治療、預防、抑制或降低心臟組織損傷的方法

專利名稱：治療、預防、抑制或降低心臟組織損傷的方法
技術領域：
本發明的領域涉及治療、預防、抑制或降低心臟組織損傷。
背景技術：
心臟疾病是新生兒和成人死亡的主要原因。
冠狀動脈疾病引起心臟血管急性阻塞，導致依賴性心肌的損失。在西方國家這些事件是死亡的主要原因之一。因為心臟不具備充分的肌再生能力，心肌梗塞的存活者一般發展為慢性心力衰竭，僅美國就有超過一千萬的該類病例。雖然一般成人患病更多，但在兒童生命的第一年中，心臟疾病是非感染性死亡的主要原因，其通常涉及心臟細胞分化、遷移或存活的異常。
有多種引起心肌和冠狀血管及組織損傷的情況，包括但不限于心肌缺血、凝血、血管阻塞、感染、發育缺陷或異常及其它該類心肌事件。心肌梗塞因心臟血管疾病引起。心肌梗塞發生于心臟某部分的血液供給減少或停止時(例如由冠狀動脈阻塞引起)。血液供應減少引起心肌細胞的損傷，甚至可以殺死心肌細胞。心臟血液供應的減少通常由動脈粥樣斑導致心外膜血管狹窄引起。這些動脈粥樣斑破裂后將引起出血、血栓形成、纖維蛋白和血小板積累及血管狹窄。
最近有證據顯示，心外或心內干細胞群可能有助于在正常環境下維持心肌數量。通過引入或補充外源性干細胞以促進心臟修復的作用認為是有希望的，但是，一般包括分離和導入自體同源或供體祖細胞。盡管干細胞群可保持細胞死亡和細胞更新之間的微妙平衡，但尚不足以完成急性冠狀動脈閉塞之后的心肌修復。導入分離的干細胞可提高心肌功能，但該方法存在爭議，并且需要分離自體同源干細胞或使用供體干細胞以及免疫抑制反應。將多能胚胎干細胞處理為心肌細胞譜系的努力尚未成功。干細胞遞送和分化的技術障礙迄今已經阻礙了心臟再生療法的廣泛臨床應用。
本領域仍需要改進治療、預防、抑制或降低冠狀組織損傷的方法和組合物。

發明內容
根據本發明的一個方面，提供一種治療、預防、抑制或降低冠狀組織損傷的方法，包括誘導至少一種生理功能，選自在所述冠狀組織中上調或增加ILK活性，在所述冠狀組織中上調或增加Akt活性，在所述冠狀組織中上調或增加磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)活性，下調或減少心肌細胞死亡，以及在所述冠狀組織中休眠心肌細胞。該方面包括向需進行該治療的受試體使用一種誘導藥劑，其能夠在受試體體內誘導至少一種所述生理功能。
發明詳述不受任何特定理論的約束，本發明提供了通過誘導一種或多種生理功能來預防、治療、抑制或降低冠狀組織的損傷的方法，其可以包括涉及有關心臟功能或發育中的調節路徑。
為了治療、預防、抑制或降低冠狀組織的損傷，根據本發明可引入的生理機能包括上調或增加整聯蛋白連接激酶(ILK)，上調或增加蛋白激酶B(Akt)，上調或增加磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)活性，下調或減少心肌細胞死亡，以及休眠心肌細胞。在一個實施例中，通過給需要治療的受試體使用能夠誘導一種或多種以上所述生理功能的藥劑，可以在患者體內誘導至少一種所述生理功能。該患者可以是動物，優選為人類。
根據本發明，通過加入誘導劑，可將ILK的活性上調或增加到大于10％、25％、50％或100％。根據本發明，Akt的活性可上調或增加到大于10％、25％、50％或100％。根據本發明，通過利用誘導劑，心肌細胞死亡可下調或減少大于10％、25％、50％或達到100％。根據本發明，通過誘導作用，心肌細胞的休眠可增加到大于10％、25％、50％或達到100％。根據本發明，通過加入誘導劑，可將PI3K的活性上調或增加到大于10％、25％、50％或100％。
在一個實施例中，該誘導劑為胸腺素β4(Tβ4或TB4)。胸腺素β4最初鑒定為體外內皮細胞遷移和分化期間上調的蛋白質。胸腺素β4由胸腺分離，是一種包含43個氨基酸殘基、4.9kDa的普遍存在的多肽，可在多種組織中鑒定。多種作用與該蛋白質有關，包括在內皮細胞分化和遷移、T細胞分化、肌動蛋白隔離和血管生成中的作用。
在另一實施例中，本發明利用胸腺素β4以外的誘導劑，治療、預防、抑制或降低冠狀組織的損傷。該誘導劑可包括，Tβ4異構體、類似物或衍生物，包括氧化Tβ4、Tβ4亞砜、Tβ4N-端變異體、Tβ4C-端變異體和Tβ4拮抗劑。
已經確定了很多Tβ4異構體，并且與已知Tβ4氨基酸序列相比具有約70％、或約75％、或約80％或更多的同源性。該異構體包括，例如，Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15。這些異構體與Tβ4共同擁有氨基酸序列LKKTET，其涉及預防、治療、抑制或降低冠狀組織的損傷。
此處引用國際申請No.PCT/US99/17282作為參考，其中公開了Tβ4異構體，與本發明的用途一致，同樣具有氨基酸序列LKKTET，及其可用于本發明的保守變體。此處引用國際申請No.PCT/GB99/00833(WO99/49883)作為參考，其中公開了可具有本發明用途的氧化胸腺素β4。
因此，特別注意誘導劑如已知的Tβ4異構體、如上文所列、尚未確定的Tβ4異構體，將用于本發明的方法中。
此外，可用于治療、預防、抑制或降低心臟組織損傷的其它誘導劑分子，同樣可在本發明的方法中使用。這樣的分子包括凝溶膠蛋白、維生素D結合蛋白質(DBP)、肌動蛋白抑制蛋白、肌動蛋白素、adsevertin、propomyosin、fincilin、蠶食蛋白、DNA聚合酶I、vilin、片段化蛋白、割切蛋白、加帽蛋白、β-輔肌動蛋白和肌動調解蛋白。因為所述方法包含應用于受試體的這些物質，本發明因而進一步提供藥物組合物，包括此處所提出的凝溶膠蛋白、維生素D結合蛋白質(DBP)、肌動蛋白抑制蛋白、肌動蛋白素、蠶食蛋白，DNA聚合酶I、vilin、片段化蛋白、割切蛋白、加帽蛋白、β-輔肌動蛋白和肌動調解蛋白。
因此，本發明的一個內容是使用誘導劑，例如包含或基本上由氨基酸序列LKKTET及其保守變體組成的肽或肽片段，包括，氨基酸側序列KLKKTET和/或LKKTETQ(有時稱其為LKKTET多肽)。
此處所使用的術語“保守變體)”及其語法變化，表示氨基酸殘基由其它生物學上相似的殘基置換。保守變異的實例包括異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸疏水性殘基的置換，極性殘基的置換，例如精氨酸取代賴氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬氨酸等等。
本發明還利用誘導劑刺激心臟組織中一種或多種在此所述的誘導劑的產生。該藥劑還稱為“誘導起始劑”。因此，根據一個實施方案，使用可刺激受試體體內產生此處所述誘導劑的藥劑治療受試體。因而本發明所使用的誘導劑可直接或間接地誘導至少一種上述的生理功能，以治療、預防、抑制或減輕降低冠狀組織損傷。在一個實施方案中，間接誘導出至少一種上述的生理功能，以治療、預防、抑制或減輕冠狀組織損傷的誘導劑，可刺激心臟組織中LKKTET肽例如Tβ4的產生，以預防冠狀組織的損傷。
不受任何特定理論的約束，其它磷酸腺肌醇3-激酶(PI3K)和整合蛋白連接激酶(ILK)和可用胸腺肽β4(Tβ4)或用其它LKKTET肽上調的AkT信號通路，可以傳遞生存信號，并因此在肌缺血損傷后對預防心臟組織損傷起重要作用。AkT是絲氨酸-蘇氨酸激酶，通過影響許多可抑制細胞凋亡的下游通路，對細胞和組織存活起一定作用。在多種膜受體、激素、細胞因子、趨化因子和其它細胞分子的刺激作用之后，PI3K和ILK激酶也可激活AkT。因此，用于本發明的誘導劑可以是除Tβ4之外的或其它另一種LKKTET肽。該誘導劑的實施例可選自但不局限于膜受體，包括生長因子受體的HER(或Erb B)族和雌激素(ER)受體；胰島素或與胰島素聯合的結合白蛋白的棕櫚酸鹽；纖連蛋白；谷胱甘肽；甘露醇；P38-MAPK抑制劑，例如SB-203580；紅細胞生成素；和Rho族蛋白質例如Ras、Cdc42和Rac1。其中，Akt的幾個下游靶點包括轉錄因子BAD和Forkhead。作為實例，Tβ4誘導的Akt活性通過磷酰化BAD抑制細胞凋亡，然后BAD抑制線粒體的細胞色素C釋放和caspase-9的活性。AkT也可激活IKK，而IKK通過抑制劑NFKB降解，可激活核因子-κB(NF-κ3)。這時NFκB可易位到核并誘導抗細胞凋亡基因的轉錄。上述分子和其它藥物和小分子也可和在此所述的誘導劑起協同作用，抑制心臟組織的損傷。該化合物的實例可選自但不局限于醛糖還原酶抑制劑(ARI)，例如唑泊司他等；ACE抑制劑，例如雷米普利等；山梨醇脫氫酶抑制劑，例如CP-470，711；M-乙酰半胱氨酸(NAC)；酪氨酸磷酸酶抑制劑，例如原釩酸鈉；維生素衍生物(RXR激動劑的胰島素致敏活性)，也就是具有胰島素致敏活性的核受體配體類，例如LG268；水楊酸鹽/酯和c-Jun N末端激酶(JNK)等的藥理抑制劑；氯氮平和奧氮平，(非典型antipsychiotics)；ROS抑制劑；和BAX抑制劑。
在一個實施例中，本發明提供了一種用在此所述的有效量的誘導劑接觸受試體損傷部位，而治療、預防、抑制或降低受試體冠狀組織損傷的方法。該接觸可以是直接的或全身性的。接觸損傷部位的實施例包括用在此所述的含有誘導劑的組合物接觸損傷部位或在此所述的與增強誘導劑穿透性的至少一種在此所述的藥劑結合，或延遲或延緩在此所述的誘導劑釋放至治療部位。
給藥可包括，例如，將在此所述的含有誘導劑的組合物直接注射至心臟組織例如心肌組織，靜脈給藥，腹膜內給藥，肌內或皮下注射，或吸入，透皮或口服。
在此所述的誘導劑，可用任意適于治療、預防、抑制或降低冠狀組織損傷的劑量給藥。例如，在此所述的誘導劑，給藥劑量在約0.001-1,000,000微克，更優選在約0.1-5,000微克，最優選在1-30微克范圍內。
本發明的誘導劑可每天、每隔一天等單劑量給藥，對于數天、數周或數月等可單劑量給藥或每天多劑量給藥，例如每天用藥2、3、4次或更多次。
Tβ4位于許多類型的組織和細胞中，因此在心臟組織和/或心臟細胞中，在此所述的刺激產生Tβ4、LKKTET肽和/或另外的在此所述的誘導劑的藥劑，可加至或含有一種組合物，以產生Tβ4、LKKTET肽和/或另外的誘導劑。該藥劑可包括多種生長因子族成員，例如胰島素樣生長因子(IGF-1)、血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子β(TGF-β)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、胸腺肽α1(Tα1)和血管內皮生長因子(VEGF)。
另外，可向組合物中加入在此所述的誘導劑和其它輔助治療、預防、抑制或降低心臟組織損傷的藥劑。該藥劑包括血管生成素、生長因子、直接分化細胞的藥劑。例如但不限于，此處描述的誘導劑能與以下一種或多種藥劑組合有效量的VEGF、KGF、FGF、PDGF、TGFβ、IGF-1、IGF-2、IL-1、胸腺素原α和胸腺素α1。
本發明同樣包括一種藥物組合物，其在藥學可接受的載體中，例如注射用水，含有在此所述的治療有效量的誘導劑。
治療或預防心臟組織損傷的實際劑量、制劑或組合物依賴于多種因素，包括受試體的體型大小和健康狀況。然而，本領域普通技術人員可使用如在申請日之前公開的PCT/US99/17282和引用的參考文獻所描述的確定臨床劑量的方法和技術，來確定適當的使用劑量。
含有此處所述誘導劑的適當制劑的濃度范圍是在約0.001-10％重量，更優選約0.01-0.1％重量，最優選約0.05％重量的范圍內。
在此所述的治療方法涉及多種含有此處所述誘導劑的試劑或組合物的給藥或遞送途徑，包括任何向受試體的常規給藥技術。使用或含有此處所述誘導劑的方法和組合物和/或用于本發明的其它組合物，可通過與藥學可接受的無毒賦形劑或載體混合，制成藥物組合物。
本發明可包括抗體的使用，該抗體與在此所述的誘導劑相互作用，例如LKKTET肽或其功能性片段。可以提供含有或基本由含有不同表位特性的總單克隆抗體的抗體，以及特異的單克隆抗體制劑。通過本領域技術人員公知的方法，如申請日之前公開的PCT/US99/17282中所述，單克隆抗體由含有蛋白質片段的抗原制備。本發明中使用的術語“抗體”的含義包括單克隆抗體和多克隆抗體。
在又一項實施例中，本發明提供一種通過使用有效量的誘導起始劑治療受試體的方法，其中誘導起始劑誘發此處所述誘導劑的基因表達，例如Tβ4、Tβ4異構體或LKKTET肽。術語“有效量”是指有效的誘發此處所述誘導劑的基因表達，從而進行有效治療的藥劑量。誘發此處所述誘導劑的基因表達的藥劑可以是多核苷酸。多核苷酸可以是反義鏈、三聯劑或核酶。例如可使用指向結構基因區域或Tβ4的啟動子區域、Tβ4異構體或LKKTET肽的反義鏈。
在另一實施例中，本發明提供了一種使用組合物的方法，該組合物可誘發此處所述誘導劑的肽活性。影響此處所述誘導劑活性的組合物(例如，拮抗劑和激動劑)，包括肽、擬肽、多肽、化合物、礦物質例如鋅以及生物制劑。
本發明還涉及一種篩選能夠預防冠狀組織損傷的如上所述的化合物的方法，包括用候選化合物與冠狀組織接觸；在所述冠狀組織中測量至少一種所述生理功能的水平，其中與缺乏所述候選化合物的冠狀組織中至少一種所述生理功能的水平相比，所述至少一種生理功能的水平增加，表明所述組合物能夠治療、預防、抑制或降低所述冠狀組織的損傷。
本發明還涉及一種篩選能夠誘導至少一種上述生理功能的化合物的方法，包括用候選化合物接觸心臟組織；測量所述組織中的Tβ4活性，其中，與缺乏所述候選化合物的冠狀組織中Tβ4活性水平相比，Tβ4活性在所述心臟組織中增加表明所述化合物能夠誘導至少一種生理功能。
本申請通過以下非限定性實施例進一步解釋。
實例1合成Tβ4和Tβ4抗體獲自RegeneRx Biopharmaceuticals，Inc.(3 BethesdaMetro Center，Suite 700，Bethesda，MD 20814)，并在膠原凝膠測試中檢測，以確定其將心臟內皮細胞轉化為間質細胞的效力。已經確定，心臟瓣膜及其它心臟組織的發育是通過上皮-間質轉化形成的，該過程的缺陷會引起個體發育及整個生命期間嚴重的心血管畸形和損傷。在膠原凝膠測試中，生理濃度的Tβ4明顯增強心內膜細胞向間質細胞的轉化。而且，抗Tβ4的抗體抑制并阻斷該轉化。房室心內膜向侵入性間質的轉化，是形成和維持正常心臟組織及形成心臟瓣膜的一個方面。
實例2參與心臟發育的調節途徑，可用于輔助心臟修復中的心臟細胞重新調整。在心臟形態發生期間的基因表達研究中，發現在發育中的心臟中，有43個氨基酸肽胸腺素β4被表達。胸腺素β4具有多種功能，其最突出的包括，分離G-肌動蛋白單體和之后的對肌動蛋白—細胞骨架組織的作用，這是細胞運動、器官形成和其它細胞生物學事件所必需的。最近的結構域分析顯示，基于其對肌動蛋白碳端的親合力，β4-胸腺素能夠影響肌動蛋白裝配。除細胞運動之外，胸腺素β4可通過影響Rho-依賴性基因表達或核肌動蛋白調節的染色質重建而影響轉錄，。
在此表明，胸腺素β4能夠刺激心肌細胞和內皮細胞的遷移，并促進心肌細胞的存活。LIM結構域蛋白質PINCH和整聯蛋白連接激酶(ILK)，兩者均是細胞位移和存或所必需的，與胸腺素β4形成復合物，導致存活激酶Akt/PKB的磷酸化作用。Akt磷酸化作用的抑制與胸腺素β4在心臟細胞上的作用是相反的。冠狀動脈結扎后，用胸腺素β4處理成年小鼠，導致心臟中Akt磷酸化作用增加，增強了在24小時內早期肌細胞的存活率，提高了心臟功能。這些結果表明，在心臟形成期表達的內源性蛋白質，在急性冠心病的情況下，可重新調配于保護心肌。
結果胸腺素β4發育表達雖然已經報導了在發育期的大腦中胸腺素β4的表達，就像心血管系統中的表達一樣，但是沒有重要的細節。胚胎期(E)10.5天的小鼠全胚胎RNA原位雜交，顯示胸腺素β4在左心室、右心室的外部彎曲和心臟流出道表達。放射性原位雜交顯示，胸腺素β4轉錄子富集于心臟瓣膜前體區域，通稱為心內膜墊。這一區域的細胞源自于內皮細胞，其經過間質轉化，從心內膜遷移出并侵入將心肌和心內膜分開的細胞外基質的隆起。除心內膜細胞以外，一種心肌細胞移至并聚集于墊區域，這是心腔分隔和重構所必需的過程。使用免疫組織化學，發現墊中表達胸腺素β4的細胞同樣表達心肌肌動蛋白，說明在胸腺素β4存在于侵入心內膜墊的遷移心肌細胞中。最后，胸腺素β4轉錄子和蛋白質在E9.5-E11.5同樣在室間隔和較少分化、較多增生的心肌區域表達，通常稱為致密層，該致密層在細胞成熟時移行至小梁區域。由前側心臟區域移行的流出道心肌，也表達高水平的胸腺素β4蛋白質。
分泌的胸腺素β4刺激心臟細胞遷移和存活盡管胸腺素β4是在細胞液和細胞核中發現以及在細胞內起作用，功但是發現用真菌標記的胸腺素β4轉染的Cos1細胞條件培養液，含有可用蛋白質印跡檢測的胸腺素β4，與之前報導的傷口液體分泌和存在于其中的胸腺素β4一致。在噬菌體顆粒表面表達胸腺素β4之后，該噬菌體是經胞外加入到胚胎心臟外植體，發現抗噬菌體抗體包裹了細胞表面，并且最終可在細胞內的細胞液和細胞核中檢測，而對照噬菌體檢測不到。用生物素標記胸腺素β4進行了類似的觀察。這些數據表明，分泌的胸腺素β4可以內在化進入細胞，盡管細胞的進入機制仍需測定。
為了檢測心臟細胞遷移中分泌的胸腺素β4的作用，設計了一種胚胎心臟外植體系統，用于在三維膠原凝膠中分析細胞遷移和轉化。在該分析中，來自瓣膜形成區域的鄰近胚胎心肌和心內膜的外植體，與鄰近膠原的心內膜一起放置于膠原凝膠上。心肌細胞的信號誘導心內膜細胞遷移，但是心肌細胞并不能正常和大量地移行至膠原。但是，一旦將胸腺素β4加入到原始外植體，就可以觀察到大量自然的搏動，心臟肌肉肌動蛋白—陽性細胞從外植體中移行出去。基于TUNEL分析法或磷—組織蛋白酶H3免疫染色，與對照細胞相比，細胞死亡或增生在這些細胞中沒有明顯不同。
為測試出生后心肌細胞的應答，將原始小鼠新生期心肌細胞培養在涂覆層粘連蛋白的玻璃上，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或胸腺素β4處理細胞。與胚胎心肌細胞相似，與對照(p＜.05)相比，發現胸腺素β4處理的新生期心肌細胞的移動距離明顯增加。除胸腺素β4在心肌細胞遷移中的作用之外，在胚胎心臟外植體分析中的內皮位移發現了類似的作用。將E11.5的外植體暴露于胸腺素β4中，與PBS(p＜.01)相比，導致了內皮細胞移行數量的增加。
在我們實驗室中，新生期心肌細胞的原代培養物生長于涂覆層粘連蛋白載玻片上，一般存活大約1至2周，并且某些細胞搏動達到2周。令人驚訝的是，暴露于胸腺素β4的新生期心肌細胞存活時間明顯地比較長，肌細胞明顯的節律性收縮可達28天。此外，在胸腺素β4處理的新生期心肌細胞中，搏動速率一直比較快(95對50搏動每分鐘，p＜.02)，表明細胞間傳達的變化以及心肌細胞更有活力胸腺素β4激活ILK和Akt/蛋白質激酶B為研究通過胸腺素β4影響細胞遷移和存活的電位機制，搜索到與蛋白質交互作用的胸腺素β4。胸腺素β4的氨基端與affi-凝膠珠融合，導致碳端暴露以鑒定上述未知交互作用蛋白質，但阻止與肌動蛋白的結合。合成E9.5-12.5小鼠心臟T7噬菌體互補DNA文庫并用噬菌體顯示篩選，富集胸腺素β4交互作用克隆，并由ELISA確認。PINCH是一種LIM結構域蛋白質.，是該篩選中最為一貫的隔離的，并在不存在肌動蛋白(ELISA)的情況下與胸腺素β4交互作用。PINCH和整聯蛋白連接激酶(ILK)作為參與胞外基質交互作用的比較大的復合物的一部分，彼此直接交互作用，并間接地與肌動蛋白細胞骨架反應，所述復合物通常稱為局部粘連復合物中。由于PINCH和ILK促進絲氨酸—蘇氨酸激酶Akt/蛋白質激酶B磷酸化作用，因而是細胞位移和細胞存活所必需的，所述蛋白質激酶B，為一種存活和生長信號通路中的中樞激酶。編碼胸腺素β4的質粒用或不用培養的細胞中的PINCH或ILK轉染，并發現胸腺素β4與PINCH或ILK分別共沉淀。更進一步說，盡管和PINCH相比，ILK和胸腺素β4之間的交互作用較弱，但PINCH、ILK和胸腺素β4一直在共有的復合物中進行免疫沉淀。PINCH與胸腺素β4的交互作用對應于圖上的PINCH的第四或第五LIM結構域，而ILK氨基末端ankryin結構域足夠進行胸腺素β4的交互作用。
由于向局部粘連復合物中補充ILK對其激活很重要，因此分析了胸腺素β4對ILK定位和表達的作用。在將胚胎心臟外植體或C2C12成肌細胞用合成胸腺素β4蛋白質(10ng/100ul)或表達胸腺素β4的質粒處理后，通過免疫細胞化學檢測，ILK在細胞周圍顯著增強。Western分析顯示在C2C12細胞中ILK蛋白質水平適度增長，說明增強的免疫熒光可能與胸腺素β4定位改變有關。并發現，在胸腺素β4處理C2C12細胞后，ILK的機能被激活，該結果通過使用Akt的絲氨酸473的磷—特異性抗體使其已知底物的Akt磷酸化作用增加可以證明，同時不改變總Akt蛋白質。細胞外胸腺素β4和轉染胸腺素β4給藥的相似作用與以前觀察到的肽內在化一致，說明對胸腺素β4發信號是細胞內而不是細胞外作用。由于胸腺素β4隔離了G-肌動蛋白單體庫，對ILK激活作用的影響有賴于胸腺素β4在調節聚合F-肌動蛋白和單體球形肌動蛋白之間的平衡所起的作用。F-肌動蛋白的聚合作用被C3轉移酶抑制，并且F-肌動蛋白的形成被活化的Rho所促進，但是兩種干預都沒有影響胸腺素β4處理后的COS1或C2C12細胞的ILK活化作用。
為了確定ILK的激活作用對所觀察到的胸腺素β4的影響是否必需，使用已經充分公開的ILK抑制劑渥曼青霉素，其抑制ILK上游的激酶、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-激酶)。使用心肌細胞遷移和搏動頻率來分析胸腺素β4活性，如上文所述，在胸腺素β4存在下以及有或無渥曼青霉素的情況下，培養胚胎心臟外植體。與ILK介導胸腺素β4的作用一致，在ILK的抑制作用下，心肌細胞遷移和搏動頻率明顯降低(p＜.05)。同時，這些結果支持生理學上明顯的細胞內胸腺素β4-PINCH-ILK的交互作用，說明該復合物可介導某些觀察到的相對獨立于于肌動蛋白聚合作用的胸腺素β4的作用。
胸腺素β4在心肌梗塞后促進細胞存活和提高心臟功能由于胸腺素β4對心肌細胞體外培養的存活和遷移的作用以及AKT的磷酸化作用，測試了在心肌損傷之后胸腺素β4是否有助于體內心臟修復。通過冠狀動脈結扎造成58只成年小鼠心肌梗塞，結扎后，將其中的一半立即在全身、心臟內或全身加心臟內使用胸腺素β4，另一半用PBS處理。用膠原(對照)或膠原與胸腺素β4的混合物進行心臟內注射。存活兩周的所有45只小鼠，在梗塞后的第2和第4周用隨機盲超聲通過心臟收縮多重測量進行心臟功能診斷。梗塞4周后，對照小鼠的左心室平均縮短分數23.2+/-1.2％(n＝22，95％置信區間)；與之對比，用胸腺素β4處理的小鼠平均縮短分數37.2+/-1.8％(n＝23，95％置信區間，p＜.0001)。作為第二種測量心室功能的方法，二維超聲心臟圖像測量顯示，胸腺素β4處理的小鼠左心室輸出血液的平均分數(射血分數)為57.7+/-3.2％(n＝23，95％置信區間，p＜.0001)，而冠狀動脈結扎后的對照小鼠的平均值為28.2+/-2.5％(n＝22，95％置信區間)。心臟縮短分數或射血分數分別大于60％或100％的提高，說明暴露至胸腺素β4的顯著提高，盡管與假手術的動物相比，心臟功能仍有所抑制(～60％縮短分數；-75％射血分數)。最后，對照組的末期舒張度(EDD)和末期收縮度(ESD)明顯較高，表明梗塞后胸腺素β4處理導致心臟擴張降低，與改善功能一致。顯著的是，當胸腺素β4被腹膜內注射全身給藥或僅在心臟梗塞局部給藥時，改進的程度在統計學上沒有差異，表明胸腺素β4的有益作用可能通過直接作用于心臟細胞而不是通過心臟外源產生的。用相同的膠原賦形劑進行對照心臟注射，使針對心臟修復的注射不產生內在反應。
為確定胸腺素β4提高心臟功能的方式，檢查用胸腺素β4處理或未用其處理的心臟的多個連續組織切片。三個水平的三色染色切片顯示，用胸腺素β4處理的所有小鼠中的疤痕的大小減小，但沒有顯示全身或局部胸腺素β4給藥的不同，這與上述超聲心臟圖像數據一致。通過對一組小鼠左心室六個水平的切片進行的疤痕體積的定量分析，證明用胸腺素β4處理的小鼠傷疤體積明顯減小(p＜.05)。用PBS或胸腺素β4處理的心臟中，在冠狀動脈結扎后第3、6、11或14天，未發現明顯的心肌細胞增殖或死亡。然而通過TUNEL測定(綠色)，在結扎24小時后，經過胸腺素β4處理的心肌細胞，其細胞死亡顯著減少，并被肌肉—肌動蛋白抗體(紅色)雙重標記證實。同樣是肌細胞的TUNEL陽性細胞在胸腺素β4組中非常稀少，但在對照心臟中大量存在。與該發現一致，發現梗塞三天后，心臟內胸腺素β4處理的左心室縮短分數為39.2+/-2.34％(n＝4,95％置信區間)，對照為28.8+/-2.26％(n＝4,95％置信區間)(p＜.02)；射血分數分別為64.2+/-6.69％或44.7+/-8.4％(p＜.02)，表明獲得了胸腺素β4了早期保護。最后，c-kit、Sca-1或Abcg2陽性心肌細胞在處理或未接受處理的心臟中的數量相似，并且胸腺素β4處理動物的心肌細胞體積與成熟的肌細胞相比沒有檢測到任何不同，表明胸腺素β4誘導的改進不受所稱干細胞向心臟細胞系補充的影響。因此，由于胸腺素β4對心肌細胞存活所起的作用以及梗塞后對心肌細胞的早期保護，使用胸腺素β4處理減小鼠少傷疤體積和保存心肌功能是可能的。
由于在培養的細胞中胸腺素β4上調ILK活性和Akt磷酸化作用，所以測試了這些激酶在體內的活性。通過蛋白質印跡，發現冠狀動脈梗塞后，與PBS處理的小鼠相比，胸腺素β4處理小鼠的心臟溶溶解產物中蛋白質ILK水平增加。相應地，與上述胸腺素β4對ILK的作用一致，Akt-5473磷—特異性抗體顯示出在胸腺素β4處理的小鼠中磷酸化Akt-5473的量上升，這與之前所描述的胸腺素β4對ILK的作用是一致的。Akt蛋白質總數沒有增加。這些體內發現與體外所示的胸腺素β4對細胞遷移和存活所起的作用是一致的，這表明ILK激活作用和之后的Akt刺激作用可部分地解釋胸腺素β4誘導心肌細胞存活增強，盡管用這個單一機制解釋胸腺素β4對細胞所起作用的全部原因是不可能的。
討論此處提供的證據表明，胸腺素β4，一種在心臟形態發生期間參與細胞遷移和存活的蛋白質，可重新調配從而減少心臟梗塞后的心肌細胞損失。根據PINCH、ILK和Akt的作用，該數據與該復合物所起的作用是一致的，即在胸腺素β4對細胞遷移、存活和心臟修復的影響中起重要作用。在小鼠中觀察到，胸腺素β4在冠狀結扎后24小時內防止細胞死亡的能力，可能導致疤痕體積的減少和改進心室功能。盡管ILK的胸腺素β4激活作用可能有許多細胞效應，但Akt的激活作用為主要機制，通過該機制，胸腺素β4促進細胞的存活。當心臟損傷后，施用在小鼠中過表達的骨髓干細胞，與預計的Akt心臟修復效果是一致的，盡管這可能發生在非細胞自主模式中。
胸腺素β4預防心臟細胞死亡的早期作用聯想到能通過“休眠”經受住組織缺氧損傷的肌細胞。雖然對心肌休眠的基本機制不了解，然而在新陳代謝和能量使用中的改變顯示促進細胞的存活。誘導劑，例如胸腺素β4可用類似休眠心肌方法來改變細胞特性，并給出內皮細胞遷移和新血管生成的時間。
在此，胚胎心臟中G-肌動蛋白分離肽胸腺素β4促進心肌和內皮細胞遷移并在出生后的心肌細胞中保留這種特性。培養的胚胎和出生后心肌細胞存活也因為胸腺素β4而增強。發現胸腺素β4與PINCH和整聯蛋白連接激酶(ILK)形成一種功能性復合物，引起殘存細胞中的激酶Akt/PKB的激活，其對胸腺素β4對心肌細胞施加影響是必需的。小鼠冠狀動脈結扎后，用胸腺素β4處理導致心臟ILK的上調和Akt的激活，增強早熟肌細胞的存活并提高心臟功能。這些結果指示，胸腺素β4促進心肌細胞遷移、存活和修復并在急性心肌損傷的情況下是一種新的治療靶點。
方法RNA原位雜交用洋地黃毒甙配基標記或S-標記的由小鼠胸腺素β4cDNA的3′UTR區合成的反義鏈核糖核酸探針，進行E 9.5-12.5小鼠胚胎的全胚胎或部分胚胎RNA原位雜交，與緊密關聯的胸腺素β10的轉錄不享有同源性。
免疫組織化學胚胎或成年心臟組織植入用于免疫組織化學的石蠟和切片。胚胎心臟切片用不識別胸腺素β10的抗胸腺素β4孵育。成年心臟從底部到頂部切成十等分。使用連續切片用于三色染色切片并與肉瘤霉素a-輔肌動蛋白、c-kit、Sca-1、Abcg2和BrdU抗體反應，用于TUNEL測定法(Intergen Company#S7111)。
膠原蛋白凝膠遷移測定法如先前所述，從E11.5野生型小鼠胚胎分割流出道并放置于膠原蛋白基質上。經過10小時附著，外植體在含30ng/300ul胸腺素β4的PBS、單一的PBS或胸腺素β4和100nM渥曼青霉素中孵育。在37℃5％CO2培養3-9天，并在室溫下固定于含4％聚甲醛的PBS中10分鐘。計數細胞對遷移和距離進行定量分析，在內皮遷移的各個條件下使用至少三個單獨的外植體和心肌遷移使用八個單獨的外植體。
膠原蛋白凝膠外植體的免疫細胞化學聚甲醛固定的外植體在室溫下用滲透溶液(10mM PIPES pH6.8；50mMNaCl；0.5％屈立通X-100；300mM蔗糖；3mM MgCl2)滲透10分鐘，并在室溫下用PBS漂洗2×5分鐘。通過一連串的阻滯和漂洗步驟，使用檢測抗體且外植體在室溫下用平衡緩沖液(Anti-Fade kit)漂洗和孵育10分鐘。外植體用勺取于玻璃顯微鏡載玻片，蓋上蓋玻片，并用熒光顯微鏡觀察。作為推薦，用ApopTag和熒光素原位細胞凋亡檢測試劑盒(Intergen Company # S7111)進行TUNEL測定。
胚胎T7噬菌體展示cDNA文庫使用Straight A′s mRNA Isolation System(Novagen，Madison WI)，從E9.5-12.5小鼠胚胎心臟中分離和純化等量mRNA。使用T7Selectlo-3定向表達cDNA隨機引物克隆系統(Novagen，Madison WI)合成cDNA。媒介物T7Selectlo-3用于展示隨機準備的cDNA，其位于5-15噬菌體10B外殼蛋白分子的C端。誘導第二外殼蛋白10A的表達。經EcoRl和Hind III消化后，將插入片段結合到T7 selectlo-3媒介物(T7選擇系統手冊，Novagen)。組裝媒介物，并且文庫的復雜性為107。組裝的噬菌體在0.5L對數期的BLT5615E.coli菌株培養基37℃下擴增4小時。離心除去細胞碎片，用8％聚乙二醇沉淀噬菌體。用1M NaCl/pH8.0的10mMTris-HCl/1mM EDTA從顆粒狀沉淀物中提取噬菌體，由CsCI梯度超速離心進行純化。純化后的噬菌體在PBS中透析，-80℃存儲于10％甘油中。
T7噬菌體的生物淘選參照說明書，將300μl的Affi-凝膠15(Bio-RadLaboratories)經氨基末端賴氨酸殘基與12μg合成胸腺素β4蛋白質(RegeneRx)結合。在PBS中用3％BSA阻滯1小時后，將凝膠轉移至柱中，用10ml PBS、2ml的1％SDS/PBS和1ml的PBS/0.05％Tween-20(PBST)x4沖洗。在500μl的PBST中，109pfu的T7噬菌體胚胎心臟文庫(復合物的100x)用于柱中孵育5分鐘以達到低標準生物淘選。用50ml的PBS洗去未結合噬菌體。用2.0ml的1％SDS洗脫結合噬菌體。測定10μl洗脫噬菌體的效價，其余噬菌體立即在0.5L對數期的BLT5651E.coli培養基中擴增直至溶解。離心去除細胞碎片，測定溶解產物的效價，109pfu的噬菌體用于下一輪生物淘選。進行4輪生物淘選，經過第2、3和4輪后，在擴增前挑選出30份單一菌落，分別用于序列分析。對含有多于10個氨基酸的單一菌落進行擴增，用于ELISA證實測定。
ELISA證實測定將Maxi Sorp Nunc-Immuno Plates(Nalgene Nunc International)用1μg/100μl的合成胸腺素β4肽包衣，過夜，然后用PBS沖洗，用3％BSA阻滯。將109pfu擴增的單一噬菌體群落分別加入PBST至每一孔盤，在室溫下孵育1.5小時。將T7野生型噬菌體作為陰性對照。用PBS(X4)沖洗以除去未結合的噬菌體，在室溫下，加入200μl的1％SDS/PBS到孔盤中洗脫結合噬菌體1小時。
共免疫沉淀反應將COS和10T1/2細胞用胸腺素β4、PINCH和/或ILK轉染，按照前述用抗體沉淀溶解產物。用抗靶向各種PINCH的物質包括抗ILK多克隆抗體(Santa Cruz)、抗胸腺素β4多克隆抗體和抗真菌或抗FLAG抗體拮抗劑，進行蛋白質印跡分析。
動物和手術操作按照上文所述，通過結扎左前下行冠狀動脈，在16周齡(25-30g)的58只雄性C57BL/6J小鼠中形成心肌梗塞。29只結扎小鼠中在結扎后立即使用胸腺素β4處理，剩余的29只用PBS注射劑處理。處理方法為，心臟內使用胸腺素β4(200μg于10μl膠原)或10μl的膠原；腹腔內使用胸腺素β4(150μg于300μl的PBS)或3000的PBS；或同時通過心臟內和腹膜內注射。每三天進行一次腹膜內注射，直至小鼠死亡。劑量基于在先的胸腺素β4生物分布研究。將心臟移出、稱重并固定以用于組織切片。其余的小鼠以同樣的方式操作，以用于梗塞后0.5、1、3、6和11天的研究。
通過超聲心臟圖像分析心臟功能使用M-模式和上文所述的2維測量法，進行用于分析心臟收縮功能的超聲波心動描記法。測量顯示了隨機選自六個選定心臟周期中的平均值，選自至少兩個單獨的掃描，以隨機盲的方式在掃瞄水平中作為一致性參照的乳頭肌中進行。末期舒張定義為最大左心室(LV)舒張尺度，并且末期收縮定義為后壁運動的峰值。在統計分析中忽略每組中的單一端值。代表收縮功能的縮短分數(FS)以LV尺度計算如下FS＝EDD-ESD/EDD×100％。射血分數(EF)由二維圖計算。EDD，末期舒張度；ESD，末期收縮度。
疤痕體積計算與上文類似，使用通過每只小鼠心臟的六個切片，由Openlab 3.03 software(Improvision)計算疤痕體積。膠原沉積面積的百分比由隨機選擇的六個切片計算，并算出每只小鼠的平均數。
統計分析用95％置信區間的變量的標準t-test測試進行統計計算。
胸腺素β4增強胚胎心臟中的心肌和內皮細胞遷移，并在出生后心肌細胞中保持該特性。胸腺素β4同樣可以增進培養基中的胚胎和出生后心肌細胞的存活。胸腺素β4與PINCH和整聯蛋白連接激酶(ILK)一起形成功能性復合物，導致存活激酶Akt的激活(同樣稱之為蛋白激酶B)。小鼠冠狀動脈結扎之后，胸腺素β4的處理可以導致心臟中的ILK上調和Akt激活，增強早期肌細胞存活并提高心臟功能。這些發現表明胸腺素β4增強心肌細胞遷移、存活和修復，其調節路徑是一種新的急性心肌損傷的治療靶點。
權利要求
1.一種治療、預防、抑制或降低冠狀組織損傷的方法，其包括誘導至少一種生理功能，所述生理功能選自在所述冠狀組織中上調或增加ILK活性，在所述冠狀組織中上調或增加Akt活性，在所述冠狀組織中上調或增加磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)活性，在所述冠狀組織中下調或減少心肌細胞死亡，以及在所述冠狀組織中休眠心肌細胞，通過對需要進行該處理的受試體使用一種誘導劑，其能夠在所述受試體體內誘導所述生理功能。
2.根據權利要求1的方法，其中所述誘導劑是胸腺素β4(Tβ4)。
3.根據權利要求1的方法，其中所述誘導劑是LKKTET肽。
4.根據權利要求3的方法，其中所述誘導劑是除Tβ4之外的其它誘導劑。
5.根據權利要求1的方法，其中所述誘導劑是除Tβ4之外的其它誘導劑。
6.根據權利要求5，其中所述多肽包含氨基酸序列LKKTET、氨基酸序列KLKKTET、氨基酸序列LKKTETQ，和Tβ4的N-端變異體、Tβ4的C-端變異體、Tβ4異構體、氧化的Tβ4或Tβ4亞砜。
7.根據權利要求1的方法，其中所述誘導劑直接或間接誘導所述生理功能。
8.根據權利要求6的方法，其中所述誘導劑間接誘導所述生理功能，且所述誘導劑刺激所述冠狀組織中LKKTET肽的產生。
9.根據權利要求7的方法，其中所述誘導劑是除LKKTET肽之外的其它誘導劑。
10.根據權利要求9的方法，其中所述誘導劑選自膜受體、HER生長因子受體、Erb B生長因子受體、雌激素(ER)受體、胰島素、與胰島素聯合的結合白蛋白的棕櫚酸鹽、纖連蛋白、谷胱甘肽、甘露醇、P38-MAPK的抑制劑、SB-203580、紅細胞生成素、Rho族蛋白質、Ras、Cdc42或Rac1的至少一種。
11.權利要求10的方法，其進一步包括對所述受試體給予有效量的至少一種分子，所述分子選自醛糖還原酶抑制劑(ARI)、唑泊司他、ACE抑制劑、雷米普利、山梨醇脫氫酶抑制劑、CP-470、CP-711；M-乙酰半胱氨酸(NAC)、酪氨酸磷酸酶抑制劑，例如原釩酸鈉、具有胰島素致敏活性的rexinoid核受體配體、水楊酸鹽/酯、c-Jun N末端激酶(JNK)的藥理抑制劑、氯氮平、奧氮平、ROS抑制劑或BAX抑制劑。
12.權利要求1的方法，其進一步包括對所述受試體給予有效量的一種分子，所述分子選自醛糖還原酶抑制劑(ARI)、唑泊司他、ACE抑制劑、雷米普利、山梨醇脫氫酶抑制劑、CP-470、CP-711；M-乙酰半胱氨酸(NAC)、酪氨酸磷酸酶抑制劑，例如原釩酸鈉、具有胰島素致敏活性的rexinoid核受體配體、水楊酸鹽/酯、c-Jun N末端激酶(JNK)的藥理抑制劑、氯氮平、奧氮平、ROS抑制劑或BAX抑制劑。
13.根據權利要求1的方法，其中所述生理功能包含在所述冠狀組織中上調或增加ILK的活性。
14.根據權利要求1的方法，其中所述生理功能包含在所述冠狀組織中上調或增加Akt的活性。
15.根據權利要求1的方法，其中所述生理功能包含在所述冠狀組織中上調或增加磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的活性。
16.根據權利要求1的方法，其中所述生理功能包含在所述冠狀組織中下調或減少心肌細胞的死亡。
17.根據權利要求1的方法，其中所述生理功能包含在所述冠狀組織中心肌細胞的休眠。
18.根據權利要求1的方法，其中給予受試體的所述誘導劑的給藥劑量在約0.001-1,000,000微克范圍內。
19.根據權利要求1的方法，其中所述誘導劑的給予是通過直接注射至所述冠狀組織、靜脈給藥、腹膜內給藥、肌內給藥、皮下注射、吸入、透皮或口服給藥。
20.根據權利要求1的方法，其中所述誘導劑給予受試體的給藥劑量在約0.1-5,000微克范圍內。
21.根據權利要求1的方法，其中所述誘導劑給予受試體的給藥劑量在約1-30微克范圍內。
22.根據權利要求21的方法，其中所述誘導劑是Tβ4。
23.根據權利要求8的方法，其中所述LKKTET肽是Tβ4。
24.一種篩選能夠按照權利要求1的方法預防冠狀組織損傷的化合物的方法，其包括用候選化合物與冠狀組織接觸；測量所述冠狀組織中至少一種所述生理功能的水平，其中與缺乏所述候選化合物的冠狀組織中至少一種所述生理功能的水平相比，所述至少一種生理功能的水平增加，表明所述化合物能夠治療、預防、抑制或降低所述冠狀組織的損傷。
25.根據權利要求24的方法，其中所述化合物是LKKTET肽而不是Tβ4。
26.一種篩選能夠按照權利要求1的方法誘導至少一種上述生理功能的化合物的方法，其包括用候選化合物接觸冠狀組織；測量所述組織中的Tβ4活性，其中，與缺乏所述候選化合物的冠狀組織中Tβ4活性水平相比，Tβ4活性在所述冠狀組織中增加，表明所述化合物能夠誘導至少一種生理功能。
全文摘要
一種治療、預防、抑制或降低冠狀組織損傷的方法，包括誘導至少一種生理功能，選自上調或增加所述冠狀組織中ILK的活性，上調或增加所述冠狀組織中Akt的活性，下調或減少所述冠狀組織中心肌細胞的死亡，以及心肌細胞在所述冠狀組織中的休眠。對需要進行該處理的受試體使用一種誘導藥劑，其能夠在受試體體內誘導至少一種所述生理功能。
文檔編號A61K38/17GK101068562SQ200580028090
公開日2007年11月7日 申請日期2005年8月19日 優先權日2004年8月20日
發明者迪帕克·斯里瓦斯塔瓦, 依爾迪科·勃克馬凱特, 安科·薩克塞納, 阿蘭·L·戈爾茨坦 申請人:德克薩斯系統大學評議委員會, 雷金納克斯生物制藥公司