抗滑膜素抗體的制作方法

專利名稱：抗滑膜素抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及抗滑膜素抗體。更詳細地講，本發明涉及能抑制滑膜素自身泛素化的抗體，含有該抗體的醫藥組合物，應用上述抗體檢測表達滑膜素的細胞的方法。
背景技術：
類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種關節的滑膜組織異常增殖的全身性炎癥性疾病。滑膜細胞(synovial cells)是一種成纖維細胞樣細胞，在關節的滑膜內形成1～6層上皮樣細胞層，提供滑液中的蛋白聚糖和透明質酸。可以觀察到RA患者的關節內滑膜組織增殖，結果引起多層結構，滑膜細胞浸潤到其它組織。此外，RA患者的血清中存在針對自身免疫球蛋白(IgG)Fc段的自身抗體。這種叫做RA因子的自身抗體很久以來已用作RA的特征性診斷指標。
但是作為自身免疫性疾病的RA的病因尚未明確。基于RA因子檢測的RA診斷，并未闡明疾病特異性抗體的產生系統，因此，它與病因的關聯還不明確。
RA的病態/病情經過從(a)生物體內的多種免疫反應，及(b)伴隨骨破壞的關節滑膜增殖這2個方面考慮，與前者免疫反應相關的有許多研究，正在闡明其分子水平的本質。但是，與后者關節滑膜細胞相關的研究，不局限于RA本身，其細胞生物學特征尚未明確。
因此為了闡明RA的發病經過，本發明者們研究了慢性、難治性疾病的發病和進展背后的分子機制。首先，以RA患者的人滑膜培養細胞作為免疫原，獲得抗人滑膜細胞抗體，與滑膜細胞的cDNA文庫進行免疫篩選，尋找在RA患者的滑膜組織中表達的新基因。成功分離出該基因，鑒于表達其所編碼的蛋白質的組織為滑膜細胞(synovial cell)，故將其命名為滑膜素(synoviolin)，闡明了其生理意義(WO02/052007號小冊子)。發明者們發現的滑膜素，與作為RA疾病的主因的滑膜組織的異常增殖密切相關，期待在診斷中能提供重要信息。此外，通過蛋白質結構預測得知，滑膜素編碼具有環指功能域(RING finger motif)的E3泛素連接酶。該功能域對蛋白質的泛素化發揮重要作用。實際上，證明它具有自身泛素化的活性，所以推測其對蛋白質功能有調控作用。
本發明者們，在進行滑膜素與信號轉導相關的研究時初次發現，滑膜素具有泛素化連接酶作用，能引起自身泛素化(self-ubiquitination)。
發明的公開如上所述，期望開發出能抑制滑膜素自身泛素化反應的抗體、含有該抗體的醫藥組合物等。
為了解決上述課題，本發明者們進行了廣泛研究，結果在滑膜素具有泛素化連接酶作用，能引起自身泛素化(self-ubiquitination)的基礎上，發現了抑制滑膜素自身泛素化的抗體，從而完成了本發明。
也就是說，本發明如下(1)一種能抑制滑膜素自身泛素化的、針對滑膜素的抗體或其片段。該抗體或其片段可以不影響滑膜素的底物蛋白質的泛素化。此外，該抗體可以是單克隆抗體。
(2)上述能抑制滑膜素自身泛素化的抗體或其片段，是用包含序列號3～5任一項所示的氨基酸序列的多肽為抗原免疫動物，通過其抗體產生細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合獲得的雜交瘤產生的、針對滑膜素的單克隆抗體或其片段。
(3)一種雜交瘤，是包含序列號3～5所示任一氨基酸序列的多肽作抗原免疫動物，將免疫動物的抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合獲得的，它產生能抑制滑膜素自身泛素化的單克隆抗體。
(4)一種能抑制滑膜素自身泛素化的、針對滑膜素的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，用包含序列號3～5所示任一氨基酸序列的多肽作抗原免疫動物，培養其抗體產生細胞與骨髓瘤細胞的融合細胞，從所得培養物中獲取上述單克隆抗體。
(5)一種含有(1)或(2)中抗體或其片段的醫藥組合物。該醫藥組合物可用于治療或預防，例如細胞增殖性疾病關節炎、癌癥、纖維癥、動脈硬化、Castleman病、多發骨髓瘤、局限性回腸炎、全身性若年特發性關節炎、腦腫瘤、舌癌、咽喉癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽道癌、膽囊癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、皮膚癌、急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴細胞白血病、成人型T細胞白血病、惡性淋巴瘤。
(6)一種滑膜素自身泛素化的抑制劑，其含有(1)或(2)中的抗體或其片段。
(7)一種含滑膜素的細胞的檢測試劑，其含有(1)或(2)中的抗體或其片段。
(8)一種因滑膜素引起的細胞增殖性疾病的檢測用試劑，它含有(1)或(2)中的抗體或其片段。細胞增殖性疾病包括，例如關節炎、癌癥、纖維癥、動脈硬化、Castleman病、多發骨髓瘤、局限性回腸炎、全身性若年特發性關節炎、腦腫瘤、舌癌、咽喉癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽道癌、膽囊癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、皮膚癌、急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴細胞白血病、成人型T細胞白血病、惡性淋巴瘤等。另外，上述細胞選自滑膜細胞、破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髓細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞、真皮細胞、肌肉細胞、神經細胞、淋巴細胞、血管平滑肌細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮內皮細胞、肺胞上皮細胞、未分化間質系細胞、外胚層頂脊。
(9)一種抑制滑膜素自身泛素化的方法，其特征在于使(1)或(2)中的抗體或其片段與滑膜素進行反應。
(10)一種滑膜素表達細胞的檢測方法，其特征在于使(1)或(2)中的抗體或其片段與生物樣品進行反應。
(11)一種因滑膜素引起的細胞增殖性疾病的檢測方法，其特征在于讓(1)或(2)中的抗體或其片段與從待檢者采集的生物樣品進行反應。細胞增殖性疾病及細胞的種類與前面相同。另外，上述細胞選自滑膜細胞、破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髓細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞、真皮細胞、肌肉細胞、神經細胞、淋巴細胞、血管平滑肌細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮內皮細胞、肺胞上皮細胞、未分化間質細胞、外胚層頂脊。
本說明書中所引用的所有技術文獻均作為參考在此引用。
附圖簡述

圖1是用SL-1抗體對關節炎患者(RA2樣本)及變形性關節炎患者(OA2樣本)來源的滑膜細胞進行Western印跡的結果照片圖。
圖2是用SL-1抗體對RA患者來源的滑膜細胞進行熒光免疫染色的結果照片圖。
圖3是用SL-1抗體對RA患者來源的滑膜組織的免疫染色結果及HE染色圖像。
圖4是通過Western印跡分析SL-1抗體抑制MBP-dTM Syno-His融合蛋白自身泛素化的照片。
圖5是通過Western印跡分析SL-1抗體不影響因滑膜素引起的GST-P4HA1融合蛋白的泛素化的照片。
實施發明的最佳狀態以下對本發明進行詳細說明。
1.概要本發明的抗體是針對滑膜素的抗體，能夠抑制滑膜素的自身泛素化。是用滑膜素的RING finger區域的部分氨基酸序列構成的肽作抗原進行免疫而獲得的。
泛素化是在泛素活化酶(E1)、泛素偶聯酶(E2)、泛素連接酶(E3)等酶的共同作用下，使底物蛋白質順次結合泛素的過程。泛素化的生理意義，傳統的認識是作為標簽修飾，將蛋白質輸送到蛋白酶體系統的蛋白質降解結構中。通過后來的研究，現在的觀點是泛素化的意義在于，將其定位于調控蛋白質功能的可逆性蛋白質修飾系統。
本說明書中“自身泛素化(self-ubiquitination，autoubiquitination)”是指由于滑膜素具有泛素連接酶活性，滑膜素自身成為泛素化的底物蛋白，不需其它泛素連接酶自己就能結合泛素。滑膜素的自身泛素化是由本發明者們發現滑膜素具有連接酶活性而闡明的。也就是說，在小鼠中，通過過表達滑膜素可自然發生伴隨滑膜細胞增殖的關節病(WO02/052007)(Amano T，et al.，Genes Dev.17(19)2436-49，2003)。另一方面，E3泛素連接酶的RING finger結構域是酶的活性中心，即使該結構域中僅1個氨基酸發生了置換完全失去酶活性。實際上，表達滑膜素的酶活性中心的1個氨基酸突變體(C307S)的小鼠中完全不出現關節炎(如上，Amano T，等)。這提示自身泛素化對滑膜素的功能表達很重要，滑膜素的自身泛素化成為滑膜素的代表性功能。而且，其自身泛素化不僅能觀察到內源性的滑膜素的全長分子，而且還可產生僅滑膜素的胞內部分與標簽蛋白質融合的滑膜素。在以上發現的基礎上，本發明者們進行廣泛研究，完成了本發明的抗體。
本發明中的“抗體”是指所有能與抗原滑膜素或其部分片段結合的抗體分子(既可以是多克隆抗體也可是單克隆抗體)，此外還包括其片段，即具有抗原抗體反應活性的活性片段，具體而言，包括Fab、F(ab′)2、重組體Fv、單鏈Fv。
2.滑膜素(1)滑膜素及其等價的蛋白質為了獲得滑膜素的抗體，除滑膜素之外，可應用與之同等或等價的蛋白質、它們的片段或部分肽等作為免疫原。它們中的任何一種均可成為抗滑膜素抗體的抗原。其理由是，與其說，通常抗體是通過識別抗原蛋白質結構整體而誘導產生，倒不如說，是通過識別作為表位部分的蛋白質表面的微小區域而被誘導的。這些表位部位是由多肽鏈的連續部分或不連續部分而形成的。因此，對于滑膜素的一種類型的抗體，作為表位發揮作用的部位對應滑膜素的固定的肽部位。
本發明中使用的滑膜素的種類，可以是人、小鼠、大鼠等來源的滑膜素，但并不限定于此。作為滑膜素，可使用例如包含序列號2中氨基酸序列多肽。
還可應用與滑膜素同等或等價的蛋白質作為抗原(如后述)。
(2)從生物樣品進行制備可從RA患者的滑膜組織中獲得滑膜素。由于滑膜細胞可以在體外培養，所以可以從其培養物中回收滑膜素。具體而言，以通過外科滑膜切除術(synovectomy)從RA患者切除的滑膜組織等為基礎，從該組織中分離出滑膜細胞。若培養分離的細胞，可作為附著性細胞回收滑膜細胞。(Nakajima T et.al.，J.Clin.Invest.92186-193，1993)。可聯合應用公知的蛋白質純化技術從回收的細胞中提取、純化滑膜素。所得滑膜素或其片段可作為獲得抗體的免疫原。
(3)通過基因工程技術進行制備滑膜素不僅可以從生物樣品獲得，也可將表達滑膜素的基因重組到適當的表達體系中，作為基因重組體的表達產物而獲得。
編碼滑膜素的多聚核苷酸的來源不限。也就是說，除基因組DNA、cDNA之外，也可合成。此外，核酸既可以是DNA，也可是RNA。只要是編碼滑膜素，包含基于遺傳密碼子簡并的具有任意堿基序列的多聚核苷酸，或者含有修飾的核苷酸的序列。
分離編碼滑膜素的多聚核苷酸，可以從上述RA患者的滑膜細胞提取出的mRNA為基礎獲得cDNA文庫，進行克隆。也就是說，通過PCR等擴增cDNA文庫，篩選雜交的克隆，獲得預期的多聚核苷酸(ShortJ.M，et.al.，Nucleic Acid Res.167583-7600，1988)。編碼序列號2中所示多肽的DNA的堿基序列示于序列號1中。作為將編碼滑膜素的多聚核苷酸重組到適當的表達體系的合適的宿主/載體體系，具體實例有表達載體pGEX和大腸桿菌。
除此之外，利用細菌作宿主時，有商品化的利用His tag、HA tag、FLAG tag等的融合蛋白質的表達載體。作為宿主/載體體系，利用畢赤酵母(Pichia)屬酵母的表達體系、或者以昆蟲細胞作宿主的利用桿狀病毒載體的表達體系，可有效表達有糖鏈修飾的蛋白質。再者，利用哺乳動物的細胞，可進行利用巨細胞病毒(CMV)啟動子、Rous肉瘤病毒(RSV)啟動子、或者SV40等的啟動子的載體進行轉染。
另外，本發明中也可從上述滑膜素基因或上述載體收集滑膜素。也就是說，本發明中通過無活細胞的無細胞蛋白質合成體系，可生產滑膜素。
無細胞蛋白質合成體系是應用細胞提取液在試管等人工容器內合成蛋白質的體系。本發明中使用的無細胞蛋白質合成體系也包含以DNA為模板合成RNA的無細胞轉錄體系。
該情況下，與上述宿主對應的生物，相當于下面細胞提取液的來源生物。此時，上面的細胞提取液可使用真核細胞來源的或原核細胞來源的提取液，例如使用小麥胚芽、兔網織紅細胞、小鼠L-細胞、HeLa細胞、CHO細胞、芽殖酵母、大腸桿菌等的提取液。這些細胞提取液既可是濃縮的也可是未濃縮的。
細胞提取液可通過，例如超濾、透析、聚乙二醇(PEG)沉淀等獲得。此外，本發明中，也可應用商品化的試劑盒進行無細胞蛋白質合成。這樣的試劑盒包括，例如PROTEIOSTM(東洋紡)、TNTTMSystem(Promega)、合成裝置PG-MateTM(東洋紡)、RTS(Roche diagnostics)等。
通過如上細胞蛋白質合成而獲得的滑膜素，可適當選擇前述的色譜進行純化。
(4)滑膜素具有同等功能的蛋白質能成為制備抗滑膜素單克隆抗體的抗原的蛋白質，不僅包含從滑膜細胞提取出的人滑膜素，還包含與滑膜素具有同等功能的各種蛋白質。這樣的蛋白質可以是人工合成的也可是天然產生的。還包含人滑膜素的氨基酸序列中因1個或數個氨基酸發生置換、缺失、附加和/或插入等而發生突變的蛋白質，或者氨基酸側鏈等發生修飾的修飾蛋白質、與其它蛋白質的融合蛋白質。
這些蛋白質中氨基酸的突變或修飾個數、或者突變或修飾部位無特殊限制，只要能保持滑膜素的功能即可。例如可使用序列號2中所示的氨基酸序列中因1個或幾個(例如1個或數個)氨基酸發生置換、缺失、附加和/或插入等而突變的蛋白質，或者氨基酸側鏈等發生修飾的修飾蛋白質。
具體的講，可使用(i)序列號2中所示的氨基酸序列中1個或幾個(例如1個或數個)(例如1～10個，優選1～5個)氨基酸缺失了的氨基酸序列；(ii)序列號2中所示的氨基酸序列中1個或幾個(例如1個或數個(例如1～10個，優選1～5個))氨基酸被其它的氨基酸置換了的氨基酸序列；(iii)序列號2中所示的氨基酸序列中附加了1個或幾個(例如1個或數個(例如1～10個，優選1～5個))其它氨基酸的氨基酸序列；(iv)包含組合了上述(i)～(iii)的氨基酸序列、且具有與上述滑膜素同樣作用的突變型滑膜素多肽。
另外，本發明中使用的多肽，只要其具有與滑膜素同等的功能，也可是與上述滑膜素的氨基酸序列具有同源性的多肽。包括與上述滑膜素多肽的氨基酸序列具有約85％以上、優選約90％以上、更優選約95％以上的同源性的氨基酸序列等。
編碼上述序列號2中所示氨基酸序列中1個或幾個氨基酸發生缺失、附加或插入的氨基酸序列的多聚核苷酸，可參照「Molecular Cloning，A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press 1989)、「Current Protocols in Molecular Biology」(John Wiley&Sons 1987-1997)、Kunkel T.A，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-92，1985等中描述的位點特異性突變誘導方法等方法進行制備。
另外，向多聚核苷酸中導入突變時可按照Kunkel法和Gappedduplex法等公知的技術方法，應用利用了位點特異性突變誘導方法的突變導入試劑盒進行，例如應用QuikChangeTMSite-DirectedMutagenesis Kit(Stratagene公司)、GeneTailorTMSite-DirectedMutagenesis System(Invitrogen)、TaKaRa Site-Directed MutagenesisSystem(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等TaKaRa公司)等。
上述“同等功能的蛋白質”是指，第1，與滑膜素在免疫學上同等的蛋白質。也就是說，作為與滑膜素同等功能的蛋白質，包含滑膜素的功能域，只要其能與特異性識別滑膜素、存在于RA患者血清中的抗體進行反應即可。
第2，與滑膜素同等功能的蛋白質是根據與滑膜素結合的配體蛋白質的結合特性而定義的。例如，HMG-CoA Reductase Degradation 3(Hrd3)、原膠原-脯氨酸、2-酮戊二酸4-過氧化物酶 (プロリン4ヒドラキシラ一ゼ(hydraxylase))、α多肽I(P4HA1)、Homocysteine-indusible endoplasmic reticulum stress-indusibleubiquitin-like domain member 1(Herp)等(專利2003-295951、專利2004-076931、專利2003-350704)。
第3，與人滑膜素同等功能的蛋白質包括具有促進滑膜增生活性的蛋白質。導入了人滑膜素基因的轉基因小鼠中，可觀察到顯著頻率的伴隨關節炎的指腫脹，組織學上可確認這些指關節中出現伴隨滑膜增生的骨破壞和異常的骨新生。
第4，與人滑膜素同等功能的蛋白質包括具有參與正常骨形成或四肢發育活性的蛋白質。在發育過程中，滑膜素在頭頂骨、四肢、耳等骨和軟骨形成的部位強表達，在四肢形成期，可觀察到在ApicalEctodermal Ridge(AER；外胚層頂脊)及軟骨、骨骺部位強表達。
第5，本發明中與人滑膜素同等功能的蛋白質，也可基于滑膜素具有的生物化學活性，例如泛素連接酶活性進行定義。這些生物化學活性表現在滑膜素中發現的各種結構域、實驗結果等中。
(5)與滑膜素素融合蛋白質或修飾蛋白質與滑膜素同等功能的蛋白質中也包含氨基酸殘基的修飾、保守的置換、缺失、附加或插入、糖鏈等生理的或人為的修飾、熒光和放射性物質的標記、或與其它蛋白質的融合等加入了各種修飾的蛋白質。例如，在上述基因重組體中，有可能因表達的宿主而產生糖鏈修飾的差異。但是，即使其糖鏈修飾不同，但只要其顯示滑膜素同樣的性狀，均作為滑膜素或其同等功能的蛋白質。
作為與其它蛋白質的融合蛋白質的例子有，附加了FLAG標簽、HA標簽、或His標簽等附加氨基酸序列、至少維持作為上述與滑膜素同等功能的蛋白質的至少一種性狀的蛋白質。或者還包括，即使具有不同于滑膜素的活性，但擁有滑膜素擁有的至少一種功能的融合蛋白質。
由于滑膜素即使是其胞內結構域也能使自身泛素化，所以，本發明中應用的滑膜素是除去了細胞膜貫穿部位的滑膜素dTM。例如，本發明中也可應用該dTM與上述標簽蛋白質融合了的MBP-滑膜素dTM-His。
或者還包括，即使具有不同于滑膜素的活性，但擁有滑膜素擁有的至少一種功能的融合蛋白質。
3.抗原的制備可應用上述滑膜素或其同等蛋白質作為制備抗滑膜素抗體的抗原。但是抗體的檢測中不僅可應用抗原分子本身(即滑膜素或其等價蛋白質)，還可采用應用其蛋白質片段、片段肽、包含化學合成的寡肽與適當載體的復合體作抗原的多種方法。其理由是，特別優勢的表位、或者在臨床上較有些意義的表位特異的分析體系，不易受到非特異性反應的影響。也就是說，由此可有效實施后述雜交瘤的克隆化和克隆篩選，且能獲得抗體效價高的抗滑膜素單克隆抗體。與可識別作為表位部位的抗原蛋白質高級結構中的多數區域相比，優選雖然特異性稍低但可識別少數特定結構低級結構中也能識別特定的少數特定結構。
在獲得針對滑膜素的特異性及親和性高的單克隆抗體的過程中，下述的途徑是有效的。具體而言，在后述獲得免疫學活性的功能域肽的方法的基礎上，能確定出作為表位的功能域。
已知表位至少由3個氨基酸殘基構成。與其它蛋白質間的免疫學識別則至少有8個氨基酸殘基才能實現。因此，選自滑膜素或其等價蛋白質的氨基酸序列，至少是連續的8個氨基酸殘基、通常為9個氨基酸殘基、優選10個氨基酸殘基、更優選11～15個氨基酸殘基、尤其是與患者血清中的抗體反應的片段，可作為本發明中抗體檢測用抗原。
再者，針對構成表位的寡肽，通過加入各種修飾而提高其免疫學反應性的方法是業內人士公知的。例如，添加人血清白蛋白等無活性蛋白質、或者附加了無義氨基酸序列的修飾可提高其免疫學反應性。
滑膜素的片段，可通過使用胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白酶進行消化，或應用溴化氫(ブロモシアン)等進行化學切斷，或聯合應用二者進行。可利用色譜、電泳等公知的分離技術，將目的肽從生成的肽混合物中分離純化出來。
其它的方法，隨機切斷編碼滑膜素的DNA，將之插入到噬菌體載體中，制備提呈功能域肽的噬菌體庫，由此而獲得。用識別滑膜素的抗體進行免疫篩選，可確定出這些文庫中有免疫學活性的功能域。
從上述觀點看，通過檢索滑膜素的親水性譜與其它抗原性指標的分析方法，可首先確定出推斷氨基酸殘基數14個以上的、較適宜的肽部分。作為候選免疫原的這些肽也可通過液相法或固相法等肽合成技術這些公知技術合成。以Merrifield法為代表的固相合成法簡便可在短時間內進行。
作為α-氨基保護基可應用標準的叔丁基氧羰基(Boc)，也可應用Sheppard等開發的9-芴甲氧羰基(Fmoc)基(Atherton，E&Sheppard，R.C，J.Chem.Soc.Chem.Comm.165，1985)(參照泉屋信夫、他著「ペプチド合成の基礎と実験」194～233頁、丸善、1985年)。
本發明中也可利用基于固相合成法的自動化肽合成儀。合成的肽，可在三氟醋酸等從存在下從樹脂上分離下來，然后通過逆相高效色譜進行純化。純化的肽其純度在85％以上。
上述候選肽中，通過從免疫動物采集的多克隆抗體與滑膜素進行反應，酶標記抗IgG抗體進行檢測反應顯示陽性的肽，可作為本發明的制備抗體用的免疫抗原。
作為免疫原，尤其是有用的滑膜素片段，至少包括一個包含以下氨基酸序列的肽。
Syno-P3(SLALTGAVVAHAYYC/序列號3)、Syno-P2(TCRMDVLRASLPAQS/序列號4)、Syno-P1(GAATTTAAGTSATAC/序列號5)這些肽與載體蛋白質結合而制備成的免疫原可產生滑膜素特異的、且具有足夠親和性的抗體。作為免疫原有用的滑膜素的上述肽與匙孔戚血藍蛋白(KLH)載體蛋白結合，致敏動物。
為了獲得免疫原而使用的其它載體物質包括結核菌素純化蛋白衍生物、破傷風變性毒素、霍亂毒素及其B亞基、白喉毒素、卵白蛋白、牛血清白蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑、胞壁酰二肽、褐色的脂蛋白等。肽與載體結合的反應、試劑等可參照公知的文獻(例如，大海忍、他著細胞工學別冊実験プロトコ一ルシリ一ズ新版抗ペプチド抗體実験プロトコ一ル「遺伝子産物の同定からタンパク質機能解析まで」秀潤社1994年；Coligan J.E et al.，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，Vol.1，p.9.4.1-9.4.11，1991)。
4.免疫(1)滑膜素多克隆抗體的制備將如上制備的抗原施用給哺乳動物。對哺乳動物無特定限制，例如大鼠、小鼠、兔等，優選兔。
每只動物抗原的施用量是，不應用佐劑時，兔1～10mg，應用佐劑時0.1～1mg。佐劑包括完全氟氏佐劑(FCA)、不完全氟氏佐劑(FIA)、氧化鋁佐劑等。主要通過注入到靜脈內、皮下、腹腔內等進行免疫。此外，對免疫的間隔無特殊限制，數日～數周間隔、優選2～5周間隔，免疫1～10次，優選2～5次。然后，在最終免疫日6～60天后，用酶免疫測定法(ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)或EIA(enzyme immunoassay))、放射性免疫測定法(RIA；radioimmunoassay)等測定抗體效價，在小時最大抗體效價的時候采血，獲得抗血清。
其后，用ELISA法等測定抗血清中多克隆抗體對這些蛋白質的反應性。
(1)滑膜素單克隆抗體的制備(i)抗體產生細胞的采集用能成為免疫抗原的滑膜素或免疫學上同等的蛋白質、或其片段或片段肽作免疫原，單獨或與載體及稀釋劑一起施用到哺乳動物可能產生抗體的部位，以制備單克隆抗體。此時，為了提高抗體產生能力，優選與佐劑等混和施用(Adv.Tubercl.Res.，1130-148，1956)。佐劑包括FCA、FIA、氧化鋁佐劑等。
單克隆抗體的獲得是讓免疫細胞(具體而言抗體產生細胞)與骨髓瘤細胞間形成融合細胞，使該細胞克隆化，篩選出產生滑膜素特異的抗體的克隆(Kohler，G.&Milstein，C，Nature 256495-7，1975)。
免疫時，用包含上述肽的復合體(或者滑膜素或其免疫學上同等的蛋白質、或其片段)作免疫原，每次，例如20μg～1mg，與適當的佐劑溶解或混和后，給動物進行免疫。
作為免疫動物應用的哺乳動物包括小鼠、豚鼠、兔、大鼠、綿羊、山羊、猴、狗等，通常從容易操作考慮，特別優選小鼠或兔。希望抗體產生細胞與骨髓瘤細胞來源于同種類型的動物。施用，通常3～6個月，每2～6周施用一次，施用2～10次。
抗體產生細胞的采集是從抗原致敏的上述動物中選擇抗體效價得到認可的個體，在最終免疫的2～5天后，采集脾臟細胞、淋巴結細胞或B淋巴細胞。讓其中所含抗體產生細胞與具有自身增殖能力的骨髓瘤細胞融合。通過篩選能產生本發明的抗滑膜素單克隆抗體的克隆，從所生成的雜交瘤中制備出能產生單克隆抗體的雜交瘤。其程序基本上按照Kohler的方法(″Immunological Method″，Academic Press，New York，391，1979)。
(ii)細胞融合可使用公知的技術進行融合操作，例如上述Kohler和Milstein的方法。骨髓瘤細胞包括P3U1、NS-1、SP2/0等來源于小鼠骨髓瘤的細胞株或其突變株等，但特別優選P3U1。作為融合劑包括聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒等，優選應用PEG。融合時，將骨髓瘤細胞懸浮到不含血清的RPMI1640培養基等中，向該懸浮液中加入上面制備的包含脾細胞等抗體產生細胞的溶液，靜置。回收離心分離的細胞，加入含PEG的RPMI1640培養基，37℃培養2～4分鐘，完成細胞融合。
離心，回收雜交瘤，轉移到HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤及胸腺嘧啶核苷)培養基中，分到96孔培養板中，培養規定的時間。培養，通常在5％CO2、孵箱中、20～40℃、優選34～38℃。通常在1周后觀察到雜交瘤形成的集落。培養的時間通常是5日～3周，優選1～2周。
(iii)抗體篩選及克隆化單克隆抗體的篩選通常可用添加了HAT的動物細胞培養基進行。對篩選及培養用的培養基無特殊限制，只要雜交瘤能在其中生長即可。例如可應用雜交瘤培養用無血清培養基、含胎牛血清(fetal calfserum；FCS)的RPMI培養基、GIT培養基等。
用酶抗體法等測定觀察到增殖的孔的培養上清中針對肽的抗體效價，例如通過有限稀釋法進行雜交瘤的克隆化，可獲得本發明的雜交瘤的克隆。
對所形成的本發明的雜交瘤的篩選操作一般如下。向直接或與載體一起吸附了作為免疫原應用的肽的微孔等固相中，添加雜交瘤培養上清，接下來添加放射性物質、用酶等標記的抗免疫球蛋白抗體或ProteinA，檢測結合到固相上的單克隆抗體，這樣的方法很便利。或者向吸附了抗免疫球蛋白抗體或ProteinA的固相中添加雜交瘤培養上清，接下來添加標記抗原，檢測結合到固相上的單克隆抗體。
通過上述操作篩選出陽性孔，數日后，將一陽性株接種到一96孔培養板中，100細胞/培養板，培養10～14天。確定集落，培養上清同樣適用于上面篩選用的抗原固相化培養板，可同樣進行檢測。篩選的集落，在培養后進行再克隆化，培養10～14天，實施與上面同樣的集落確定和培養上清的鑒定。篩選出親株不同的孔，在24孔培養板中進行培養，回收上清，進行克隆的檢測，鑒定抗體的亞型及抗體產生。
(iv)單克隆抗體的產生及其分離體外培養如上篩選出的克隆SL-1，能產生本發明的單克隆抗體SL-1抗體。其培養，可使用該技術領域慣用的方法。
用體外培養的培養基培養雜交瘤SL-1時，可很容易的從其培養物中分離出SL-1抗體。為了提高增殖速度、抗體產生 率，可對培養基種類的選擇與維持、培養條件的管理(例如培養基內氧濃度、攪拌速度、污染)進行探求。
利用除人之外的溫血動物克隆培養時，可從其腹水和/或血液中收集單克隆抗體。例如，將克隆接種到補足了胎牛血清的RPMI1640培養基等中，使之達到規定的細胞密度，培養箱中，5％CO2存在下、37℃培養。接下來，將其培養物接種到預先施用了降植烷的小鼠腹腔內，在預定的時間內，按常規方法飼養。通常1～2周后，收集腹水，向其中添加硫酸銨，進行鹽析沉淀。利用色譜等從其級分中分離、純化單克隆抗體。
從培養物或腹水和/或血液分離單克隆抗體的方法，與常規的多克隆抗體的純化方法相同，就是免疫球蛋白的分離純化法。也就是說，可以適當的組合應用鹽析法、透析法、過濾法、濃縮、乙醇沉淀法，等電點沉淀法、各種電泳法、離子交換(DEAE樹脂等)吸脫著法、超離心法、凝膠過濾法、特異的親和純化法等。隨后對生成的單克隆抗體進行濃縮、干燥，按用途制備成液狀或固體狀。
(iv)人源化或人型化抗體本發明中抗體包括人型化或人源化抗體。
人抗體可與常規的單克隆抗體同樣制備，只是把免疫體系換成人，免疫哺乳動物即可。
人型化抗體是恒定區域和可變區域的一部分為人型的抗體，它是一種重組抗體，可變區域中框架區域(FR)來源于人，稱為CDR的互補性決定區域(complementarity determining region)來源于小鼠。制備人型化抗體時，CDR從小鼠抗體的可變區域移到人可變區域，然后將這些人型化的重構人可變區域連接到人恒定區域。人型化抗體的制備方法，可按照基因工程學方法獲得，在該技術領域已經確立(杉村和久「本格化する抗體醫療！抗體エンジニアリンクと抗體醫薬のすベて」Bioベンチヤ一Vol.2 No.4羊土社2002年)。
(3)本發明的抗體的特征(i)能抑制滑膜素的自身泛素化也就是說，可用于因滑膜素自身泛素化所導致的疾病的治療。
(ii)不影響滑膜素的底物蛋白P4HA1的泛素化也就是說，對與P4HA1的泛素化相關的生理功能沒有影響。
(iii)本發明抗體的亞類是IgG1。
5.本發明單克隆抗體的用途由于本發明的抗體(例如SL-1抗體)能特異性識別滑膜素或其部分肽，所以我們認為它有多種多樣的利用形式。以下，以SL-1抗體為例說明其幾個典型的利用方式。
(1)抑制滑膜素自身泛素化反應泛素化是在泛素活化酶(E1)、泛素偶聯酶(E2)、泛素連接酶(E3)等酶的共同作用下，使底物蛋白質順次結合泛素的過程。如上所述，滑膜素的自身泛素化是指，由于滑膜素具有泛素連接酶的活性，滑膜素自身可成為泛素化的底物蛋白質，不需其它泛素連接酶就能自己結合泛素。
上述泛素活化酶(E1)、泛素偶聯酶(E2)等酶類有商品化的，可適當應用。其應用范圍是，96孔微孔培養板的每孔中，E110～50ng，優選20～40ng，E20.1～0.5μg，優選0.2～0.3μg。
作為對泛素化必要的低分子反應因子，可適當選擇MgCl2、MgSO4等Mg鹽、ATP、EDTA、NAF、DTT(二硫蘇糖醇)、崗田酸(okadaicacid)等。這些化合物均有商品化的產品，很容易獲得。
再者，溶解酶類或試劑的緩沖液、洗滌用緩沖液、測定用緩沖液、反應終止緩沖液等，可使用任意的公知的緩沖液(例如、Tris-HCl)，只要其不使酶失活、或者抑制反應即可。
應用His標簽融合蛋白質MBP-dTM Syno-His，與如上制備的單克隆抗體、抗FLAG抗體或小鼠IgG混和，4℃1.5小時，進行抗原抗體反應。
其后，進行自身泛素化反應。通常滑膜素的自身泛素化反應按以下條件進行。向一定量的成為反應溶劑的緩沖液(pH6～8)中分別添加上述量的對滑膜素的自身泛素化必要的反應物質(滑膜素或其活性衍生物除外)，室溫孵育5～30分鐘。然后添加滑膜素或其活性衍生物，或固化的滑膜素的活性衍生物，開始滑膜素的自身泛素化反應。室溫～37℃的溫度下，孵育20～120分鐘，加入一定量的終止緩沖液(含有0.2 M硼酸緩沖液、TritonX-100及EDTA)終止反應。然后，測定與滑膜素結合的泛素或未結合的泛素的含量，求出自身泛素化的程度。
(2)檢查、診斷、治療效果或藥效判定方面的利用滑膜素在RA患者的滑膜組織中強表達。此外，在RA患者的血中可高頻度地檢測出識別滑膜素的抗體(自身抗體)。另一方面，在健康者的血中，基本上檢測不出滑膜素的抗體。滑膜素抑制體外培養的滑膜細胞的增殖。對于促進滑膜細胞增殖的配體，認為其是與滑膜素相競爭的。基于這些信息，推定如下分子機制。即，滑膜素在滑膜細胞的強表達，促進與對滑膜細胞具有增殖促作用的滑膜素的配體的結合，結果促進滑膜細胞的增殖。因此，滑膜細胞的異常增殖即導致RA的病癥。
基于這樣的發現，利用SL-1抗體的免疫學特性可提供細胞增殖性疾病的檢測方法或診斷方法。細胞增殖性疾病包括，例如關節炎、癌癥、纖維癥、動脈硬化、Castleman病、多發骨髓瘤、局限性回腸炎、全身性若年特發性關節炎、腦腫瘤、舌癌、咽喉癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽道癌、膽囊癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、皮膚癌、急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴細胞白血病、成人型T細胞白血病、惡性淋巴瘤等，但并不限定于此。此外，與癌相關的不管是原發性還是轉移性。另外，細胞包括滑膜細胞、破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髓細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞、真皮細胞、肌肉細胞、神經細胞、淋巴細胞、血管平滑肌細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮內皮細胞、肺胞上皮細胞、未分化間質系細胞、外胚層頂脊等，但并不限定于此。
這些方法包括(i)待檢者的生物樣品與本發明的抗體反應，檢測樣品中存在的疾病標記物的步驟，及(ii)將步驟(i)中的檢測結果與疾病關聯的步驟。
上面的標記物可應用以下(a)～(d)中所示的任一種標記物。這些標記物的測定方法后面講述。
(a)滑膜素或與滑膜素同等功能的蛋白質；(b)滑膜素或與滑膜素同等功能的肽(c)與滑膜素或與滑膜素同等功能的蛋白質結合的抗體，及(d)與滑膜素或與滑膜素同等功能的肽結合的抗體。
例如，若在從待檢者獲得的血液樣品中能檢測到與滑膜素或與滑膜素同等功能的蛋白質或肽反應的抗體，則該待檢者為RA的可能性高。
或者，在從患者采集的滑膜組織中發現滑膜素或與滑膜素同等功能的蛋白質的表達，則提示因RA造成的滑膜組織的增生。蛋白質的表達通常以蛋白質自身或攜帶其信息的mRNA的存在為指標進行檢測。滑膜素的檢測優選應用本發明的SL-1抗體進行滑膜素的檢測。滑膜細胞、滑膜組織等、或體液中檢測到滑膜素時，認為RA為進行性。
除RA的診斷之外，包含本發明抗體的免疫學分析用試劑對治療效果或藥效的判定有用。用基本上與RA的診斷同樣的方法進行RA的治療效果或藥效的判定。滑膜組織和血液中滑膜素或其抗體的水平，與編碼這些蛋白質的基因的表達增減相關，它們的檢測具有可作為指示癥狀推移、疾病緩解的指標的意義。
本發明的SL-1抗體還可用于表達滑膜素的細胞的分離或檢測。包括滑膜細胞、破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髓細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞、真皮細胞、肌肉細胞、神經細胞、淋巴細胞、血管平滑肌細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮內皮細胞、肺胞上皮細胞、未分化間質系細胞、外胚層頂脊等，但并不限定于此。除在發生過程中的外胚層頂脊表達外，滑膜素在風濕病滑膜細胞、滑膜、骨·軟骨及成為肢體原基的未分化間質細胞中強表達。因此，滑膜素可作為，特別優選作為外胚層頂脊、風濕病滑膜細胞及未分化間質細胞的標記物使用。
也就是說，以滑膜素的表達為指標，可檢測或分離滑膜細胞、破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髓細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞、真皮細胞、肌肉細胞、神經細胞、淋巴細胞、血管平滑肌細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮內皮細胞、肺胞上皮細胞、未分化間質系細胞、外胚層頂脊，特別是外胚層頂脊、風濕病滑膜細胞及未分化間質細胞。例如，將針對滑膜素的抗滑膜素單克隆抗體與用適當的熒光等標記的細胞進行反應，通過細胞分選等分離出表達滑膜素的細胞。分離出的未分化間質細胞在體外或體內對組織、例如、肌肉、肌腱、脂肪、及骨髓等的基質(stroma)、骨·軟骨的形成、或關節的再建有用。再建的組織和器官不僅可在基礎研究利用，還可有再生醫學的應用。
本發明的抗體也可用于純化滑膜素抗體柱的制備、純化時各級分中存在的該蛋白質的檢測。但與本發明相關的特異性抗滑膜素單克隆抗體的利用并不僅限定于這些用途。
(3)應用免疫學分析用試劑的分析下面，對包含SL-1抗體的免疫學分析用試劑如何在上述用途中使用進行具體講述。
針對樣品中的抗原或抗體的免疫學分析方法有很多，一般已經普及。應用針對滑膜素或其片段等的單克隆抗體的測定法無特殊限定。樣本中的抗原量，既可通過化學的或物理的手段檢測與滑膜素的量相對應的抗體或抗原-抗體復合體的量測定，也可從應用含已知量的抗原的標準溶液制備的標準曲線計算出其含量的測定方法。作為抗原-抗體復合體量的檢測方法，具體而言，適于應用競爭法、免疫測定法、用懸液計測量懸液(nephelometry)、三明治法等。從靈敏度和特異性考慮，特別優選以下的三明治夾心法。
三明治法(例如ELISA法)是，將待檢樣本(含有定量對象滑膜素)與固相化的本發明的SL-1抗體進行反應(1次反應)，再與標記了的抗滑膜素抗體進行反應(2次反應)，通過測定固相化載體上標識劑的活性，可對待檢樣本中滑膜素的量進行定量。該情況下，1次反應與2次反應可逆順序進行，也可同時進行，也可錯開時間進行。2次反應中應用的抗體，優選應用其滑膜素結合部位與本發明的SL-1抗體不同的抗體。
使用本發明的單克隆抗體的免疫測定法是，將待檢樣本中的抗原與固相化抗原對一定量的標記化單克隆抗體進行競爭性反應后，分離固相與液相。或者，將待檢樣本中的抗原與過量的標記化單克隆抗體進行反應，接著加入固相化抗原，使未反應的標記化抗體結合到固相上后，分離固相與液相。接下來測定任一相中的標記量，對待檢樣本中的抗原量進行定量。
競爭法是，將待檢樣本中的抗原與標記抗原對抗體進行競爭性反應，然后分離(B/F分離)未反應的標記抗原(F)、與抗體結合的標記抗原(B)，測定B、F中的標記量，對待檢樣本中的抗原量進行定量。作為其它的方法，有應用可溶性抗體，使用聚乙二醇進行B/F分離、使用針對上述抗體的第2抗體等的液相法；應用固相化抗體作第1抗體，或者第1抗體用可溶性的，用固相化抗體作第2抗體。例如，將固化到載體上的本發明的抗滑膜素單克隆抗體及標記化的抗體與待檢樣本同時或連續進行競爭性結合反應，然后測定固相化載體上的標記劑的活性。
Nephelometry法是測定凝膠內或溶液中抗原抗體反應結果產生的不溶性沉淀物含量。因待檢樣本中抗原量少而僅得到微量的沉降物時，優選應用利用激光散射的laser Nephelometry。
為了檢測分析樣品中的抗體，將抗原敏化的板與樣品中的抗體進行反應，用特異的抗原標記抗體檢測被捕捉到板表面的成為檢測對象的抗體的方法是常用的抗體的免疫學分析方法(Immunochemistry，8871-879，1971)。或者，可使用本發明的SL-1抗體作為標記抗體檢測板上的未結合抗原。此外，將吸附了抗原的乳膠顆粒與樣品混和，作為免疫學的凝集反應檢測抗體的方法也是公知的(Plotz C.M &Singer J.M，Am.J.Med.，21888-892，1956)。免疫學的粒子凝集反應是一種能對1種試劑進行迅速分析的方法，是一種適于大規模篩選的方法。
本發明的SL-1抗體作為細胞分離或檢測用試劑應用時，抗滑膜素單克隆抗體可與其它溶媒和溶質聯合應用形成組合物。例如可與蒸餾水、pH緩沖溶液、鹽、蛋白質、表面活性劑等聯合應用。
反應試劑有可通過適當的化學或物理的檢測手段進行檢測的標記。應用這樣的標記物的測定方法中所使用的標記劑有，例如熒光物質、酶、放射性同位素、發光物質等。用酶進行標記時，叫做ELISA法，被廣泛應用。
作為熒光物質，示例有熒光胺、熒光異硫氰酸鹽等，作為酶有過氧化物酶、堿性磷酸酶、蘋果酸脫氫酶、α-糖苷酶、α-半乳糖苷酶等，作為放射性同位素有125I、131I、3H、14C等，作為發光物質有蟲熒光素、ルシゲニン、魯米諾、魯米諾衍生物等。
本發明的SL-1抗體或抗原與標記劑的結合也可應用生物素-親和素體系。抗原或單克隆抗體的固相化中，可應用物理吸附，或者應用常規的蛋白質或酶等固相化，固化中應用的活性結合的方法。作為載體可應用聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、硅膠等合成樹脂、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素等不溶性多糖類、或玻璃等。
作為反應溶媒，給予最適的反應條件，包含對反應生成物的穩定有用的緩沖液、反應物的穩定劑等。
作為檢測手段，包含分光器、放射線檢測器、光發射檢測器等能檢測上述標記的儀器。
(4)檢查診斷用的試劑盒本發明的SL-1抗體用于免疫學測定方法時，沒有特別的條件、操作等的限制。在各種方法中按常規條件操作進行。必要時可構建添加若干修飾的適當的測定體系。
為了能更簡便、有效的進行測定，將上述試劑試劑盒化。通過試劑盒化，在普通的檢查室或實驗室，無需特殊的分析儀器、熟練的操作、高難的知識，即可高效地進行定量。對用于實施上述各種診斷方法或治療判定方法的檢測試劑盒的構成及形式無特殊限定，對其內容沒有限定，只要其能達成預期的目的即可。通常由解釋實行檢測方法所得結果的使用說明書、反應試劑、進行反應時的反應介質、提供檢驗場所的基材等構成。此外，期望還包含作為比較基準的或制備標準曲線的對照樣品、檢測器等。
(5)醫藥組合物本發明的抗體作為細胞增殖性疾病的治療或預防用醫藥組合物應用。細胞增殖性疾病包括，例如關節炎、癌癥、纖維癥、動脈硬化、Castleman病、多發骨髓瘤、局限性回腸炎、全身性若年特發性關節炎、腦腫瘤、舌癌、咽喉癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽道癌、膽囊癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、皮膚癌、急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴細胞白血病、成人型T細胞白血病、惡性淋巴瘤等，但并不限定于此。此外，與癌相關的不管是原發性還是轉移性。
本發明的醫藥組合物，包含以本發明的抗體或其片段作為有效成分。此外優選以包含藥學上允許的載體的醫藥組合物形式提供。
這里所講“藥學上許可的載體”包括賦形劑、稀釋劑、增量劑、崩 劑、安定劑、保存劑、緩沖劑、乳化劑、芳香劑、著色劑、甘味劑、粘稠劑、矯味劑、溶解輔助劑或其它的添加劑等。通過使用一個以上的載體，可制備成注射劑、液劑、膠囊劑、懸濁劑、乳劑或糖漿等劑型的醫藥組合物。這些醫藥組合物可以經口施用也可非經口施用。作為非經口施用的其它形式，包含一個或一個以上的活性物質，包含按常規方法處方的注射劑等。
本發明的藥劑的施用量根據患者的年齡、性別、體重及癥狀、治療效果、施用方法、處理時間、或該藥劑中所含活性成分-高親和性抗體的種類而不同，通常每個成人，一次600μg～6000mg，優選6～600mg，但并不限定于該范圍。
例如，注射劑時，可通過將其溶解或懸浮到，例如生理鹽水或商品化的注射用蒸餾水等藥學上許可的載體中，使其濃度達到1mg抗體/ml載體～100mg抗體/ml載體，進行制備。這樣制備的注射劑，對有必要進行處置的人患者，一次1kg體重10μg～100mg，優選100μg～10mg，1日施用1～數次。施用方式包括靜脈內注射、皮下注射、皮內注射、肌肉內注射或腹腔內注射等，但優選靜脈內注射。此外，可根據情況，將注射劑制備成非水性稀釋劑(例如，丙二醇、聚乙二醇、橄欖油等植物油、甲醇等醇類等)、懸浮劑或乳濁劑。這些注射劑的無菌化可通過用濾器過濾除菌、配合滅菌劑等進行。可將注射劑制備成用時制備的形式。也就是說，通過冷凍干燥等制成無菌的固體組合物，使用前溶解到無菌的注射用蒸餾水或其它溶劑中使用。
以下通過實施例對本發明再進行具體說明。這些實施例，業內人士可進行多種多樣的改變。本發明不限定于這些實施例。如果沒有特殊說明，％表示重量％。
〔實施例1〕本實施例，其目的是制備抗滑膜素單克隆抗體。
合成以下所示含人滑膜素的部分氨基酸序列的3種肽作為免疫用的肽，用于制備抗滑膜素單克隆抗體。這些氨基酸序列選自推測其有抗原性的區域。
Syno-P3(SLALTGAVVAHAYYC)(序列號3)、
Syno-P2(TCRMDVLRASLPAQS)(序列號4)、及Syno-P1(GAATTTAGTSATAC)(序列號5)各合成的肽中，借助氨基酸序列中的Cys，可與匙孔戚血藍蛋白(KLH)結合。將結合了KLH的各合成肽50μg溶解到0.1ml生理鹽水中，添加0.1ml的氟氏完全佐劑(FCA)作為免疫原。將各免疫原分別注射0.2ml到8只小鼠(BALB/c雌性、5周齡)背部皮下，進行免疫。每2周免疫1次，共免疫4次，1周后再免疫1次。最終免疫8日后，從心臟取血，獲得血清200μl以上。從通過ELISA驗證抗體效價升高的個體中取出脾細胞，進行細胞融合。
對于各免疫原，通過ELISA測定3只小鼠血清中的抗體效價。無論應用哪種免疫原，均可觀察到其抗體效價上升的個體。可以確認這些免疫原均可作為滑膜素的免疫原應用。
將骨髓瘤細胞株(P3U1)與小鼠脾細胞以1∶10混和，在50％PEG(和光純藥社PEG1540)存在下進行細胞融合。融合后，將脾細胞5×105個/ml接種到96孔培養板中。在HAT培養基中培養10～14天后，確認細胞的增殖，進行培養上清的鑒定。
應用固化了各合成肽的ELISA板進行培養上清的鑒定。鑒定操作如下進行。將培養上清與ELISA板進行反應后，應用抗小鼠IgG山羊過氧化物酶(POX)進行陽性孔的篩選。篩選出供于克隆化的孔，其它陽性孔的細胞冷凍保存。
數日后，將一株細胞接種到一96孔培養板中，100個細胞/培養板(20細胞/ml)，培養10～14天。判定集落，進行培養上清的鑒定。培養上清的鑒定是，將上清50μl加到上述篩選用抗原固相化的ELISA培養板中。使用抗小鼠IgG山羊-PoX作為第2抗體。篩選的集落，培養后進行亞克隆，培養10～14天，與上面同樣進行集落判定和培養上清的鑒定。選擇親株不同孔，在24孔培養板中進行培養，回收上清，進行克隆的驗證，鑒定抗體的亞類及抗體產生。克隆化的結果，作為能高效產生針對滑膜素的、具有極高親和性的單克隆抗體的雜交瘤，篩選出以Syno-P2作免疫原而獲得的克隆SL-1。
〔實施例2〕本實施例，其目的是應用抗滑膜素單克隆抗體進行患者樣品中滑膜素的檢測。
(1)用抗滑膜素單克隆抗體對患者來源的滑膜細胞進行Western印跡應用實施例1中獲得的識別Syno-P2的SL-1抗體，用SDS-PAGE分離慢性關節風濕病患者(RA)來源的滑膜細胞的蛋白質，進行Western印跡。Western印跡的操作是，應用實施例1的SL-1抗體作一抗，應用抗小鼠IgG綿羊-HRP作為標記抗體。
用變形性關節病患者(OA)來源的滑膜細胞作對照進行分析。結果，RA患者來源的滑膜細胞中可檢測出特異的信號(圖1「RA」泳道1、2的85kDa附近的條帶)。可以確認實施例1中所得SL-1抗體特異性識別滑膜素。
(2)用抗滑膜素單克隆抗體對RA患者來源的滑膜細胞進行免疫熒光染色應用SL-1抗體對RA患者來源的滑膜細胞進行免疫熒光細胞化學分析。免疫染色的操作是，除應用實施例1的SL-1抗體作一抗，應用抗小鼠IgG綿羊-FITC作為標記抗體之外，按照WO02/052007號的實施例9中描述的進行。可以檢測到滑膜素的信號在RA患者來源的滑膜細胞中很強(圖2上)，但僅用二抗進行反應作為對照，未檢測出信號(圖2下)。
(3)用抗滑膜素單克隆抗體對RA患者來源的滑膜組織進行免疫染色應用SL-1抗體對RA患者來源的滑膜組織切片進行免疫染色。免疫染色的操作是，除應用實施例1的SL-1抗體作一抗，應用抗小鼠IgG綿羊-HRP作為標記抗體之外，按照WO02/052007號的實施例9中描述的進行。滑膜素在RA患者來源的滑膜組織中強表達(圖3SL-1抗體部分)。通過同時進行的HE染色觀察到滑膜細胞的增殖層，該部分即是單克隆抗體染色的部位。根據這些結果可以確認本發明的SL-1抗體特異性識別RA患者滑膜組織中的滑膜素(圖3HE染色部分)。
如上，通過應用抗滑膜素抗體檢測患者樣品中的滑膜素，可實施RA的檢查和診斷。
〔實施例3〕本實施例的目的是開發滑膜素檢測用ELISA法檢測試劑。
將適量按實施例1的方法獲得的SL-1抗體溶解到PBS中，使其濃度為20μg/ml。將溶液加到酶免疫測定(EIA)用96平底微孔板中，100μl/孔，室溫下靜置數小時。除去孔中的溶液，用含0.05(V/V)％Tween20的PBS洗滌，加入含1(V/V)％-胎牛白蛋白(BFA)的PBS、100μl/孔，4℃靜置一晚，封閉單克隆抗體后，除去PBS，獲得抗體板。
與此不同的是，按照常規方法用滑膜素免疫致敏兔，制備多克隆抗體。按過碘酸氧化法用辣根過氧化物酶(HRP)標記多克隆抗體。應用PBS預平衡過的Sephacryl S-300HR(Pharmacia社)，通過凝膠過濾色譜，獲得純化的標記抗體。該二次標記抗體作為包含鹽、穩定劑、防腐劑等緩沖試劑的組合物。
按照常規的EIA，將適當稀釋的患者的血液、尿等體液或組織等加到上面所得具有固相SL-1抗體的上述96孔微孔板中，室溫作用1小時。此時，以只加稀釋液的孔作對照。用含0.05％Tween20的磷酸緩沖液洗滌后，加入HRP標記的抗小鼠IgG兔抗體，室溫反應30分鐘。用含0.05％Tween20的磷酸緩沖液洗滌未反應的二抗后，向各孔中加入底物緩沖液-含0.015％過氧化氫的0.1M檸檬酸緩沖液，以及染色劑O-苯二胺檸檬酸緩沖液(10mg/ml)，室溫反應30分鐘后，添加2M硫酸終止顯色反應。接著用酶標儀測定492nm的吸光度，由此求出待檢樣本中滑膜素的含量。
〔實施例4〕本實施例的目的是探討滑膜素的自身泛素化。
滑膜素是具有RING finger功能域的E3泛素-蛋白質連接酶，RING finger功能域是E2泛素結合酶的結合部位。此外，已知E3泛素-蛋白質連接酶能使自身泛素化，因此實驗驗證是否與滑膜素的自身泛素化相關。
用與滑膜素蛋白質的RING finger區域的328～342位氨基酸對應的肽作抗原，制備小鼠單克隆抗體SL-1(實施例1)。應用His標簽融合蛋白質MBP-dTM Syno-His、與一定濃度的SL-1抗體、抗FLAG抗體或小鼠IgG混合，4℃1.5小時，進行抗原抗體反應。
其后，應用體外泛素化反應體系檢測滑膜素的自身泛素化。混和E1(酵母來源)、E2(UbcH5c)、ATP、GST-HA-泛素、預先與抗體反應的各MBP-dTM Syno-His，37℃、反應120分鐘。反應后，各樣品中加入4xSDS-PAGE緩沖液，5分鐘沸騰后，在10％SDS-PAGE上展開。用Western印跡分析法，用SL-1抗體檢測滑膜素泛素化的條帶。
結果，可以觀察到250kDa的條帶以SL-1抗體量依賴性的方式受到抑制，2μg的SL-1抗體可抑制MBP-dTM Syno-His的自身泛素化。但是，未見到等量的抗FLAG抗體和小鼠IgG對250 kDa條帶的抑制備用(圖4上)。此外，同樣的實驗中，SL-1抗體量到達8～44μg/L時也能抑制250kDa附近的條帶，這提示SL-1抗體可抑制MBP-dTM Syno-His的自身泛素化(圖4下)。由此表明，SL-1抗體特異性抑制MBP-dTM Syno-His的自身泛素化。
〔實施例5〕本實施例的目的是探討SL-1抗體是否對因滑膜素引起的泛素化產生影響。
泛素通過由活化酶(E1)、結合酶(E2)、連接酶(E3)構成的泛素體系與靶蛋白共價結合，該反應反復進行形成多聚泛素鏈，成為被蛋白酶體降解的標記。人們發現P4HA1是滑膜素的底物蛋白。P4HA1是脯氨酰羥化酶的α亞單位。脯氨酰羥化酶是膠原產生過程中必須的、催化膠原的脯氨酸殘基羥化的酶。因為發現了SL-1抗體具有抑制滑膜素自身泛素化的作用，所以探討該抗體是否對因滑膜素引起的P4HA1泛素化產生影響。
首先，將MBP-dTM Syno-His與一定濃度的SL-1抗體、抗FLAG抗體或小鼠IgG混合，4℃1.5小時，進行抗原抗體反應。其后，在體外泛素化反應體系中，將2μg的GST融合P4HA1蛋白質GST-P4HA1與E1(酵母來源)、E2(UbcH5c)、ATP、GST-HA-泛素、預先與抗體反應的各MBP-dTM Syno-His混和，37℃、反應120分鐘。反應后，各樣品中加入4xSDS-PAGE緩沖液，5分鐘沸騰后，在10％SDS-PAGE上展開。用Western印跡分析法，用抗GST抗體檢測P4HA1泛素化的條帶。
結果表明，4μg的SL-1抗體可顯著抑制MBP-dTM Syno-His的自身泛素化，但8μg的SL-1抗體對GST-P4HA1的泛素化一點也沒有抑制(圖5)。圖5中，-E3是不含滑膜素的樣品，α-SL1是添加抗體的樣品，IgG表示陰性對照，GST-P4HA1-Ubn所示的250kDa附近的條帶表示泛素化的GST-P4HA1。因此可以明確，SL-1抗體可特異性抑制滑膜素的自身泛素化，對GST-P4HA1的泛素化無影響。
產業上利用的可能性本發明的抗體可調節滑膜素的自身泛素化。
另外，由于RA患者的血中發現識別滑膜素的自身抗體，所以在RA的診斷上可提供一全新的途徑。因此，含有本發明抗體的醫藥組合物對RA治療方法等的開發也能提供一全新的途徑。
另外，本發明提供產生上述抗體的細胞、及利用上述單克隆抗體的滑膜素含有細胞的檢測試劑盒。
滑膜的發育及骨·軟骨、四肢的發育相關的滑膜素基因與RA的病態相關，RA患者中能產生針對該基因產物的抗體。本發明的SL-1抗體可用于成為對RA診斷有用的標記物的滑膜素以及患者血清中高頻度出現的抗體的特異性檢測、定量，有利于對RA疾病的診斷和治療效果的判定。
本發明的SL-1抗體，利用其高特異性，可及滑膜素作為細胞標記物應用，可從胚胎細胞獲得未分化間質細胞，有望在再生醫學中應用。
序列表<110>Locomogene Inc.
<120>抗滑膜素抗體<130>G06-0076<150>JP2004-197010<151>2004-07-02<160>5<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>3374<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(403)..(2256)<400>1gccctttctt atgagcatgc ctgtgttggg ttgacagtga gggtaataat gacttgttgg 60ttgattgtag atatagggct ctcccttgca aggtaattag gctccttaaa ttacctgtaa120gattttcttg ccacagcatc cattctggtt aggctggtga tcttctgagt agtgatagat180tggttggtgg tgaggtttac aggtgttccc ttctcttact cctggtgttg gctacaatca240ggtggcgtct agagcagcat gggacaggtg ggtaagggga gtcttctcat tatgcagaag300tgatcaactt aaatctctgt cagatctacc tttatgtagc ccggcagtcg cgcggattga360gcgggctcgc ggcgctgggt tcctggtctc cgggccaggg ca atg ttc cgc acg 414Met Phe Arg Thr1gca gtg atg atg gcg gcc agc ctg gcg ctg acc ggg gct gtg gtg gct 462Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly Ala Val Val Ala5 10 15 20cac gcc tac tac ctc aaa cac cag ttc tac ccc act gtg gtg tac ctg 510His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr Val Val Tyr Leu25 30 35acc aag tcc agc ccc agc atg gca gtc ctg tac atc cag gcc ttt gtc 558Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile Gln Ala Phe Val40 45 50ctt gtc ttc ctt ctg ggc aag gtg atg ggc aag gtg ttc ttt ggg caa 606Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val Phe Phe Gly Gln55 6065
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<213>智人<400>3Ser Leu Ala Leu Thr Gly Ala Val Val Ala His Ala Tyr Tyr Cys1 5 10 15<210>4<211>15<212>PRT<213>智人<400>4Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala Ser Leu Pro Ala Gln Ser1 5 10 15<210>5<211>15<212>PRT<213>智人<400>5Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala Cys1 5 10 1權利要求
1.一種針對滑膜素的抗體或其片段，它能抑制滑膜素的自身泛素化。
2.權利要求1的抗體或其片段，其特征在于，它不影響滑膜素的底物蛋白質的泛素化。
3.權利要求1或2的抗體或其片段，其抗體是單克隆抗體。
4.權利要求1-3中任一項所述的能抑制滑膜素自身泛素化的抗體或其片段，是用包含序列號3～5所示的任一氨基酸序列的肽作抗原免疫動物，通過其抗體產生細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合而獲得的雜交瘤產生的，是針對滑膜素的單克隆抗體或其片段。
5.一種雜交瘤，是包含序列號3～5所示任一氨基酸序列的肽作抗原免疫動物，將免疫動物的抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合而獲得的，它產生能抑制滑膜素自身泛素化的單克隆抗體。
6.一種方法，其是能抑制滑膜素自身泛素化的針對滑膜素的單克隆抗體的制備方法，用包含序列號3～5所示任一氨基酸序列的肽作抗原免疫動物，培養其抗體產生細胞與骨髓瘤細胞的融合細胞，從所得培養物中獲取上述單克隆抗體。
7.一種含有權利要求1～4任一項中抗體或其片段的藥物組合物。
8.權利要求7的醫藥組合物，它用于治療或預防關節風濕病、癌癥、纖維癥、動脈硬化、Castleman病、多發骨髓瘤、局限性回腸炎、全身性若年特發性關節炎、腦腫瘤、舌癌、咽喉癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽道癌、膽囊癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、皮膚癌、急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴細胞白血病、成人型T細胞白血病、惡性淋巴瘤。
9.一種滑膜素自身泛素化的抑制劑，它含有權利要求1～4任一項中的抗體或其片段。
10.一種滑膜素含有細胞的檢測試劑，它含有權利要求1～4任一項中的抗體或其片段。
11.一種因滑膜素引起的細胞增殖性疾病的檢測用試劑，它含有權利要求1～4任一項中中的抗體或其片段。
12.權利要求11的試劑，其中細胞增殖性疾病至少選自關節風濕病、癌癥、纖維癥、動脈硬化、Castleman病、多發骨髓瘤、局限性回腸炎、全身性若年特發性關節炎、腦腫瘤、舌癌、咽喉癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽道癌、膽囊癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、皮膚癌、急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴細胞白血病、成人型T細胞白血病、惡性淋巴瘤中的一種。
13.權利要求10～12任一項中的試劑，其中細胞選自滑膜細胞、破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髓細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞、真皮細胞、肌肉細胞、神經細胞、淋巴細胞、血管平滑肌細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮內皮細胞、肺胞上皮細胞、未分化間質系細胞、外胚層頂脊中的任一種。
14.一種抑制滑膜素自身泛素化的方法，其特征在于，使權利要求1～4任一項中的抗體或其片段與滑膜素進行反應。
15.一種滑膜素表達細胞的檢測方法，其特征在于，使權利要求1～4任一項中的抗體或其片段與生物樣品進行反應。
16.一種因滑膜素引起的細胞增殖性疾病的檢測方法，其特征在于，使權利要求1～4任一項中的抗體或其片段與從待檢者采集的生物樣品進行反應。
17.權利要求16的方法，其中細胞增殖性疾病至少選自關節風濕病、癌癥、纖維癥、動脈硬化、Castleman病、多發骨髓瘤、局限性回腸炎、全身性若年特發性關節炎、腦腫瘤、舌癌、咽喉癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽道癌、膽囊癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、皮膚癌、急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴細胞白血病、成人型T細胞白血病、惡性淋巴瘤中的一種。
18.權利要求15～17任一項中的方法，其中細胞選自滑膜細胞、破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髓細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞、真皮細胞、肌肉細胞、神經細胞、淋巴細胞、血管平滑肌細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮內皮細胞、肺胞上皮細胞、未分化間質細胞、外胚層頂脊中的任一種。
全文摘要
本發明涉及針對滑膜素的抗體或其片段，以提供識別滑膜素部分的單克隆抗體，該抗體能抑制滑膜素自身泛素化。
文檔編號A61P29/00GK101018810SQ200580029608
公開日2007年8月15日 申請日期2005年7月4日 優先權日2004年7月2日
發明者中島利博, 山崎聰士, 張蕾, 天野徹也 申請人:株式會社洛科摩基因