專利名稱：：獨特麥盧卡因子(umf)強化蜂蜜的制作方法
技術領域：
：本發明涉及由UMF改進的食品和藥物。尤其是，盡管不是唯一地，本發明涉及UMF強化蜂蜜、制備UMF強化蜂蜜的方法和制備蜂蜜的含UMF級份的方法。
背景技術：
：麥盧卡樹土生土長在新西蘭，并且出產具有濃郁風味的蜂蜜。除了數千年用作食品外，蜂蜜已經用于醫學目的，其主要作為抗菌劑。抗菌活性的主要原因是由于通過葡萄糖氧化酶在蜂蜜中產生的過氧化氫。除所述抗菌活性之外，已經發現麥盧卡蜂蜜還擁有一些活性。該額外的活性稱為非過氧化物活性，并且商業上稱為獨特麥盧卡因子(uniquemanukafactor，UMF)。已經作了很多研究以鑒定非過氧化物活性的特，并進行了鑒定負責所述額外活性的級份的嘗試，但迄今為止尚未成功。蜂蜜已經被使用了數千年，最初涉及蜂蜜的書面文件追溯到大約4000年前。蜂蜜是僅有的不需要處理或加工以使其可被食用的增甜材料(White，1992)。麥盧卡樹，澳洲茶樹(Leptospermumscoparium)，土生土長在新西蘭。它喜較潮濕和低肥滲濾性土壤，可存活大約60年。該樹可長成6-8m高度和7-10cm直徑。花寬10-12mm并且通常是白色(Ward，2000)。麥盧卡樹出產的蜂蜜具有草本、木本特征的濃郁風味并且顏色是黑色。已經實施了很多研究以確定蜂蜜中存在的化合物。原因包括創建蜂蜜的“指紋”數據庫以便可以確定其地理和植物來源，并且也可查明蜂蜜的摻假貨。大多數化合物包括在碳水化合物、酶、芳香酸、碳氫化合物、直鏈一元和二元酸以及水的種類之內。盡管蜂蜜主要由糖類、葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖組成(White，1978)，但是也已經鑒定出許多其他低聚糖。在麥盧卡蜂蜜中經鑒定重要的低聚糖包括maltulose、曲二糖、松二糖、黑霉糖、麥芽糖、海藻糖、帕拉金糖、蔗糖、erlose和潘糖、松三糖和麥芽三糖(Weston&Brocklebank，1999；Wu，2000)。Wu(2000)發現松二糖是麥盧卡蜂蜜中的主要低聚糖，然而Weston&Brocklebank(1999)發現麥芽糖是其中的主要低聚糖。通過蜜蜂添加到蜂蜜中的其他物質是氨基酸，最豐富的是脯氨酸，和較少量的過氧化氫酶(White，1992)。過氧化氫酶降解過氧化氫成為水和氧。麥盧卡蜂蜜包含高濃度的芳香酸，其中占主要的是2-羥基-3-苯基丙酸(Tanet.al.，1988；Wilkinset.al.，1993)，并且麥盧卡中的芳香酸濃度大大高于新西蘭苜蓿蜜(高1000倍)(Tanet.al.，1988)。已被鑒定的芳香酸是2-甲氧基苯甲酸、2′-甲氧基苯乙酮、2-癸烯二酸(2-decenedioicacid)、4-羥基-3-5-二甲氧基苯甲酸、2-羥基-3-(4′-甲氧基苯基)丙酸、丁香酸、3，4，5三甲氧基苯甲酸和苯乙酮(Tanet.al.，1988；Wilkinset.al.，1993)。不考慮季節和地理來源，單花麥盧卡蜂蜜的樣品的特征是丙酸的組合濃度高于700mg/kg蜂蜜、組合的苯甲酸濃度高于35mg/kg蜂蜜、和組合的苯乙酮濃度高于20mg/kg蜂蜜(Wilkinset.al.，1993)。Tanet.al.(1989)也鑒定出2-羥基-3-苯基丙酸是主要的特征性化合物，并且舉例說明了高水平的該化合物與2-甲氧基苯甲酸和2′-甲氧基苯乙酮作為標記以確定麥盧卡植物來源的應用。Wilkinset.al.(1993)指出經常在麥盧卡蜂蜜中發現比在其他蜂蜜中具有更高濃度的癸二酸和反式-2-癸二酸。已經在蜂蜜中有二價酸，包括辛二酸、壬二酸、癸二酸和反式-2-癸烯二酸(Tanet.al.，1988；Wilkinset.al.，1993)。Whiteet.al.(1962)在其他蜂蜜中鑒定的其他化合物包括內脂、淀粉酶、自由酸度(freeacidity)和灰分。該文獻不包含麥盧卡蜂蜜中任何關于這些的信息，也沒有任何麥盧卡蜂蜜水分含量的已公開信息。從古時起蜂蜜已經被很多文明用于醫學(Ransom，1937，Adcock，1962)。由于了解到明確的抗菌作用，最近蜂蜜作為有報道價值的藥劑的興趣已經增加。蜂蜜的抗菌作用基本上由蜂蜜種類而定(Dustmann，1979)。也已經觀察到，麥盧卡(澳洲茶樹桃金娘科)蜂蜜具有更高水平的抗菌活性，其不能僅僅由蜂蜜滲透壓、pH和葡萄糖氧化酶活性來解釋(Russell，1983)。活性的貢獻者現被稱為“非過氧化物活性”或“UMF”。Dustman(1979)已經注意到并非因為葡萄糖氧化酶活性或高滲透壓所致的抗菌活性的存在。然而，他的觀點是后一活性僅僅是總活性的一小部分。Molan&Russell(1988)給出了在麥盧卡蜂蜜中抗菌活性的存在不是由于過氧化氫所致的證據，并且也發現具有高總體活性的麥盧卡蜂蜜也具有高水平的非過氧化物活性。有關蜂蜜非過氧化物活性的研究已經發現它具有一些有趣且明顯矛盾的特性。Verge(1951)在水、醇、醚和丙酮中獲得了活性組分。Schuler和Vogel(1956)用醚提取了該活性。Lavie(1960)發現有可能使用丙酮而不是醚提取活性。Gonnet和Lavie(1960)發現冷醚提取物中的活性在95℃是揮發性的。Mladenov(1974)報道了蜂蜜包含揮發性、強揮發性和非揮發性的抗菌物質。已經發現麥盧卡蜂蜜的活性是熱和光穩定性的(Molan&Russell，1988，Tanet.al.，1988，Russellet.al.，1990)，并且Tanet.al.(1988)的初步研究顯示該額外的活性在有機溶液例如乙醇和醚中是可溶的。芳香酸和酚類化合物是除了過氧化氫和溶菌酶之外已從蜂蜜中分離的具有抗菌活性的僅有其他物質(Westonet.al.，2000)。咖啡酸和阿魏酸，這兩種酚酸，已經被確定為具有抗微生物活性(CizmarikandMatel，1970，Cizmarik，2000)，并且已經從蜂蜜中分離出來(Wahdan，1998，Weston，2000)。然而，發現它們僅僅是低濃度，并且當與過氧化氫所起的作用相比時，它們對蜂蜜的抗菌活性貢獻很少(Weston，2000)。MarhuendaRequendaet.al.(1987)報道了其他酚酸的抗菌活性，其包括咖啡酸、香草酸、對香豆酸、對羥基苯甲酸和丁香酸。由蜂蜜分離的類黃酮包括pinocembrine、短葉松素(pinohanksin)、柯因和二氫黃酮(Wahdan，1998，Ferrereset.al.，1994)。它們具有充分論證的抗菌活性(Rivera-Vargaset.al.，1993，ltohet.all.，1994)，而且在蜂蜜中的濃度不夠高，不具有顯著抗菌作用(Weston，2000)。Russell(1983)鑒定了兩種芳香化合物是來自蜂蜜的主要抗菌組分。它們是4-羥基-3-5-二甲氧基苯甲酸(酯)和甲基-3，4，5-三甲氧基苯甲酸(酯)。蜂膠，一種通過蜜蜂從樹的樹膠滲出物中收集的、并且在蜂巢中用作抗菌劑的樹脂材料，包括取代的苯甲酸和肉桂酸類以及類黃酮(Marcucci，1995)。Wahdan(1998)指出在抗菌蜂膠中類黃酮是主要物質。發現負責該抗菌活性的組分已經被鑒定為良姜素、松屬素(pinocembrin)、咖啡酸和阿魏酸。(Lavie，1960，Ghisalbert，1979，Russellet.al.，1990)。Weston(2000)已經證明單個組分缺乏抗微生物活性，而僅僅對全蜂膠觀察到生物活性。蜂毒肽(mellitin)和磷脂酶被認為是引起其弱抗菌活性的蜂毒的組分。這兩者都是蛋白質，并且凝膠過濾色譜已經顯示麥盧卡蜂蜜中的抗菌物質具有低于1000amu的分子量(Russellet.al.，1990)。對麥盧卡蜂蜜的非過氧化物活性可能有貢獻的其他產物可能是由蜜蜂體液鑒定的抗生素肽。已經鑒定的產物是蜂毒素、多肽抗生素、hymenoptaecin、王漿素、和溶菌酶。所述肽擁有強的抗生素活性，并且如果它們存在于蜂蜜中，則它們能顯著地貢獻非過氧化物活性(Westonet.al.，2000)。盡管已進行了多年的研究，麥盧卡蜂蜜抗菌活性的非過氧化物級份(UMF)尚未被分離或鑒定。確實，一些研究者認為不存在麥盧卡蜂蜜組分的可分離級份。Russellet.al.，(1990)認為關于額外抗菌活性(即不是因為過氧化氫或高滲透壓所致的活性)重要性的觀點的差異，有可能是由于所述活性的量中的差異所致。Molan和Russell(1988)發現，對于一系列新西蘭蜂蜜樣品，該額外的活性從一些樣品中的零變化到其他樣品中幾乎全部的活性。他們也注意到在額外抗菌活性的水平和單個蜂蜜樣品的總體抗菌活性間存在密切相關性。Bogdanov(1997)嘗試通過分離揮發性、非極性和非揮發性、酸性、和堿性級分以測定在哪個級份中存在非過氧化物活性。他通過測試樣品的活性、取出級份、然后再測試該活性而完成此項工作。如果樣品中沒有保留該活性，那么他可以得出抗菌組分存在于被取出的級份中的結論。通過在轉子蒸發器中在60℃下加熱2小時提取揮發性物質。通過C-18柱提取非極性、非揮發性物質。在陽離子交換柱上以H形式提取堿，并且在陰離子交換柱上以OH形式提取酸。為了移除酸，調整蜂蜜到pH11，以使酸以離解的陰離子形式存在。Bogdanov指出，在初始蜂蜜中將pH調到pH11對抗菌活性沒有影響，因為回滴定到原始的pH可導致初始抗菌活性的恢復。對于麥盧卡蜂蜜，Bogdanov指出，當針對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)測試時，100％活性在酸性級分中，當針對騰黃微球菌(Micrococcusluteus)測試時，75％活性在酸性級份中、10％在堿性級份中、5％在非極性級份中、和10％在揮發性級份中。因此得出結論，蜂蜜中的非過氧化物抗菌活性存在于酸性級份中，并且與酸含量顯著相關，但與pH無關。通過比較糖類溶液和未稀釋蜂蜜的滲透作用，Wahdan(1998)發現，該高糖濃度是抗菌活性的重要因素，但當它被稀釋時，顯然也存在其它的貢獻因素。其中也指出，在該研究中pH不是這樣的因素，因為蜂蜜是用營養肉湯(pH7.2)稀釋的，因此必然有其他物質存在。Weston&Brocklebank(1999)嘗試通過測試數種方法，包括在酸性和中性條件下進行聚(辛基)酰胺、SephadexG-10、BiogelP-2、和XAD-2樹脂的色譜，從而從抗菌材料中分離單糖。同樣測試了使用2-丁醇進行分離。在聚酰胺和SephadexG-10上的色譜指示活性材料位于后期組分中，HPLC分析暗示存在類黃酮類。通過薄層色譜在酚提取物中鑒定出主要產物為丁香酸甲酯，次要產物是苯基乳酸。HPLC分析顯示，甲基丁香酸甲酯構成超過45％的總酚提取物。該文件也進行了測試，并得出了麥盧卡蜂蜜中丁香酸甲酯和苯基乳酸的水平本身不負責所有的非過氧化氫活性這一結論。而且，丁香酸甲酯水平在活性和非活性麥盧卡蜂蜜中是相同的，因此不是引起所觀察到的差異的原因。在XAD-22上，用碳水化合物洗脫下了所有活性，而用酚類未洗脫下顯著的活性。在Biogel-P2上得到了相同的結果。因為單糖沒有抗菌特性，所以暗示糖類攜帶了該抗菌組分。Westonet.al.(1999)證明了酚類級份整體而言在活性和非活性蜂蜜中具有相同的抗菌作用，所以結論是，盡管麥盧卡蜂蜜的酚類組分各自地和共同地具有抗菌活性，但是它們不引起該“觀察到”的活性。Weston&Brocklebank(1999)假設活性麥盧卡蜂蜜可能具有類似于四糖唾液酸化路易斯X的獨特低聚糖，其是介導可以引起胃胃潰瘍的細菌黏附到胃內層的抗原決定簇。他們測試了活性和非活性麥盧卡蜂蜜的低聚糖組成，并且發現在活性和無活性麥盧卡蜂蜜間無差異。Perryet.al.(1997)發現在新西蘭存在三種化學型的麥盧卡，并且它們可以通過來自葉的精油的組成區分開來。一種包含大部分蒎烯類，另一種包含大部分倍半萜烯類，生長在東部陸地區域的第三種包含高比例的環三酮——纖精酮。該油具有這三種中最強的抗微生物活性。Westonet.al.(2000)嘗試通過三種不同方法在非常高的非過氧化物活性的麥盧卡蜂蜜樣品中檢測纖精酮。一種方法中使用XAD-2樹脂吸收酚類，另一種使用2-丁醇進行提取，第三種是液-液提取。對所有三種提取物進行的分析未能檢測到任何三酮。其結論是因為纖精酮在水中不溶，所以它不太可能存在于花蜜中，故不存在于蜂蜜中。Westonet.al.(2000)比較了抗菌麥盧卡蜂蜜和無活性麥盧卡蜂蜜中的酚組分，并且顯示其在定性或定量上無差異。桂皮酸和類黃酮的水平也非常相似，并且與很多歐洲蜂蜜相當。通過測試19種麥盧卡蜂蜜，顯示了所有樣品中酚類特征譜是同樣的，因此地理不影響酚類特征譜。Weston(2000)指出(i)在蜂蜜中過氧化氫是有任何重要性的唯一抗菌物質，并且其他物質，例如蜂膠衍生的酚類物質，與過氧化氫比較而言都是無關緊要的。(ii)在蜂蜜中過氧化氫的水平基本上是通過蜂蜜中由植物衍生的過氧化氫酶的量確定的；并且(iii)基于Whiteet.al.(1963)和Dustmann(1971)的發現，在蜂蜜樣品或其級分中過氧化氫由葡萄糖氧化酶產生。當稀釋它們并且為抗菌試驗準備時，以現在的方法(Allen，MolanandReid，1991，MolanandRussell，1988)加入到這些樣品中的過氧化氫酶的量是不足以破壞所有由這種方式產生的過氧化氫。同樣指出的是，通過GC-MS分析的揮發物通常是花蜜的組分，并且貢獻花的香味。盡管存在多種揮發物，但是在蜂蜜中它們的量小，并且對于特定花源和蜂蜜獨特的組分似乎在蜂蜜中以它們的水平不具有任何抗菌特性。同樣，用于鑒定蜂蜜為單花來源的花蜜酚類成分確實具有抗氧化劑特性，但并未鑒定為具有適當水平的抗菌活性。因此Weston(2000)的結論是迄今為止的工作忽視了UMF存在的可能性，并且建議更有可能這是因為因添加過氧化氫酶而被不完全破壞的異常高水平過氧化氫所致。事實上，該“獨特因子”可能是在麥盧卡蜂蜜中是否存在或缺乏大量過氧化氫酶，這可以區分活性和非活性麥盧卡蜂蜜。有高UMF值的蜂蜜，和從這種蜂蜜衍生的產物，是消費者所尋求的。這與有高UMF值的蜂蜜的有益特性是否歸因于可分離的含UMF級分無關。如果與UMF活性有關的麥盧卡蜂蜜級分能夠被分離，那么能夠制備UMF強化蜂蜜和其他改進的食品和藥物。還能夠增強麥盧卡蜂蜜的已知有利特性和有益作用。本發明的目的是提供一種制備麥盧卡蜂蜜的含UMF級份、或者至少向公眾提供有用選擇的方法。
發明內容在本發明的第一個方面中，提供了UMF強化蜂蜜。優選蜂蜜是麥盧卡蜂蜜。優選蜂蜜具有的UMF值高于任何未經強化的麥盧卡蜂蜜的UMF值。更優選強化蜂蜜具有高于25的UMF值，更優選高于35。在本發明的第二個方面中，提供一種制備UMF強化蜂蜜的方法，其包括混合蜂蜜與含UMF級份的步驟。在本發明的第三個方面中，提供一種制備含UMF級份的方法，其通過從獲得該級份的樣品中基本上所有的總單糖中分離該級份。優選該方法包括如下步驟·施加一定量的蜂蜜到基質中；·用溶劑從該基質上洗脫樣品；和·收集合UMF級份。優選在洗脫樣品中存在的基本上所有單糖后開始收集含UMF級份。更優選所收集的含UMF級份是基本上沒有樣品中存在的總量單糖。優選蜂蜜是麥盧卡蜂蜜。優選麥盧卡蜂蜜的量具有高于25的UMF值，更優選高于35。優選基質是大小排阻基質或反相基質。優選溶劑是水。優選基質是色譜柱的形式。在本發明第三個方面的第一個實施方案中，基質是大小排阻和離子交換基質。優選平衡離子是Na+。更優選基質具有104的大小排阻限。更優選基質是苯乙烯二乙烯基苯共聚物。在本發明第三個方面的第二個實施方案中，基質是C18。優選基質具有15μm粒子大小和100孔大小。盡管優選使用全蜂蜜，但是事先從蜂蜜分離的級份或者部分，包括篩分的蜂蜜，也可用在本方法中。在本發明的笫四個方面中，提供了麥盧卡蜂蜜的含UMF級份。優選該級份是基本上無單糖。優選含UMF級份的抗菌活性在堿性pH下是不穩定的。更優選該堿性pH大于9。優選含UMF級份是根據本發明第三個方面的方法制備的。優選含UMF級份具有在實施例2、3和4中所述的色譜特征。優選地，當將包含含UMF級份的蜂蜜樣品(20μL)施加到串聯和處于鈉形式的ShodexTMSugarKS-801和KS-802分析柱上、在50℃下操作、并用Milli-Q水以1mL/分鐘的速率洗脫時，該含UMF級份具有19.4-25分鐘的停留時間。更優選該含UMF級份具有19.4-21.7分鐘的停留時間。在本發明的第五個方面中，提供一種被本發明第四個方面的含UMF級份改進的藥物。優選地，該藥物是創傷敷料，例如在新西蘭專利公開no.501687中所述的創傷敷料。在本發明的第六個方面中，提供一種被本發明第四個方面的含UMF級份改進的食品。優選該食品是蜂蜜。“UMF強化蜂蜜”指添加了分離的含UMF級份的蜂蜜。“麥盧卡蜂蜜”指主要從麥盧卡花(澳洲茶樹)衍生的植物蜂蜜。“UMF值”指在瓊脂平板擴散試驗中，相對于酚相當物測量的全或篩分蜂蜜或其級份的抗菌活性測定值。“含UMF級份”指包含非過氧化物抗菌活性的全或篩分麥盧卡蜂蜜的級份。針對級份而言的“基本上無單糖”指在該級份中單糖的量按重量計只占獲得該級份的樣品中總單糖的一小部分或可忽略的部分，例如小于總單糖的5％(w/w)，更典型小于1％(w/w)。應該認識到，采用本發明可以明確檢測早先并不知道其表現非過氧化物活性的全蜂蜜中的含UMF級份。可進一步認識到，除了麥盧卡蜂蜜外的、目前尚未測試含UMF級份的存在情況的蜂蜜也可以表現非過氧化物活性。本發明將參照附圖詳細描述如下圖1使用配體交換和大小排阻色譜進行麥盧卡蜂蜜的HPLC折射率分析。圖2通過配體交換和大小排阻色譜擴大麥盧卡蜂蜜HPLC折射率分析的基線區域。圖3在KS-2002柱上篩分蜂蜜的HPLC。來自300mg/mL篩分蜂蜜的200μl注射液的洗脫物折射率監測。圖4來自KS-2002柱的再注射活性級份的HPLC。來自級份4的200μl注射液(其濃度相當于在200mg/ml篩分蜂蜜中出現的濃度)的洗脫物折射率監測。圖5來自KS-2002柱的再注射活性級份的HPLC。擴大來自級份4的200μl注射液(其濃度相當于在200mg/mL篩分蜂蜜中出現的濃度)的洗脫物折射率監測。圖6在KS-2002柱上來自級份4的20.5-25分鐘級份的HPLC。來自200μL注射液(其濃度相當于在100mg/mL篩分蜂蜜中出現的濃度)的洗脫物折射率監測。圖7在KS-2002柱上來自級份4再注射的20.5-25分鐘級份的HPLC光譜。擴大來自該級份的200μL注射液(其濃度相當于在100mg/mL篩分蜂蜜中出現的濃度)的洗脫物折射率監測。圖8.C18柱上的HPLC。來自0.5g/mL篩分蜂蜜的2ml注射液的洗脫物折射率監測。圖9.C18柱上的HPLC。擴大來自0.5g/mL篩分蜂蜜的2ml注射液的洗脫物折射率監測。圖10驗證來自C18柱的收集在Milli-Q和MeCN中的級份。圖11活性級份的非過氧化物活性的存儲效果。圖12調查強化篩分蜂蜜的比例。圖13來自平板分組的強化試驗的數據。(1^2是清除區，單位mm2，比率是級份C對篩分蜂蜜的比率，單位g/g)。具體實施例方式本發明確定了通常構成干重中不到百分之一的蜂蜜小級份事實上包含所有非過氧化物活性，并且其能夠從大體積蜂蜜源中作為含UMF級份分離出來。含UMF級份可以由技術人員已知的多種方式從大體積蜂蜜中分離出來。然而，盡管早先已經嘗試用HPLC分開和分離對蜂蜜賦予非過氧化物生物活性的活性劑，但是在現有技術中所用柱和溶劑的選擇妨礙了這種目標實現。現有技術中的嘗試可能已經不知不覺地使用錯誤的實驗條件或者使用不允許適當分離從而鑒定分離級份的柱而破壞了蜂蜜的生物活性。此外，因為UMF級份是蜂蜜的一小部分，也有可能即使早先已經實現了分離，但洗脫峰被無意中忽略了或者被其他化合物掩蓋。在本發明優選的實施方案中，使用了為分離蜂蜜中存在的主要單糖而設計的分離柱。這些主要單糖是葡萄糖和果糖。所述柱的實例包括RezexTM、NucleosilTM和ShodexTM。應當理解，它們只是一些實例。在通過柱洗脫蜂蜜期間，優選收集小級份，并且使用UV吸收和折射率檢測之一或二者進行分析以監測感興趣級份的洗脫。ShodexTM(混合模式的配體交換和大小排阻)色譜柱已經用于將葡萄糖和果糖與蜂蜜的其他組分分離開。已發現通過折射率監測以小峰形式檢測的級份在果糖峰后洗脫。所述級份具有UV吸收，然而果糖沒有。已經測試了該級份，并且發現其中包含了蜂蜜的幾乎所有非過氧化物抗菌活性。該級份被稱為含UMF級份。當使用過氧化氫酶破壞蜂蜜的任何基于過氧化物的抗菌活性時，UMF級份的活性仍被保留。使用醚對蜂蜜進行的液-液提取也可以用于簡化含UMF級份的分離。在這些試驗中，醚可以除去蜂蜜中的很多非糖、有機化合物，而在剩余樣品中保留非過氧化物活性。為了進一步純化UMF級份，可以使其多次通過柱以消除越來越多的雜質，或者使之通過有其他種類填充樹脂的色譜柱，例如反相柱，其可以分離該級份的組分。UMF級份早先根本沒有被分離出來，或者甚至沒有被認識到作為可分離的級份存在，盡管許多不同的研究組進行了眾多嘗試。以前已在現有技術中使用了反相、生物膠P-2、XAD-40和陰離子交換柱，以嘗試分離和鑒定有非過氧化物生物活性的化合物。在這些條件下，或者不能分離所述級份，或者因為其較小而沒有被認識到，也許在早先的HPLC蜂蜜研究中被大的單糖峰所掩蓋，或者色譜條件破壞了蜂蜜的生物活性。本發明人的初步調查已經發現，分離的UMF級份不能出現在需要堿性pH的柱中，例如陰離子交換柱。已發現堿性條件破壞蜂蜜的活性。因此必須使用在中性pH或接近中性pH下運行的柱。已發現含UMF級份在pH9下30分鐘后損失其大部分生物活性。在pH10下5分鐘后該級份被破壞。HPLC分離法一般都比這花費更長時間。在pH11下蜂蜜的生物活性立即被破壞。使用標準技術，用醚提取顯示非過氧化物活性(UMF)的麥盧卡蜂蜜樣品，以除去可能干擾色譜的脂肪酸。使用抗菌試驗測試水相和醚相，以確定UMF活性被分離在哪一相中。發現UMF活性保留在水相中，在醚相中沒有發現顯著的生物活性。為檢測蜂蜜樣品中非過氧化物活性的水平，使用過氧化氫酶破壞過氧化氫賦予給蜂蜜的任何抗菌活性。通過溶解過氧化氫酶(0.02g)在蒸餾水中(10ml)來制備過氧化氫酶溶液。將蜂蜜溶解在蒸餾水中形成1g蜂蜜/ml水的濃度，以1ml等分。然后將1ml蒸餾水(對于總活性)或者1ml過氧化氫酶溶液(單獨對于非過氧化物活性)加入到每個樣品瓶。實施例1-抗菌活性的孔擴散試驗通過在蒸餾水中(1L)溶解瓊脂(23g)制備營養瓊脂，并且在高壓滅菌前以150ml的量倒入燒瓶。當需要時，在水浴中(30min，100℃)蒸燒瓶，然后使瓊脂溫度在另一個水浴中降低至細菌培養物耐受的溫度(30min，50℃)。用玻珠培養物無菌接種胰蛋白酶豆胨培養液(30g/L)，然后培養(18h，37℃)，得到金黃色葡萄球(S.aureus)培養物。使用ThermoSpectronicHeliosγ分光光度計(540nm)，用胰蛋白酶豆胨培養液調整金黃色葡萄球菌培養物到0.5AU的光密度。胰蛋白酶豆胨培養液用作空白。在水平面上通過傾注接種有金黃色葡萄球菌培養物(100μl，0.5OD如上制備)的150ml營養瓊脂制備大方格試驗平板(Corning431111無菌生物測試皿，245mm×245mm×18mm)。一旦凝固，在4℃下倒立儲存該平板過夜。通過稱重全蜂蜜(1.00g)并溶解在蒸餾水(1mL)中制備全蜂蜜樣品。為了試驗的重現性，對該方法輔以培養(37℃，30分鐘)以軟化蜂蜜，同時保持可使H2O2產量恒定的時間。對于不測定H2O2活性的其他試驗，在室溫下攪拌樣品直至溶解。所得的50％(w/v)溶液進一步通過將等體積(1∶1)的樣品與或者蒸餾水或者過氧化氫酶溶液(20mg/10mL蒸餾水)合并而稀釋，其取決于是否需要總非過氧化物活性。將來自HPLC和液/液提取的蜂蜜級份在蒸餾水中稀釋(1∶1)，以達到在分離蜂蜜前存在的相同濃度。所得的50％溶液用過氧化氫酶溶液進一步稀釋(1∶1)，因為僅僅對非過氧化物活性感興趣。從苯酚的10％原液(10g苯酚/100mL蒸餾水)制備2、3、4、5、6和7％的苯酚標準液。這些溶液在被替換之前在4℃暗處儲存長達一個月。使用8mm穿孔器和接種針在規格8×8載網上打孔，以移除瓊脂。用于在平板上放置樣品的模板是在平板上有16個編號并重復4次的孔的準拉丁方，其在每對行和列中一次。這就允許在平板上隨意地放置樣品以消除邊緣效應的偏差。在每個孔中(11μl)以分配的位置放置25％濃度的蜂蜜樣品和苯酚標準液。實施例2在使用515HPLC泵、2410折射率檢測器、996光電二極管陣列檢測器和Millennium操作軟件的WatersHPLC系統上實施高效液相色譜(HPLC)。在起始的研究中，發現ShodexTMSugarKS800系列柱在所有使用的柱中提供最好分離。在此，串聯使用ShodexTMSugarKS801和KS802以通過結合大小排阻和配體交換色譜對蜂蜜樣品分級分離。KS801是鈉的形式，排阻限度為103。KS802也是鈉的形式并具有104的排阻限度。兩者都填充苯乙烯二乙烯基苯。按照廠商的建議使用的操作溫度開始是80℃，流速為1mL/分鐘。洗脫液是Milli-Q水。將20mg/20μl注射液的蜂蜜樣品加樣到KS800系列HPLC柱上。圖1和2顯示了用折射率檢測獲得的繪圖。從20次注射中收集用于抗菌試驗的級份。在圖1中，級份A從0-12分鐘收集，級份B從12-19.4分鐘間收集，級份C從19.4-25分鐘收集。該繪圖顯示葡萄糖(1)峰之后是果糖(2)峰。同樣顯示了低聚糖(3)峰。使用孔擴散技術，用金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)作為測試培養物，測試所述分離級份的抗菌活性。在耦聯了40℃下Biichi461水浴的BiichiRE111旋轉蒸發器上，在減壓下蒸發從HPLC收集用于測試的級份。該樣品在包含200μL蒸餾水和200μL過氧化氫酶溶液中再次溶解，以確保僅有非過氧化物活性存在。以25％的濃度測試蜂蜜樣品的抗菌活性。使用范圍為2％-6％的3個重復苯酚標準液實施抗菌試驗，并且將3-5個重復的測試樣品引入到瓊脂平板上已記錄的任意孔中。在37℃下培養所述平板過夜，以使細菌在可能的情況下生長。培養后，使用數字游標卡尺測量孔周圍抑制區域的直徑。蜂蜜的非過氧化物抗菌活性完全包含在級份C中(圖1)。當聚焦在HPLC繪圖的基線區域時，在級份C的活性區域中可見兩個峰(圖2)。為了確定哪個峰與活性有關，設計級份收集時間的另一個方案級份D0-19.4分鐘，級份E19.4-21.7分鐘，和級份F21.7-25分鐘。在這些試驗中，所有的抗菌活性均分離在級份E中。重復該測試另外兩次，獲得了相同的結果。實施例3-蜂蜜的半制備分級分離(結合大小排阻和離子交換)先前的研究(實施例2和Snow(2001))已確定了串聯使用ShodexTMSUGARKS-801和KS-802分析柱可以從單糖的主要部分中拆分出含UMF級份。因為比較合乎需要的是增加可以通過柱的樣品的量，所以使用所述柱的制備型(KS-2002柱)。被篩分蜂蜜的洗脫譜的特征在于早期的酚物質、接著二糖和低聚糖、最后是單糖。ShodexTMSUGARKS2002(20mm×300mm，20μm粒子大小，60孔大小)制備級柱結合了大小排阻和配體交換。該柱是以鈉(Na+)的形式并具有1×104排阻限度。在室溫下使用Milli-Q水作為洗脫液實施色譜，其以3mL/分鐘的流速運行。注射300mg/mL高加樣量的蜂蜜到200μL環路中。使用996PDA和2410RI檢測監測光譜。在大蒸發皿中冷凍干燥任何收集的級份。圖3提供了從300mg/mL篩分蜂蜜溶液的200μL注射液所獲得的洗脫譜。由于在注射前篩分蜂蜜，故與果糖峰相比而言葡萄糖峰縮小，而不是它們在全蜂蜜中所存在的大約相等濃度(Whiteetal.，1962)。大小排阻基質通常是輕微疏水性和弱陰離子性，其導致不能理想地分離，由此分離不是嚴格的分子大小的函數(Cunicoetat.，1998)。該柱子使用苯乙烯二乙烯基苯作為大小排阻聚合物，其可與酚類相互作用從而進行離子交換。因此，停留時間不是必然地意味著分子大小。開始以四個級份的形式收集柱的洗脫液10.0-13.0分鐘酚類213.0-18.4分鐘二糖和低聚糖318.4-22.6分鐘葡萄糖和果糖422.6-30.0分鐘后期洗脫物質在18.4和30分鐘間的級份內一致地發現有活性。然后嘗試將所有活性集中在一個級份中。表1從KS-2002柱收集的級份的活性各值基于a)所有平板上的單個孔，和b)各平板的酚活性的計算值.表1顯示三種不同級份收集時間的試驗結果，和所得級份的非過氧化物活性。注意所示的第一試驗使用全蜂蜜，然而后兩者使用篩分的蜂蜜。所有可檢測的活性最終被限制在19.5-25.0分鐘的級份中。這兩種級份的95％置信區間(CI＝平均數±2×SE)給于表2。置信區間不與清除區或者酚相當物重疊，其顯示了級份4的活性在統計學上與篩分蜂蜜的情況并不相同。這指示在低于試驗的檢測限度的水平下有活性的部分損失，其或者通過吸收到柱或者分配到其他級份中而導致。級份4中的活性的平均量是篩分蜂蜜對應酚活性的90％。表2在KS-2002柱上，最后試驗的活性的清除區和酚相當物95％的置信區間清除區的值基于單個孔，而酚相當物的值基于從平板計算的數據.由圖3可見，該級份包含幾乎所有果糖。除了減低水活性的物理作用和為葡萄糖氧化酶提供底物以產生H2O2和葡萄糖酸外，單糖本身不具有抗菌活性。因此，顯然有其他化合物以低濃度存在于該級份中。Snow(2001)在使用所述柱的分析級型的研究中觀察到果糖峰尾部的小峰。Snow(2001)嘗試分離該級份，并且通過GC-MS和NMR鑒定其組成。然而，樣品中組分多表明該結果不是結論性的。也嘗試將該峰的大小和全蜂蜜的活性聯系起來，但并未發現任何關系。這指示該峰由很多化合物組成，其中至少有一種沒有活性。Snow(2001)注意到與所述活性級份相關的峰是UV活性的。因為柱的制備性特征降低了分辨率，以及該區域中弱UV活性開鏈單糖的高濃度造成的干擾，所以該操作不能鑒定這些UV活性峰。決定再次注射級份4以獲得無單糖的級份。被再次注射的級份的光譜(圖4)沒有顯示在單糖峰尾部有集中峰的證據，但注意到在10.5分鐘出現新的峰。單糖峰開始處的凸起可能是殘留的葡萄糖。基線的擴大顯示在圖5。糖類通常會提高有限可溶分子在水性體系中的溶解度。因此，有可能存在與所述糖類結合或者被其溶解化的化合物。當糖類濃度降低時，它們離解并且更早地被洗脫。有可能所這一峰就是活性因子，并且該峰的大小與負責該非過氧化物活性的化合物以異常低的濃度存在的觀點一致。或者，它可能是降解產物，因為所用的樣品已經在冷凍機中儲存了一個月。然而，在再次注射前對樣品中的活性進行的測試顯示無活性損失，這得到了活性級份在分離后在冷凍機中儲存超過2個月仍然保持穩定這些發現的支持。有可能所述峰反映非抗菌組分的降解。收集來自再次注射的級份4的20.5-25.0分鐘級份，并且再次注射以調查Snow(2001)觀察到的活性峰是否仍然能被鑒定出來。顯然在10.5分鐘處觀察到的新峰在光譜中也出現(圖6和圖7中的擴大圖)，但是大為降低。這暗示該峰不是儲存的降解產物，并且的確可以反映活性由糖類所解離。對于再次注射級份的活性的生物試驗，沒有收集到足夠大的量(為了非常粗略的指示活性，需要最少200mg蜂蜜通過柱，或者對于嚴格的活性試驗需要800mg)。對于再次注射后色譜行為的變化無法下任何結論。決定不繼續該方法，代之以嘗試不同方法的分離和更高容量的柱。實施例4-蜂蜜的半制備分級分離(反相)C1825mm反相柱的優點是具有顯著更大的容量，從而一次可以注射1g在柱子上，而不象在KS-2002柱上僅注射60mg。所用的反相制備柱是3個串聯的Delta-PakC18柱體(25mm×100mm，15μm粒子大小，100孔大小)。其裝配了Delta-C18保護內插件(25mm×10mm，15μm粒子大小，100孔大小)。在室溫下以10mL/分鐘的流速，用0.5g/mL高加樣量進入2mL環路實施色譜。使用兩種不同的洗脫液體系。第一種中僅使用Milli-Q水。然而，后來決定以100％Milli-Q水開始運行，然后在糖類被洗脫后轉換成100％乙腈。由于所用的高流速，只可能使用大口徑垂直的Waters410差示折射計檢測。水中收集的級份在大蒸發皿中冷凍干燥。MeCN中收集的級份在減壓真空下濃縮，然后在冷凍干燥機上完全干燥。這樣大量地減少了為活性生物試驗收集足夠樣品所花費的時間。此外，比較感興趣的是是否所述柱能夠更有效地從單糖中拆分出該活性。圖8顯示了在高柱加樣量下(0.5g/ml，2mL注射液)以Milli-Q水運行，使用該柱獲得的光譜。單糖峰在光譜中占主要。該柱不能從果糖中拆分出葡萄糖，但是它確實顯示在單糖后馬上洗脫的一組峰，大約14-25分鐘。這些峰中的某些歸因于低聚糖，其在活性麥盧卡蜂蜜中以大約總蜂蜜8％的水平存在(WestonandBrocklebank，1999)。圖9顯示了證實這些峰的基線擴大。初始時以四個級份的形式收集柱的洗脫液A0.0-8.3分鐘初期洗脫物質B8.3-11.8分鐘糖類C11.8-25.0分鐘后期洗脫物質發現所有可檢測的活性洗脫在級份C中(表3)。表3C18柱上起始收集的級份的活性.各值基于a)所有平板上的單個孔，和b)各平板上酚活性的計算值.比較感興趣的是是否該活性的一部分能夠通過MeCN洗脫下來，因為這可以顯示該級份的差別溶解度。此外，有必要確定用Milli-Q水是否從柱中洗脫下所有活性。在反相色譜中MeCN是比H2O更強的溶劑，所以它能用于從柱中沖洗下任何殘留的物質。收集的級份如圖10所示。如前面所述，開始用Milli-Q水運行柱，然后收集級份A和B。在橫跨級份B到級份C處(11.8分鐘)，停止泵，并且將溶劑直接轉換為100％MeCN。正如通過溶劑折射率變化引起的在基線中的快速升高所指示，從11.8分鐘開始收集級份CH2O直至MeCN達到檢測器(大概13分鐘或者在24分鐘停留時間處)。從此時起，通過柱沖洗MeCN的3個柱體積，并且收集洗脫液作為級份CMeCN。如表4所示，所有可檢測的活性保留在級份CH2O中，并且不與CMeCN相關聯。這顯示活性未被柱可逆地保留。級份C和CH2O僅分別占篩分蜂蜜相當物苯酚活性的72％和75％，沒有其他級份顯示可檢測的活性。這暗示該活性可能已經不可逆地結合在柱上。所用柱是制備型的，并且由在非封端的硅支持物上的C18鏈組成，有可能該物質已經黏附到硅上，或者甚至通過與活性硅烷醇基團反應而已經分解。此外，該級份一貫地顯示部分活性的變化水平。在這種特定情況中，這可能是由于當糖類含量降低時，在試驗中缺乏非過氧化物活性的擴散性所致。表4.來自C18柱反相色譜的級份的重量和活性.值基于a)重復的HPLC試驗，b)所有平板上的單個孔，和c)單個平板上酚活性的測定值.比較KS-2002和C18Delta-PakC18活性級份包含比KS-2002活性級份少得多的糖類，并且反映了該活性與所述糖類的更好分離。相反，從KS-2002柱回收了更高比例的活性，這可能反映了活性物質與C18柱中硅支持物的化學相互作用。與C18柱級份中的部分活性相反，在來自KS-2002柱的活性級份中觀察到全部活性。然而，這可能與試驗中KS-2002級份的更高糖類含量幫助擴散有關。實施例5-在含UMF級份中非過氧化物活性的穩定性早先的作者已注意到，在加熱(Bogdanov，1984；MolanandRussell，1988；RothetaL.，1986)或儲存(Bogdanov，1984；Sealey，1988)蜂蜜后，具有非過氧化物活性的蜂蜜剩余有顯著的活性，并且這是導致提議非過氧化物活性的觀察的部分。該研究著眼于在室溫和冰箱溫度下經短期(8-24小時)，和在冷凍機溫度下經中等時期(1-8周)儲存時在分離的HPLC級份中的穩定性。與試驗期間一樣，這是具有實際的意義，我們希望確定該級份不是正在降解，因而活性的任何損失都是由于非活性組分的去除。此外，知道多少樣品能被“貯存堆積”以便用于測試是有用的。附帶的興趣是觀察在儲存中該活性是否由于在工業中暗示儲存能增加全蜂蜜活性的軼事證據而確實能夠增加。表5給出該試驗的綜合結果，并且該結果直觀地顯示在圖11。表5.穩定性試驗的綜合數據.值基于a)所有平板上的單個孔，和b)單個平板的酚活性的計算值.在KS-2002柱上分離篩分蜂蜜，并且收集19.5-25分鐘間的級份，然后立即轉移至冷凍機。當完成當天的注射后，冷凍干燥該級份。一旦干燥，用蒸餾水將它們重溶成50％的強度，然后或者在室溫或者在冰箱或冷凍機中儲存一段時間。每個樣品相當于480mg的篩分蜂蜜。儲存后，將樣品稀釋成25％的強度，并且在雙份板上的四個孔中測試，以調查是否出現活性的任何損失或獲得。該結果與在相同平板上測試的新鮮收集活性級份的活性相比較。此外，冷凍干燥兩個重復的篩分蜂蜜以調查冷凍干燥過程對蜂蜜活性的影響。表6給出原始級份的保留百分數原始活性的保留在清除區中是94-106％，在酚相當物這是86-114％。因此，各種形式的儲存已經對分離的活性級份中的非過氧化物活性產生某些影響。表6.在儲存的級份中非過氧化物的活性的保留.原始活性的百分表.表7提供這些結果的REML分析。該結果顯示儲存中活性的某些改變在統計學上比較顯著。使用清除區數據，室溫和冰箱樣品都顯著地低于對照。在這些處理中酚相當物沒有顯示統計學顯著性，這很可能是由于數據組的重復更少，所以較大的標準誤差模糊了預計平均值間的任何差異。在八周冷凍級份的清除區數據中，以及在四周冷凍級份的酚相當物數據中也可見活性在統計學上顯著的增加。然而，本實驗中的局限是沒有重復地實施這些處理，并且是在同一天在雙份板上進行測試。因此，各日之間的變化可以在確定顯著性中發揮重要作用。使用酚標準曲線產生酚相當物可給出比使用清除區甚至更寬范圍的值，暗示酚標準物沒有補償這些日之間效果。盡管這些結果的統計學顯著性，仍然可觀察活性的良好保留。在冷凍機中儲存的某些樣品也有增加活性的統計學顯著性證據。然而，由于沒有重復進行這些處理，在該實驗中日之間和板之間效果的影響仍然未知。表7.有關儲存活性HPLC級份后，非過氧化物的活性變化的顯著性的統計信息.平均值間的差異用處理的預測平均值減去對照的運測平均值表示值基于a)所有平板上的單個孔，和b)單個平板上酚活性的計算值.實施例6-蜂蜜的強化有格外高抗菌活性的蜂蜜通常不會天然出現，故它們的要價很高。因此，如果能夠開發一種方法來濃縮因活性太低而在醫學上沒有用處的蜂蜜的活性，或者將已經具有高活性的蜂蜜的潛力提高到天然條件下不能常規獲得的水平，將會有商業上的優勢。這僅僅對濃縮非過氧化物活性(UMF)有用，因為蜂蜜的過氧化物活性是原位產生的，并且其取決于過氧化物破壞物的濃度和葡萄糖過氧化酶的穩定性。由于反相HPLC能夠拆分UMF，并且該柱能處理大加樣量的樣品，因此，與大小排阻/離子交換上的級份4相反，收集級份C(用100％Milli-Q水洗脫)，并且用于強化篩分蜂蜜。為產生強化的樣品，向在1ml蒸餾水中的1g未加工的篩分蜂蜜添加級份C(從1g篩分蜂蜜的分離中產生)。該50％溶液進一步用過氧化氫酶稀釋成25％溶液。因此，樣品在技術上具有雙倍于篩分蜂蜜對照的UMF量。初步試驗(表8)顯示與篩分蜂蜜的活性相比獲得了少量的增加。表8.初始調查篩分蜂蜜的強化值基于a)所有平板上的單個孔，和b)單個平板上酚活性的計算值.這占了篩分蜂蜜的對應酚活性的23.5％增加。因為沒有觀察到雙倍的活性，所以擴展本實驗到包括強化的增加水平，以調查是否有可能對增加劑量的活性級份產生正比例的應答。每個劑量包括向1g如上所述未加工的篩分蜂蜜中以相當于1、2和3g篩分蜂蜜中的濃度添加級份C。表9顯示所得樣品的活性，圖12以圖表形式顯示了清除區的結果。表9.調查強化的篩分蜂蜜的比例性.值基于a)所有平板上的單個孔，和b)單個平板上酚活性的計算值.觀察到強關聯性(R2＝0.9874)，指示出現了正比例的應答。這確定有可能增加蜂蜜的非過氧化物活性。然而，線性回歸分析顯示，在測試這些樣品中所用的雙份板在梯度上具有統計學上顯著的差異(p值＝0.011)。由圖13的Minitab結果可見這些曲線。觀察到象這樣的平板效果并非不尋常。如已討論的，在WDA方法中平板變化是最重要變量之一，因此所有樣品都在雙份板上進行測試，對其平均以補償這種作用。作為替代，相比于其他三種強化水平，在1∶3強化(比率3，圖13)的數據點在兩條曲線之間顯示更多的變化。因此可能某些局限于該點的某些因素使曲線歪斜。這可能是簡單地因為當加入到兩個平板時該樣品不均一。然而，在高活性下本實驗沒有如此敏感。對此的原因有三層(i)清除區可能重疊，其趨向引起清除區延長，使測量困難。(ii)分散更加易變。(iii)清除區能超過最高標準。在本研究中，小心地隔開各級份以減小清除區重疊的機會，然而，1∶3的強化樣品接近活性的最高標準。不管這些考慮，現已經證實了制備麥盧卡蜂蜜的含UMF級份的方法和它在強化蜂蜜中的應用。在前面的描述中提及具有已知相當物的整數或組分之處，這樣的相當物象單獨列出一樣引入本文中。盡管已經通過實施例并參考其可能的實施方案描述了本發明，但是應當理解，可以對其進行改良和/或修改而不離開本發明的范圍或精神。參考文獻Abuharfeil，N.；Al-Oran，R.；Abo-Shehada，M.(1999)TheeffectofbeehoneyonproliferativeactivityofhumanB-&T-lymphocytesandtheactivityofphagocytesFood&Agri.Invn.11，169-177Adcock，D.(1962)TheeffectofcatalaseontheinhibineandperoxidevaluesofvarioushoneysJ.Apic.Res.1，38-40Allen，K.L.；Molan，P.C.；Reid，G.M.(1991)ASurveyoftheAntibacterialActivityofSomeNewZealandHoneysJ.Pharm.Pharmacol.43，817-822BenjB.；Sunshine，G.；Leskowitz，S.(1996)Immunology3rdeditionNewYorkWiley-LissBogdanov，S.(1997)NatureandOriginoftheAntibacterialSubstancesinHoneyLebensm-Wiss.U.-Technol.30，1，748-753Breitmaier，B.；Voelter，W.(1987)Carbon-13NMRSpectroscopy3rdeditionVerlagsgeseilschaft，Weinheim，GermanyBulman，M.W.(1955)HoneyasasurgicaldressingMiddlesexHospitalJournal5，188-189Chirife，J.；Scarmato，G.；Herszagel，L.(1982)ScientificbasisforuseofgranulatedsugarintreatmentofinfectedwoundsLancet，March6，560-561Cizmarik，L；Matel，I.(1970)Examinationofthechemicalcompositionofpropolis.I.Isolationandidentificationofthe34-dihydroxycinnamicacid(caffeicacid)frompropolisExperientia26，7，713Cizmarik，L；Matel，I.(1973)Chemicalcompositionofpropolis.2.Isolationandidentificationof4-hydroxy-3-methoxycinnamicacid(ferulicacid)frompropolisJ.Apicult.Res.12，1，52-54Cooper，R.A.；Molan，P.C；Harding，K.G.(1999)AntibacterialactivityofhoneyagainststrainsofStaphylococcusaureusfrominfectedwoundsJournaloftheRoyalSocietyofMedicine92，283-285Cotton，FA，Wilkinson，GFRS(1972)AdvancedinorganicchemistryAcomprehensivetext3rdedition，JohnWiley&Sons，Inc.，USADustmann，JH(1971)Catalaseactivityinhoneyofheatherplant(Ericacea)flowZLebensm-Unters-Forsch145，5，294-5Dustmann，JH(1979)AntibacterialeffectofhoneyApiacta147-11Efem，SBB(1988)ClinicalObservationsontheWoundHealingPropertiesofHoneyBritJSurgery75，679-681Efem，SBE(1993)RecentAdvancesintheManagementofFoumier′sGangrenePreliminaryObservationsSurgery113，2，200-204.El-Banby，M，Kandil，A，Abou-Sehly，G，Ei-Shenf，ME，Abel-Wahed，K(1989)Healingeffectoffloralhoneyandhoneyfromsugar-fedbeesonsurgicalwound(animalmodel)FourthInternationalConferenceonApicultureinTropicalClimates，Cairo，InternationalBeeResearchAssociationLondon，46-49Farr，JM.(2005*)AnInvestigationintosomepropertiesofthenon-peroxideantibacterialactivityofmanukahoneyWaikatoUniversityMastersThesis(*embargoed).Ferreres，F，Tomas-Barberan，FA，Soler，C，Garcia-Viguera，C，Ortiz，A，Tomas-Lorentz，F(1994)AsimpleextractivetechniqueforhoneyflavonoidBIPLCanalysisApidologie25，1，21-30Ghisalbert，EL(1979)PropolisAreviewBeeWorld60，59-84Gonaet，M.；Lavie，P.(1960)TheinfluenceofheatontheantibioticfactorpresentinHoneyAnn.Abeille34，349-364Gupta，S.K.；Singh，H.；Varshney，A.C.；Prakash，P.(1992)TherapeuticefficacyofhoneyininfectedwoundsinbuffaloesIndianJournalofAnimalScience62，6，521-523Hodges，R.；White，E.P.(1966)DetectionandisolationoftutinandhyenanchinintoxichoneyNewZealandJ.Sci.9，1，233-35Hutton，D.J.(1966)TreatmentofpressuresoresNursingTimes62，46，1533-1534Itoh，K.；Amamiya，I.；Ikeda，S.；Konishi，M.(1994)Anti-HelicobacterpylorisabstancesinpropolisHoneybeeScience15，4，171-173Jones，K.P.；BlairS.；Tonks，A.；Price，A.；Cooper，R.(2000)HoneyandthestimulationofinflammatorycytokinereleasefromamonocyticcelllineFirstWorldWoundHealingCongress，Melbourne，AustraliaKandil，A.；El-Bnby，M.；Abdel-Wahed，K.；Abou-Sehly，G.；Ezzat，N.(1987)Healingeffectoftruefloralandfalsenon-floralhoneyonmedicalwoundsJ.DrugRes.(Cairo)17，1-2，71-75Lavie，P.(1960)AntibacterialsubstancesinthehoneybeecolonyAnn.Abaille3，103-183Majno，G.(1975)TheHealingHand.ManandWoundintheAncientWorldCambridge，Massachusetts，HarvardUniversityPressMarcucci，M.C.(1995)PropolisChemicalComposition，BiologicalPropertiesandTherapeuticActivityApidologie26，89-99MarhuendaRequenaE.；AlarcondeIaLastra，C；GarciaGimenez，M.D.(1987)DemonstrationofantibacterialpropertiesofphenolicacidsfromT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是C18。18.根據權利要求17的方法，其中基質具有15μm粒子大小和100孔大小。19.麥盧卡蜂蜜的含UMF級份。20.根據權利要求19的含UMF級份，其中該級份基本上無單糖。21.根據權利要求19或20的含UMF級份，其中該含UMF級份的抗菌活性在堿性pH中不穩定。22.根據權利要求19-21中任一項的含UMF級份，其中所述堿性pH大于9。23.根據權利要求19-22中任一項的含UMF級份，其中所述含UMF級份是通過權利要求6-18中任一項的方法制備的。24.根據權利要求19-23中任一項的含UMF級份，其中所述含UMF級份具有描述在實施例2中的色譜特征。25.根據權利要求19-23中任一項的含UMF級份，其中當將包含有含UMF級份的蜂蜜樣品(20μL)施加到串聯和處于鈉形式的ShodexTMSugarKS-801和KS-802分析柱、并在50℃的溫度下操作、用Milli-Q水以1mL/分鐘速率洗脫時，所述含UMF級份具有19.4-25分鐘的停留時間。26.根據權利要求25的含UMF級份，其中所述含UMF級份具有19.4-21.7分鐘的停留時間。27.用權利要求19-26中任一項的含UMF級份改進的藥物。28.根據權利要求27的藥物，其中該藥物是創傷敷料。29.用權利要求19-26中任一項的含UMF級份改進的食品。30.根據權利要求29的食品，其中該食品是蜂蜜。全文摘要本發明涉及由UMF改進的食品和藥物。尤其是，盡管不是唯一地，本發明涉及UMF強化蜂蜜、制備UMF強化蜂蜜的方法以及制備蜂蜜的含UMF級份的方法。文檔編號A61K35/64GK1980577SQ200580021939公開日2007年6月13日申請日期2005年6月8日優先權日2004年6月8日發明者梅拉妮·簡·斯諾,梅里琳·曼利－哈里斯,朱迪·馬里·法爾申請人:瓦卡托大學