毒載體組合物組方以增強轉導效率。劑。例如，諸如布洛芬或類固醇的控制炎癥的試劑可以是腺病毒載體組合物的一部分以減少與該腺病毒載體的體內給藥相關的腫脹和炎癥。如本文所討論的，可將免疫系統刺激物給藥以增強對所述抗原的任何免疫應答。可提供抗菌素，即殺#1生物劑和殺真菌劑以治療存在的感染和/或減少將來感染的風險，如與基因轉移操作相關的感染。可將所述組合物給藥以用于治療性治療。在治療應用中，在暴露于HIV或HIV感染之前或之后，將治療有效量的所述組合物向給體給藥。當在暴露前給藥，該治療應用可稱為預防性給藥(例如，疫苗)。根據所述個體需要和耐受的劑量和頻率，可將所述組合物單次或多次給藥。在一實施方案中，將所述劑量以大丸劑(bolus)的形式一次給藥，但是在另一實施方案中，周期性地使用所述劑量直到獲得諸如保護性免疫應答的治療結果為止。通常，所述劑量足以治療或緩解疾病的癥狀或體征，而不對所述個體產生不可接受的毒性。可使用全身給藥或局部給藥。可將控釋的腸胃外給藥制劑制備為埋植劑、油性注射劑或為顆粒體系。顆粒體系包括微球、微粒、微嚢、納米嚢、納米球和納米顆粒。比約lpm小的顆粒、微球和微嚢通常分別稱為納米顆粒、納米球和納米嚢。毛細血管具有約5/mi的直徑，因此只有納米顆粒可靜脈內給藥。凝:粒通常直徑為約100/mi，可皮下或肌肉內給藥(參見Kreuter，Co//ozWa/Z>wgZ)e/Zv^y加/ems，J,Kreuter，ed.，MarcelDekker，Inc.,NewYork,NY，pp.219-342，1994;Tice&Tabibi，rmz船eowCowfra〃^/i)rwgZ)e"ve/7,爿.Kydonieus，ed"MarcdDekker，Inc.NewYork,NY，pp.315-339,1992)。在某些實施方案中，所述藥物組合物包含佐劑。佐劑可以是諸如明石凡、氫氧化鋁、^粦酸鋁的礦物混懸液，抗原吸附于該礦物上；或油包水型乳液，其中抗原溶液被乳化在油中(MF-59，弗氏不完全佐劑)，有時包含被殺死的分枝桿菌(弗氏完全佐劑)以進一步增強抗原性(抑制抗原的降解和/或引起巨噬細胞流入)。關于核酸疫苗，結合并刺激參與先天免疫的肽的核酸構建體一起給藥。例如，刺激某些Toll樣受體(例如TLR7、TLR8和TLR9)的試劑可與編碼HIV抗原性多肽的所述核酸構建體聯合給藥。在一些實施方案中，所述核酸構建體可與免疫刺激性CpG寡核苷酸聯合給藥。可將編碼HIV抗原性多肽的核酸構建體作為棵露DNA質粒引入體內。通過本領域內/>知的方法可將DNA載體引入至預期的宿主細胞內，該方法包括但不限于轉染、電穿孔(例如，經皮膚的電穿孔)、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸鉀沉淀、基因槍的應用或DNA載體轉運體的應用(參見，例如Wu&a/./歷o/.CAe附.，267:963-967，1992;WuandWu歷o/.C/iem.，263:14621曙14624,1988;和WilliamseZa/.M7f/.^cadt/5L488:2726-2730,1991)。如在實施例中詳細描述的，可使用諸如BIOJECTOR無針注射裝置的無針輸送裝置以體內引入所述治療性核酸構建體。還可使用受體-介導的DNA輸送途徑(Curiel&a/.Hwm.(7e"e7%^"3:147-154，1992;和WuandWu，/歷o/.C/ie/w.,262:4429-4432,1987)。配制并將棵露DNA向哺乳動物肌肉組織給藥的方法在第5，580，859和5,589,466號美國專利中公開，在此將這兩個專利引入作為參考。其它分子也可用于促進核酸在體內轉染，例如陽離子寡肽(例如W095/21931)、源于DNA結合蛋白的肽(例如WO96/25508)或陽離子聚合物(例如W095/21931)。可選擇地，可方便使用電穿孔以將編碼HIV抗原的核酸構建體引入細胞內。電穿孔是本領域內技術人員公知的(參見，例如Lohr^fl/.Oz"c^及仏61:3281-3284,2001;Nakano&a/.//wm77^r12:1289-1297,2001;Kim&a/.7Tier10:1216-1224,2003;DeanWa/.77en10:1608-1615，2003;和Youngaa/.77ier10:1465-1470，2003)。例如，在電穿孔中，向宿主細胞(例如分離的自體外周血細胞或骨髓細胞)的混懸液中加入高濃度的DNA載體，并用電場休克該混合物。可將透皮的電穿孔用于動物和人類以在體內將異源的核酸引入實體組織(例如，肌肉)內。通常，通過將含所述DNA的溶液引入靶組織內，例如，使用與輸送一次或多次電脈沖的電極連接的針或套管針來在體內將所述核酸構建體引入組織中。例如，可使用一系列的電脈沖以優化轉染，例如3至IO次的100V和50毫秒脈沖。在某些情況下，實施多階段或給藥。可用來將編碼HIV抗原的核酸構建體引入宿主細胞內的另一公知的方法是粒子轟擊(也稱為生物射彈轉化)。通常以多種方式之一實現生物射彈轉化。一種普通方法涉及推進在細胞處的惰性或生物活性粒子。在Sanford等人的第4,945,050、5,036,006和5,100,792號美國專利中公開了該技術，在此引入作為參考。通常，該方法涉及在有效穿透細胞的外表面并引入至細胞內部的條件下，推進在細胞處的惰性或生物活性粒子。當使用惰性粒子時，可通過用含有外源性DNA的質粒包被該粒子來將該質粒引入細胞。或者，可用所述質粒包圍輩巴細胞以便通過粒子的覺醒來將該質粒運載進該細胞內。可選擇地，可通過脂質轉染法體內引入所述載體。對于過去十年多來，脂質體越來越多地用于包嚢和體內轉染核酸。為減少脂質體介導的轉染所遇到的困難和危險而設計的合成的陽離子脂質可用于制備適于將編碼標記的基因進行體內轉染的脂質體(Feigneret.al.Vw/.爿cyk/.84:7413-7417，1987;Mackey,etal,A^/.爿cadC/5^85:8027-8031,1988;Ulmeretal.Sc/e"ce259:1745-1748,1993)。陽離子脂質的應用可促進與帶有負電荷的細胞膜融合(FeignerandRingoldSc&"ce337:387-388,1989)。用于轉移核酸的特別適用的脂質化合物和組合物在W095/18863和W096/17823以及在第5,459,127的美國專利中描述，在此引入作為參考。在其它實施方案中，所述核酸構建體是病毒栽體。用于構建并使用病毒載體的方法是本領域/>知的(參見，例如MillerandRosman，BioTeck，7:980-990，1992)。優選地，該病毒載體是復制缺陷型，即，其不能夠在所述靶細胞中自主復制。通常，在本公開范圍內使用的該復制缺陷型病毒載體的基因組缺乏至少一個在受感染的細胞中病毒復制所必需的區。這些區可以是去除的(全部或部分)，或者通過本領域技術人員公知的任何技術使其無功能性。這些技術包括全部去除、替代(被其它序列替代，特別^^皮所插入的核酸替代)、部分缺失或向(復制)必需區增加一個或多個堿基。這類技術可在體外(例如，在分離的DNA上)實施。在某些情況在，所述復制缺陷型病毒保留使病毒顆粒殼體化所必需的基因組的序列。DNA病毒載體通常包括減弱的或缺陷的DNA病毒，包括但不限于單純皰滲病毒(HSV)、乳頭瘤病毒屬、EB病毒(EBV)、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、莫洛尼白血病病毒(MLV)和人免疫缺陷病毒(HIV)等等。因為在引入細胞內后缺陷病毒不具有感染性，因此優選完全或幾乎完全缺乏病毒基因的缺陷病毒。缺陷病毒載體的應用允許向特定的局部區域中的細胞給藥，而無需考慮該載體可感染其它細胞。因此，可特異性地靶向特定組織。特殊載體的實例包括但不限于缺陷型皰瘆病毒l(HSVl)載體(Kaplittetal.MoZCe〃.A^/raw',2:320-330，1991)、缺乏糖蛋白L基因的缺陷型皰滲病毒栽體(參見，例如，專利公開RD371005A)、或其它缺陷型皰滲病毒載體(參見，例如WO94/21807和WO92/05263);減毒的腺病毒載體，如Stratford-Pemcaudet等人描述的載體(丄C""./"ves.:90:626-6301992;LaSalleetal.，S"e"ce259:988-990，1993);和缺陷型腺伴隨病毒載體(Samulskietal.，/Wra/.,61:3096-3101,1987;Samulskietal.，/F/ra/，63:3822-3828,1989和Lebkowskietal.，Mo/.Ce仏歷o/,8:3988-3996，1988)。在一實施方案中，所述載體是腺病毒載體。腺病毒是可被修飾以有效地向許多種細胞類型輸送本公開的核酸的真核DNA病毒。存在多種血清型腺病毒。這些血清型中，在^/>開的范圍內，優選2型或5型人腺病毒(Ad2或Ad5)或動物來源的腺病毒(參見，例如W094/26914)。那些可用在本公開范圍內的動物來源的腺病毒包括犬、牛、鼠(例如Mavl,Beardetal.Fz'ra/，75-81，1990)、豬、禽和猿(例如SAV)來源的腺病毒。在一些實施方案中，該動物來源的腺病毒是犬腺病毒、如CAV2腺病毒(例如Manhattan或A26/61病毒才朱(ATCCVR-800))。本文所述的復制缺陷型腺病毒載體包括ITRs、所關注的殼體化序列和多核苷酸序列。在一些實施方案中，至少該腺病毒的E1區是無功能性的。在該El區的缺失優選地從Ad5腺病毒序列中的核香酸455擴展至核苦酸3329(尸vtJI-5gffl片段)或從382擴展至3446(/f/w_/II-A^3A片段)。還可飾其它區，特別是E3區(例如W095/02697)、E2區(例如W094/28938)、E4區(例如W094/28152、W094/12649和WO95/02697)或4壬一晚期基因Ll-L5。在其它實施方案中，所述腺病毒載體在E1區有缺失(Ad1.0)。在歐洲專利185,573中公開了El-缺失的腺病毒的實例，在此將其內容引入作為參考。在另一實施方案中，所述腺病毒載體在E1和E4區具有缺失(Ad3.0)。在WO95/02697和W096/22378中公開了El/E4缺失的腺病毒的實例。本公開所述的復制缺陷型重組腺病毒可通過本領域技術人員公開的任何技術來制備(參見，例如Levreroetal.101:195，1991;EP185573和Graham五M5(9J，3:2917，1984)。特別地，可通過腺病毒與質粒之間的同源重組來制備它們，該質粒格外包括所關注的DNA序列。，將該腺病毒和質粒共轉染進適合的細胞株內后完成該同源重組。所用的細胞株優選地(i)可被待使用的元件所轉化，以及(ii)含有能夠補充該復制缺陷型腺病毒的部分基因組的序列，優選地采用整合形式以便避免重組的危險。可使用的細胞抹的例子為人胚腎細胞系293(Grahametal.丄K/w/.36:59,1977)，其含有整合在其基因組內的Ad5腺病毒基因組的左手部分(12%),以及為能夠補充E1和E4功能的細胞林，如在申請W094/26914和WO95/02697中所述。釆用本領域技術人員公知的標準分子生物技術回收和純化重組腺病毒。還可使用其它病毒栽體來引入編碼HIV抗原的核酸，該病毒載體例如逆轉錄病毒載體，如慢病毒屬載體或腺病毒-伴隨病毒(AAV)載體。如在實施例中詳細描述的，在一實施方案中，在暴露于HIV之前將包含核酸構建體的藥物組合物SI入個體內以引發保護性免疫應答，該核酸構建體編碼對應HIV多種進化枝或病毒的抗原性多肽的HIV抗原。通常，該核酸構建體是質粒。例如，可將包含編碼不同HIV抗原的多核苷酸序列的多種質粒包括在藥物組合物內。例如，可將編碼不同HIV進化枝或病毒抹的抗原性多肽的一組質粒包括在該組合物內，以引發免受HIV的多種進化枝或病毒抹感染的免疫性。在示例性實施方案中，所述組合物包括六種質粒。每種質粒包括與促進抗原性多肽體內表達的轉錄調節序列可操作地連接的編碼不同HIV抗原的多核普酸序列。例如，所述組合物可包括編碼Gag多肽、Pol多肽、Nef多肽和任選的不同進化枝或病毒4朱的Env多肽(例如，進化枝AEnv多肽、進化枝BEnv多肽和/或進化枝CEnv多肽)的不同質粒。在一具體實施方案中，所述疫苗組合物包括該六種質粒(分別為SEQIDNOs:1-6所示的VRC4409、VRC4401、VRC-4404、VRC5736、VRC5737和VRC5738)。將該特定實施方案指定為VRC-HIVDNA016-00-VP，并在實施例中進一步描述。通常，所述多質粒組合物包括基本上等比例(例如大約l:l:l:l:l:l)的所述六種質粒。該藥物組合物可以單次劑量或多次劑量向個體給藥。該劑量范圍可根據所述個體的身體特征、代謝特征和免疫特征而變化，但是通常給藥至少約lmg并不超過約12mg的劑量。例如，單次劑量可以是至少約2mg，或至少約3mg，或至少約4mg的組合DNA。通常，單次劑量不超過約6mg、或約8mg或約10mg的組合DNA。如在實施例中描述的，約4mg組合質粒的劑量通常在免疫活性成體中有效引發保護性免疫應答。可將單次劑量或由時間間隔分開的多次劑量給藥以引發抗HIV的免疫應答。例如，可在數周、數月或甚至數年的時間內將兩次劑量、或三次劑量、或四次劑量、或五次劑量或六次劑量或更多次劑量向個體給藥以優化免疫應答。在一些情況中，可將包含所述核酸構建體的藥物組合物，例如所述多質粒疫苗VRC-HIVDNAO16-00-VP包括在聯合治療方案內，將其用作DNA疫苗初始物，隨后腺病毒載體加強。初始-加強方案在HIV感染的非人類模型中顯示出前景。這種方案具有增加高水平的免疫應答的潛在性。例如，可將包含編碼至少一種HIV抗原的一種或多種核酸構建體的"初始物"組合物向個體給藥，該HIV抗原與由腺病毒載體組合物中的腺病毒載體編碼的HIV抗原相同。例如，可在將包含一種或多種腺病毒載體的該"加強劑"組合向個體給藥至少約前1周，將該初始物組合物給藥。可將該初始物組合物(例如VRC-HIVDNA016-00-VP)的一種或多種核酸序列作為基因轉移載體的一部分或作為棵露DNA給藥。任何基因轉移載體均可用于該初始物組合物中，其包括但不限于質粒、逆轉錄病毒、腺伴隨病毒、疫苗病毒、皰滲病毒或腺病毒。在示例性實施方案中，該轉移載體是質粒。因此，上述多質i^立組合物與包含一種或多種編碼HIV抗原的腺病毒載體的組合物聯合給藥時，其可用于引發抗HIV的免疫應答。例如，該腺病毒載體組合物可包括(i)編碼兩種或更多種HIV抗原的單個腺病毒載體，例如，作為多蛋白或融合蛋白，如編碼Gag-Pol-Nef多肽的融合蛋白。或者，該腺病毒載體組合物可包括(ii)多種腺病毒載體，每種載體編碼單一HIV抗原，例如兩種或多種，如三種、或四種或更多種腺病毒載體，每一腺病毒載體編碼一種諸如Env多肽的HIV抗原。與配置(i)一致，在本發明范圍內^f吏用包含編碼多于兩種不同HIV抗原(例如，三種或更多種、四種或更多種、或甚至五種或更多種不同的HIV抗原)或編碼同一抗原的多種拷貝的核酸序列的腺病毒栽體，只要該腺病毒載體編碼至少兩種或多種不同HIV抗原。同樣的，與配置(ii)一致，在本發明范圍內使用包含多種核酸序列(例如，三種或更多種、四種或更多種、或甚至五種或更多種不同的核^歹'J)的腺病毒載體，每一核酸序列編碼不同的HIV抗原或同一抗原的不同拷貝，只要該腺病毒載體編碼至少兩種不同的HIV抗原。無論是配置(i)或(ii)，該腺病毒載體組合物優選包含編碼三種或更多種、甚至四種或更多種不同HIV抗原的一種或多種腺病毒載體(例如，其中每一載體包含編碼三種或更多種、或四種或更多種不同HIV抗原的核,列，或者其中每一載體包含三種或更多種、或四種或更多種核酸序列，且每一核酸序列編碼不同的HIV抗原)。在某些實施方案種，所述兩種或更多種、三種或更多種、或四種或更多種不同HIV抗原來自兩種或更多種、三種或更多種、或四種或更多種不同HIV進化枝。所用的腺病毒載體的數目或由其編碼的不同HIV抗原的數目沒有上限。當然，上述配置的腺病毒載體的組合可用于單一組合物中。例如，根據本發明使用的所述腺病毒栽體組合物可包含編碼單一HIV抗原的第一腺病毒載體和編碼與該第一腺病毒載體編碼的HIV抗原不同的兩種或更多種HIV抗原的第二腺病毒載體。本領域技術人員可易于確定本文公開的腺病毒載體配置的其它類似組合和排列。在某些實施方案中，所述加強劑組合物包含多種腺病毒載體。例如，該加強劑可包括多種腺病毒載體，每一載體編碼HIVEnv多肽，如不同進化枝或病毒4朱的Env多肽。另外，該加強劑組合物可包含編碼Gag、Pol和/或Nef多肽的腺病毒載體。在一具體實施方案種，命名為VRC-HIVDNA014-00VP的加強劑組合物包括四種腺病毒載體，其中三種腺病毒載體編碼不同進化枝(即，進化枝A、進化枝B和進化枝C)的Env多肽和編碼(進化枝B的)Gag和Pol抗原的腺病毒載體。當然，本領域技術人員可易于設計眾多種變體，該變體結合了或多或少的腺病毒載體，和/或編碼了相同或不同HIV進化枝或病毒抹的抗原。雖然由所述加強劑組合物的一種或多種核酸序列編碼的HIV抗原通常與由所述初始物組合物的核酸構建體編碼的HIV抗原相同，4旦是在一些實施方案中，適合^f吏用包含一種或多種核酸序列的初始物組合物，該核酸序列編碼與所述腺病毒載體組合物編碼的抗原不同的HIV抗原。例如，不同進化枝或病毒才朱的Gag和/或Pol和/或Nef抗原或不同進化枝或病毒的Env纟元原。將所述初始物組合物向所述哺乳動物給藥以初始化對HIV的免疫應答。可在任何合適的時幀內(例如，加強前至少約l周、2周、4周、8周、12周、16周或更多周)提供多于一個劑量的初始物組合物。優選地，在將所述加強劑組合物給藥前至少3個月(例如，3個月、6個月、9個月、12個月或更多個月)將所述初始物組合物向所述哺乳動物給藥。最優選地，在將所述加強劑組合物給藥前至少約6個月至約9個月，將所述初始物組合物向所述哺乳動物給藥。可在任何合適的時幀內提供多于一個劑量的加強劑組合物以維持免疫性。可采用任何給藥途徑來向所述哺乳動物輸送所述腺病毒載體組合物和/或所述初始物組合物。實際上，可采用多于一種的途徑來給藥所述腺病毒載體組合物和/或所述初始物組合物，但是特別的途徑可比其它途徑提供更迅速和更有效的反應。最通常地，所述腺病毒載體組合物和/或所述初始物組合物通過肌肉內注射給藥。還可將該腺病毒載體組合物和/或該初始物組合物涂敷或慢慢灌輸體腔內，經皮膚(例如，通過透皮貼劑)吸收，吸入，攝取、局部應用于組織、或通過諸如靜脈內給藥、腹膜給藥或動脈內給藥來進行腸胃外給藥。可將所述腺病毒初始物組合物和/或所述加強劑組合物在允許控釋或緩釋的裝置內或裝置上給藥，該裝置例如海綿、生物相容的網狀物、機械貯庫或機械埋植系統。植入劑(參見，例如第5,443,505號美國專利)、裝置(參見，例如第4,863,457號美國專利)，例如可植入的裝置，如機械貯庫或埋植系統或包含聚合組合物的裝置特別適用于所述組合物的給藥。還將所述腺病毒載體組合物和/或所述初始物組合物以緩釋制劑(參見，例如第5,378,475號美國專利)的形式給藥，該緩釋制劑包含例如凝膠泡沫、透明質酸、明膠、硫酸軟骨素、聚磷酸酯、例如對苯二甲酸雙-2-羥乙酯(BHET)、和/或聚乳酸-乙醇酸。力口強劑組合物可包括單次劑量的《、有至少約1xl05個腺病毒載體顆粒(也稱為顆粒單位)的腺病毒載體。該劑量優選至少約lxl()G個所述腺病毒載體顆粒(例如，約^106至lxlO^個顆粒)，更優選至少約"107個顆粒，更優選至少約"108個顆粒(例如，約lxl()S至lxlO"個顆粒或約lx108至lxlO^個顆粒)，且最優選至少約"109個顆粒(例如，約^109至lxl01G個顆粒或約lxl(^至lxlO。個顆粒)。或者，該劑量包含不超過約lx1014個顆粒，優選不超過約lxlO"個顆粒，甚至更優選不超過約lxl(^個顆粒，甚至更優選不超過約lxlO"個顆粒，且最優選不超過約lxl(T個顆粒(例如，不超過約lxl(f個顆粒)。換言之，所述腺病毒載體組合物可包含單次劑量的腺病毒載體，該腺病毒栽體含有例如約lxl(^顆粒單位(pu)、2xl06pu、4xl06pu、lxl07pu、2xl07pu、4xl07pu、lxl08pu、2xl08pu、4xl08pu、lxl09pu、2xl09pu、4xl09pu、lxl010pu、2xl010pu、4xl010pu、lxlOupu、2xlOupu、4xlOupu、lxl012pu、2xl012pu或4xl012pu的腺病毒載體實施例實施例l:質粒的構建所述核酸構建體衍生于含有人CMV即早期(IE)增強子、啟動子和內含子的親代1012DNA疫苗質粒。為了構建CMV/R調節元件，用HTLV-IR區的227bp￡coRV////7flI片段置換該含有CMVIE內含子的大主要部分的1012質粒的SacII///a;7l片段(Seikietal.,iVoc.A/flf/.Sc/.80:3618-3622，1983)。所得到的CMV/R質粒因此含有人CMVIE增強子/啟動子，接著是HTLV-IR區和CMVIE3，內含子的123bp片段。R區中的剪接供體和CMVIE3，內含子中的剪接受體用作剪接信號對。類似地分別通過勞斯肉瘤病毒(RSv)增強子/啟動子的38ibp4/nw/"^in片段或小鼠泛素B(mUB)增強子/啟動子的842bp^el/五coRV片段置換CMV/R質粒的CMV增強子/啟動子區來構建RSV/R和mUB/R質粒。先前已描述了該mUB增強子/啟動子(Yewetal.，Mo/.7T^r.4:75-82，2001)。CMV/R進化枝BGag/h(VRC-4401)的構建為了構建圖1中圖示的DNA質粒VRC-4401，采用為在人細胞中表達而優化的密碼子，將來自HXB2(GENBANK⑧登錄號K03455)的gag多蛋白(Pr55，氨基酸l-432)的蛋白序列用于產生gag基因的合成版本。該合成的gag基因的核,列顯示出與HXB2基因具有很少的同源性，但是所編碼的蛋白是相同的。將包含編碼Gag(B)的該合成基因的SalI/BamHI片段從質粒VRC3900中切除，該質粒VRC3900含有與pVR1012骨架中的插入片段相同的插入片段，并克隆在上述CMV/R骨架的SalI/BamHI位點內。表2中提供了預測的VRC-4401結構域的概述。該質粒長度為5886個核香酸4tt^t(bp)且具有約3.9MDa的分子量。在SEQIDNO:l中提供了VRC-4401的序列。表2:質粒VRC-4401的描述<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>CMV/R進化枝BPol/h(VRC-4409)的構建為了構建圖2中圖示的DNA質粒VRC-4409，采用為在人細胞中表達而優化的密碼子，將來自NL4-3(GENBANK⑧登錄號M19921)的Pol多蛋白(氨基酸3-1003)的蛋白序列用于產生pol基因的合成版本。為了在pol的起點處開始翻譯，向所合成的聚合酶基因的5，-端加入蛋氨酸密碼子以產生Pol/h基因。另外，在氨基酸553處引入蛋白酶(PR)突變(AGG-〉GGC或氨基酸R-〉G)，在^J^酸771處引入逆轉錄酶(RT)突變(GAC-〉CAC或氨基酸D-〉H)。將表達Pol的基因插入上述的CMV/R骨架內。表3中提供了預測的VRC-4409結構域的概述。該質粒長度為7344個核苷酸堿基對(bp)并具有約4.8MDa的分子量。SEQIDNO:2中提供了VRC-4409的序列。表3:質粒VRC-4409的描述<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>CMV/RHIV-1Nef/hfVRC-4404)的構建為了構建圖3中圖示的DNA質粒VRC-4404,采用為在人細胞中表達而優化的密碼子，將來自HIV-1NY5/BRU(LAV-1)克隆pNL4-3(GENBANK⑧登錄號M19921)的Nef蛋白的蛋白序列用于產生Nef基因(Nef/h)的合成版本。該核^列Nef/h顯示出與該病毒基因具有很少的同源性，但是所編碼的蛋白相同。刪除豆蔻酰位點(GGC-Gly,氨基酸2-3)。從利用Xbal/BamHI從所述的pVR1012骨架中消化出編碼Nef的片段，該片段最初被插入在該骨架內，然后將該片段克隆在上述CMV/R骨架的Xbal/BamHI位點內。表4中提供了預測的VRC-4404域的總結。該質粒長度位5039個核苷酸堿基對(bp)并具有約3.3MDa的分子量。SEQIDNO:3中提供了VRC-4404的序列。表4:質粒VRC-4404的描述<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>CMV/R-HIV-1進化枝AEnv/h(VRC-5736)為了構建圖4中圖示的DNA質粒VRC-5736,采用為在人細胞中表達而改變的密碼子，將來自92rw020(R5-趨向性的，GENBANK⑧登錄號U08794)的包膜多蛋白(gpl60)的蛋白序列用于產生基因(進化枝-Agpl45delCFI)的合成版本。采用通過使用通常在人細胞中發現的密碼子來破壞限制蛋白表達的病毒RNA結構而設計的序列合成產生表達所述HIV-1基因的質粒。該核苷^列R5gpl45delCFI顯示出與該92rw020基因具有很少的同源性，但是所編碼的蛋白是相同的。所截短的包膜多蛋白含有完整的SU蛋白和TM結構域，但是缺乏融合和胞漿結構域。七重復(Heptad)(H)1、七重復2及其間隔(IS)參與寡聚化。刪除了融合和裂解(F/CL)結構域，從氨基酸486至519。刪除了七重復(H)l和2之間的間隔(IS)，從氨基酸576至604。將包含5，端的多聚接頭、Kozak序列和ATG的Xbal(從ATG開始的上游18個氨基酸)至BamHl(從ATG開始的下游1912個氨基酸)片^R克隆在上述CMV/R骨架的XbaI至BamHl位點內。表5提供了預測的VRC-5736域的EnvA總結。該質粒長度為6305個核苦酸堿基對(bp)并具有約4.2MDa的分子量。SEQIDNO:4中提供了VRC-5736的序列。表5:質粒VRC-5736的描述<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>CMV/R進化枝BEnv/h(VRC-5737)的構建為了構建圖5中圖示的DNA質粒VRC-5737,釆用為在人細胞中表達而優化的密碼子，使用來自HXB2(X4-趨向性的，GENBANK⑧登錄號K03455)的包膜多蛋白(gpl60)的蛋白序列以產生基因(X4gpl60/h)的合成版本。該核苷*列X4gpl60/h顯示出與該HXB2基因具有很少的同源性，但是所編碼的蛋白與具有如下氨基酸替代的蛋白是相同F53L、N94D、K192S、1215N、A224T、A346D和P470L。為了產生該包膜蛋白的趨向R5版本(R5gpl60/h),將來自X4gpl60/h(VRC3300)的編碼HIV-1包膜多蛋白氨基酸275至361的區用來自HIV-1的BaL病毒抹(GENBANK⑧登錄號M68893,再次使用人優選的密碼)的相應的區置換。全長的來自pR5gpl60/h(VRC3000)的包膜蛋白基因的趨向R5版本在704位氨基酸之后的密碼子處終止。該截短的包膜多蛋白(gpl45)包含完整的SU蛋白和一部分TM蛋白，其包括融合域、跨膜結構域和對低聚物形成重要的區。七重復(H)l、七重復2及其間隔(IS)參與寡聚化。刪除了融合和卵裂(F/CL)結構域，從氨基酸503至536。刪除了七重復(H)l和2之間的間隔(IS)，從氨基酸593至620。該表達載體骨架是CMV/R，如上所述。表6中提供了預測的VRC-5737域的總結。該質粒長度位6338個核苷酸堿基對(bp)并具有約4.2MDa的分子量。SEQIDNO:5中提供了VRC-5737的序列。表6:質粒VRC-5737的描述<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>CMV/RHIV-1進化枝CEnv/h(VRC-5738)的構建為了構建圖6中圖示的DNA質粒VRC-5738,釆用為在人細胞中表達而優化的密碼子，使用來自97ZA012(R5-趨向性的，GENBANK⑧登錄號AF286K7)的包膜多蛋白(gp145delCFI)的蛋白序列來產生基因(進化枝-Cgpl45delCFI)的合成版本。該核酸序列R5gpl45delCFI顯示出與該基因97ZA012具有4艮少的同源性，但是所編碼的蛋白相同。所截短的包膜多蛋白含有完整的SU蛋白和TM域，但是缺乏融合和胞漿結構域。七重復(H)l、七重復2及其間隔(IS)參與寡聚化。從氨基酸487至520，刪除了融合和裂解(F/CL)域。從氨基酸577至605，刪除了七重復(H)l和2之間的間隔(IS)。將包含5，端的多聚接頭、Kozak序列和ATG的XbaI(ATG上游的18個氨基酸)至BamHl(ATG下游的1914個氨基酸)片段克隆在所述CMV/R骨架的Xbal至BamHl位點內。表7中提供了預測的VRC-5738域的EnvA總結。該質粒長度為6298個核苷酸堿基對(bp)并具有約4.2MDa的分子量。SEQIDNO:6中提供了VRC-5738的序列。表7:質粒VRC-5738的描述<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>實施例2:由CMV/R轉錄調節序列增加HIV抗原性多肽的表達為了評價來自含有所述CMV/R轉錄調節元件的質粒的抗原表達，用上述表達載體轉染3T3細胞，并用Western印跡法測定gpl45ACFI表達。使用磷酸鉤，在6孔板中用均表達HIV-1Envgpl45ACFI(9)的0.5jLig的親代1012(CMV)、CMV/R、RSV、RSV/R、mUB和mUB/RDNA疫苗轉染鼠成纖維細胞3T3細胞。轉染后24小Bf，收獲細胞并在50mMHEPES、150mMNaCl、含有蛋白酶抑制劑的1%NP-40中裂解。用SDS-PAGE將10/ig總蛋白電泳，并用Western印跡分析評價gpl45表達。將人HIV-IgG的1:5000稀釋液用作一抗。將HRP-軛合的山羊抗人IgG的1:5000稀釋液用作二抗。用ECLWestern印跡顯影體系(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ)顯影印跡。來自CMV/R質粒的gpl45ACFI的表達比來自所述親代1012質粒的表達高5倍至IO倍(圖8)。因此，該HILV-1R元件的添加基本上增加了由CMV啟動子引發的抗原表達。來自mUB質粒的基線表達高于來自該1012質粒的基線表達，但是其不受所述R元件的添加而進一步增強(圖8)，這證實添加該R元件的效應是啟動子-依賴性的。與RSV質粒相比，在RSV/R中觀察到表達增力口(圖8)。來自RSV質粒的表達常規地低于來自該1012質粒的表達。實施例3:CMV/R介導的fflV疫苗的免疫原性用包含所述DNA質粒疫苗VRC-HIVDNA016-00-VP的質粒構建體以及用使用重組腺病毒載體疫苗VRC-HIVADV014-00-VP的DNA質粒初始/腺病毒載體加強方案在小鼠和非人類靈長類中實施非臨床性免疫原性研究。在這些非臨床性免疫原性研究中通過7干擾素(IFN-力ELISPOT分析測試細胞免疫應答，該分析通過來自免疫動物的外周血單個核細胞(PBMC)定量測定IFN-7的產生。將該細胞體外暴露于HIV-1抗原(跨越在所述疫苗中表達的蛋白的長度的一系列短的重疊肽)中。由抗原致敏的T-淋巴細胞產生的IFN-7與包被分析板的抗體結合，并可作為斑點形成細胞(SFC)通過使用堿性磷酸酯酶軛合的讀出系統比色定量計數。該結果以SFC每百萬PBMC的形式表達。采用表達HIV-1基因的、組成與臨床級疫苗VRC-HIVDNA009-00-VP(4質粒疫苗，第WO/05034992號PCT公開)或VRC-HIVDNA016-00-VP相同的質粒實施DNA質粒初始方案。在臨床前免疫學研究中使用的所述重組腺病毒載體疫苗由GMP級VRC-HIVADV014-00-VP(批號026-03017，2005年4月12日提交的第PCT/US2005/12291號PCT申請)組成，該VRC-HIVADVO14-00-VP由編碼進化枝Bgag/pol和進化枝A、B和CEnv組成，由GenVec，Inc.Gaithersburg,MD提供。表8提供了所述質粒的總結。表9中總結了在小鼠和非人類靈長類中實施的免疫學研究的列表式表8:VRCDNA疫苗的臨床前和臨床研究概要<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>結論與用所述1012骨架構建的質粒相比，具有gwg-;o/-"e/接受用表達HIV-1Gag、Pol、Nef和進化枝A、B和CEnv(VRC-HIVDNAO16-00-VP)<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>炎^翁碼2収-"0/-^/"廚合蛋冷的cmf/及x^在的凝神力潔碼河一廚和蛋^的釆修彿的^在初^在'/、^沐力^發^^的H/F^掙弄'/i勿應^多為了探索增強的抗原表達導致體內改進這些新DNA疫苗的免疫原性的可能性，用均表達HIV-1Envgpl45ACFI的50/xg的親代1012DNA疫苗或CMV/R、RSV/R、mUB或mUB/RDNA疫苗免疫Balb/c小鼠(N-5只/組)。在第0周、第2周和第6周將小鼠免疫三次。最后一次免疫接種后第10天，通過IFN-7和TNF-a細胞內細胞因子染色(ICS)分析評價脾細胞的Env-特異性細胞免疫應答。與表達同一抗原的該親代1012DNA疫苗相比，該CMV/RDNA疫苗引起約2倍高的CD4+(p:0.15)和CD8+(p-0.043)T淋巴細胞應答(圖9)。相反，該RSV/R、mUB和mUB/RDNA疫苗不引起增強的CD8+免疫應答，這表明關于所述CMV啟動子，所述HTLV-1R元件選擇性地改進免疫原性。隨后將均表達其它抗原的所述親代1012DNA疫苗和所述CMV/RDNA疫苗的免疫原性進行了比較。用假質粒或用表達HIV-1Gag-Pol-Nef融合蛋白的這些DNA疫苗免疫小鼠(N-8只/組)。在第0周和第6周時將小鼠免疫兩次，并用在首次免疫或加強免疫后3周收獲的脾細胞通過IFN-7ELISPOT分析評價細胞免疫應答。采用生理鹽水中稀釋的質粒的如下方案將BALB/c雌性小鼠組(每組8只小鼠)免疫進化枝Bg-;-"(1012):VRC-4306(50]Ltg/動物)；該質粒表達作為融合蛋白的Gag-Pol-Nef，且被包含在四質粒疫苗VRC-HIVDNA009-00-VP(BB誦IND10681)中；進化枝g-p-"(CMV/R):VRC-4400(50/tg/動物)；該質粒表達作為融和蛋白的Gag-Pol-Nef。第0天時用50/il總DNA向小鼠的四頭肌中進行單次肌內(i.m.)注射免疫接種。免疫接受后第21天，將小鼠處死以進行免疫分析。ICS分析。通過7干擾素(IFN-力和a肺瘤壞死因子的細胞內細胞因子染色(ICS)評價CD4+和CD8+T淋巴細胞應答。簡而言之，收獲來自免疫小鼠的脾細胞，并用覆蓋全部HIV-1Env蛋白的11個氨基酸重疊的15氨基酸肽(每個2.5jng/ml)池孵育該細胞，隨后用10Aig/ml的布雷菲德菌素A(Sigma，StLouis，MO)處理該細胞。然后將細胞固定、通透、并用大鼠抗小鼠CD3、CD4、CD8、IFN-7和TNF-a單克隆抗體(BDPharmingen,圣地亞哥，CA)進行染色。用FlowJo方案(TreeStar，Ashland，OR)分析在CD4+和CD8+細胞群中的IFlSky和TNF-a陽性細胞。無菌取出脾細胞并將其均漿以產生單細胞混懸液。然后用接種小鼠的脾細胞實施IFN-7ELISPOT分析已評價疫苗-引起的細胞免疫應答的量值。用100/xl/孔的含10/ig/ml大鼠抗小鼠IFN-7(Pharmingen，圣地亞哥，CA)的PBS包被過夜的96孑L多篩板用含0.25%Tween-20的無內毒素的Dulbecco，sPBS(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)洗滌，并在37。C用含5%FBS的PBS封閉2小時。將該培養板用含0.25%Tween-20的Dulbecco，sPBS洗滌三次，用含10%FBS的RPMI1640漂洗，并在含有混合肽的100/xl反應容積中用5xl()S脾細胞每孔進行重復三份的孵育。使用HTV-1Gag、Pol和Nef肽池(VRC，Bethesda，MD)測定應答。孵育18小時后，用含0.25%Tween-20的Dulbecco，sPBS洗滌9次，并用蒸餾水洗滌一次。然后將該培養板用75/xl/孔的jng/ml生物素化的大鼠抗小鼠IFN-7(Pharmingen，圣地亞哥，CA)孵育2小時，用CoulterWash(CoulterCorporation,Miami,FL)洗滌6次，并用鏈霉抗生物素AP(SouthernBiotechnologyAssociates,伯明翰，AL)的1:500稀釋液孵育2小時。用CoulterWash洗滌5次并用PBS洗滌1次后，將該培養板用NBT/BCIP(Pierce,Rockford，IL)色原顯影，通過用自來水洗滌來終止，空氣干燥并用ELISPOT讀數器(HitechInstruments,Edgemont，PA)讀數。免疫數據用帶有標準誤的平均值表示。用GraphPadPrism4.01版本(GraphPad軟件有限公司，2004)實施統計分析。通過兩尾非參數Mann-Whitney檢驗進行動物組之間平均細胞免疫應答的比較。在所有情況中，認為小于0.05的p值是顯著的。與先前的試驗一致，我們觀察到在首次免疫后，與所述親代1012DNA疫苗相比，由所述CMV/RDNA疫苗引起大約2倍高的Gag-特異性(p-0.038)和Pol-特異性(p-0.020)應答(圖10A)。在加強免疫后，使用未分級的脾細胞(圖10B)和CD-8衰竭的脾細胞(圖IOC)時，由該CMV/RDNA疫苗引起的應答仍然比由該親代DNA疫苗引起的應答高大約2倍。DA^々始/fjg靡^喜裁沐》g強義^的漱凝的^;^^^在獼猴中，將表達多種HIV-1抗原的CMV/RDNA疫苗與所述親代1012DNA疫苗的免疫原性進行比較。用1012或CMV/RDNA疫苗的表達來自進化枝A、B和C的HIV-1Envgpl45ACFI和來自進化枝B的Gag-Pol-Nef融合蛋白的4種質粒的1:1:1:3混合物免疫兩組成年獼猴(N=6/《iL)。該多進化枝、多價DNA疫苗先前已進行了描述并且目前正在臨床試驗中進行評價(VRC-HIVDNA009-00-VP;第WO/05034992號PCT公開)。第三組猴子用來調查將Gag-Pol-Nef融合蛋白分離到由單獨質粒編碼的單獨基因內是否增加對這些抗原的免疫應答(VRC-HIVDNA016-00-VP)。該第三組猴子接受編碼來自進化枝A、B和C的HIV-1Envgpl45和來自進化枝B的Gag、Pol和Nef蛋白的六種質粒的1:1:1:1:1:1混合物。所有的猴子均在第O周、第4周和第8周時接受8mg總DNA疫苗的三次免疫。表達HrV-lGag、Pol、Nef蛋白或Gag-Pol-Nef融合蛋白和進化枝A、B和CEnv的質粒DNA載體(AltheaTechnologies,Inc.,圣地亞哥CA)用于所述DNA初始免疫。該質粒表達與4-質粒疫苗VRC-HIVDNA009-00-VP和6-質粒疫苗VRC-HIVDNA016-00-VP中所含的蛋白相同的蛋白。用1012質粒VRC4306(進化枝BGag-Pol-Nef)、VRC5305(進化枝AEnv)、VRC2805(進化枝BEnv)和VRC5309(進化枝CEnv)配制4-質粒組合。為了在動物研究中達到三次預定注射的需要量，制備三批配制的材料。將該三批材料混合在50mL圓錐管中。將該試管倒置數次以混合，將15.6-15.7mL的該混合物等分在三個50mL圓錐管的每一個管中。用研究號、批號、質粒數、試管號和制備日期標記試管。將試管在-20。C下貯存直到^皮分配為止。用CMV/R質粒VRC4401(進化枝BGag)、VRC4409(進化枝BPol)、VRC4404(進化枝BNef)、VRC5736(進化枝AEnv)、VRC5737(進化枝BEnv)和VRC5738(進化枝CEnv)配制6-質粒組合。為了在動物研究中達到三次預定注射的需要量，制備三批配制的材料。將該三批材料混合在無菌容器中。將該容器倒置數次以混合，將16.8mL的該混合物等分在三個50mL圓錐管的每一個管中。用研究號、批號、質粒數、試管號和制備日期標記試管并在-20。C下酔存直到被分配為止。VRC-HIVADV014-00-VP(批號026-03024)用作rAd加強劑。用DNA疫苗初始物接種遠交的成年獼猴(每組6只猴)，在第0周、第4周和第8周時用Biojector肌內輸送該疫苗。在每種情況中，用3號Biojector注射器(BIOJECT)向四頭肌內2次注射0.5ml的質粒疫苗以進行輸送。通過針和注射器在第38周(組l)和第24周(組2)時肌內輸送rAd疫苗加強劑。實施如下接種方法組1:1012質粒DNA初始物(4-質粒組合):以進化枝BGag-Pol-Nef融合蛋白(4mg)、進化枝AEnv(l.3mg)、進化枝BEnv(1.3mg)和進化枝CEnv(1.3mg)的組合輸送8mg總劑量。其是所述VRC-HIVDNA009-00-VP臨床產品(BB-IND10681)的非-GMP版本。rAd疫苗加強劑VRC-HIVADV014-00-VP(10"PU總劑量；GMP批號026-03024)。組2:CMV/R質粒DNA(6-質粒組合):以進化枝BGag(1.3mg)、進化枝BPol(1.3mg)、進化枝BNef(1.3mg)、進化枝AEnv(1.3mg)、進化枝BEnv(1.3mg)和進化枝CEnv(1.3mg)的組合輸送8mg總劑量。其是所述VRC-fflVDNA016-00-VP臨床產品(該IND提交物)的非-GMP版本。rAd疫苗加強劑:VRC-HIVADV014-00-VP(GMP批號026-03024)。組3:CMV/R質粒DNA(4質粒組合)以進化枝BGag-Pol-Nef融合蛋白(4mg)、進化枝AEnv(1,3mg)、進化枝BEnv(1.3mg)和進化枝CEnv(1.3mg)的組合輸送8mg總劑量。rAd疫苗加強齊，J:VRC-HIVADV014-00-VP(GMP批號026-03024)。組4:1012質粒DNA(6質粒組合)以進化枝BGag(1.3mg)、進化枝BPol(1.3mg)、進化枝BNef(1.3mg)、進化枝AEnv(1.3mg)、進化枝BEnv(1.3mg)和進化枝CEnv(1.3mg)的組合輸送8mg總劑量。rAd疫苗加強劑:VRC-HIVADV014-00-VP(GMP批號026-03024)。免疫后42周內在不同時間間隔內對猴子^jfe。ELISPOT分析用于監測疫苗引起的對多種病毒抗原的T細胞免疫應答的出現。采用涵蓋與所述疫苗免疫原的序列匹配的所述HTV-1Gag、Pol、Nef、進化枝AEnv、進化枝BEnv和進化枝CEnv蛋白的11個氨基酸重疊的15氨基酸肽池對每只動物實施單獨分析。用100/^1/孔的含5jiig/ml抗人IFN-t(B27;BDPharmingen)的無內毒素的Dulbecco，sPBS(D-PBS)將96孔多篩板包被過夜。然后將該培養板用含0.25%Tween-20的D-PBS(D-PBS/Tween)洗滌三次，在37。C下用含5%FBS的D-PBS封閉2小時，用D-PBS/Tween洗滌三次，用含10%FBS的RPMI1640漂洗以除去該Tween-20，并用肽池和含2xl05PBMC的lOOjiil反應容積重復三份進行孵育。在37。C下孵育18小時后，將該培養板用D-PBS/Tween洗滌9次并用蒸餾水洗滌1次。然后在室溫下將該培養板用2pg/ml的生物素化的家兔抗人IFN-7(Biosource)孵育2小時，用CoulterWash(Beckman-Coulter)洗滌6次，并用鏈霉抗生物素蛋白國AP(SouthernBiotechnology)的1:500稀釋液孵育2.5小時。在用CoulterWash洗滌5次和用PBS洗滌1次后，將該培養板用NBT/BCIP色原(Pierce)顯影，通過用自來水洗滌來終止，空氣干燥并用ELISPOT讀數器(HitechInstruments)讀數。計算斑點形成細胞(SFC)每106PBMC。培養基背景始終如一為<15斑點形成細胞每106PBMC。在CMV(1012)(組l)或CMV/R調節元件(組3)的控制下，在接受所述4質粒混合物的猴子中將抗Env進化枝A、Env進化枝B、Env進化枝C和來自進化枝B的Gag、Pol和Nef的細胞免疫應答進行比較。在第6周進行第二次免疫后2周時，用所述親代1012DNA疫苗免疫的猴子對Env產生低且散發的IFN-7ELISPOT應答，以及未檢測到對Gag、Pol和Nef的清晰的高于背景的應答(圖11A)。相反，用所述類似物CMV/RDNA疫苗免疫的猴子對所有抗原表現出顯著增高的應答(圖IIB)。與該親代1012DNA疫苗相比，該CMV/RDNA疫苗在此時間點上對Gag(p=0.0022)、Pol(p-0.0043)和Nef(p=0.041)引起>10倍高的ELISPOT應答，以及對Env進化枝A(p=0.026)、B(p峋.0087)和C(p-0.030)引起7至9倍高的應答。這些結果證實與該親代1012DNA疫苗相比，在非人類靈長類中該CMV/RDNA疫苗對多種HIV-1抗原具有明顯更多的免疫原性。將所述Gag-Pol-Nef融合蛋白分離在不同質粒上編碼的單獨基因內可進一步改進這些應答。特別地，與接受包括該Gag-Pol-Nef融合蛋白在內的CMV/RDNA疫苗的4質粒混合物的動物相比(圖IIB)，接受所述CMV/RDNA疫苗的6質粒混合物的猴子(組2)對Gag(p-0.0022)產生4倍高的應答，對Pol(p-0.19)產生2倍高的應答趨勢和對Nef(p-0.049)產生4倍高的應答(圖IIC)。在接受CMV/RDNA疫苗的4質粒混合物和6質粒混合物的兩組猴子之間，Env-特異性應答是可比的(p-0.48)。在第0周、第2周、第6周、第10周和第12周時評價了這些組猴子中平均IFN-7ELISPOT應答的發展。在第8周進行第三次DNA免疫后，在所有的猴子組中應答增加(圖12)。在第10周時，所述親代1012DNA疫苗在大多數動物中引起Env-和Pol-特異性應答，雖然Gag-和Nef-特異性應答仍然低(圖12A)。相反，所述CMV/RDNA疫苗對所有抗原引起有效且廣泛的應答(圖12B-C)。與所述4質粒親代1012DNA疫苗相比(圖12A)，在第10周時，所述4質粒CMV/RDNA疫苗(圖12B)對Gag(p-0.0022)和Nef(p-0.0022)引起〉10倍高的ELISPOT應答，對Pol(p-0.043)引起4倍高的ELISPOT應答，且對Env進化枝A、B和C引起1.5至4倍高的應答趨勢(圖12B)。在接受所述的具有在單獨質粒上編碼的這些基因的6質粒CMV/RDNA疫苗的動物中，Gag-、Pol-和Nef-特異性應答保持最高(圖12C)。rAd良好地加強了所有應答。這些研究證實與所述親代1012DNA疫苗相比，所述CMV/RDNA疫苗對多種抗原基本上引起較高的量值及較廣的細胞免疫應答。因此，將包括所述HTLV-1R元件和單獨的所述Gag、Pol和Nef基因可在非人類的靈長類中顯著增強HIV-1DNA疫苗的免疫原性。在小鼠和獼猴中，表達HIV-1抗原的CMV/RDNA疫苗比表達同一抗原的所述親代1012DNA疫苗引起更高的細胞免疫應答。但是，在兩個物種之間所觀察到的效應的量值基本上不同。雖然該CMV/RDNA疫苗在小鼠中只引起2倍高的應答(圖10)，但是在兩次免疫后該CMV/RDNA疫苗在獼猴中對Gag、Pol和Nef引起〉10倍高的細胞免疫應答，且對Env引起7至9倍高的應答(圖11和12)。這些差異反映出該親代1012DNA疫苗在非人類的靈長類中具有較低的基線免疫原性且表明所述R元件的有益作用在有限的情況中是更明顯的。與該觀察一致，該R元件在增強由該親代1012DNA疫苗引起的抗Gag和Nef的最弱的應答方面具有最大的作用。但是，與該親代1012DNA疫苗相比，當由CMV/RDNA疫苗誘發時，Env-和Pol-特異性細胞免疫也是明顯增高的。與包括所述Gag-Pol-Nef融合蛋白在內的CMV/RDNA疫苗的4-質粒混合物相比，包括單獨質粒上的Gag、Pol和Nef的CMV/RDNA疫苗的6-質粒混合物顯著引起對這些抗原的顯著增高的細胞免疫應答。這些作用特別值得注意，因為該單獨的Gag、Pol和Nef質粒每一個均以所述編碼Gag-Pol-Nef融合蛋白的質粒的三分之一劑量應用。不受理論束縛，與該融合基因相比，該增加的免疫原性可反映出所述較短基因的增強的翻譯或mRNA穩定性，這可有效地影響抗原加工和呈遞。累積的數據證實細胞免疫應答在控制人體內HIV-1復制和獼猴體內SIV復制方面具有重要性。此外，旨在引起病毒特異性細胞免疫應答的疫苗在獼猴中提供部分控制SHIV和SIV激發。因此，在本研究中，在非人類靈長類中由所述CMV/RDNA疫苗提供的HIV-1特異性細胞免疫應答的量度和寬度的顯著增加被認為在HIV-1和其它病原體的第二代DNA疫苗的開發中是有益的。特別地，引入所述HTLV-1R元件并用單獨的基因代替融合基因表現了簡單且實用的策略以改進DNA疫苗，產生這些適于臨床應用的疫苗。實施例4:臨床應用的材料的制備用于制造，填充和包裝所述VRC-HIVDNA016-00-VP藥品的方法包括大腸桿菌發酵、純化和配制為用于肌內注射的無菌液體注射劑型。該棵露DNA產品不包含脂質、病毒或細胞載體組分。所述疫苗VRC-HIVDNA016-00-VP由六種閉合的環狀質粒DNA大分子(VRC-4401、4409、4404、5736、5737和5738)的組合組成。為了制備用于臨床應用的質粒，制備用于每種來源的質粒(VRC-4401、4409、4404、5736、5737和5738)的肥大細胞帶(MCB)。通過序列分析確證來自這些MCB中每種MCB的質粒DNA樣品的同一性和組成。還實施限制酶分析和微生物分析(包括霉菌和酵母)以證實同一性和無菌。從含有卡那霉素選擇培養基的細菌細胞培養物中制備大批質粒制劑。在所有情況中，細菌細胞生長是依賴于由所述質粒DNA的一部分編碼耐卡那霉素蛋白的細胞表達。含所述質粒的細菌細胞生長后，從細胞組分中純化出該質粒DNA。在cGMP條件下制備臨床試驗疫苗。給藥前該疫苗符合分批發放規格。將所述DNA疫苗以4.0mg的劑量在磷酸緩沖鹽水(PBS)中制備。將小藥瓶無菌填充1:1:1:1:1:1比例的所述六種質粒至1.2mL容積。將該4.0mg質粒DNA疫苗小藥瓶在干水上運至(非盲化)研究藥劑師，并貯存在誦20。C或以下直到孑吏用為止。從Bell國MoreLabs，Incorporated(HampsteadMD)中獲得2.4mLPBS(pH7.2±0.2)的安慰劑對照小藥瓶。在發放所述疫苗產品之前，進行所述單獨的質粒和所述最終配制的藥品的表達測試。通過將Western印跡上的反應蛋白帶與相同條件下跑膠的標準物進行比較來檢驗所述質粒蛋白的定量表達。一旦將所述質粒組合，用相同的分析操作檢驗表達。通過檢測由轉染的293人胚腎(HEK)細胞表達的蛋白測定表達。對于轉染，采用磷酸鉤方法，用l-5/xg的質粒DNA轉染105至106細胞。將細胞孵育14-20小時以允許DNA攝取。更換培養基后，在收獲前將細胞再生長另外24-48小時。采用公知的具有相同骨架類似裁體監測轉染率。細胞裂解后，將10/ig的適當量的總細胞蛋白負載在SDS-PAGE凝膠上以分離粗溶胞產物蛋白。電泳約1.5小時后，將所述蛋白轉染到硝酸纖維素膜(0.45/mi)上以進行Western印跡分析。在用所述一抗孵育60分鐘后，將該膜用脫脂乳封閉以阻止非特異性結合相互作用。洗滌后，將該膜用HRP軛合的二抗孵育45分鐘。通過用化學發光底物孵育該膜并暴露在X-射線膠片2分鐘或適當時間完成所述蛋白帶的顯色。通過觀察表達的蛋白在Western印跡上的強度測定由轉染的細胞產生的蛋白的表達。將該分析進一步發展以允許對所述疫苗質粒的蛋白表達進行半定量分析。實施例5:人體內的臨床安全-性對于臨床應用，VRC-HIVDNA016-00-VP由6中閉合的環狀DNA質粒組成，每種該質粒為該疫苗的16.67%(重量比)。在該6種疫苗中每一種質粒表達單一基因產物。將質粒VRC4401、VRC4409和VRC4404設計為分別表達進化枝BHIV-1Gag、Po1和Nef。將VRC5736、VRC5737和VRC5738設計為分別表達泉自進化技A、進化枝B和進化枝C的HIV-1Env糖蛋白。以4mg/mL提供疫苗小藥瓶。采用Biojector2000Needle-FreeInjectionManagementSystemTM(無4十注射才喿作系統)肌內(三角肌內)輸送lmL所述疫苗組合物來進行每種DNA給藥。所述疫苗的安全性評價包括臨床醫師進行的實驗室研究、醫學史、體格評價以及日志卡片上記錄的受試者的自我評價。在繼續所述免疫程序之前還評價潛在的不良反應。第0天被確定為登記并進行首次注射的日期。在進行首次注射前的第0天評價是隨后安全性評價的基線。接種程序是第0天、第28±7天和第56土7天(在每次注射之間至少有21天)。通過采用Biojector2000⑧無針注射系統將VRC-HIVDNAO16-00-VP以4mg的劑量肌內給藥來進行全部的研究注射。研究注射被給藥入三角肌。進行研究注射后，觀察受試者最少30分鐘。在免疫后30-45分鐘時獲得生命征象(體溫、血壓、脈搏和呼吸頻率)。檢查注射部位是否有局部反應的跡象。給受試者"日志卡片"以在該卡片上記錄5天內每天的體溫和癥狀。在每次注射后第一天或第二天通過電話進行的健康受試者追蹤觀察。如果電話會談表明，則進行診所就診。在每次注射當天(注射前)及每次注射后第14土3天，通過臨床檢查和實驗室測試評價所研究的受試者。長期的追蹤就診是第12周±7天、第24周士14天和第32周±14天。在全部過程的間隔，對所研究受試者抽血以進行免疫分析。將未使用的任何細胞、血清或血漿貯存以將來進行病毒學分析和免疫分析。還在最后的臨床就診(第32周)時關于社會傷害與受試者會談，該社會傷害包括就業問題、旅行、移民、獲得保險、醫療護理或牙科護理以及來自家庭、朋友和同事的負面反應。產品安全性的評價包括臨床觀察和血液和化學參數的監測。將評價以下參數局部反應原性體征和癥狀；全身反應原性體征和癥狀；安全性的實驗室測定；以及不良和嚴重不良經歷。在第0周(基線)和第6、8、10和12周(對于細胞免疫應答)時測定主要免疫原性終點，該終點由通過細胞內細胞因子染色(ICS)分析測定的HIV-l-特異性T細胞應答組成。在其它研究時間點的ICS以及由HIV-特異性抗體分析測定的HIV-1-特異性體液免疫應答將作為探索性評價來完成。按該公司指導，采用BIOJECTOR2000NEEDLE-FREEINJECTIONMANAGEMENTSYSTEM⑧進行所述疫苗組合物的給藥。所注射的材料和三角肌注射部位皮膚的準備均按標準操作。簡而言之，將該注射部位消毒并使該區域完全干燥。當所述注射器相對于注射部位以90°角放置時，將該注射部位周圍的皮膚穩固地固定。按壓執行器并將該材料釋放到肌肉內。繼續穩固地保持3秒。注射后，將該部位用無菌覆蓋物覆蓋并用3根手指按壓1分鐘。BIOJECTOR2000⑧使用適于最高達l.OmL的可變劑量藥物給藥的無菌一次性注射器。通過貯存在BIOJECTOR⑧內的壓縮的C02氣藥筒在壓力下將所研究的試劑輸送。當壓下BIOJECTOR的執行器時，釋放co2，使活塞將所研究的試劑推出無菌注射器通過皮膚進入下面的組織。所研究的試劑以高速在不到一秒內通過微孔噴出，刺穿皮膚。co2不與注射劑接觸并且所設計的注射器防止任何后濺或防止該裝置#1受試者的組織污染。十五名受試者按照第0月、第1月、第2月的程序表以4mg/mL三次接受lmL的劑量。使用BIOJECTOR2000⑧肌內給藥來進行接種。15名受試者中14名接受了三次通過BIOJECTOR2000⑧給藥的肌內注射的4mg劑量的疫苗；一名受試者在兩次接種后未再追蹤觀察。接種后沒有受試者報告發燒。除了兩名受試者報告注射部位中度疼痛以及一名受試者報告中度惡心和不適之外，反應性為無至輕微。需要速報給IND召集者僅有的不良事件是3級全身蕁麻滲。受試者已報告在第一次接種后約2周開始服用抗組織胺藥，但是那時報告原因是橡膠過敏癥。當VRC010被篩選以進行再加強劑研究時，了解到當停止抗組織胺藥供給時，受試者大約在第二次接種后經歷全身蕁麻滲。受試者患有慢性蕁麻滲，并被抗組織胺藥良好地控制。進行評價。病因學是未知的，但是此時因為其可能與所研究的疫苗相關，所以評估慢性蕁麻滲。迄今為止，存在兩個可能歸因于疫苗的中度(2級)不良事件。在一名受試者(該受試者接受第三次接種而沒有癥狀再發生)中這些不良事件是在第二次接種接后第13天開始，持續2天的間歇頭暈，以及在另一名受試者中這些不良事件是無癥狀的低血糖，首先在第三次接種后第14天追蹤觀察就it時注意到。未再追蹤觀察的那名受試者的最后一次安全性評價是在第二次接種后第一天通過電話進行的；那時該受試者報告沒有來自接種引起的副作用。已觀察到了該DNA疫苗的未預料到的局部注射部位反應。在44例接種中有4例接種(9%)給藥后，在所接種的部位出現輕度皮膚損傷(直徑0.5-1.0cm)，15名受試者中有三名受試者(20%)出現這些損傷。在所研究的接種后如果受試者經歷任何異常問題，均按常規要求訪問該受試者。該接種部位的皮膚損傷程度不足以警告患者促使其在下一次按規律排定的就診前聯系VRC診所。在回顧中，三名受試者報告他們經歷了皮膚損傷，該皮膚損傷在接種后三天內以小丘滲或小水泡的形式出現。幾天后，該丘滲或小水泡除去蓋并形成結痂。在周圍有輕度紅斑和輕度硬結。在結痂脫落后，無需處理皮膚愈合。該皮膚損傷不與膿泡滲出液、發熱、滲或蕁麻滲相關。它們似乎不是局部感染或變態反應。在第一次接種后診所就診(第14±3天)時發現前三例皮膚損傷；那時它們大多都沒問題了。在該診所中檢查出第四例皮膚損傷，雖然其仍處于活動期并在接種后第6天^皮活組織檢查。該活組織檢查i正明顯微可見的皮下和皮膚血管周圍淋巴細胞浸潤。該浸潤幾乎只由CD3陽性細胞組成，包括CD4+和CD8+細胞。存在很少的嗜酸性粒細胞和很少的巨細胞。該過程似乎對主要是具有皮膚現象的接種的皮下和皮膚反應。這些反應是否與所述疫苗誘導的免疫應答的強度相關依然是未知的。14名保持追蹤觀察的受試者中8名受試者由商業測試表明在一個或多個時間點上具有疫苗誘導的陽性HIVELISA反應；這包括具有皮膚損傷的所有三名受試者。所述6-質粒DNA的初步免疫原性數據表明Env-特異性T細胞應答與在所述4-質粒DNA中看見的應答相似，且也存在Gag-和Nef-特異性應答。在用表達所述病毒抗原的肽池刺激后，通過細胞內細胞因子染色(ICS)和流式細胞計測定受試者體內細胞應答以檢測在CD4+和CD8+T淋巴細胞中的IFN-7或IL-2(圖13)。每名單獨受試者的數據顯示于列中。對每一肽池的應答顯示于行中。每一條柱表示從接種前至12周(最后一次接種后4周)的全部的時程。每一條柱的刻度為所測試的總CD4+或CD8+群的0-0.2%。CD4+應答顯示為紅色以及CD8+應答顯示為綠色。幾乎所有的受試者可檢測到對Env肽的應答。相反，對于所述4-質粒產品，大多數受試者可檢測到對Gag的應答以及也存在Nef應答者。實施例6:嵌合的Env蛋白的免疫原性為了證實不同遺傳序列在誘導中和抗體中的作用，產生了表達嵌合的抗原性多肽的核酸構建體，該抗原性多肽具有來自兩種不同進化枝的病毒包膜的不同區。分析編碼進化枝CEnv多肽和進化枝BEnv多肽的不同部分的核酸構建體并將其與進化枝CEnv多肽進行比較。在進化枝B背景上進化枝C的近25%的轉座，顯示增加了抗多種進化枝B分離物的中和的有效性和廣度，并改進了進化枝C分離物的中和。用進化枝CEnv置換進化枝B的遠側區導致改進了抗進化枝B分離物的中和，這表明含有該進化枝B分離物內的V3的區對其抑制多種不同病毒分離物的能力起作用。這些核酸構建體由SEQIDNOs:7-15表示。因此，所公開的組合物的某些實施方案可包括編碼組合多種進化枝的嵌合的Env多肽的構建體。為了證實其它進化枝中V區的作用，在進化枝A、B和C的ViV2和V3區內產生突變。為了證實進化枝A中V!V2的作用，將進化枝A原型與包含VI和V2區缺失的進化枝A比較。V,V2和/或V3的去除增強了所述進化枝AEnv多肽引起中和多種進化枝B分離物的免疫應答的能力，這表明這些區的缺失增加了所述抗原性多肽引起廣泛地中和抗體的能力(例如，通過增加對引起可交叉反應的抗體的特異性表位的可接近性)。因此，在本文公開的某些實施方案中，所述核酸構建體包括V,、V2和/或V3區的缺失。為了證實進化枝B中的ViV2抗來自進化枝C的異源V3的作用，將來自南非進化枝C分離物的V3插入來置換來自進化枝B的V3并與已顯示出增強中和的采用進化枝BV3環的莖縮短的版本比較。評價了這些質粒DNA栽體與重組腺病毒加強劑聯合引起抗所示病毒林的中和抗體的能力。用兩個V3替代進行的免疫使來自進化枝A、B和C的病毒分離物中和，雖然應答的量值比該莖縮短的1ABV3更大。另夕卜，所述肽抑制表和C的V3區相互作用。因此，該進化枝CV3環似乎引起廣泛反應的V3中和抗體。這些包膜中V,和V2區的缺失改善了引起中和抗體應答的能力。這些應答大多是抗不同進化枝中的V3區。衍生于不同進化枝的其它V區的應用證實這些V區在引起病毒株特異性應答的能力方面表現出差異。例如，包含來自進化枝C的V3區允許中和多種進化枝B分離物并通過來自不同病毒林的V3肽進行更大廣度的中和。因此，消除V!和V2區以及存在具有更廣泛反應性的V3可增強由Env抗原性多肽介導的中和。除了V3-介導的中和外，當V3不被暴露時，其它可變區也可起病毒中和的作用。在這些區中，鑒定了V!中的高度暴露區。雖然該區很可能顯示病毒抹特異性變異，但是在V,內還存在保守區，該保守區起增加對該可變環的免疫應答的廣度的作用。使用基于病毒多樣性的遺傳信息來定義改進的免疫原的能力可改進設計有效的HIV疫苗的能力。上述結果表明所述基因型序列變異可產生不依賴于進化枝的中和靈敏度。此發現在設計基于遺傳序列的改進的HIV免疫原方面具有重要的意義。本公開發明的原理可應用到的許多可能的實施方案中，應認識到所述示例性實施方案只是本發明的優選實施方案并不應理解為限制本發明的范圍。本發明的范圍受權利要求所定義。我們因此要求保護在這些權利要求范圍和精神內的我們的發明。權利要求1.能夠在免疫活性個體中引起抗HIV的免疫應答的組合物，所述組合物包含多種不同的核酸構建體，每種核酸構建體包含與CMV/R轉錄控制序列可操作地連接的編碼HIV抗原性多肽的多核苷酸序列，其中所述多種核酸構建體編碼多種HIV進化枝或病毒株的抗原性多肽。全文摘要本公開提供了引起包括預防性免疫應答在內的抗人免疫缺陷病毒免疫應答的組合物。該組合物包括編碼多種進化枝或病毒株的HIV抗原性多肽的核酸構建體。還提供了通過將該組合物向個體給藥來引起免疫應答的方法。文檔編號A61P31/00GK101277971SQ200580031207公開日2008年10月1日申請日期2005年7月15日優先權日2004年7月16日發明者加里·J·內伯,嵐吳,凌徐,楊志勇,比馬爾·沙克拉博蒂,賈森·G·D·加爾,里克特·C·金,越黃申請人:美國政府健康及人類服務部;金維克有限公司