專利名稱：修飾的2，4-二氧四氫蝶啶合酶的分離的嵌合蛋白的制作方法
修飾的2，4-二氧四氫蝶-定合酶的分離的嵌合蛋白發效拔^說效包括插入布魯氏菌屬的2， 4-二氧四氫蝶啶合酶氨基末端的達到 十個拷貝的肽、多肽或蛋白結構域的分離的嵌合蛋白。編碼該嵌合蛋 白的分離的核苷酸序列。用于表達該蛋白的載體、質粒和轉化細胞。 由該嵌合蛋白產生的單克隆和多克隆抗體。產生單克隆抗體的雜交瘤。 包含嵌合蛋白、核苷酸序列和抗體的疫苗和藥物化合物。 一種在高等 生物中誘導免疫反應的方法，包括給予有效量的疫苗和藥物化合物。 包括該嵌合蛋白的生物傳感器。由該嵌合蛋白和配體通過共價和非共 價鍵結合形成的蛋白綴合物。該嵌合蛋白、核苷酸序列、栽體、質粒、 轉化細胞、抗體、雜交瘤、綴合物、生物傳感器、疫苗和藥物化合物 的用途。該嵌合蛋白的四級結構。本發明涉及由布魯氏菌屬的2，4-二氧四氫蝶啶合酶與肽、多肽或 蛋白結構域連接得到的經修飾蛋白形成的嵌合蛋白。嵌合蛋白具有在 高等動物中誘導免疫反應和用于其他目的的用途。本發明還涉及包含 與該經修飾蛋白結合的抗原或抗體、或抗原或抗體的片段的藥物化合 物。活減毒疫苗的大規模應用帶來了若干經濟和健康不便。例如，當 活疫苗被減毒后，它們的免疫原性能力常常降低。參見Leclerc， et al.， Immunol. Today, 19 (7): 300-302， (1998) ; Nieba， et al.， Mod. Asp. Immunobiol. ， 1 (2): 36-39 (2000)。另一個不便是減毒作 用被逆轉和微生物恢復其疾病誘導性能的可能性。參見
N. Eng. J Med. , 316:673-678 (1998)。因此，在過去的幾年里， 趨勢一直是基于從細菌或病毒分離的單獨化合物配制非細胞疫苗。通 常，這些單獨的化合物，象微生物所特有的蛋白，具有低免疫原性。 使用佐劑已經克服了這個限制。然而，有的蛋白甚至在佐劑存在下仍 顯示低免疫原性。已提出了幾個蛋白質工程策略來克服這些困難。參 見Leclerc， et al. , Immunol. Today, 19 (7): 300—302 (1998)。病毒殼體蛋白能夠形成三維有序顆粒，稱為"病毒樣顆粒"。這 些顆粒具有與完整病毒相同的大小和形狀。然而，它們內部是空的并 且沒有遺傳物質，致使它們沒有產生感染的能力。它們的大尺寸和順 序為它們提供了顯著的免疫原性。參見Bachmann，et al. ， Science, 262:1448-1451 (1993)。市場上普遍合格的抗乙型肝炎的重組疫苗是 基于這個概念。為了生產抗某些致病微生物的疫苗，"病毒樣顆粒" 已經用作插入這類病原體特征性的肽的載體。參見WO 0032227 (Renner， et al.); WO 0185208 (Bachmann， et al.)。為了給肽提供 載體的輔佐性能，在免疫原性十足的載體中插入多拷貝的肽是有利策 略。然而，這個方法遇到了許多困難由于這些顆粒的尺寸巨大，在 它的復合蛋白中肽的任何插入都妨礙它的正確折疊和，在很多情況下， 降低它的穩定性。此外，只有少數蛋白位點能夠接受肽插入，而不改 變它們的一般結構。參見Nieba， et al. Mod. Asp. I畫nobiol.， 1 (2): 36-39 (2000)。一些細菌蛋白已被假定作為開發嵌合疫苗的載體。參見Leclerc， et al. ， Immunol. Today, 19 (7): 300-302 (1998)。霍亂毒素的B 亞單位是穩定的五聚蛋白，已用來從粘膜獲得抗插入肽的免疫反應。 由于這種毒素穿透胃粘膜的能力，這個策略已經成功。參見Arakawa， et al. Nature Biotech. ， 16:934-938 (1998)。嗜熱脂肪芽孢桿菌 的二氫硫辛酸脫氫酶也已被假定作為蛋白載體，因為它形成復合物和 非常穩定的聚合結構。參見Domingo， et al, ， J Mol. Biol. ， 305: 259-267 (2001); WO 0142439 (Domingo, et al.)。2，4-二氧四氫蝶啶合酶催化核黃素生物合成途徑中的倒數第二 步。參見Goldbaum， etal.， J Med Microbiol. ， 48: 833-839 (1999)。 它的活性位點位于單體當中的中間相，使得這種蛋白具有很穩定的聚 合次序。參見Ritsert， et al. J Mol. Biol. ， 253: 151-167 (1995)。 這些次序在形成五聚和二十面體顆粒的蛋白之間有變化。參見 Braden, et al.， J Mol. Biol. ， 297:1031-1036 (2000)。枯草芽孢 桿菌2，4-二氧四氫蝶啶合酶的二十面體結構已被假定作為插入肽和 開發疫苗的載體。參見W0 0053229 (Bacher， et al.).布魯氏菌屬的2，4-二氧四氫蝶啶合酶是一種非常穩定的蛋白。已 經證明這種18-kDa蛋白是用于人和動物布魯氏菌病的血清學診斷的 有用才示^己。參見Goldbaum, et al. ， J. Clin. Microbiol. ， 30: 604-607 (1992); Goldbaum， et al. ， J Clin. Microbiol.， 31:2141-2145 (1993) ; Baldi， etal.， Clin. Diag. Lab. Immunol.， 3 (4) : 472-476 (1996)。根據X-射線晶體衍射法分析的免疫化學、 酶作用和三維結構，原始未經修飾蛋白當重組表達時，顯示出與天然 蛋白相同的折疊。參見Braden， etal.JMol. Biol. ， 297: 1031-1036 (2000); Goldbaum, et al. ， J Med. Microbiol. ， 48:833-839 (1999); Goldbaum, et al. ， J. Struct. Biol. ， 123: 175-178 (1998)。結 構表明這種18-kDa蛋白在溶液中表現為180-kDa十聚體，變成2， 4-二氧四氫蝶啶合酶的新型四元排列。參見Zylberman， et al. ， J Biol. Chem. ， 279 (9): 8093-8101 (2004)。已假定布魯氏菌屬的2， 4-二氧四氫蝶啶合酶的免疫原性主要源 自于它的聚合特性。參見Baldi， et al.， Braz. J Med. Biol. Res. ， 33:741-747 (2000)。該結構也表明10個氨基酸的氨基末端既 不參與一般折疊也不參與單體當中的聯系。參見Braden， et al. J Mol.
Biol. ，297:1031-1036 (2000)。布魯氏菌屬的2，4-二氧四氬蝶咬合 酶是一種能夠在鼠模型中產生高體液和細胞免疫反應的強大免疫原。 當用重組未經修飾蛋白和用編碼該蛋白的質粒謙導免疫(基因治療、 DNA疫苗接種)時，已經證實了這個能力。參見Velikovsky， et al.， J. Immunol. Meth. ， 244 (1-2) :1-7 (2000)。通過改變免疫途徑和使 用的佐劑有可能調節該反應。參見Velikovsky, et al. ， Infec. Iramun,， 70 (5) :2507-11 (2002)。尤其是，有可能建立強烈的TH1型反 應，其將是布魯氏菌病中具有最高保護能力的反應。參見Velikovsky, et al. Infec. Immun. ， 70 (5): 2507-11 (2002)。然而，本領域仍然需要通常可用于展示肽、多肽和蛋白，和特別 是展示抗原或免疫反應誘導物的具有較小穩定結構的新載體。本領域 尚未描述過2，4-二氧四氫蝶啶合酶十聚體結構作為這種類型載體的 開發和應用。微^參^沐減pBLS-0MP31質粒于2004年4月1日保藏在德國D-38124 Braunschweig, Mascheroder Weg IB的德意志微生物保藏中心 (DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zel lkulturen)， 保藏號為DSM 15546。餘思說效
圖1顯示了表達載體pETlla (Novagen， USA)中的克隆BLS基因 5'末端的核苷酸和氨基酸序列和所產生的盒。粗體部分顯示了編碼區。 紅色部分顯示了盒中的突變堿基。用黃色突出顯示的部分顯示了新的 限制性酶切位點。圖2顯示了用于產生BLS-0MP31嵌合體的寡核苷酸。它們的退火 引起對應于Nsil (5'末端)和Af111 (3'末端)限制性內切酶的粘性位
點的出現，嵌合體中插入的27個氨基酸的序列(在下面，以粗體顯示) 位于它們當中。也顯示了產生的蛋白單體的理論分子量(19， 977. 5道 爾頓)和所插入肽的理論等電點(pl=6. 00)。圖3顯示a)pETlla質粒方案，包含BLS-0MP31嵌合體序列，顯 示了克隆時使用的限制性酶切位點，b)包括BLS-0MP31嵌合體的 pETlla質粒的完整核苷酸序列和c) BLS-0MP31嵌合體的開放讀框。圖4描述了在17。/。丙烯酰胺中通過SDS-PAGE分析的BLS-0MP31的 表達。MW:以千道爾頓表示的分子量標記，1:純化的BLS， 2和3: 兩個BLS-0MP31克隆的等份表達培養物。蛋白遷移如同20-KDa單體， 因為凝膠是變性的。圖5描述了在17。/。丙烯酰胺中通過SDS-PAGE分析的BLS-0MP31的 表達。1:沒有誘導的培養物，2:用lmM IPTG誘導的培養物，3:胞 質部分，4:重懸于8M尿素中的包含體部分箭頭顯示相當于BLS-0MP31 的條帶。(LMWM -低分子量標記，以千道爾頓表示的重量)。圖6顯示了相當于BLS-0MP31在Superdex 200 (Pharmacia, USA) 柱中洗脫的色鐠圖。然后用凝膠分析峰并計數。參見圖7。圖7顯示了在17。/。丙烯酰胺中通過SDS-PAGE分析的BLS-0MP31的 純4匕數據。1和2:以BLS-0PM31洗脫梯度通過Sepharose (Pharmacia, USA)柱獲得的峰，4和5:與圖6中的峰相關的峰數目。(LMWM =低分 子量標記，以千道爾頓表示的重量)。圖8顯示了 BLS和BLS-0MP31嵌合體的圓二色性語。用分光偏振 計(Jasco， UK)監測190和260 nm之間的1. OyM蛋白溶液的摩爾橢圓 性(elipticity )。
圖9描述了 BLS-0MP31嵌合體相對于天然蛋白的穩定性的比較分 析。該曲線顯示了在濃度不斷增加的變性鹽酸胍化學試劑存在下對解 疊的敏感性，用分光偏振計在222認下的由蛋白產生的橢圓性來評價。圖IO顯示了 ELISA測定的BLS-OMP32的抗原性。lyg、 0. 25yg、 0. lyg和20ng BLS-0MP31和BLS用作抗原。抗BLS Mab (1/1000)和 抗OMP31 Mab (1/1000)用作抗體。圖11顯示了用ELISA分析的BLS-0MP31的免疫原性。顯示了來自 用含有佐劑("AF")或無佐劑("PBS")的BLS-0MP31免疫的小鼠的 血清的1/100稀釋物抗0MP31的反應性。根據漸減的反應性，對每組 的血清進行排序。免疫前血清(陰性對照)的反應性以點線圖解。來自 AF組的一只小鼠在選取之前死亡。圖12顯示了來自抗BLS-0MP31兔的血清的ELISA試驗的滴定結 果。測定了三個血清抗0MP31的反應性。兔抗天然BLS血清的1/100 稀釋物用作陰性血清。這種血清的反應性以點線圖解。圖13描述了抗BLS-0MP31兔血清(4°劑量)抗平滑或粗糙的馬耳他 布魯氏菌全菌的反應性。從所示的值減去相當于同時滴定的抗這兩種 抗原的兔抗天然BLS血清的反應性。誤差相當于平均標準誤差的總和。圖14顯示了用lOOpg pCI-BLS-OMP31通過肌內和真皮內途徑在4 個時機免疫的小鼠批組BALB/c (8只/組)中總抗OMP31 IgG抗體的動 力學。每15天用ELISA分析抗體水平。該值表示8只動物的平均值 土S.D.。箭頭顯示了免疫的時間。pCI小鼠(對照)的血清顯示與"截止，， 標準相似或低于其的n個DO值。
圖15描述了 a)用于獲得BLS-KETcl嵌合體的寡核苷酸序列，b) 包括BLS-KETcl嵌合體的pETlla質粒的全部核苷酸序列和 c)BLS-KETcl嵌合體的開放讀框及其氨基酸序列。圖16顯示了產生混合嵌合體的一般戰略性方案。圖17顯示了在BLS-0MP31和BLS-KETcl嵌合體之間建立的混合嵌 合體的純化結果和分析。A: BLS-0MP31 (峰3)和BLS-KETcl (峰l)再 折疊嵌合體和二者的化學計量混合物(峰2)的MonoQ柱的陰離子交換 色譜法分析，Bl:通過陰離子交換色鐠法中獲得的峰1、 2和3的 SDS-PAGE的分析，B2:通過純BLS-0MP31和BLS-KETcl嵌合體和相當 于混合嵌合體的峰2的天然PAGE的分析。圖18顯示了用ELISA分析的BLS-0MP31-KETcl混合嵌合體的免疫 原性。來自用BLS-0MP31-KETcl (空棒)免疫的小鼠的血清的1/100稀 釋物抗BLS和抗0MP31和KETcl合成肽的反應性。抗相同抗原的免疫 前血清(陰性對照)的反應性以灰色棒表示。圖19顯示了通過用BLS-KETcl免疫誘導的脾細胞的體外增殖。它 表明了體外刺激用乳化于皂苷中的KETcl肽或BLS-KETcl預先免疫的 小鼠脾細胞后，滴定的(以cpm計)胸苷摻入的平均值加l個標準偏差。 *就用培養基孵育的脾細胞來說cpm計顯著增加(P〈0. 05)。圖20描述了 BLS-RBD3嵌合體的核苷酸和氨基酸序列。以紅色顯 示了鼠蛋白Staufen-l的結構域RBD3的編碼序列。以黑色顯示了其氨 基末端的前8個殘基的截短BLS的編碼序列。圖21顯示了 BLS-RBD3嵌合體的結構(圖A:側視圖，圖B:俯視 圖)。用MacroModel程序設計結構，將鼠蛋白Staufen-l的結構域RBD3的理論結構(以藍色顯示)的C-末端與BLS晶體結構(蛋白數據庫文件 pdb : 1DI0)N-末端(以紅色顯示)合并。鼠蛋白Staufen-l的結構域 RBD3的理論結構是通過用Prc^o/^/7a /z e/a^ai70Sfer的蛋白Staufen 結構域RBD3結構(pdb : 1EKZ)的同源建模的方式構建的。該圖是用 CHIMERA程序建立的。圖22顯示A:通過在15%聚丙烯酰胺凝膠(7v)中的SDS-PAGE 分離BLS-RBD3嵌合體，各種分子量標記在右側泳道中運行。B:遠離 BLS-RBD3嵌合體的UV圓二色性鐠。該圖比較顯示了實驗測定的嵌合 體譜(以實線表示)和它的理論譜(以虛線表示)，該理論譜由相當于在 分離狀態中的BLS蛋白和鼠蛋白Staufen-l的RBD3結構域的譜組合計 算而來。該測定在50 mM Tris/HCl、 1. 2M NaCl、 pH 8緩沖液、4°C 進行。C:通過使用與分子濾柱出口和折光指數(RI)檢測器串聯連接的 光散射檢測器估計BLS-RBD3嵌合體的分子量。BLS-RBD3在 Superdex-200柱中運行并用50 mM Tris/HCl、 3M尿素、1M NaCl、 pH 8緩沖液，以0.5 ml/min的流速洗脫。通過測定其在90度的光散射 信號和光折射(LR)監測洗脫。通過比較其與用作參考模式的牛血清白 蛋白樣品(BSA分子量66.5 kDa)的光散射和折射信號的關系計算樣 品分子量。圖23顯示了在492nm獲得的分析的每個研究組每只小鼠血清的 1/100稀釋物的光密度。第二次免疫后30天時間間隔的結果作為代表 性實例顯示。水平線表示每組的平均值。圖24顯示了抗OMP31 Mab ELISA試驗的結果。圖25顯示了使用通過用BLS-0MP31嵌合蛋白衍生形成的生物傳感 器檢測抗OMP31、 AcMo37F7單克隆抗體。
圖26顯示了在用BLS刺激的樹突細胞中共刺激分子的表達。來源 于骨髓的樹突細胞用BSL (IOjjM BLS)或僅僅用培養基(對照)孵育18 小時。顯示了 CD40在CDllc+細胞(A)和I-Ad在CDllc+ (B)中的表達。 該同種型對照在每個圖的左邊示出。圖27顯示了用摻入經修飾的BLS蛋白的互補異源二聚肽與理論X 抗原靶形成分子裝配物所遵循的策略。參見Braden， et al.，見上 文。使用Swisspdbviewer建模軟件。圖28顯示了在表達栽體pETlla (Novagen， USA)中克隆的肽 BLS-RRuEE34sL插入基因的核苷酸序列。紅色部分顯示了 BLS-RR12EE3"L 插入肽的編碼區。黑色部分顯示了經修飾的BLS蛋白的編碼區。圖29描述了 BLS-RR12EE345L融合蛋白的核苷酸和氨基酸序列。紅 色部分顯示了 RRuEEwL肽的編碼區。黑色部分顯示了經修飾的BLS蛋 白的編碼區。綠色部分顯示了用絲氨酸置換的IU殘基的位置。圖30顯示了通過在17%聚丙烯酰胺凝膠中的SDS-PAGE分離 BLS-RR12EE345L融合蛋白。1:分子量標記；2:不相關樣品；3:融合 蛋白BLS-RR12EE345L。圖31顯示了使用與分子濾柱出口和折光指數(RI)檢測器串聯連 接的光散射檢測器估計BLS-RI^EE345L嵌合體的分子量。BLS-RR12EE345L 在Superdex-200柱中運行并用50 mM Tris/HCI、 3M尿素、0. 1MNaCl、 pH8緩沖液，以0. 5ml/min的流速洗脫。通過測定其在90度的光散 射信號和光折射(LR)監測洗脫。通過比較其與用作參考模式的牛血清 白蛋白樣品(BSA分子量66.5 kDa)的光散射和折射信號的關系計算 樣品分子量。
圖32顯示了在表達載體pGEX-4Tl(Novagen， USA)中克隆的肽 EEuRRwL插入基因的核苷酸序列。該序列插在該載體的BamHl和EcoRl 限制性酶切位點之間。黑色部分顯示了 GST蛋白的編碼區。紅色部分 顯示了 EEuRR化L肽的編碼區。本發明描述了通常可用于展示肽、多肽和蛋白的嵌合蛋白。在此 顯示的肽、多肽和蛋白可以誘導免疫反應或適于其他有用的目的。本發明還描述了藥物化合物和免疫原性值和功效高的疫苗。這些 化合物和疫苗包括用布魯氏菌屬的2，4-二氧四氫蝶啶合酶(BLS)作為 免疫原性載體產生的嵌合蛋白。本申請中描述的嵌合蛋白可以展示肽、多肽、蛋白或其他特殊的 病原體和非病原體型的分子。更具體而言，本申請中描述的嵌合蛋白可以有效治療和預防人類 疾病。這些實體可用于具有低或無免疫原性活性的抗原、毒素和蛋白 結構域的接種。這些適應癥的實例將是抗嬰兒中的普通麻滲、風瘆、 肝炎、破傷風、百日咳、脊髓灰質炎、白喉、流行性腮腺炎、腦膜炎 和狂犬病的疫苗接種。這些適應癥的其他實例是抗成人中的甲型肝炎、 乙型肝炎和丙型肝炎、流感、腦炎、狂犬病、傷寒、黃熱病、單純皰 滲、水痘帶狀皰滲、登革熱、人乳頭瘤病毒、霍亂、痗疾、肺結核和 流行性腮腺炎的疫苗接種。這些適應癥的其他實例是對抵抗生物恐怖 活動有用的疫苗，適合于下列病原體肉毒毒素、炭疽芽孢桿菌、產 氣莢膜梭菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、出血性結膜炎病毒(腸 道病毒70)和輪狀病毒。這些實體還可以用于慢性病癥的治療，如阿爾茨海默氏病、帕金森氏癥和類風濕性關節炎或其他病癥的治療，如過敏和腫瘤。后者的 實例可以由同時包括抗腫瘤標記或用于放療的放射性元素的抗體或抗 體片段的嵌合蛋白組成。根據本發明開發的嵌合蛋白，和來源于它們 的抗體，還可以用于診斷生育力和妊娠，或診斷疾病如結腸、肺、乳 房和前列腺癌。這些實體還可以用于監測和控制藥物濫用或治療法的 發展。本發明描述的嵌合蛋白還具有用于飼養家畜、農畜和魚的多種用 途。這些實體可以用來制備抗布魯氏菌屬-在牛中引起很多問題的細 菌因子的疫苗，或抗鮭魚立克次氏體的疫苗，該立克次氏體主要影響 鮭魚的商業飼養。此外，這些實體可用于將抗菌劑，如青霉素、羥氨 芐青霉素或其他青霉素副產品，單獨或與特異性抗體聯合給予馴養動 物，象貓和狗，或農畜，象牛。本申請描述的嵌合蛋白的其他可能用途是抗豬肺炎枝原體- 一種 引起豬巨大損失的肺炎因子的疫苗的制備，和通常將殺寄生物藥，象 抗奧氏奧斯特他(氏)線蟲的丙硫咪唑、苯硫咪唑和伊維菌素給予小牛和牛。還可能使用這些新實體將殺寄生物藥，象abamectine和吡會酮 給予馬，或用抗原表位或病毒蛋白結構域，象禽流感接種鳥。無論如 何，嵌合蛋白可以同時含有殺寄生物藥和抗有關寄生蟲的特異性抗體。 新實體的另外的治療用途將是將抗炎劑，象卡洛芬給予馴養動物，象 狗和貓。根據本發明的嵌合蛋白還可以具有控制病原體的不同適應癥。這 些實體可用于調節某些激素的表達，在農畜中加快生長速率和增加乳汁產量，或使得它們的肉變得更瘦。這些非常規適應癥的實例將是使 用這些實體免疫閹割農畜，象豬。本申請描述的嵌合蛋白還可以用于分子農業中疫苗和抗體的大規
模生產。在這種方法中，疫苗或抗體將首先在合適的植物中表達。然 后將從植物中提取疫苗或抗體并純化來制備藥物制劑。另一種可能性 將是為了通過動物的攝食來免疫(可食用疫苗)，用以在此描述的實體 轉化的植物喂養它們。本發明的特殊優點是在此描述的載體能夠攜帶比本領域已知其他 栽體，如"病毒樣顆粒"所攜帶的肽更大的肽。這個優點是由于它們的 尺寸小和穩定性更高。在此描述的載體的這種抗原展示系統具有另外的優點展示重復和按空間順序插入的肽、多肽和蛋白，增加它們的 穩定性和半衰期。載體蛋白(BLS)對所插入的肽、多肽和蛋白還具有相 當大的輔佐作用，因此提高免疫反應有效性。本發明的另 一個優點是載體蛋白BLS在沒有另外的佐劑存在下， 單獨誘導免疫反應。這個特征促進在有或無佐劑的情況下通過各種給 藥途徑(例如靜脈內、經鼻、口、無針)給予根據本發明制備的疫苗。本申請描述的藥物化合物和疫苗的特征是它們在室溫下的高穩定 性。這個特征將很可能保存化合物或疫苗，而不必保持嚴格的冷藏環 節。含插入載體蛋白BLS不同末端的多種肽的混合嵌合體的產生還對 設計多價疫苗或針對不同免疫反應途徑的疫苗有用。目前本領域中普 遍的觀點是疫苗不應該含有10種以上免疫反應誘導物。疫苗應該含有 5種或更少的誘導物以達到最佳效果也是本領域中普遍的觀點。本申請描述的嵌合蛋白具有生產抗體的用途。這些抗體和它們的 相關實體可以用于診斷。使用上面提及的抗體和相關實體開發用于診 斷疾病的試劑盒也是可能的。
根據本發明開發的這些實體中的幾個也可以用于展示肽和建立蛋 白文庫及其相關應用(例如應用于鑒定開發藥物的分子或鑒定用于納 米生物應用的優選結合無機化合物的多肽序列的組合生物學)。這些新 實體中的一些還可以用于生產和裝配納米技術裝置或用于納米技術方 法的實施。根據本發明的嵌合蛋白可用于構建和開發應用于分析檢測幾種物 質和分子(例如檢測水、土壤或空氣中的污染物或毒素、檢測食品中的 藥物、除草劑和殺蟲劑殘留物)的生物傳感器。本申請描述的實體的另一個優點是它的生產容易和低成本。從來 自熟知操作和培養的微生物大腸桿菌的轉化菌林模型獲得了高產量的本申請描述的嵌合蛋白。根據這種方法獲得的感興趣蛋白容易從培養 基中純化。在本發明的一個方案中，在此要求保護的分離的嵌合蛋白是由與從布魯氏菌屬2，4-二氧四氫蝶啶合酶突變的蛋白連接的肽、多肽或蛋 白形成的，其編碼核苷酸序列在其N-末端的前8個殘基已被修飾以允 許它被限制性內切酶切割，當然該酶不切割布魯氏菌屬的天然2，4-二 氧四氫蝶啶合酶蛋白的編碼核苷酸序列。優選，突變的布魯氏菌屬蛋 白2，4-二氧四氬蝶咬合酶在其N-末端前8個殘基已被修飾以便允許用 Nsi I和Afl II限制性內切酶切割該酶。更優選，根據本發明使用的 突變的2，4-二氧四氫蝶啶合酶蛋白具有SEQ ID NO: la、 SEQ ID NO: 2a、 SEQ ID NO: 3a、 SEQ ID NO: 4a、 SEQ ID NO: 5a、 SEQ ID NO: 6a或SEQ ID NO: 7a的氨基酸序列。連接的肽、多肽或蛋白可以是同 源的或異源的。在本發明的一個方案中，與突變蛋白連接的肽是異源 二聚結構域。優選，這個異源二聚結構域是"亮氨酸拉鏈"結構域。 由此獲得的嵌合蛋白包括但不限于氨基酸序列SEQ ID NO: 8a，且優 選用于蛋白結構域、完整蛋白或其他非蛋白實體的偶聯。在本發明的
另一個方案中，也要求保護本申請描述的分離的嵌合蛋白的組合。也 要求保護這些分離的嵌合蛋白和它們的組合的用途。在本發明的另一個實施方案中，要求保護本申請描述的分離的編碼嵌合蛋白的核苷酸序列。這些序列可以是RNA、基因組DNA或拷貝 DM的序列。在本發明的另一個實施方案中，連接的肽、多肽或蛋白 的編碼序列位于編碼突變的布魯氏菌屬2，4-二氧四氫蝶啶合酶蛋白 的核苷酸序列的5'區。在本發明的另一個實施方案中，連接的肽、多 肽或蛋白的編碼序列與編碼突變的布魯氏菌屬2，4-二氧四氫蝶啶合 酶蛋白的核普酸序列的5'區可操作連接。優選，使用的下列DNA序列 是SEQ ID NO: lb、 SEQ ID NO: 2b、 SEQ ID NO: 3b、 SEQ ID NO: 4b、 SEQ ID NO: 5b、 SEQ ID NO: 6b、 SEQ ID NO: 7b或SEQ ID NO: 8b。本發明中使用的突變蛋白序列的具體例子包括但不限于框架核普 酸序列a) BLS-0MP31 b) BLS-KETcl和c) BLS-RBD3，分別在實施 例1、 5和8中使用。在本發明的另一個實施方案中，要求保護本申請 描述的分離的核苷酸序列的組合。也要求保護這些分離的核苷酸序列 和它們的組合的用途。在本發明的另一個實施方案中，要求保護本申請描述的分離的嵌 合蛋白的組合和分離的核苷酸序列的組合。在本發明的另一個實施方案中，要求保護包括在此描述的嵌合蛋 白的編碼序列的載體。這些載體可以是細菌、病毒或其他來源，且能 夠表達本申請描述的嵌合蛋白或促進該表達。這些載體的具體例子是 pBLS-匿31、 pBLS-KETcl和pBLS-RBD3質粒，分別在實施例1、 5和 8中使用。優選，使用pBLS-0MP31、 DSM 15546質粒作為栽體和作為 產生表達本申請描述的嵌合蛋白的質粒的前體。也要求保護這些載體 的用途。
在本發明的另一個實施方案中，要求保護用本申請描述的載體轉 化的細胞或微生物。這些微生物可以是原核、真核或其他來源的微生蟲細胞，細菌如大腸桿菌，和哺乳動物細胞如CHO、 C0S、 BHK、 Namalwa 和HeLa。更優選，使用感受態大腸桿菌菌林進行這類轉化。也要求保 護這些細胞的用途。在本發明的方案中，在此描述的分離的嵌合蛋白能夠在真核生物 中誘導免疫反應。這些嵌合蛋白可以在所治療的生物中誘導細胞或體 液反應。在這些情況下，該反應可以對抗相同抗原、毒素、蛋白結構 域或誘導物或對抗不同抗原、毒素、蛋白結構域或誘導物。根據本發 明使用的抗原、毒素、蛋白結構域或誘導物可以是細菌、寄生蟲、病 毒或其他來源的，并且能夠誘導免疫反應。這些誘導物的具體例子包 括但不限于a)馬爾他布魯氏菌0MP31蛋白的27個氨基酸的序列， b)豬肉絳蟲KETcl蛋白的14個氨基酸的序列和c)鼠蛋白Staufen RBD3結構域的75個氨基酸的序列，它們分別在實施例l、 5和8中使 用。通常，所治療的真核生物是鳥、魚或哺乳動物。優選，這些生物 來自鼠、兔或人來源。更優選，該生物是人來源的。也要求保護能夠 誘導免疫反應的這些嵌合蛋白的用途。在本發明的方案中，編碼在此描述的分離的嵌合蛋白的核苷酸序 列能夠在真核生物中誘導免疫反應。這些核苷酸序列可以在所治療生 物中誘導細胞或體液反應。在這些情況下，該反應可以對抗相同抗原， 毒素，蛋白結構域或誘導物或對抗不同抗原、毒素、蛋白結構域或誘 導物。根據本發明使用的抗原、毒素、蛋白結構域或誘導物可以是細 菌、寄生蟲、病毒或其他來源的，并且能夠誘導免疫反應。這些誘導 物的具體例子包括但不限于，編碼下列蛋白的核苷酸序列a)馬爾他 布魯氏菌0MP31蛋白的27個氨基酸，b)豬肉絳蟲KETcl蛋白的14個 氨基酸和c)鼠蛋白Staufen RBD3結構域的75個氨基酸，它們分別在
實施例1，5和8中使用。通常，所治療的真核生物是鳥、魚或哺乳動 物。優選，這些生物來自鼠、兔或人來源。更優選，該生物是人來源 的。也要求保護能夠誘導免疫反應的這些核苷酸序列的用途。在本發明的方案中，要求保護包括下列成分的藥物化合物或疫苗 l)至少一種類型的本申請描述的嵌合蛋白、2)至少一種類型的編碼本 申請描述的嵌合蛋白的核苷酸序列或3) 1)和2)的組合。本申請要求保護的藥物制劑或疫苗可以是液態的或者是本領域中 已知的任何其他藥物形式，如可注射乳劑。本發明中描述的藥物化合 物或疫苗還可以是用于口服的片劑、液體溶液、懸浮液或酏劑，或無 菌液體如溶液或懸浮液。優選使用惰性介質，如鹽水介質、磷酸鹽緩 沖液和任何其他介質，在其中嵌合蛋白、核苷酸序列或其片段具有適 當的溶解度。本發明要求保護的藥物化合物或疫苗的活性物質以有效的生理劑 量存在。這些活性物質可以單獨給予，或與可接受藥物賦形劑，如為 了增加抗體產生的佐劑聯合給予。根據本發明使用的藥物化合物或疫苗包括但不限于幾種油性制 劑，如弗氏佐劑、酪氨酸硬脂酸鹽、MDP二肽、皂苷、氫氧化鋁(明礬)、 淋巴細胞因子，布魯氏菌屬2，4-二氧四氫蝶啶合酶的天然蛋白和在此 描述的由布魯氏菌屬2，4-二氧四氫蝶啶合酶突變的蛋白。參見US 4, 258, 029 (Moloney, et al.); US 5,057, 540 (Kensil， et al.)。 優選，就人而言使用酪氨酸硬脂酸鹽、氫氧化鋁、布魯氏菌屬2，4-二 氧四氫蝶啶合酶的天然蛋白和在此描述的突變蛋白。弗氏佐劑盡管有 效，但在人中通常不使用。還可以利用緩釋機制，如脂質體給予藥物 化合物或疫苗。參見US 4,235, 877 (Fullerton， W.)。在高等生物 中使用的疫苗和藥物化合物的制備是本領域中已知的。參見 Remington, et al. ， Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton， Pennsylvania, 1980; Voller， et al.， Eds. ， New Trends and Developments inVaccines， University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978。在本發明的方案中，要求保護一種在真核生物中誘導免疫反應的 方法。該方法包括給這種生物施用有效量的藥物化合物或疫苗，包括 l)至少一種類型的本申請描述的嵌合蛋白，2)至少一種類型的編碼本 申請描述的嵌合蛋白的核苷酸序列或3) 1)和2)的組合。在本發明的 方案中，誘導了體液反應。在本發明的另一個實施方案中，誘導了細 胞反應。在本發明的另一個實施方案中，同時或順序誘導了體液或細 胞反應。在這些情況下，該反應可以對抗相同抗原、毒素、蛋白結構 域或誘導物或對抗不同抗原、毒素、蛋白結構域或誘導物。根據本發 明使用的抗原、毒素、蛋白結構域或誘導物可以是細菌、寄生蟲、病 毒或其他來源的，并且能夠誘導免疫反應。這些誘導物的具體例子包 括但不限于，編碼下列蛋白的核苷酸序列a)馬爾他布魯氏菌0MP31 蛋白的27個氨基酸，b)豬肉絳蟲KETcl蛋白的14個氨基酸和c)鼠蛋 白Staufen RBD3結構域的75個氨基酸，它們分別在實施例1， 5和8 中使用。可以用本申請描述的疫苗和藥物化合物治療的生物實例是鳥、 魚或哺乳動物。優選，這些生物來自鼠、兔或人來源。更優選，該生 物是人來源的。本發明描述的疫苗或藥物化合物可以一劑或多個劑量 給予。優選，僅以一劑進行給藥。還可以通過皮下、靜脈內、肌內、 經口、鼻或無針途徑進行給藥。優選，通過皮下或肌內途徑進行給藥。在本發明的另一個實施方案中，要求保護應答用在此描述的嵌合 蛋白和核苷酸序列免疫而產生的單克隆和多克隆抗體。還要求保護為 表達和產生本申請描述的抗體而開發的雜交瘤。要求保護這些抗體用 于預防、治療、診斷和其他目的的用途。還要求保護包括在此描述的 抗體的藥物化合物和它們的用途。
在本發明的另一個實施方案中，要求保護在此描述的嵌合蛋白和 至少一個配體之間形成的蛋白綴合物。在本發明的方案中，嵌合蛋白 和配體之間的連接是共價的。在這些情況下，優選該連接是肽鍵。在 本發明的另 一個實施方案中，嵌合蛋白和配體之間的連接是非共價的。 還要求保護這些蛋白綴合物的用途。在本發明的另一個實施方案中，要求保護在此描述的嵌合蛋白的 典型四級結構。在此使用的術語"活性物質"被定義為l)編碼本申請描述的嵌 合蛋白或其片段的基因組DNA、拷貝DNA、信使RM或其片段和2)本 申請描述的嵌合蛋白或其片段，3) l)和2)的組合或4)在此描述的嵌 合蛋白和其它實體之間形成的蛋白綴合物、其片段。在此使用的術語"有效量"被定義為足以產生一種或多種下列結 果的量l)誘導適當的免疫反應，無論是體液的還是細胞的，包括生 產抗誘導物的抗體；2)抑制與誘導物相關的細胞或微生物的生長、發 育、大小或運動性。當誘導物是腫瘤時，"有效量"將是足以減小腫 瘤大小、阻止腫瘤生長、抑制轉移或腫瘤生長，或減輕由這種腫瘤引 起的不適或延長罹患這種腫瘤的個體的生命的量。在此使用的，術語"哺乳動物"被定義為用其乳腺的分泌的乳汁 來喂養其后代的熱血脊推動物。術語"哺乳動物，，包括但不限于大鼠、 小鼠、兔、狗、貓、山羊、母牛、綿羊、豬、靈長類動物和人。在此使用的術語"藥物化合物或疫苗"被定義為與活性物質共同 給予的稀釋劑、佐劑或賦形劑。它包括每種溶劑、分散介質、水溶液 和氣體溶液、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑、吸收延緩劑或催化
劑或類似物質。活性藥物物質給藥中使用這類介質和試劑是本領域中 已知的。除非用該介質導致活性物質無效，否則這類常規介質與活性 物質一起使用是必要的。補充的有效成分也可以合并到本發明描述的 活性物質中。術語"藥物化合物或疫苗"包括但不限于惰性溶劑或賦 形劑、無菌水溶液和幾種無毒有機溶劑。"藥物化合物或疫苗，，既不 應該與活性物質反應，也不應該另外降低活性物質的功效或穩定性。 可接受的藥物載體包括但不限于水、乙醇、聚乙二醇、礦物油、礦脂、 丙二醇、羊毛脂和類似物質。注射使用的"藥物化合物或疫苗"包括 無菌水溶液(當可溶于水時)或無菌分散液和制備無菌注射分散液或溶 液的粉劑。在每種情況下，該制劑都應該是無菌的和為了使它能夠通 過注射器給予，優選為液體。它還應該在制備和貯藏條件下穩定并且 應該得到保護免受微生物如細菌、病毒和真菌的污染作用。在此使用的術語"預防應用"被定義為誘導和產生抗一種或多種 抗原、毒素、蛋白結構域或其他誘導物或其片段的免疫反應的能力。在此使用的術語"順序給藥"意思是l)同一活性物質以連續的 時段，在一個以上的時機給予或2)兩種或多種活性物質以連續的時 段，在一個以上的時機交替給予。當"順序"給藥時，活性物質給藥 之間的時間差可以是數分鐘、數小時、數天、數周或數月，取決于用 途是預防還是治療和所治療生物的自然狀態。在此使用的術語"單次或同時給藥"意思是在相同時機同時給予 一種或多種活性物質。在此使用的術語"治療應用"被定義是指高等生物，包括人，為 了直接或間接改善這種生物的病癥或抗病性的目的，接受醫療護理的 每一過程、應用、療法或類似行為。
,滋辦J 5i^-嵌合差厲的祐建這個實施例描述了用于將相當于馬爾他布魯氏菌0MP31蛋白的多 肽序列第48至74位氨基酸的序列插入形成布魯氏菌屬2， 4-二氧四氫 蝶啶合酶十聚體的IO個氨基末端的策略。1. ^^T々義磬通過下列方案構建pBLS-0MP31質粒，SEQ ID NO: 9c:a) 為了克隆布魯氏菌屬2，4-二氧四氫蝶啶合酶的編碼基因 (BLS)，通過用特異性引物從流產布魯氏菌基因組DM進行PCR擴增獲 得BLS序列并在pETl 1 a載體(Novagen， USA)中克隆。用Bam HI和Xba 1 限制性內切酶進一步消化包括布魯氏菌屬2，4-二氧四氬蝶啶合酶開 放讀框的pETll-BLS質粒。獲得的插入物在pALter-Exl載體(Promega: USA)中亞克隆。b) 對編碼布魯氏菌屬(BLS) 2,4-二氧四氫蝶啶合酶開放讀框的 序列進行定點誘變。使用ALTERED s i tes 11試劑盒(Promega， USA)將 這個序列在pALter-Exl載體(Promega， USA)中克隆。為了產生該盒， 將兩個新限制位點插入BLS基因的5'區Nsi位點插入BLS天然氨基 酸序列5'末端的前兩個密碼子中，而一個AFL II位點插入包含BLS 天然氨基酸序列的8和9個殘基的兩個密碼子中。要考慮到這些限制 位點在天然BLS基因或pETlla載體中不存在。參見圖1。c) 然后通過測序檢查突變。包括突變BLS序列(SEQ ID NO: 16) 的盒在pETlla栽體(Novagen， USA)中亞克隆以獲得以下稱作pBSLm 的質粒。d) 為了插入相當于0MP31質粒的序列，設計兩個寡核苷酸以便它 們形成雙鏈DNA并包括馬爾他布魯氏菌0MP31蛋白第48-74位氨基酸 的編碼序列，其在退火時被Nsi I和Afl II限制性內切酶特有的粘性 末端所保護。圖2顯示了為構建pBLS-0MP31而設計的寡核苷酸和由這 些寡核苷酸形成的合成插入物。e) 用Nsi I和Afl II限制性內切酶消化pBLSm質粒。除去相當 于BLS前8個殘基的編碼序列。在這種情況下，原始的BLS序列被變 為插入的0MP31肽的核苷酸序列。f) 上述步驟d)的合成插入物與步驟e)中獲得的開放pBLSm盒通 過用DM T4連接酶在16。C孵育過夜而連接。通過測序證實該插入。 從而，獲得了具有SEQ ID NO: 9b序列的基因。序列分析表明布魯氏 菌屬2,4-二氧四氫蝶啶合酶的前8個氨基酸被來自馬爾他布魯氏菌 0MP31蛋白的第48-74位序列的27個氨基酸替代。這個開放讀框稱作 BLS-0MP31嵌合體，由SEQ ID NO: 9b組成。它的相應質粒稱作 pBLS-0MP-31,由SEQ ID-N0 : 9c組成。參見圖3b和c。使用突變BLS的DNA序列SEQ IDN0: 2b、 SEQ ID N0: 3b、 SEQ ID NO: 4b、 SEQ ID NO: 5b、 SEQ ID NO: 6b和SEQ ID NO: 7b重復這個 實驗。獲得了類似結果。2. 脊/么用根據上述方案獲得的pBLS-0MP31質粒通過熱休克轉化感受態 大腸桿菌BL21 (DE3)菌林。然后，在包括LB-瓊脂/氨千青霉素的瓊脂 平板中培養細菌以選擇用該質粒轉化的細菌。將2 ml LB/氨千青霉素 培養基接種到從瓊脂平板提取的菌落中進行小規模表達試驗。搖動該 菌落并在37T孵育。用2yl 1M IPTG誘導飽和的培養物。三小時后， 移出lOOpl培養物并離心。將產生的沉淀重懸于25jj1樣品緩沖液IX， 通過SDS-PAGE 17%進行分析。參見圖4.3. ALS"-ftW^7嵌合f根據上述步驟用500 ml LB/氨節青霉素培養5-ml轉化菌林的預 培養物至飽和。孵育該培養物并在37'C搖動。用0，5 ml IPTG (1M)
誘導以達到600 nm下0.6-0.8的光密度。三小時后移出培養物并以 4， 000 g離心20分鐘。將沉淀懸浮于15 ml懸浮液(50 raM Tris、 5 mM EDTA、 1% Triton X-IOO， pH 8. O)中。以每分鐘1分鐘的時間間隔超聲處理懸浮液5分鐘并以20， 000 g 離心30分鐘。將沉淀重懸于無Triton X-100的15 ml懸浮溶液中并 重復超聲處理過程。第三次重復該步驟。細胞質中表達的嵌合體包含 在三次超聲處理的上清液中，而包含體包含在沉淀中。參見圖5。將包含體重懸于含8M尿素的PBS緩沖液中并在室溫下放置過夜。 對著PBS透析重懸液兩天，更換緩沖液。將樣品離心并對著緩沖液A(50mMTris/HCl、 pH8.5)透析上清液。通過在FPLC設備(Pharmacia, USA)中的MonoQ或Q-Sepharose (Pharmacia, USA)柱中的陰離子交換色譜法進行第一個純化步驟。將樣品注射到用緩沖液A平衡的柱中并 通過直至50。/。緩沖液B (緩沖液A+1M NaCl)的線性梯度洗脫。通過在Superdex 200 (Amersham， UK)分子排阻柱中的色讒法進 行第二個純化步驟。參見圖6和7。為此，將嵌合體峰集中在Centriprep (Millipore， USA)管中并注射到柱中,用PBS洗脫。用SDS-PAGE估 計峰中嵌合蛋白的存在。使用本領域已知的分子生物學技術進行BLS-OMP31嵌合基因的構 建。參見 Sambrook, et al.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, New York, 1989; Brown, Gene Cloning, Chapman & Hal 1, London, England, 1995; Watson, et al. ， Recombinant DNA， 2nd Ed. ， Scientific American Books, New York, New York, 1992 and Davis et al. ， Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publ ishing Co. ， New York, New York, 1986， Alberts, et al. , Molecular Biology of the Cell,4th Ed. ， Garland Science, New York, New York, 2002。^/ W嵌合^裙定#通過光散射技術獲得了 BLS-0MP31嵌合蛋白采取十聚體折疊的第 一個證據。這個步驟用來計算在溶解狀態中該蛋白的分子大小。為進 行這些測定，將分子排阻柱與光散射檢測器相連。隨蛋白從柱中洗脫， 它的分子量被測定。根據這種方法，計算的BLS分子量是163 kDa，而BLS-0MP31嵌 合體的分子量是215 kDa。天然BLS和BLS-0MP31十聚體的理論分子 量分別是174.4和197. 8kDa。考慮到這種方法準確性是90%，這個結 果提示BLS-0MP31嵌合體形成非常類似于天然BLS蛋白的十聚體。通過圓二色性研究了嵌合蛋白的折疊。在J-810分光偏振計 (Jasco， UK)中進行圓二色性測定，設置IOO nm/min的閱讀速度、4s 的響應時間和1 nm的帶寬。^使用1、 2或5 mm的石英盤(Hellma)。 在50 mM pH 7磷酸鹽緩沖液中測定樣品。BLS-0MP31嵌合體和天然BLS 的圓二色性i普的覆蓋圖表明這兩種蛋白的一般折疊非常類似。參見圖 8。因此，證實了該正確折疊的嵌合蛋白和十聚體一樣，具有與天然蛋 白相似的二級結構。接下來，研究了在該嵌合蛋白N末端的置換是否影響它們的穩定 性。為此，通過圓二色性研究了通過鹽酸胍(Gdm-HC1)和溫度誘導的嵌 合體變性。從變性-平衡曲線，有可能獲得幾個熱力學參數，如與解疊相關的 自由能的變化。用這個參數，估計蛋白所特有的構象穩定性。參見Pace， et al， Methods Enzymol.， 131: 266-80 (1986)。為評價與每種蛋 白解疊相關的自由能變化，調整研究數據以適合理論描述性曲線。這 個圖描述了嵌合蛋白的折疊和解疊期之間的平衡常數和變性劑的變化 濃度的相關性。為進行這些實驗，將相同量的蛋白(O. 1 M十聚體)與濃度漸增的 變性劑一起孵育。由6 M胍-HC1 (ICN，超高純)、50 mM磷酸鹽，pH 7 的基質溶液制備曲線上每個點的溶液。樣品在室溫下孵育三小時并在 測定前離心。在5mm盤中25。C進行圓二色性測定。由此證明了用胍使 BLS天然蛋白和BLS-0MP31嵌合蛋白變性的可逆性。調整變性-平衡曲線以適合兩步解離模式。根據這個模式，十聚體 首先分離為兩個相等的五聚體。在變性的第二步中，這些五聚體的每 一個進一步解離為五個解疊單體。描述這個轉變的公式源自于已經對 于單體蛋白提出的公式。參見Zylberman， et al， J Biol. Chem.， 279 (9): 8093-8101 (2004)。由天然BLS和BLS-0MP31獲得的熱力學數值表明BLS N末端的替 代不影響十聚體穩定性。參見圖9。因此，證實了 BLS嵌合體形成正 確折疊的十聚體，而且它們的穩定性類似于天然BLS的穩定性。^4辨J 》LSH M^7嵌合雄戎#^和_^瘦通過測定BLS-0MP31與抗插入肽的特異性單克隆抗體 (A59/10F09/G10單克隆抗體)和抗天然BLS蛋白的特異性單克隆抗體 (BI24單克隆抗體)結合的能力研究了它的抗原性。參見Vizcaino, et al., Infect. Im瞧.，69 (11): 7020-28， (2001) ; Goldbaum， et al.， J CHn. Microbiol. ， 31: 2141-2145 (1993)。這個步驟允許測定插 入物和蛋白核心的抗原性。用ELISA測定抗原性。參見圖10。用抗天然BLS的單克隆抗體和抗插入肽的單克隆抗體鑒定了 BLS-0MP31。正如所料，天然BLS僅由第一個抗體識別。這個結果表明 插入肽當被嵌合體展示時保留了其抗原性能。此外，還表明了嵌合體 的折疊不影響抗BLS抗體與蛋白核心的親合力。這兩個抗體檢測達到 每孔2Gng嵌合體。然后，評價BLS-0MP31誘導抗插入肽的特異性體液免疫反應的能 力。在有和沒有佐劑輔助下，在小鼠中分析了這種能力。以每組五只 小鼠的兩個組進行實驗。"AF"組通過腹膜內途徑以0、 20和40天間 隔接受三個劑量的含弗氏佐劑的乳劑中的25jjg蛋白。第一劑量與弗 氏完全佐劑一起給予。其余劑量與弗氏不完全佐劑一起給予。"PBS" 組得到相同處理，但是在無佐劑情況下注射嵌合蛋白。第三次免疫后 7天抽取血液并用ELISA測定抗0MP31膜蛋白的血清反應性。參見圖 11。在用嵌合體和佐劑免疫的小鼠中獲得了抗0MP31的強烈反應。從用嵌合蛋白有和沒有佐劑免疫的小鼠獲得的血清學反應也是相應的。 這些結果表明用BLS-0MP31嵌合體有或沒有佐劑免疫的小鼠具有抗插 入肽的特異性免疫反應。根據下列方案用BLS-0MP31嵌合體與佐劑注入兔第一劑量，第0天:含200jjg BLS-0MP31的lml PBS+lml弗氏完 全佐劑，通過肌內注射。第二劑量，第22天含200jjg BLS-0MP31的lml PBS+lml弗氏 不完全佐劑(IFA)，通過皮下注射。第三劑量，第45天含200pg BLS-0MP31的lml PBS+lml IFA， 通過肌內注射。
第四劑量，第155天:含200jjg BLS-0MP31的lml PBS+lml IFA， 通過皮下注射。在第31、 52和180天抽取血液樣品。將樣品離心并冷凍血清。用ELISA滴定注射第二、第三和第四劑量的抗原后收集的抗0MP31 膜蛋白的抗血清。參見圖12。對于相當于第二、第三和第四劑量的血 清，測定的抗血清滴度分別是3,200、 12， 800和25, 600。將基線定義 為能夠鑒定出陰性血清中抗原的最大稀釋度。經免疫的兔顯示出抗 OMP31的強烈特異性免疫反應。由于抗天然BLS的血清不能鑒定OMP31 ， 因此這種高反應性是由于特異性抗體抗插入嵌合體的肽的反應。參見 圖13，陰性對照。在大腸桿菌中重組產生ELISA試驗中使用的OMP31蛋白。由于這 個分子是膜蛋白，它不能保持在水溶液中，因此在變性條件下獲得。 在進行的試驗中，沒有證實抗血清能夠鑒定作為細菌膜蛋白的呈天然 構象的0MP31嵌合體。這個性能對評價嵌合體作為能夠提供抗布魯氏 菌屬的體液免疫的免疫原的潛在有效性很重要。為評估這個性能，使 用馬耳他布魯氏菌H38的平滑和粗糙菌抹作為抗原進行ELISA試驗。 參見圖13。由于使用的抗原的復雜性，通常難以評價血清抗全菌的反 應性。然而，該試驗表明抗BLS-0MP31血清特異性識別插入粗糙菌林 膜的0MP31。這種血清抗光滑菌林的反應性不同于由抗天然BLS血清 顯示的反應性。這個結果與對于A59/10F09/G10單克隆抗體所公開的 數據完全一致。參見Vizcaino, etal.，見上文。對包含在BLS-OMP31 嵌合體中的插入物特異性的這種抗體與馬耳他布魯氏菌林H38的粗糙 而不是光滑菌林具有強烈的反應性。*滋辨4 將BLS-0mp31的編碼序列亞克隆入栽體pCI-neo (Promega， USA)， 包含引物5'末端(符合讀框)的限制位點和Kozak共有序列(帶下劃 線)。因此，構建了下列寡核普酸BLS-0MP31 "有義，，:5'TAAGAA GAATCC ACCACCATG CAT ACC GCC GGT TA 3:BLS-0MP31 "反義":5'TGT CCA CCA GTC AT GCTAGCT CAG ACA AGC GCG ATG C 3'。使用pET-BLS-0MP31質粒作為模板通過PCR擴增該序列。用相應 的限制性內切酶消化PCR產物和載體，然后進行連接反應。通過測序 核查獲得的構建體。在大腸桿菌JM109細胞中擴增pCI-BLS-0MP31質 粒并用"mega prep"柱(Quiagen, UK)進一步純化。在260/280nm 下用分光光度測定法估計DNA純度和濃度。用鱟變形細胞溶胞產物分 析試劑盒(Sigma， USA)測得，質粒制劑含有每100jjg DNA少于0.05 單位的內毒素。在第0、 2、 4和6周，通過肌內(im)和皮內(id)途徑給Balb/c 小鼠組接種含lOOpg pCI-BLS0MP31質粒和無插入物的對照質粒(pCI) 的生理溶液。在第一次免疫后第0、 15、 30、 45、 60和75天，通過眶 后途徑抽取動物血液。將血清保存在-20。C用于特異性抗體的檢測。通過使用重組0MP31蛋白作為抗原的間接ELISA分析經 BLS-0MP31 DNA疫苗(pCI-BLS0MP31)免疫誘導的抗OMP31體液反應。 免疫后，所有動物產生體液免疫反應。觀察到產生的特異性抗0mp31 蛋白的高水平IgG同種型。參見圖14。
使用分子生物學技術和本領域已知的藥物化合物的制備和給藥方法進行pCI-BLS-0MP31質粒的制備、擴增、純化和作為DNA疫苗的使 用。參見Schleef， M， Ed， Plasmids for Therapy andVaccination， Wiley-VCH Verlag GmbH， Weinheim， Ger醒y， 2001。^^嵌合沐的;遂合參當用高濃度氯化胍處理時，布魯氏菌屬2，4-二氧四氫蝶啶合酶可 逆解離的事實用來構建混合嵌合體。參見Zylberman， etal.，JBiol. Chem. 279 (9): 8093-8101 (2004)。構建了插入物大小和等電點具有 顯著差異的兩個嵌合體。為了更容易地區別由混合嵌合體形成的十聚 體，遵循這個策略。為此，除了已經描述的0MP31肽，使用圖15所示的KETcl肽。KETcl高保護性。參見Huerta， et al. ， Vaccine 20:62-266 (2001); Toledo, et al.，Infect. Immun. ， 69:1766-1773 (2001)。根據下列方案獲得BLS-KETcl嵌合蛋白a) 用Nsi I和Afl II限制性內切酶消化pBLS-0MP31質粒以除 去相當于0MP31蛋白第48-74位序列的27個氨基酸的編碼序列。提取 0MP31蛋白編碼序列。b) 將KETcl肽的14個氨基酸的編碼序列與a)中的開放盒連接， 其通過pBLS-0MP3r,"質粒的開放盒與DNA T4連接酶在16'C孵育過 夜來進行。由此獲得了 BLS-KETcl讀框。經讀框測序證實了該插入。 這個讀框稱作BLS-KETcl嵌合體，具有SEQIDNO: 1Qb，和表達質粒， pBLS-KETcl。
還可以遵循實施例1的步驟l)中指出的方案進行這個步驟，其通過用Nsi和Afl I限制性內切酶切割BLSm盒(SEQ ID NO: lb)和它與 KETcl插入物進一步連接來進行。由此，也獲得了 BLS-KETcl讀框和 pBLS-KETcl質粒。使用突變BLS的DM序列SEQ IDNO: 2b、 SEQ ID NO: 3b、 SEQ ID NO: 4b、 SEQ ID NO: 5b、 SEQ ID NO: 6b和SEQ ID NO: 7b重復這個 實驗。得到相似結果。2. 辟/A用根據上述方案獲得的pBLS-KETcl質粒通過熱休克轉化感受態 大腸桿菌BL21菌林(DE3)。然后，在包含LB-瓊脂/氨節青霉素的瓊脂 平板中培養細菌以選擇用該質粒轉化的細菌。3. "^y-i^rW嵌合蛋^時》S;^趟必將2ml LB/氨千青霉素培養基接種到從瓊脂平板提取的菌落中進 行小規模表達試驗。搖動該菌落并在37'C孵育。用2yl 1M IPTG誘導 飽和的培養物。三小時后，移出100yl培養物并離心。產生的沉淀重 懸于25yl樣品緩沖液IX，用SDS-PAGE 17%進行分析。根據上述步驟用500 ml LB/氨千青霉素培養5-ml轉化菌抹的預 培養物至飽和。孵育該培養物并在37t:搖動。用0.5 ml 1M IPTG誘 導以達到600 nm下0. 6-0. 8的光密度。三小時后移出培養物并以4， 000 g離心20分鐘。沉淀重懸于15 ml懸浮溶液(50 raM Tris、 5 mM EDTA、 1% Triton X-IOO， pH 8. 0)中。以每分鐘1分鐘的時間間隔超聲處理懸浮液5分鐘并以20, 000 g 離心30分鐘。沉淀重懸于無Triton X-100的15 ml懸浮溶液并重復
超聲處理過程。第三次重復該步驟。細胞質中表達的嵌合體包含在三 次超聲處理的上清液中，而包含體包含在沉淀中。包含體重懸于含8 M尿素的PBS緩沖液中并在室溫下放置過夜。 對著PBS透析重懸液兩天，更換緩沖液。將樣品離心并對著緩沖液A (50mMTris/HCl、 pH8.5)透析上清液。通過在FPLC設備(Pharmacia, USA)中的MonoQ或Q-Sepharose (Pharmacia, USA)柱中陰離子交換色 i普法進行第一個純化步驟。將樣品注射到用緩沖液A平衡的柱中并通 過直至50。/。緩沖液B (緩沖液A+1M NaCl)的線性梯度洗脫。通過在Superdex 200 (Amersham， UK)分子排阻柱中的色語法進 行第二個純化步驟。為此，將嵌合體峰集中在Centriprep (Millipore， USA)管中并注射到柱中，用PBS洗脫。用SDS-PAGE估計峰中嵌合蛋白 的存在。使用本領域已知的分子生物學技術進行BLS-KETcl嵌合基因的構 建。參見Sambrook, et al.，見上文；Brown，見上文；Watson， et al.， 見上文；Daviset al.，見上文，Alberts, et al.，見上文。BLS-0MP31和BLS-KETcl嵌合體在2M氯化胍中解疊，以等摩爾濃 度混合并通過透析重聚。添加2M胍，使十聚體分離，由此產生保留它 們的二級結構的五聚體。當通過透析除去胍時，五聚體重聚再次形成 十聚體。參見Zylbe簡n， etal.， J Biol. Chem. ， 279 (9): 8093-8101 (2004)。用這種方式，產生了 BLS嵌合體的混合物。參見圖16。通過在MonoQ (Amersham， UK)陰離子交換柱中的交換色鐠法純化 重聚產物。根據下列方案將結果與每個單獨的嵌合體(沒有解離的樣品) 的洗脫分布圖相比以16. 8。/。緩沖液B洗脫BLS-KETcl嵌合體(由于插 入物理論等電點，估計這個顆粒堿性最大)和以35. 8%的相同緩沖液洗
脫BLS-0MP31嵌合體。重聚樣品分離產生三個不同的峰，第一個峰相 當于純BLS-KETcl嵌合體；第二個最大的峰相當于混合嵌合體而最后 一個峰相當于純BLS-0MP31嵌合體。參見圖17 A。用SDS-PAGE和天然PAGE分析相當于第二個峰的樣品。結果表明 相當于由在一個五聚體的五個氨基末端展示的KETcl肽和由在另一個 五聚體的五個氨基末端展示的0MP31肽形成的嵌合體混合物的樣品。 參見圖17B1和B2。這個結果表明提出的分離、混合和重聚經修飾蛋白的策略可有效 產生嵌合體的混合物，其中由BLS十聚體結構展示五個拷貝的兩種不 同的肽。參見圖16。該混合物可能具有不同的特性，這取決于插入物 的性質(例如一種插入物可能針對特定的細胞運輸，而另一種可能誘導 特定的免疫反應)。見^嵌會伴W;遂會游^;^將BLS-0MP31-KETcl嵌合體的混合物與佐劑一起給予小鼠以估計 它誘導特異性體液免疫反應的能力。以每組五只小鼠進行實驗。該組 在0、20和40天通過腹膜內途徑接受三個劑量的含弗氏佐劑的乳劑中 的25|jg蛋白。第一劑量與完全佐劑一起應用。笫二和第三劑量與不 完全佐劑一起應用。第三次免疫后7天抽取血液并用ELISA測定抗 0MP31和KETcl合成肽的血清反應性。參見圖18。在用嵌合體的混合物與佐劑一起免疫的小鼠中獲得了抗這兩種肽 的強烈反應。這證明了用BLS-0MP31-KETcl嵌合體的混合物免疫的小鼠同時產生了抗這兩種插入物的特異性免疫反應。 《順7拔嵌合# ^勿應^^^:^用乳化于皂苷中的50iJg/小鼠的BLS-KETcl嵌合體和用乳化于皂 苷中的10jjg/小鼠的KETcl合成肽免疫每組五只BALB/c小鼠的組，以 評估由BLS-KETcl嵌合體誘導的抗插入肽的特異性細胞免疫反應。在 10天間隔內通過皮下途徑免疫小鼠兩次。最后一次免疫后三天無菌摘除兩組的脾。脾細胞重懸于補充了 L-谷氨酰胺(O. 2mM)、 2-巰基乙醇(O. 05mM)、非必需氨基酸(0. OlmM)、青 霉素(IOO U/ml)、鏈霉素(1QQi4g/ml)和胎牛血清10% (FBS)的RPMI 1640 Gibco (InVitrogen Corp., USA)培養基中。將培養基、KETcl 肽或BLS-KETcl嵌合體(10iJg/ml)添加至不同的細胞培養物中。將細 胞以每200|jl終體積2 x 105個細胞的濃度懸于平底培養微板中。將 它們保持在5。/。C02, 37'C的濕潤環境中。72小時后，向每個培養物添加l|jCi [曱基-力]胸苷(Amersham Biosciences, UK)。接種細胞和在1205 betaplate 液體閃爍計數器 (Wallac 0y， FI)中測定滴定的胸苷摻入水平。所有試驗一式三份進行。該試驗表明用BLS-KETcl嵌合體免疫的小鼠脾細胞在肽和嵌合體 都存在下在培養物中增殖。這個結果清楚地表明BLS-KETcl嵌合體能 夠誘導抗插入BLS的KETcl肽的特異性細胞免疫反應。參見圖19。BLS可以被修飾，不僅展示肽，而且在它的十個氨基末端展示完 整蛋白結構域。為了證明這個交替的用途，通過將修飾的BLS編碼序
列與鼠蛋白Staufen-l的RBD3蛋白結構域的編碼序列連接而構建 BLS-RBD3嵌合體。參見圖20和21。根據下列方案獲得BLS-KETcl嵌合蛋白1. Ma) 用Nsi I和Afl II限制性內切酶消化pBLS-0MP31質粒以除 去相當于0MP31蛋白第48-74位序列的27個氨基酸的編碼序列。提取 0MP31蛋白編碼序列。b) 將鼠蛋白Staufen的RBD3結構域的75個氨基酸的編碼序列與 a)中的開放盒連接，其通過pBLS-0MP31，"質粒的開放盒與DNA T4 連接酶在16'C孵育來進行。由此獲得了 BLS-RBD3讀框。經讀框測序 證實了該插入。這個讀框稱作BLS-RBD3嵌合體，具有SEQIDNO: llb， 和表達質粒，pBLS-RBD3。還可以遵循實施例1的步驟l)中指出的方案進行這個步驟，其通 過用Nsi和Afl I限制性內切酶切割BLSm盒(SEQ ID NO: lb)和它與 RBD3插入物進一步連接來進行。由此，也獲得了 BLS-RBD3讀框和 pBLS-RBD3質粒。寸吏用突變BLS的DNA序列SEQ IDNO: 2b、 SEQ ID NO: 3b、 SEQ ID NO: 4b、 SEQ ID NO: 5b、 SEQ ID NO: 6b和SEQ ID NO: 7b重復這個 實驗。得到相似結果。2. 轉化用根據上述方案獲得的pBLS-KETcl質粒通過熱休克轉化感受態 大腸桿菌BL21菌林(DE3)。然后，在有氨千青霉素存在的LB培養基中 接種菌抹。用IPTG 1 mM在28。C誘導基因表達4小時。 3. "LSS /U嵌合蛋-付^這;^趟^該蛋白以包含體表達，用4和6M尿素溶液洗滌并通過在4。C磁力 攪拌16小時溶于緩沖液Tris/HCl 50 mM、尿素8 M、 EDTA 5raM、 ^ -ME5mM、 PMSFlmM、 pH 8。溶解蛋白在變性條件下，在Q-Sepharose 離子交換柱中純化，應用在緩沖液Tris/HCl 50mM、 8M尿素、pH 8. 5 中0至1MNaCl的線性梯度。洗脫蛋白通過對著PBS緩沖液透析再折 疊并用肝素Hyper D柱純化。對于洗脫，使用緩沖液Tris/HCl 50 mM、 NaCl 1.2 M、 pH 8。圖22顯示了通過如上所述方法獲得的BLS-RBD3嵌合體的 SDS-PAGE、圓二色性和光散射分析。SDS-PAGE分析顯示獲得的BLS-RBD3嵌合體純度很高。在電泳遷 移中觀察到的微小異常歸因于RBD3結構域正電荷的高密度。通過BLS 和分離的鼠蛋白Staufen-l的RBD3結構域的譜組合計算的BLS-RBD3 圓二色性譜與其理論譜的相似性表明該嵌合體很好折疊。由嵌合體在 與光散射檢測器和折光指數檢測器串聯連接的分子濾柱中運行計算的 嵌合體分子量(257 kDa)表明BLS-RBD3嵌合體呈現十聚體結構。使用本領域已知的分子生物學技術進行BLS-RBD3嵌合基因的構 建。參見Sambrook, et al.，見上文；Brown，見上文；Watson， et al.，見上文；Daviset al.，見上文，Alberts, et al.，見上文。^ 嵌會琳^《,^f *戎# 使用BLS-Staufen嵌合體作為免疫原以獲得抗Staufen RBD3結構 域的抗體。給5只Balb/c小鼠接種含80|jg BLS-RBD3嵌合體的緩沖 液200|jl HCl 50mM、 NaCl 1, 2M、 50mM磷酸鹽、pH8，不含佐劑，通 過腹膜內途徑以14天的間隔接種兩次。作為對照，用BLS蛋白和 S t auf en RBD3結構域的混合物免疫同 一品系的5只小鼠，包含的嵌合 體質量相同。最后一次免疫后十五天通過眶后穿刺抽取小鼠血液。通 過以1000 xg離心10分鐘制備血清。在具有谷胱甘肽S-轉移酶-RBD3 (GST-RBD3)融合蛋白的96孔板中通過ELISA測定抗RBD3的血清反應 性。與羊過氧化物酶(DakoCytomation， USA)綴合的小鼠抗免疫球蛋白 用作第二抗體。用orthophenildyamin (0PD)引發反應，并用4 N硫 酸中止。用ELISA讀數器在492 mn處測定光密度。圖23顯示了由兩組產生的體液免疫反應的代表性實例。觀察到， 用BLS-RBD3嵌合體免疫引起強烈的抗RBD3抗體反應。在用BLS和RBD3 混合物接種的小鼠中沒有觀察到抗該肽的反應性。,施鄉M遞迎^ 嵌合傳克《Z^卓^謦^e傳評估用BLS-0MP31嵌合體免疫的小鼠脾細胞產生抗0MP31肽的特 異性單克隆抗體的能力。以每組五只小鼠進行實驗。該組以0、 20和 40天間隔通過腹膜內途徑接受三個劑量的含弗氏佐劑的25pg蛋白的 乳劑。在第60天，通過腹膜途徑給顯示抗0MP31肽的較好反應的小鼠 接種溶于PBS的25pg BLS-0MP31。取出這種小鼠的脾并將脾細胞與 NSO骨髓瘤細胞融合。在HAT培養基中選擇所產生的雜交瘤，并且測 定它們的培養物上清液，通過ELISA測定抗0MP31肽的反應性。通過 有限稀釋克隆顯示較高反應性的雜交瘤。圖24顯示了抗0MP31肽和完 整0MP31蛋白的AcMo 37F7反應性。獲得了抗二者的強烈反應。這證 明了用BLS-0MP31嵌合體免疫的小鼠產生了抗插入肽的特異性免疫反 應。這個經驗也表明使用BLS嵌合體可以產生特異性單克隆抗體。嵌合# #為^參傳4器#^途生物傳感器允許檢測大分子當中的特異性相互作用，其通過增加與反應表面上的質量累積成比例的信號顯現。使用BLS-0MP31經修飾 蛋白研究BLS嵌合體作為用于開發生物傳感器的肽和蛋白結構域載體 的應用。為此目的，進一步分析了上述實施例中描述的BLS-0MP31和 AcMo 37F7之間的反應。BLS-0MP31嵌合體用來衍生葡聚糖羧曱基(dextran carboximethyl )平板(IAsys Affinity Sensors, Thermo, USA)。 為 了該目的，包含80|jg/ml BLS-0MP31的10 mM乙酸鈉pH 5. 5緩沖液 在用EDC/NHS試劑預先衍生的平板中孵育。使相當于800弧秒的信號 (等于5 ng的抗原)固定后，用二乙胺封閉反應表面。衍生后，研究抗 -0MP31 AcMo 37F7反應性，為此將50|jl的培養物上清液在預先活化 的平板中孵育。如在圖25中所觀察到的，AcMo 37F7發生強烈反應，產生了大約 300弧秒的信號。在分離階段，洗滌和添加緩沖液PBS + Tween，觀察 對應于固相AcMo分離的信號下降。這個實施例清楚顯示了該嵌合體能 夠檢測針對生物傳感器中肽的抗體。紹辦" 遽d見S承^^^f爻勿^分析BLS活化樹突細胞的能力。為此，在這些細胞與BLS孵育18 小時后，研究它們中不同標記的活化水平。來自Balb/c小鼠的骨髓細 胞在含RPMI培養基的培養平板中，在5°化02環境下37'C的培養箱中培 養，RPMI培養基含2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100|jg/inl鏈 霉素、50yM 2-巰基乙醇和10。/。胎牛血清(培養基R10)，補充了小鼠粒 細胞和巨噬細胞集落刺激因子(mGM-CSF)。在第3、 6和8天更換培養
基。在第9天，取出非貼壁細胞并以300 xg離心8分鐘。然后將細胞 以2xl(^個細胞/ml的濃度在R10培養基中孵育18小時(n-4)，終體積 lffll，有BLS ( 1， 5或IO一)或沒有BLS。然后，將每200jul終體積 4xl05個細胞離心并與和異疏氰酸熒光素(FITC)綴合的下列單克隆抗 體(Pharmingen):抗-CD40、抗-CD80、抗I-Ad或抗-CD86，和與同藻 紅蛋白(PE)綴合的抗-CDllc單克隆抗體孵育。進行三次洗滌并用 FACScan細胞計數器(Becton Dickinson, USA)提取細胞。用CellQuest (Becton Dickinson, USA)軟件分析獲得的數據。在與BLS孵育的細胞中，在CDllc+亞群(75-80%)內，觀察到表達 CD40、 CD80、 I-Ad和CD86的細胞的百分比和平均熒光顯著增加。實 驗進行三次，獲得相似的結果。圖26顯示了在有或沒有BLS時處理的 CDllc+細胞中，CD40表達(A)和I-Ad (B)的代表性直方圖。在C3H/HeJ小鼠(對LPS無應答者)的樹突細胞中或當BLS蛋白與 多粘菌素B預先孵育以便除去大腸桿菌的LPS時，觀察到由BLS引起 的類似活化。這些結果證明BLS能夠活化樹突細胞。遽《4 ^^嵌合伴^凝^接興農一f冷潛種喊承4'^^f襲翁浙的/^BLS蛋白可以在它的氨基末端被修飾以展示完整的蛋白結構域。 這可以伴隨分子裝配物的形成。在這些簇中，互補異源二聚肽與修飾 的BLS蛋白和靶合并。然后，異源二聚體之間的高親合力將靶分子和 修飾的BLS蛋白連接起來。高親合力異源二聚體的使用對避免影響載 體蛋白的正確折疊有用。為證明BLS嵌合體的這個應用，使用本領域
已知的兩種異源二聚肽RR12EE3"L和EE12RR345L。參見Moll, et al.，M Protein Sci. ， 10:649-655 (2001)。參見圖27。這個策略允許分子 裝配物的構建，包括十個拷貝的與BLS結合的結構域。體外進行裝配， 使得可能控制該過程的化學計量。這個系統也能夠在不同于BLS的重 組系統中表達抗原。參見圖28。1. 融合蛋白BLS-RR12EE345L的構建在BLS的N-末端克隆肽RRuEEwL。參見圖28和29。位于BLS和 RR12EE3"L接頭區的IU殘基替代絲氨酸。BLS-RR12EE345L嵌合基因在 pETlla載體中克隆。用所產生的載體轉化感受態大腸桿菌BL21 (DE3) 細菌菌林。然后，將該細菌在LB-瓊脂/氨節青霉素培養基中培養。用 1M IPTG在37'C誘導基因表達16小時。該蛋白以包含體表達。用緩沖液50 mMTris/HCI、 5mM EDTA、 5 mM P-ME、 1 mM PMSF， pH 8洗涂包含體。用緩沖液50 mMTris/HCl、 8M尿素、5mM EDTA、 5 mM P-ME、 lmM PMSF、 pH 8處理溶解的蛋白并在4'C磁力攪拌16小時。 在變性條件下通過在Q-Sepharose (Pharmacia, USA)柱中的陰離子交 換色i普法純化所產生的BLS-RR12EE345L嵌合體。使用緩沖液50 mM Tris/HCl、 8 M尿素、pH 8. 5在0至1 M NaCl線性梯度下洗脫樣品。 用SDS-PAGE和光散射分析測定該融合蛋白。參見圖30和31。SDS-PAGE分析表明該融合蛋白BLS-RR12EE345L具有高水平的純度。 用光散射技術測得，該蛋白分子量是224 kDa。此外，該蛋白在遠距 離紫外光譜中顯示出高質量的CD信號。這些結果提示該融合蛋白很好 地折疊并觀察到在8M尿素存在下與天然BLS蛋白相似的十聚體結構。 當尿素濃度降低時，BLS結構在室溫下變形。這大概是由于RR12EE345L 與其本身的結合。2. 肽EEuRR"sL的構建
在谷胱甘肽S-轉移酶(GST)蛋白的C-末端克隆肽EE12RR345L。這個 肽與由BLS融合蛋白展示的RRuEEwL肽互補。參見圖32。EE12RR345L肽基因在pGEX-4Tl栽體中克隆。用所產生的載體轉化 感受態大腸桿菌BL21 (DE3)細菌菌林。然后，將該細菌在LB-瓊脂/ 氨芐青霉素培養基中37'C培養。用lniMIPTG在37。C誘導基因表達16 小時。然后超聲處理該細菌。使用谷胱甘肽/瓊脂糖基質純化所產生的EE12RR345L肽，作為GST 融合蛋白。將偶聯的復合物裝入柱并用緩沖液50niMTris， pH 8洗滌， 直到洗脫液中沒有肽。然后，將基質與凝血酶在室溫下孵育16小時以 從GST融合蛋白中切下EEI2RR345L。然后用緩沖液50 inM Tris， pH 8 洗脫該肽以進一步純化它。產生的EEuRR34sL肽具有高水平的純度。3.融合蛋白BLS-RRuEE化L和肽EEuRRwL之間分子裝配物的形成 將一份融合蛋白BLS-RR12EE345L與8 M尿素、50 mM Tris、 0.5 M NaCl， pH 8在30。C預先孵育15分鐘。將四份肽EE12RR345L在緩沖液 50 mM Tris、 0. 1 M NaCl、 pH 8中，30。C預先孵育15分鐘。將該融 合蛋白和肽混合并在30'C孵育15分鐘。孵育后該混合物保持可溶。通過光散射分析測定產生的分子裝配物并計算它的理論分子量 (MW: 222. 1 kDa)。參見圖34。這個分析表明大約10個EE12RR345L肽 (MW: 5. 6 kDa)與BLS-RR12EE3"L十聚體歸:222. 1 kDa)連接在一起。參 見圖35。此外，該裝配物在遠距離紫外光i普中顯示出高質量的CD信號。這 些結果提示使用這種技術產生與修飾的BLS蛋白形成的分子裝配物是 可行的。
已經相當詳細地描述并舉例說明了本發明以便于對它的理解和重 現。本領域任何技術人員都可以進行形式和細節方面的某些改變，而 不背離本發明權利要求的真實目的和范圍。在此引用方面的全部出版 物完全引入作為本發明說明書的參考文獻。
參考文獻Arakawa， T., Yu， J., Chong， D.， Hough, J，， Engen, P， C. and LangHdge， W. H. R. "A plant-based cholera toxin B subunit-insulin fusion protein protects against the development of autoimmune diabetes" Nature Biotech,, 16:934-938, 1998.Bacher A. and Fischer M. "Protein conjugates, methods, vectors, proteins and DNA for producing them, their use, and medicaments and vaccines containing a certain quantity of said protein conjugates" WO0053229.Bachmann, M. F.， Rohrer, U. H., Kundig， T. M.， Burki, K.， Hengartner, H. and Zinkernagel， R. M. "The influence of antigen organization on B cell responsiveness" Science, 262:1448-1451, 1993.Baldi， P.C,， Velikovsky， C.， Braden， B.C., Giambartolomei， G.H,, Fossati, C.A, and Goldbaum， F.A. "Structural, functional and immunological studies on a polymeric bacterial protein" Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 33:74卜747， 2000.Baldi, P,C.， Giambartolomei, G.H.， Goldbaum, F.A.， Abd6n, L.F.， Velikovsky， C.A. Kittelberger, R. and Fossati, C.A. "Humoral immune response against LPS and cytoplasmic proteins of Brwce//" in cattle vaccinated with "6orto S19 orexperimentally infected with Tm1/"/" ew/erao ////ca 0:9" Clinical Diagnostic and Laboratory Immunology, 3 (4):472-476， 1996,Braden, B,C,， Vdikovsky， C.A.， Cauerhff， A.， Polikarpov， I. and Goldbaum, F. A. "Divergence in macromolecular assembly: X-ray crystallographic structure analysis of lumazine synthase from 5rwce〃" a6or加"Journal of Molecular Biology, 297:1031-1036， 2000.Domingo, G丄,Orru， S, and Perham, R.N. "Multiple display of peptides and proteins on a macromolecular scaffold derived from a multienzyme complex" Journal of Molecular Biology, 305:259-267,2001.Domingo, G丄，Orru， S. and Perham， R.N. "Molecular display on multimeric protein scaffolds derived from the E2 component of the alphaketoacid dehydrogenase" WO0185208.Goldbaum， F.A,， Rubbi, C,P，， Wallach， J.C., Miguel, S.E.， Baldi, P.C. and Fossati， C.A "Differentiation between active and inactive human brucellosis by measuring antiprotein humoral immune responses" Journal of Clinical Microbiology, 30:604-607， 1992.Goldbaum， F,A', Leoni, J.， Wallach， J.C. and Fossati， C.A. "Characterization of an 18 kDa brucella cytoplasmic protein which appears to be a serological marker of active infection of both human and bovine brucellosis" Journal of (jlinical Microbiology, 31:2141-2145， 1993.Goldbaum, F.A.， Polikarpov, L， Cauerhff, A.， Velikovsky， C.A., Braden B.C. and Poljak， R丄"Crystallization and preliminary X-ray analysis of the lumazine synthase from 卿."Journal of Structural Biology, 123:175-178， 1998.Goldbaum, F,A,， Velikovsky, C.A., Baldi， P.C., Mdrtl， S., Bacher， A. and Fossati, C.A. "The 18 kDa cytoplasmic protein of 5race〃a卿.is as enzyme with lumazine synthase activity" Journal of Medical Microbiology, 48:833-839， 1999.Huerta, M,， " "Synthetic peptide vaccine against 7bem,a w//, pig cysticercosis: successful vaccination in a controlled field trial in rural Mexico" Vaccine, 20:262-266， 2001.Laemmli, U.K. "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4." Nature, 227(259): 680-5, 1970.Leclerc, C. and Ronco， J. "New approaches in vaccine development" Immunol. Today， 19(7):300-302， 1998.Li， Y., Mui， S. ， Brown, J. H. ， Strand， J. ， Reshetnikova, L. ， Tobacman, L. S. y Cohen, C. 2002. The Crystal Structure of the C-Terminal Fragment of Striated-Muscle Alpha-Tropomyosin Reveals a Key Troponin T Recognition Site. Procedings Nacional Academy of Sciences USA, 99: 7378.Moll, J.， Ruvinov， S., Pastan, I. and Vinson, C. "Designed heterodimerizing leucine zippers with a ranger of pis and stabilities up to 10-15 M" Protein Sci.， 10:649-655, 2001.Nieba， L. and Bachmann， M. F. "A new generation of vaccines" Moderns Aspects of Immunobiology， l(2):36-39, 2000.Pace, C,N. "Determination and analysis of urea and guanidine hydrochloride denaturation curves" Methods Enzymol,， 131: 266-80， 1986.Redfield， N. New England Journal of Medicine, 316:673-678， 1998，Renner, W.A.， Bachmann， M.， Hennecke， F.， and Nieba， L. "Ordered molecular presentation of antigens, method of preparation and use" WO0032227.Bachmann， M.， Dunant N., Sebbel, P.， Tissot， A., and Lechener， F. "Molecular antigen array" WO0185208.Ritsert， K.， Huber， R.， Turk， D.， Ladenstein， R.， Schmidt陽Base， K. and Bacher， A. "Studies on the lumazine synthase/riboflavin synthase complex of 5a"7/ws sw6"/^y: crystal structure analysis of reconstituted, icosahedral p-subunit capsids with bound substrate analogue inhibitor at 2.4 A resolution" Journal of Molecular Biology， 253: 151-167,1995.Toledo， A., & a/. "Two epitopes shared by rae /a cray57ce戸and !Taem'a jo/z'w/w confer protection against murine 71. cysticercosis along with a prominent Tlresponse" Infect Immun 69:1766-1773， 2001. Velikovsky, C. A., Cassataro， J., Sanchez, M.， Fossati， C. A.， Fainboim， L. and Spitz, M. "Single-shot plasmid DNA intrasplenic immunization for the production of monoclonal antibodies" Persistent Expression of DNA, J. Immunol. Meth., 244(1-2): 1-7, 2000b.
權利要求
1.分離的嵌合蛋白，包含與修飾的2，4-二氧四氫蝶啶合酶蛋白連接的肽、多肽或蛋白結構域，其中編碼該經修飾蛋白的前8個N-末端殘基的核苷酸序列已被改變以允許其被限制性內切酶切割，該酶不切割編碼天然存在的2，4-二氧四氫蝶啶合酶蛋白的核苷酸序列。
2. 根據權利要求1的分離的嵌合蛋白，其中編碼經修飾蛋白N-末 端前8個殘基的核苷酸序列包含酶Nsi I和Afl II的限制性酶切位點。
3. 根據權利要求1的分離的嵌合蛋白，其中經修飾蛋白來源于布 魯氏菌屬的2，4-二氧四氫蝶啶合酶。
4. 根據權利要求2的分離的嵌合蛋白，其中經修飾蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: la。
5. 根據權利要求2的分離的嵌合蛋白，其中經修飾蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: 2a。
6. 根據權利要求2的分離的嵌合蛋白，其中經修飾蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: 3a。
7. 根據權利要求2的分離的嵌合蛋白，其中經修飾蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: 4a。
8. 根據權利要求2的分離的嵌合蛋白，其中經修飾蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: 5a。
9. 根據權利要求2的分離的嵌合蛋白，其中經修飾蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: 6a。
10. 根據權利要求2的分離的嵌合蛋白，其中經修飾蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: 7a。
11. 根據權利要求2的分離的嵌合蛋白，其中經修飾蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: 8a。
12. 根據權利要求2的分離的嵌合蛋白，其中經修飾蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: 9a。
13. 根據權利要求2的分離的嵌合蛋白，其中經修飾蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: 10a。
14. 根據權利要求2的分離的嵌合蛋白，其中經修飾蛋白的氨基酸 序列包含SEQ ID NO: lla。
15. 分離的核苷酸序列，包含根據權利要求1至14的嵌合和經修 飾蛋白的編碼序列。
16，根據權利要求15的分離的DNA序列，包含SEQIDNO: lb。
17. 根據權利要求15的分離的DNA序列，包含SEQIDNO: 2b。
18. 根據權利要求15的分離的DNA序列，包含SEQ ID NO: 3b。
19. 根據權利要求15的分離的DNA序列，包含SEQ ID NO: 4b。
20. 根據權利要求15的分離的DNA序列，包含SEQ ID NO: 5b。
21. 根據權利要求15的分離的DNA序列，包含SEQ ID NO: 6b。
22. 根據權利要求15的分離的DM序列，包含SEQ ID NO: 7b。
23. 根據權利要求15的分離的DNA序列，包含SEQIDNO: 8b。
24. 根據權利要求15的分離的DNA序列，包含SEQ ID NO: 9b。
25. 根據權利要求15的分離的DNA序列，包含SEQIDNO: 10b。
26. 根據權利要求15的分離的DNA序列，包含SEQIDNO: llb。
27. 用來運載根據權利要求15至26的核苷酸序列的載體。
28. 根據權利要求27的載體，其中該載體是病毒性的。
29. 根據權利要求27的載體，其中該載體是質粒性的。
30. SEQ ID NO: 9c的質粒。
31. 質粒pBLS-0MP31，保藏號DSM 15546。
32. 用根據權利要求27至31的載體轉化的細胞。
33. 根據權利要求32轉化的真核細胞。
34. 根據權利要求32轉化的原核細胞。
35. 根據權利要求34轉化的大腸桿菌細胞。
36. 根據權利要求1的分離的嵌合蛋白，其中連接的肽、多肽或蛋 白結構域是同源的。
37. 根據權利要求1的分離的嵌合蛋白，其中連接的肽、多肽或蛋 白結構域是異源的。
38. 根據權利要求1的分離的嵌合蛋白，其中連接的肽、多肽或蛋 白結構域是抗原、毒素、物質或其片段，能夠在真核生物中誘導免疫反 應。
39. 根據權利要求38的分離的嵌合蛋白，其中連接的肽、多肽或 蛋白結構域是細菌來源的抗原、毒素、物質或其片段。
40. 根據權利要求38的分離的嵌合蛋白，其中連接的肽、多肽或 蛋白結構域是病毒來源的抗原、毒素、物質或其片段。
41. 根據權利要求38的分離的嵌合蛋白，其中連接的肽、多肽或 蛋白結構域是寄生蟲來源的抗原、毒素、物質或其片段。
42. 根據權利要求38的分離的嵌合蛋白，其中該抗原是BLS-0MP31 或其片段。
43. 根據權利要求38的分離的嵌合蛋白，其中該抗原是BLS-KETcl 或其片段。
44. 根據權利要求38的分離的嵌合蛋白，其中該抗原是BLS-RD3 或其片段。
45. 根據權利要求38的分離的嵌合蛋白，其中免疫反應是體液的。
46. 根據權利要求38的分離的嵌合蛋白，其中免疫反應是細胞的。
47. 根據權利要求38的分離的嵌合蛋白，其中真核生物包括鳥、 魚或哺乳動物樣本。
48. 根據權利要求47的分離的嵌合蛋白，其中真核生物是哺乳動 物樣本。
49. 根據權利要求47的分離的嵌合蛋白，其中哺乳動物樣本包括 鼠、兔或人樣本。
50. 根據權利要求49的分離的嵌合蛋白，其中哺乳動物樣本是人。
51. 根據權利要求38的分離的嵌合蛋白，其中連接的肽、多肽或 蛋白結構域是在體外或體內誘導免疫反應的抗原、毒素、物質或其片段。
52. 根據權利要求51的分離的嵌合蛋白，其中免疫反應是在體外 引發的。
53. 根據權利要求51的分離的嵌合蛋白，其中免疫反應是在體內 引發的。
54. 根據權利要求1的兩種或多種分離的嵌合蛋白的組合，其中與 每個經修飾蛋白連接的肽、多肽或蛋白結構域是不同的。
55. 根據權利要求1的兩種或多種分離的嵌合蛋白的組合，其中與每個經修飾蛋白連接的肽、多肽或蛋白結構域是相同的。
56. 根據權利要求15的兩種或多種分離的核苷酸序列的組合，其 中編碼與經修飾蛋白連接的肽、多肽或蛋白結構域的核苷酸序列是不同 的。
57. 根據權利要求15的兩種或多種分離的核苷酸序列的組合，其 中編碼與經修飾蛋白連接的肽、多肽或蛋白結構域的核苷酸序列是相同 的。
58. 根椐權利要求1的一種或多種分離的嵌合蛋白和根據權利要 求15的一種或多種分離的核苷酸序列的組合。
59. —種藥物化合物，包含至少一種根據權利要求1至14的分離 的嵌合蛋白。
60. 根據權利要求59的藥物化合物，包含藥物可接受賦形劑。
61. 根據權利要求60的藥物化合物，其中藥物可接受賦形劑是佐劑。
62. 根據權利要求61的藥物化合物，其中佐劑包括弗氏佐劑、MDP 二肽或皂苷。
63. 根據權利要求61的藥物化合物，其中佐劑包括酪氨酸硬脂酸 鹽、氫氧化鋁、淋巴細胞因子、布魯氏菌屬2,4-二氧四氫蝶啶合酶的天 然蛋白或布魯氏菌屬2，4-二氧四氫蝶啶合酶的經修飾蛋白。
64. 根據權利要求63的藥物化合物，其中佐劑是布魯氏菌屬2，4-二氧四氫蝶啶合酶的天然蛋白。
65. 根據權利要求63的藥物化合物，其中佐劑是布魯氏菌屬2，4-二氧四氫蝶啶合酶的經修飾蛋白。
66. —種藥物化合物，包含至少一種根據權利要求15至26的分離 的核苷酸序列。
67. 根據權利要求66的藥物化合物，包含藥物可接受賦形劑。
68. 根據權利要求67的藥物化合物，其中藥物可接受賦形劑是佐劑。
69. 根據權利要求68的藥物化合物，其中佐劑包括弗氏佐劑、MDP 二肽或皂苷。
70. 根據權利要求68的藥物化合物，其中佐劑包括酪氨酸硬脂酸 鹽、氫氧化鋁、淋巴細胞因子、布魯氏菌屬2,4-二氧四氫蝶啶合酶的天 然蛋白或布魯氏菌屬2，4-二氧四氫蝶啶合酶的經修飾蛋白。
71. 根據權利要求70的藥物化合物，其中佐劑是布魯氏菌屬2,4-二氧四氫蝶啶合酶的天然蛋白。
72. 根據權利要求70的藥物化合物，其中佐劑是布魯氏菌屬2，4-二氧四氫蝶啶合酶的經修飾蛋白。
73. —種藥物化合物，包含至少一種根據權利要求1至14的分離 的嵌合蛋白和至少一個根據權利要求15至26的分離的核苷酸序列。
74. 根據權利要求73的藥物化合物，包含藥物可接受賦形劑。
75. 根據權利要求74的藥物化合物，其中藥物可接受賦形劑是佐劑。
76. 根據權利要求75的藥物化合物，其中佐劑包括弗氏佐劑、MDP 二肽或皂苷。
77. 根據權利要求75的藥物化合物，其中佐劑包括酪氨酸硬脂酸 鹽、氫氧化鋁、淋巴細胞因子、布魯氏菌屬2,4-二氧四氫蝶啶合酶的天 然蛋白或布魯氏菌屬2,4-二氧四氫蝶啶合酶的經修飾蛋白。
78. 根據權利要求77的藥物化合物，其中佐劑是布魯氏菌屬2，4-二氧四氫蝶啶合酶的天然蛋白。
79. 根據權利要求77的藥物化合物，其中佐劑是布魯氏菌屬2，4-二氧四氫蝶啶合酶的經修飾蛋白。
80. —種在真核生物中誘導免疫反應的方法，包括給該生物施用有 效量的根據權利要求59、 66或73制備的藥物化合物。
81. 根據權利要求80的方法，其中免疫反應是體液的。
82. 根據權利要求80的方法，其中免疫反應是細胞的。
83. 根據權利要求80的方法，其中藥物化合物是同時給予的。
84. 根據權利要求80的方法，其中藥物化合物是順序給予的。
85. 根據權利要求80的方法，其中真核生物包括鳥、魚或哺乳動 物樣本。
86. 根據權利要求85的方法，其中真核生物是哺乳動物樣本。
87. 根據權利要求86的方法，其中哺乳動物樣本包括鼠、兔或人 樣本。
88. 根據權利要求87的方法，其中哺乳動物樣本是人。
89. 根據權利要求80的方法，其中藥物化合物通過皮下、靜脈內、 腹膜內、肌內、經口或鼻途徑或通過無針注射系統給予。
90. 根據權利要求89的方法，其中藥物化合物通過皮下、腹膜內 或肌內途徑給予。
91. 單克隆和多克隆抗體，其中該抗體與由根據權利要求15的核 苷酸序列所編碼的肽、多肽和蛋白結構域或其片段起反應。
92. 單克隆和多克隆抗體，其中該抗體與包含根據權利要求1的氨 基酸序列或其片段的肽、多肽和蛋白結構域或其片段起反應。
93. 包含根據權利要求91和92的單克隆和多克隆抗體的藥物化合物。
94. 表達根據權利要求91和92的單克隆抗體的雜交瘤。
95. —種生物傳感器，包括(a)基底，其固定了至少一種根據權 利要求1的分離的嵌合蛋白和(b)所述基底與能夠測定配體是否附著于分離的嵌合蛋白或與其起反應的測量單元連接。
96. 根據權利要求95的生物傳感器，其中配體是抗體。
97. 蛋白綴合物，包含與肽、多肽或蛋白結構域連接的配體，該肽、 多肽或蛋白結構域與根據權利要求1的布魯氏菌屬2,4-二氧四氫蝶啶 合酶的經修飾蛋白連接。
98. 根據權利要求97的蛋白綴合物，其中連接是共價鍵。
99. 根據權利要求98的蛋白綴合物，其中共價鍵是肽鍵。
100. 根據權利要求97的蛋白綴合物，其中連接是非共價的。
101. 根據權利要求97的蛋白綴合物，其中配體和嵌合蛋白通過異 源二聚體結構域的連接序列而連接。
102. 根據權利要求101的蛋白綴合物，其中異源二聚體結構域的 連接序列編碼亮氨酸拉鏈。
103. 根據權利要求1的分離的嵌合蛋白，其中它們的四級結構是 五聚二聚體。
全文摘要
包括插入布魯氏菌屬的2，4-二氧四氫蝶啶合酶氨基末端的達到十個拷貝的肽、多肽或蛋白結構域的分離的嵌合蛋白。編碼該嵌合蛋白的分離的核苷酸序列。用于表達該蛋白的載體、質粒和轉化細胞。由該嵌合蛋白誘導的單克隆和多克隆抗體。產生該單克隆抗體的雜交瘤。包括該嵌合蛋白、核苷酸序列和抗體的疫苗和藥物化合物。一種在高等生物中誘導免疫反應的方法，包括給予有效量的疫苗和藥物化合物。包括該嵌合蛋白的生物傳感器。由該嵌合蛋白和配體通過共價和非共價鍵結合形成的蛋白綴合物。該嵌合蛋白、核苷酸序列、載體、質粒、轉化細胞、抗體、雜交瘤、綴合物、生物傳感器、疫苗和藥物化合物的用途。該嵌合蛋白的四級結構。
文檔編號A61K39/12GK101133163SQ200580026046
公開日2008年2月27日 申請日期2005年6月3日 優先權日2004年6月3日
發明者F·A·戈德鮑姆 申請人:金基因有限公司