來自乳桿菌gg的益生化合物及其用途的制作方法

專利名稱：來自乳桿菌gg的益生化合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及炎性病癥領(lǐng)域。更明確地，其涉及炎性腸病或障礙，例如潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病。本發(fā)明的實(shí)施涉及對來源于乳桿菌GG(Lactobacillus GG)(LGG)的新的生物活性化合物的鑒定和表征以及使用這些化合物治療炎性腸病的用途。
背景炎性腸病(IBD)是一組影響易感個(gè)體的消化道的慢性病癥。炎癥誘發(fā)的損傷與修復(fù)和細(xì)胞保護(hù)進(jìn)程之間的平衡失調(diào)確定IBD中粘膜損傷的程度和嚴(yán)重性。示例性IBD，例如潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病，導(dǎo)致消化道的炎癥或潰瘍。遺傳背景、對環(huán)境因子的暴露或某些刺激性共生細(xì)菌的定殖的不幸組合可在易感個(gè)體中導(dǎo)致IBD的發(fā)生。
作為治療策略，用益生菌制劑改變IBD患者的腸道菌群已受到一定的關(guān)注。近來體外和體內(nèi)的研究已顯示多種益生菌制劑在預(yù)防或減輕和實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎相關(guān)的腸粘膜炎癥方面是有效的(Madsen等人，2001；Gionchetti等人，2000b；Campierei等人，2000；在參考文獻(xiàn)列表中提供了完整的引用)。此外，益生菌似乎降低慢性炎癥情境下結(jié)腸粘膜的惡性轉(zhuǎn)化率(Wollowski等人，2001)。許多初步的臨床試驗(yàn)已顯示益生菌在囊炎和IBD中是有效的。也在進(jìn)行數(shù)項(xiàng)多中心臨床試驗(yàn)以確定這些試劑的有效性并優(yōu)化在IBD患者中的劑量。盡管這些結(jié)果很有前景，但益生菌作用的機(jī)制仍不清楚，并且活益生菌生物的使用存在感染和其他不良結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。
潰瘍性結(jié)腸炎(一種示例性的IBD)導(dǎo)致結(jié)腸和直腸內(nèi)襯的炎癥和潰瘍。其極少影響小腸，除了和結(jié)腸連接的末端(稱為末端回腸)。潰瘍性結(jié)腸炎也可稱為結(jié)腸炎或直腸炎。潰瘍性結(jié)腸炎可在任何年齡的人中發(fā)生，但最常見地其始于年齡15至30歲之間。潰瘍性結(jié)腸炎對男性和女性的影響相同并且似乎傾向于在某些家族中發(fā)生。關(guān)于導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎的原因的理論非常多，但沒有一個(gè)已被證實(shí)。流行的理論是，身體的免疫系統(tǒng)通過在腸壁中引發(fā)持續(xù)炎癥來對病毒或細(xì)菌作出反應(yīng)。
潰瘍性結(jié)腸炎的最普遍的癥狀是腹痛和血性腹瀉?；颊咭部山?jīng)歷疲勞、體重減輕、食欲不振、直腸出血，以及體液和營養(yǎng)的丟失。大約一半的患者具有輕微癥狀。其他患者經(jīng)常發(fā)燒、血性腹瀉、惡心和具有嚴(yán)重的腹部痛性痙攣。潰瘍性結(jié)腸炎也可產(chǎn)生問題例如關(guān)節(jié)炎、眼部炎癥、肝病(肝炎、肝硬化和原發(fā)性硬化性膽管炎)、骨質(zhì)疏松、皮疹和貧血。沒有人確切知道在結(jié)腸外發(fā)生問題的原因?？茖W(xué)家認(rèn)為當(dāng)免疫系統(tǒng)在身體的其他部分引發(fā)炎癥時(shí)可發(fā)生這些并發(fā)生癥。當(dāng)結(jié)腸炎得到治療時(shí)，這些問題中的一些就消失了。
對潰瘍性結(jié)腸炎的治療取決于疾病的嚴(yán)重性。多數(shù)人用藥物進(jìn)行治療。在嚴(yán)重的病例中，患者可能需要進(jìn)行手術(shù)以除去患病的結(jié)腸。一些其癥狀是通過某些食物引發(fā)的人能夠通過避免食用使其腸不適的食物(如調(diào)味濃重的食物、生水果和蔬菜或奶糖(乳糖))來控制癥狀。一些人具有持續(xù)數(shù)月或甚至數(shù)年的緩解。然而，大多數(shù)患者的癥狀最終會復(fù)發(fā)。
因?yàn)榇嬖诖罅砍鲅?、?yán)重的疾病、結(jié)腸的破裂或癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，大約25-40％的潰瘍性結(jié)腸炎患者最終必須將其結(jié)腸切除。如果醫(yī)藥治療失敗，或如果皮質(zhì)激素或其他藥物的副作用威脅患者的健康，有時(shí)醫(yī)生會推薦切除結(jié)腸。
克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎的不同在于其可影響消化道的任何部分。其引起可影響消化道內(nèi)襯最深層的炎癥和潰瘍。一般開處抗炎藥，例如5-氨基水楊酸(例如，美沙拉秦)或皮質(zhì)激素，但其并不總是有效。使用環(huán)孢菌素進(jìn)行的免疫抑制有時(shí)對于對皮質(zhì)激素耐藥或不耐受的患者是有益的。
然而，在90％患有克羅恩病的患者中最終需要外科矯治；50％進(jìn)行結(jié)腸切除。(Leiper等人，1998；Makowiec等人，1998)。手術(shù)后的復(fù)發(fā)率很高，50％的患者在5年內(nèi)需要再次手術(shù)。(Leiper等人，1998；Besnard等人，1998)。
目前關(guān)于IBD的發(fā)病機(jī)理的概念表明存在細(xì)胞保護(hù)和創(chuàng)傷愈合過程與促炎癥反應(yīng)途徑之間的平衡失調(diào)，其凈結(jié)果最終導(dǎo)致促炎癥反應(yīng)的過度活動(dòng)的狀態(tài)和所致的對腸粘膜的破壞(Chang，1999；Podolsky，2002)。保持粘膜完整性的核心是維持上皮屏障功能，這一點(diǎn)由這樣的事實(shí)證明，即導(dǎo)致屏障功能受損的改變的緊密連接結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是促成潰瘍性結(jié)腸炎的臨床后遺癥的原因(Schmitz等人，1999)。
可使用治療來誘導(dǎo)和維持緩解，以及提高患有炎性疾病或病癥例如潰瘍性結(jié)腸炎的人的生活質(zhì)量。目前可獲得幾類藥物。
氨基水楊酸藥物，例如含有5氨基水楊酸(5-ASA)的藥物，有助于控制炎癥。柳氮磺吡啶是磺胺吡啶和5-ASA的組合，其用于誘導(dǎo)和維持緩解?；前愤拎そM分將抗炎的5-ASA運(yùn)送至腸。然而，磺胺吡啶可導(dǎo)致副作用例如惡心、嘔吐、胃灼熱、腹瀉和頭痛。其他5-ASA試劑例如奧沙拉秦、美沙拉秦和巴柳氮，具有不同的載體，提供較少的副作用，并可為不能服用柳氮磺吡啶的人使用。5-ASA可口服、通過灌腸法施用，或以栓劑的形式施用，取決于炎癥在結(jié)腸中的位置。首先使用該組藥物對大多數(shù)患有輕微或中度潰瘍性結(jié)腸炎的人進(jìn)行治療。
皮質(zhì)激素，例如潑尼松和氫化可的松，也減輕炎癥。它們可為具有中度至嚴(yán)重潰瘍性結(jié)腸炎或?qū)?-ASA藥物不起反應(yīng)的人使用。皮質(zhì)激素可口服、經(jīng)靜脈內(nèi)、通過灌腸法或以栓劑的形式施用。這些藥物可導(dǎo)致副作用例如體重增加、痤瘡、面毛、高血壓、心境不穩(wěn)和增加的感染風(fēng)險(xiǎn)。因?yàn)樵撛?，不推薦長期使用這些藥物。
免疫調(diào)節(jié)劑，例如硫唑嘌呤和6-巰基-嘌呤(6-MP)，通過影響免疫系統(tǒng)減輕炎癥。其用于對5-ASA或皮質(zhì)激素不起反應(yīng)或依賴于皮質(zhì)激素的患者。然而，免疫調(diào)節(jié)劑作用緩慢，其可能需要長達(dá)6個(gè)月的時(shí)間才能顯現(xiàn)完全的益處。監(jiān)測服用這些藥物的患者中的合并癥(包括胰腺炎和肝炎、減少的白細(xì)胞計(jì)數(shù)和增加的感染的風(fēng)險(xiǎn))?？蓪h(huán)孢菌素A和6-MP或硫唑嘌呤一起使用來在對靜脈內(nèi)的皮質(zhì)激素不起反應(yīng)的人中治療活動(dòng)性的、嚴(yán)重的潰瘍性結(jié)腸炎。除了上述藥物外，可施用其他藥物來放松患者或減輕疼痛、腹瀉或感染。
乳桿菌GG已成功地用于在嬰兒和兒童中治療急性和輪狀病毒腹瀉，也成功地用于治療由于正常共生菌群的改變而導(dǎo)致的抗生素相關(guān)性腹瀉(22、40和43)。最后，已顯示乳桿菌GG在結(jié)腸癌的鼠類模型中減少腫瘤負(fù)荷水平，表明該益生菌菌株可能還具有抗癌活性。
細(xì)胞熱激蛋白(Hsp)表達(dá)的誘導(dǎo)，如在熱應(yīng)激例如發(fā)燒后發(fā)生的誘導(dǎo)，是一種已詳盡說明的機(jī)制，通過該機(jī)制細(xì)胞能夠保護(hù)其自身免受進(jìn)一步的傷害。該現(xiàn)象，稱為“應(yīng)激耐受性”，在整個(gè)進(jìn)化和在所有物種中是高度保守的。在面臨各種不同類型的應(yīng)激(從熱和滲透壓應(yīng)激至氧化和炎癥性應(yīng)激物)時(shí)，可誘導(dǎo)的熱激蛋白為細(xì)胞提供了保護(hù)作用。已顯示腸上皮細(xì)胞中Hsp72的過量表達(dá)增強(qiáng)了存活力和對抗來自單氯胺的氧化傷害的保護(hù)作用，單氯胺是一種在炎癥期間當(dāng)由先天性細(xì)胞和炎癥性細(xì)胞釋放的次氯酸和氨反應(yīng)時(shí)大量產(chǎn)生的病理生理相關(guān)的活性氧代謝物。在腸上皮細(xì)胞中，可誘導(dǎo)的熱激蛋白Hsp72和Hsp25據(jù)報(bào)道強(qiáng)化了上皮屏障對抗來自許多有害損傷的破壞，從而保持緊密連接和屏障功能。也已報(bào)道Hsp25穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。
通過使用有義和反義轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，已顯示熱激蛋白在對上皮細(xì)胞提供細(xì)胞保護(hù)中起著核心作用，這一點(diǎn)通過其在氧化應(yīng)激的情況下保護(hù)上皮屏障功能的能力(Ropeleski等人，2003；Urayama等人，1998)得以說明?？烧T導(dǎo)的熱激蛋白(Hsp)屬于高度保守的蛋白的家族，所述蛋白在保護(hù)細(xì)胞對抗環(huán)境中的生理和病理應(yīng)激物方面發(fā)揮重要作用。在應(yīng)激例如熱、暴露于重金屬和毒素、局部缺血/再灌注損傷或來自炎癥的氧化應(yīng)激的條件下，Hsp的誘導(dǎo)既快速又強(qiáng)烈。通過溫和的“應(yīng)激”獲得的熱激蛋白的誘導(dǎo)賦予對抗隨后的損傷或傷害的保護(hù)作用，否則所述損傷和傷害可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。該已詳細(xì)描述的現(xiàn)象稱為“應(yīng)激耐受性”(Parsell等人，1993)。
在腸上皮細(xì)胞中，可誘導(dǎo)的熱激蛋白提供一定程度對抗應(yīng)激物例如來自炎癥性細(xì)胞的氧化劑和熱應(yīng)激(例如，發(fā)燒)的細(xì)胞保護(hù)作用；可誘導(dǎo)的Hsp也在惡劣的條件下保存腸上皮細(xì)胞屏障功能的完整性(Chang，1999；Musch等人，1996；Musch等人，1999)。腸上皮細(xì)胞中熱激蛋白的誘導(dǎo)在應(yīng)激條件下延長了存活力(Musch等人，1996)和保存緊密連接(如通過跨上皮電阻所測量的)(Musch等人，1999)。
也已報(bào)道活LGG細(xì)菌激活p38 MAP激酶，盡管在單獨(dú)使用條件培養(yǎng)基的情況下沒有看到對MAP激酶中的任一種的效應(yīng)(Yan等人，2002)。通過將細(xì)菌培養(yǎng)在MRS肉湯中，然后沉淀、漂洗，重懸浮細(xì)菌于組織培養(yǎng)基中，讓其再進(jìn)行2小時(shí)的生長，之后在使用前過濾，來制備所用的條件培養(yǎng)基。
對益生菌的用途存在不斷增長的興趣，所述益生菌被定義為可攝入的微生物，其在治療各種胃腸疾病中具有超越其內(nèi)在營養(yǎng)價(jià)值的健康益處，所述胃腸疾病包括炎性腸病(Gionchetti等人，2000a)、腸易激綜合征(Niedzielin等人，2001)、囊炎(Gionchetti等人，2000b；Gionchetti等人，2003)，以及輪狀病毒和抗生素相關(guān)性腹瀉(Isolauri等人，1991；Majamaa等人，1995；Arvola等人，1999)。盡管對其作用機(jī)制知之甚少，但益生菌似乎對腸粘膜具有保護(hù)性、營養(yǎng)性和抗炎性效果。
益生菌生物乳桿菌GG已成功地用于在嬰兒和兒童中治療急性和輪狀病毒腹瀉(Isolauri等人，1991；Majamaa等人，1995)，也成功地用于治療抗生素相關(guān)性腹瀉(Arvola等人，1999；Kalliomaki等人，2003)。輪狀病毒感染需要VP4突起蛋白和上皮細(xì)胞表面的起始相互作用，C末端片段VP5*被認(rèn)為負(fù)責(zé)細(xì)胞的細(xì)胞膜透化作用，其是病毒進(jìn)入所必需的(Zarate等人，2000)。
益生菌也被證實(shí)在治療和預(yù)防異位性疾病中是有用的。在幾種動(dòng)物模型中，益生菌的使用表現(xiàn)出抗小球隱孢子蟲(C.parvum)、幽門螺桿菌(H.pylori)和念珠菌感染的保護(hù)性。此外，已顯示乳桿菌GG在結(jié)腸癌的鼠類模型中減少腫瘤負(fù)荷的水平，表明該益生菌菌株可能還具有抗癌活性(Goldin等人，1996)。
盡管益生菌顯示改善許多疾病的病程，但對益生菌的作用機(jī)制了解甚少，這在本領(lǐng)域是公認(rèn)的不足。只是近年來才試圖理解其作用和其與宿主細(xì)胞相互作用背后的機(jī)制。已提出許多不同的可能機(jī)制，包括粘液產(chǎn)生的上調(diào)、上皮屏障功能的改善、IgA產(chǎn)生的增加和增加的對腸上皮上的粘附位點(diǎn)的競爭，以及抑制致病菌生長的有機(jī)酸、氨、過氧化氫和細(xì)菌素的產(chǎn)生。
作為治療策略，正在對用益生菌制劑改變IBD患者的腸道菌群進(jìn)行研究，但益生菌的作用機(jī)制仍不清楚。此外，益生菌的臨床功效高度依賴于建立和維持細(xì)菌定殖的能力，依賴于細(xì)菌可靠一致地產(chǎn)生活性劑，且受限于制劑的未調(diào)節(jié)組成和這些試劑的順勢療法遞送。另外，活細(xì)菌的使用存在不可避免的感染和染病的風(fēng)險(xiǎn)。因此，需要分離的、具有生物活性的益生因子和需要更有效的療法來預(yù)防或治療炎性病癥例如炎性腸病。
發(fā)明概述本發(fā)明通過提供具有生物活性的細(xì)胞保護(hù)性化合物來滿足本領(lǐng)域中至少一個(gè)上述需要，所述化合物由乳桿菌GG分泌并且誘導(dǎo)熱激蛋白的表達(dá)。熱激蛋白的細(xì)胞保護(hù)性作用可支持細(xì)胞抵抗炎癥。因此，本發(fā)明的化合物提供了用于治療IBD和其他炎性病癥的方法和組合物。
不受理論的束縛，要指出的是益生菌對腸上皮細(xì)胞功能的保護(hù)作用和有益作用表明益生菌作用的機(jī)制之一可包括對細(xì)胞保護(hù)性熱激蛋白的誘導(dǎo)。本公開內(nèi)容顯示由益生菌LGG合成的肽具有在鼠腸上皮細(xì)胞中以時(shí)間和濃度依賴性的方式誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)性熱激蛋白的能力，包括通過轉(zhuǎn)錄因子HSF-1進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。進(jìn)一步有意義的是，本發(fā)現(xiàn)表明來自LGG的條件培養(yǎng)基不僅提供了對抗氧化劑應(yīng)激的保護(hù)作用和上調(diào)上皮細(xì)胞熱激蛋白，而且其還調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含分離的來源于乳桿菌GG例如乳桿菌GG-條件培養(yǎng)基(Lactobacillus GG-conditioned medium)的細(xì)胞保護(hù)性化合物的組合物。如此處所用的，“來源于”是指通過直接分離或基于特征(例如此處公開的特征或根據(jù)此處的公開內(nèi)容使用常規(guī)方法確定的特征)最終從其獲得的意思。使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)例如重組表達(dá)法、化學(xué)合成法等獲得所述化合物。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞保護(hù)性化合物誘導(dǎo)至少一種熱激蛋白的表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞保護(hù)性化合物誘導(dǎo)Hsp25和Hsp72中至少一個(gè)的表達(dá)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞保護(hù)性化合物是蛋白。也存在其中蛋白是熱穩(wěn)定的實(shí)施方案。如此處所用的，“熱穩(wěn)定的”是指在水中煮沸20分鐘后仍能保持可檢測的活性的蛋白?？赏ㄟ^測定本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)性蛋白誘導(dǎo)至少一種熱激蛋白例如Hsp25或Hsp72的表達(dá)的能力來確定其活性。在一些實(shí)施方案中，所述蛋白是酸穩(wěn)定的。如此處所用的，“酸穩(wěn)定的”蛋白是指在低于7.0的pH下最具活性的蛋白，其中通過蛋白誘導(dǎo)Hsp25的表達(dá)的能力來確定活性。在一些實(shí)施方案中，蛋白具有低于10kDa的分子量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞保護(hù)性化合物是熱穩(wěn)定、酸穩(wěn)定和具有低于10kDa的分子量的蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞保護(hù)性化合物保護(hù)上皮細(xì)胞免受選自熱和氧化的應(yīng)激的傷害。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的細(xì)胞保護(hù)性化合物是這樣的蛋白，該蛋白具有從乳桿菌GG分離的能力、具有在上皮細(xì)胞例如腸上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)Hsp25和Hsp72表達(dá)的能力、具有小于10kDa的分子量，并且是酸穩(wěn)定的和熱穩(wěn)定的。
本發(fā)明的另一方面提供了用于治療患有炎性病癥的受治療者例如人患者的方法，其包括給患者施用治療有效量或劑量的分離的來源于乳桿菌GG-條件培養(yǎng)基的細(xì)胞保護(hù)性化合物。如此處所用的，“治療有效量”是這樣的量，該量在預(yù)防、改善或影響炎性病癥的進(jìn)程(例如，通過抑制該病癥的發(fā)生或延緩其速度)方面具有可檢測的有益效果。適合于根據(jù)本方法治療的示例性炎性病癥是炎性腸病，例如，克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞保護(hù)性化合物誘導(dǎo)至少一種熱激蛋白例如Hsp25和/或Hsp72的表達(dá)。
本發(fā)明的相關(guān)方面涉及用于改善炎性病癥的癥狀或與炎性病癥相關(guān)的癥狀的方法，其包括給受治療者例如人患者施用治療有效劑量的分離的來源于乳桿菌GG如乳桿菌GG培養(yǎng)基的細(xì)胞保護(hù)性化合物。本發(fā)明的該方面的示例性實(shí)施方案是用于改善炎性腸病例如克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎的癥狀的方法。和其相關(guān)的是本發(fā)明這一方面，提供了預(yù)防炎性病癥的方法，該方法包括給受治療者例如人患者施用分離的來源于乳桿菌GG的細(xì)胞保護(hù)性化合物，例如分離的存在于乳桿菌GG-條件培養(yǎng)基中的細(xì)胞保護(hù)性化合物。
炎性病癥可以是自身免疫病癥?？筛鶕?jù)本發(fā)明治療的自身免疫病癥的實(shí)例包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、特應(yīng)性皮炎、濕疹性皮炎、牛皮癬、斯耶格倫綜合征、克羅恩病、口瘡性潰瘍，虹膜炎、結(jié)膜炎、角結(jié)膜炎、潰瘍性結(jié)腸炎、哮喘、過敏性哮喘、皮膚紅斑狼瘡、硬皮病、陰道炎、麻風(fēng)病逆轉(zhuǎn)反應(yīng)、麻風(fēng)結(jié)節(jié)性紅斑、自身免疫眼色素層炎、多軟骨炎、史蒂文斯-約翰遜綜合征、扁平苔癬、結(jié)節(jié)病、原發(fā)性膽汁性肝硬變、后色素層炎、間質(zhì)性膀胱炎或間質(zhì)性肺纖維化。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，炎性病癥是炎性腸病。在示例性實(shí)施方案中，炎性腸病是克羅恩病。在本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，炎性腸病是潰瘍性結(jié)腸炎。在其他實(shí)施方案中，所施用的化合物誘導(dǎo)至少一種熱激蛋白例如Hsp25和/或Hsp72的表達(dá)。
在治療、改善和炎性病癥相關(guān)的癥狀或預(yù)防炎性病癥的方法中，本發(fā)明包括給受治療者例如人患者施用有效量或劑量的此處公開的包含細(xì)胞保護(hù)性化合物的藥物組合物。下面描述這些藥物組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了用于在細(xì)胞中誘導(dǎo)至少一種熱激蛋白例如Hsp25和/或Hsp72表達(dá)的方法，其包括將細(xì)胞和分離的來源于乳桿菌GG的細(xì)胞保護(hù)性化合物例如存在于乳桿菌GG-條件培養(yǎng)基中的細(xì)胞保護(hù)性化合物接觸。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在細(xì)胞中誘導(dǎo)Hsp25和Hsp72之一或兩者的表達(dá)的方法，其包括將細(xì)胞和從乳桿菌GG或乳桿菌GG-條件培養(yǎng)基分離的細(xì)胞保護(hù)性化合物接觸。在某些實(shí)施方案中，分離的細(xì)胞保護(hù)性化合物和表皮細(xì)胞例如腸上皮細(xì)胞接觸。在其他實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是免疫細(xì)胞例如樹突細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了這樣的藥物組合物，該組合物包含分離的來源于乳桿菌GG的細(xì)胞保護(hù)性化合物(例如發(fā)現(xiàn)于乳桿菌GG-條件培養(yǎng)基中或從其中純化的細(xì)胞保護(hù)性化合物)和至少一種藥物可接受的賦形劑。在某些實(shí)施方案中，藥物可接受的賦形劑是聚乙二醇。細(xì)胞保護(hù)性化合物或生物活性劑為“分離的”形式，意味著已將其和至少一種這樣的蛋白分離，其與所述蛋白一起天然地在乳桿菌GG細(xì)胞或培養(yǎng)基中被發(fā)現(xiàn)。在本發(fā)明的該方面的一些實(shí)施方案中，所述化合物誘導(dǎo)至少一種熱激蛋白例如Hsp25和/或Hsp72表達(dá)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生分離的細(xì)胞保護(hù)性化合物的方法，其包括獲得乳桿菌GG和從乳桿菌GG分離細(xì)胞保護(hù)性化合物的步驟。如上面所提到的，細(xì)胞保護(hù)性化合物的分離形式是指已將該化合物和至少一種和其一起在乳桿菌GG細(xì)胞或培養(yǎng)基中天然地被發(fā)現(xiàn)的蛋白分離開。在獲得乳桿菌GG的過程中，可獲得大量這樣的細(xì)胞，或可在合適的培養(yǎng)基例如MRS中生長或培養(yǎng)這些細(xì)胞，從而在條件培養(yǎng)基中獲得所述細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，為確保細(xì)胞保護(hù)性化合物的產(chǎn)生，預(yù)期培養(yǎng)期至少為8個(gè)小時(shí)。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞保護(hù)性化合物是蛋白。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞保護(hù)性化合物是熱穩(wěn)定的和/或酸穩(wěn)定的和/或具有小于10千道爾頓(kDa)的分子量。在另一個(gè)方面，本方法還包括表征和/或鑒定細(xì)胞保護(hù)性化合物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉用于分離蛋白的方法。例如，可通過HPPLC、FPLC、 疏水性LC、離子交換LC、配體/親和LC、大小排阻LC、薄層層析、膜過濾、等電聚焦或聚丙烯酰胺凝膠電泳、或這些方法的任何組合，分離本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)性蛋白質(zhì)。
用于表征本發(fā)明的化合物的細(xì)胞保護(hù)特性的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。細(xì)胞保護(hù)活性的指標(biāo)包括，例如，誘導(dǎo)熱激蛋白表達(dá)的能力，和在患有炎性病癥的受治療者中減少細(xì)胞損傷和/或促進(jìn)傷口愈合的能力。因此，表征本發(fā)明的化合物的一個(gè)方法是測定對熱激蛋白的誘導(dǎo)。另一個(gè)表征本發(fā)明的化合物的方法是測定化合物在受治療者中減少細(xì)胞損傷和/或促進(jìn)傷口愈合的能力。
用于鑒定蛋白的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。例如，可通過將樣品接受6N水解，然后通過HPLC-質(zhì)譜測序以鑒定組成感興趣的肽的所有單個(gè)氨基酸來鑒定細(xì)胞保護(hù)性蛋白。此外，可從容易鑒定的經(jīng)胰蛋白酶處理的片段來確定內(nèi)部氨基酸序列?？赏ㄟ^基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)來確定這些片段的氨基酸序列。然后將所述氨基酸序列和相關(guān)數(shù)據(jù)庫(例如，SwissProt，Genbank)比較以鑒定感興趣的蛋白或多肽。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明的方法還包括獲得更具細(xì)胞保護(hù)性的化合物?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法獲得更具細(xì)胞保護(hù)性的化合物。例如，可通過從乳桿菌GG或乳桿菌GG-條件培養(yǎng)基中分離來獲得更具細(xì)胞保護(hù)性的化合物。可選擇地，更具細(xì)胞保護(hù)性的化合物可通過編碼該細(xì)胞保護(hù)性化合物的重組DNA的表達(dá)來獲得。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明的方法還包括將更具保護(hù)性的化合物置于藥物組合物中。在某些方面，該方法還包括給患有炎性病癥的受治療者施用該藥物組合物。所述受治療者可以是哺乳動(dòng)物。優(yōu)選地所述受治療者是人。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了分離的編碼多肽保護(hù)性化合物的多核苷酸，其中所述被編碼的多肽的特征在于下列特征從乳桿菌GG分離的能力；在腸上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)Hsp25和Hsp72表達(dá)的能力；低于10 kDa的分子量；以及酸穩(wěn)定和熱穩(wěn)定的性質(zhì)。
本發(fā)明的其他方面涉及包含上述分離的細(xì)胞保護(hù)性化合物的組合物，其中所述化合物在上皮細(xì)胞中激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致選自Hsp25和Hsp72的熱激蛋白的表達(dá)。除非另外指出，Hsp70和Hsp72同物異名，這一點(diǎn)在本領(lǐng)域是已知的，盡管Hsp72包含更精確的蛋白質(zhì)量的估計(jì)。在一些實(shí)施方案中，激活作用是通過熱激因子-1(HSF-1)介導(dǎo)的。在一些實(shí)施方案中，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包含選自MAP激酶、SAP激酶、ERK1和ERK2的激酸。在某些實(shí)施方案中，所述途徑的激活包括選自MAP激酶、SAP激酶、ERK1和ERK2的激酶的激活。
在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了在上皮細(xì)胞中激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的方法，其包括將細(xì)胞和有效量的此處公開的分離的細(xì)胞保護(hù)性化合物接觸。在一些實(shí)施方案中，該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包含選自MAP激酶、SAP激酶、ERK1和ERK2的激酶。在一些實(shí)施方案中，以藥物組合物的形式施用所述分離的細(xì)胞保護(hù)性化合物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及預(yù)防氧化劑損傷的方法，其包括給細(xì)胞例如上皮細(xì)胞施用有效量的此處公開的分離的細(xì)胞保護(hù)性化合物或包含該化合物的藥物組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是穩(wěn)定細(xì)胞骨架的方法，其包括給細(xì)胞例如上皮細(xì)胞施用有效量的此處公開的分離的細(xì)胞保護(hù)性化合物或包含該化合物的藥物組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是預(yù)防炎性病癥的方法，其包括給受治療者施用有效劑量的此處公開的藥物組合物。優(yōu)選的受治療者是人患者。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是試劑盒，其包含此處公開的藥物組合物和用于給受治療者施用該組合物的方案。本發(fā)明涉及適合用于預(yù)期目的的本領(lǐng)域已知的任何給藥方案。優(yōu)選的受治療者是人患者。
預(yù)期可等同地實(shí)施此處描述的任何方法或組合物以及此處描述的任何其他方法或組合物。
權(quán)利要求中使用的術(shù)語“或者”是指“和/或”，除非明確表明是指僅僅擇一或者可選項(xiàng)是互相排斥的，盡管公開內(nèi)容支持定義僅僅指擇一以及“和/或”。
在本申請通篇中，術(shù)語“大約”用于表示這樣的值，該值包括用于確定該值的設(shè)備或方法的誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
在權(quán)利要求中或說明書中，詞“一種”和“一個(gè)”當(dāng)和詞“包含”結(jié)合使用時(shí)，是指一個(gè)(種)或多個(gè)(種)，除非明確地指出。
根據(jù)下列詳細(xì)的描述，本發(fā)明的其他特征和有利方面將變得更加明顯。然而，應(yīng)當(dāng)理解，詳細(xì)的描述和特定的實(shí)施例(盡管表示本發(fā)明的特定的實(shí)施方案)僅以舉例說明的方式提供，因?yàn)楦鶕?jù)本詳述的說明書，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種改變和變動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯而易見。
附圖簡述下列附圖形成了本說明書的組成部分，其包括在內(nèi)用于進(jìn)一步說明本發(fā)明的某些方面。通過將附圖中的一幅或多幅和此處提供的特定實(shí)施方案的詳細(xì)描述結(jié)合參考可更好地理解本發(fā)明。


圖1A和圖1BLGG-條件培養(yǎng)基以時(shí)間和濃度依賴性的方式在結(jié)腸上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)Hsp25和Hsp72。圖1A顯示LGG-CM誘導(dǎo)的時(shí)間進(jìn)程(600μl LGG-CM/孔)。圖1B描述在16個(gè)小時(shí)的處理的情況下，LGG-CM的劑量-反應(yīng)關(guān)系。
圖2LGG-條件培養(yǎng)基對熱激蛋白的誘導(dǎo)涉及HSF-1。
圖3LGG-條件培養(yǎng)基中的生物活性因子顯示具有小的分子量。
圖4LGG-條件培養(yǎng)基中的生物活性因子顯現(xiàn)具有熱穩(wěn)定性和在酸性pH下最活躍。
圖5用胃蛋白酶使LGG-條件培養(yǎng)基中的生物活性因子失活。
圖6用DTT使LGG-條件培養(yǎng)基中的生物活性因子失活。
圖7由實(shí)時(shí)PCR顯示的LGG-CM誘導(dǎo)的熱激蛋白的表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程直方圖。圖7AHsp72的誘導(dǎo)；圖7BHsp25的誘導(dǎo)。
圖8電泳遷移率變動(dòng)測試法，使用抗HSF-1和抗HSF-2的抗體作為探針/結(jié)合劑，證明了LGG-CM對熱激蛋白的誘導(dǎo)在性質(zhì)上是至少部分轉(zhuǎn)錄性的。
圖9顯示在暴露于LGG-GM后熱激蛋白是上調(diào)最顯著的上皮細(xì)胞基因的散布圖。
圖10洗出實(shí)驗(yàn)(washout experimental)的結(jié)果的電泳圖，該結(jié)果表明在將上皮細(xì)胞暴露于LGG-CM后，熱激蛋白誘導(dǎo)信號被快速傳遞(圖10A)，其由至少一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)(圖10B)。
圖11顯示LGG-CM對受到氧化劑應(yīng)激攻擊的上皮細(xì)胞的保護(hù)作用(如通過使用51Cr進(jìn)行的存活力檢測法(圖11A)或通過細(xì)胞骨架完整性的G/F肌動(dòng)蛋白測定法(圖11B)所顯示的)的直方圖。
圖12來源于乳桿菌GG的細(xì)胞保護(hù)性因子的物理性質(zhì)的說明。顯示所述因子對胃蛋白酶的易感性(圖12A)、因子的電泳大小(圖12B)、和因子的熱穩(wěn)定性的電泳證據(jù)的電泳圖。
圖13顯示LGG-CM的細(xì)胞保護(hù)性因子的穩(wěn)定性作為pH的函數(shù)(圖13A)和在重新酸化后因子的部分復(fù)性(圖13B)的電泳圖。
發(fā)明詳述A.總體描述益生菌是主要在食物補(bǔ)充劑中發(fā)現(xiàn)的提供除其營養(yǎng)價(jià)值外的保健益處的活生物。預(yù)期本發(fā)明的益生化合物對宿主具有多種有益效果。由一種常見益生菌-乳桿菌GG產(chǎn)生的可溶性因子作用于上皮細(xì)胞，從而產(chǎn)生對細(xì)胞保護(hù)性熱激蛋白Hsp25和Hsp72的時(shí)間和濃度依賴性的誘導(dǎo)。由LGG產(chǎn)生的可溶性因子足以誘導(dǎo)Hsp而不需要活的細(xì)菌。盡管Hsp蛋白的實(shí)際出現(xiàn)需要數(shù)小時(shí)，其中只將細(xì)胞暴露于LGG-CM幾分鐘的洗出實(shí)驗(yàn)顯示，啟動(dòng)上皮細(xì)胞上調(diào)熱激蛋白的信號所需要的時(shí)間非常短，表明信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在將啟動(dòng)信號從LGG-CM傳遞至上皮細(xì)胞中起作用。已知許多蛋白激酶在應(yīng)激反應(yīng)中被激活，已證實(shí)LGG-CM的暴露激活許多MAP激酶。盡管在我們的YAMC細(xì)胞中存在激活的ERK1/2的基線水平，但LGG-CM預(yù)處理如佛波酯PMA一樣有效地激活ERK1/2，并且也激活p38和JNK。在LGG-CM暴露前，用p38和JNK的抑制劑處理細(xì)胞抑制了LGG-CM對Hsp72的誘導(dǎo)但對Hsc73的表達(dá)無影響。這表明這兩種MAP激酶在傳遞啟動(dòng)通過暴露于LGG-CMM觸發(fā)的可誘導(dǎo)的Hsp的表達(dá)所需的細(xì)胞信號中起作用。其他研究已顯示p38和JNK通過共同的途徑起作用，該途徑不同于ERK1/2(Liu等人，F(xiàn)ree Radic.Biol.Med.21771-781(1996))。這些結(jié)果顯示LGG-CM在上皮細(xì)胞中影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而表明至少一種用于誘導(dǎo)Hsp產(chǎn)生的快速信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過至少一種信號傳導(dǎo)途徑來啟動(dòng)。
來自益生菌乳桿菌GG的條件培養(yǎng)基(LGG-CM)(在整個(gè)公開內(nèi)容中，“培養(yǎng)基”可通過上下文判定以單數(shù)或復(fù)數(shù)的情況使用)在腸上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)熱激蛋白的表達(dá)。Hsp25和Hsp72都由LGG-CM以時(shí)間和濃度依賴性的方式誘導(dǎo)。此外，這些作用由酸穩(wěn)定和熱穩(wěn)定的小分子量肽介導(dǎo)。DNA微陣列實(shí)驗(yàn)顯示在上皮細(xì)胞中，Hsp72(Hsp70)是對LGG-CM處理起反應(yīng)的最高度上調(diào)的基因之一。實(shí)時(shí)PCR和電泳遷移率變動(dòng)分析證實(shí)，Hsp誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)在性質(zhì)上是至少部分轉(zhuǎn)錄性的并且涉及轉(zhuǎn)錄因子HSF-1。即使暴露后數(shù)小時(shí)Hsp仍不被誘導(dǎo)，但短暫的暴露于LGG-CM足以啟動(dòng)Hsp誘導(dǎo)的信號，且鑒于反應(yīng)是快速的，這些時(shí)間暗示可能有信號傳導(dǎo)途徑參與。實(shí)驗(yàn)顯示，LGG-CM通過活化MAP激酶在腸上皮細(xì)胞中調(diào)節(jié)某些信號傳導(dǎo)途徑的活性。p38和JNK的抑制劑阻斷了通常由LGG-CM誘導(dǎo)的Hsp72的表達(dá)。功能研究表明對腸道上皮細(xì)胞的LGG-CM處理保護(hù)其免于氧化劑應(yīng)激的傷害并保持細(xì)胞骨架的完整性。通過在腸道上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)性Hsp的表達(dá)，和/或通過激活信號傳導(dǎo)途徑，由LGG分泌的分離的肽產(chǎn)物促成了該肽的有益的臨床效果。
本發(fā)明表明可從乳桿菌GG(LGG)(益生菌微生物)分離生物活性化合物。使用不含細(xì)菌的、來源于益生菌的化合物而不是活細(xì)菌提供了優(yōu)于使用活細(xì)菌的安全有利方面。此外，分離的化合物的臨床功效可能比益生菌更一致，后者依賴于建立和維持細(xì)菌定殖的能力。
存在于LGG-GM中的負(fù)責(zé)熱激蛋白誘導(dǎo)的因子是具有驚人的酸和熱穩(wěn)定性的小分子量肽。這些性質(zhì)可為這些分泌因子提供在其通過GI道時(shí)在腸道的惡劣環(huán)境中存活所需的復(fù)原力。有趣地也要指出的是，腸腔中部的物理化學(xué)環(huán)境和上皮細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的環(huán)境很不同，腸腔中部的環(huán)境傾向于更酸(Rechkemmer等人，1986)。該酸性微環(huán)境據(jù)認(rèn)為在發(fā)揮功能例如膜運(yùn)輸、藥物攝取和營養(yǎng)吸收上起著重要的作用(Sanderson，1999)。已顯示酸性微環(huán)境對某些二肽進(jìn)入腸上皮細(xì)胞的運(yùn)輸具有直接的作用(Lister等人，1995)。如果LGG-CM中的生物活性肽通過受體介導(dǎo)的途徑起作用，那么其不尋常的酸穩(wěn)定性可在其結(jié)合上皮細(xì)胞表面上的受體和啟動(dòng)對細(xì)胞保護(hù)性Hsp的誘導(dǎo)的能力中發(fā)揮重要的作用。
因此，本發(fā)明的化合物為炎性病癥例如IBD的治療提供優(yōu)于目前在本領(lǐng)域可獲得的治療法的新療法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了這樣的組合物，該組合物包含可從乳桿菌GG分離的或來源的分離的細(xì)胞保護(hù)性化合物。此外，本發(fā)明提供了用于預(yù)防、治療或改善炎性病癥患者的至少一種已知癥狀的方法，其包括給患者施用有效劑量或量的來源于乳桿菌GG的細(xì)胞保護(hù)性化合物。在其他方面，本發(fā)明提供了用于分離和表征具有細(xì)胞保護(hù)特性的來源于乳桿菌GG-條件培養(yǎng)基的化合物。
B.細(xì)胞保護(hù)性化合物的鑒定和表征本發(fā)明提供了鑒定和表征來源于細(xì)菌培養(yǎng)物的具有細(xì)胞保護(hù)特性的化合物。本發(fā)明也提供了可從益生菌生物分離的細(xì)胞保護(hù)性化合物，以及用于治療、預(yù)防或改善炎性疾病的至少一種癥狀的組合物和方法。
1.細(xì)胞保護(hù)性化合物的分離任何細(xì)菌菌株或益生菌制劑都適合用于篩選細(xì)胞保護(hù)性化合物。優(yōu)選地，細(xì)菌是非致病性腸細(xì)菌。在此處公開的示例性實(shí)施方案中，細(xì)菌是乳桿菌GG。細(xì)菌培養(yǎng)的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。一般使用MRS肉湯來分離和培養(yǎng)乳桿菌種類。例如，在37℃下在5％CO2中在微需氧的條件下，乳桿菌GG容易地生長在MRS肉湯中。用于培養(yǎng)乳桿菌種類的培養(yǎng)基的另一個(gè)實(shí)例是蕃茄汁肉湯。
細(xì)胞保護(hù)性化合物經(jīng)確定是在乳桿菌GG-條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的可溶性因子。為幫助鑒定和表征這些化合物，優(yōu)選地從培養(yǎng)基中除去細(xì)菌細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉分離培養(yǎng)基中的細(xì)胞和可溶性因子的方法。例如，可通過離心、過濾或這兩種技術(shù)的組合除去細(xì)胞。除去細(xì)菌細(xì)胞后，然后將“條件培養(yǎng)基”用作這樣的來源，可從該來源進(jìn)一步純化和表征分離的細(xì)胞保護(hù)性化合物。
(a)其他分離技術(shù)也預(yù)期使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他分離技術(shù)分級分離條件培養(yǎng)基，從而分離益生因子(即，生物活性劑)。高效液相色譜(HPLC)的特征在于非?？焖俚姆蛛x，同時(shí)具有極高的峰分辨率。這可以通過使用非常細(xì)的顆粒和保持足夠流速的高壓來實(shí)現(xiàn)。分離可在大概數(shù)分鐘內(nèi)完成，或最多1小時(shí)內(nèi)完成。此外，只需要非常小體積的樣品，因?yàn)轭w粒非常小并且裝填緊密，這樣外水體積只是柱床體積的極小部分。還有，樣品的濃度不必非常高，因?yàn)闂l帶窄到只有非常少的樣品稀釋。
快速蛋白液相色譜法(FPLC)是普遍用于蛋白分離的技術(shù)。FPLC基本上是在低壓下運(yùn)行的HPLC形式，其具有由惰性物質(zhì)如纖維素或葡聚糖制成的“樹脂”，所述惰性物質(zhì)具有附著至其上的為其提供特異性結(jié)合特性的化學(xué)側(cè)基。所述側(cè)鏈決定了色譜的類型。例如，疏水性LC通過蛋白含有的疏水性氨基酸的量來分離蛋白；離子交換LC通過帶電荷的氨基酸的數(shù)目和類型來分離蛋白；配體/親和LC通過蛋白對某些底物、染料或抗體的特異性來分離蛋白；和大小排阻LC(或凝膠過濾)通過蛋白的大小來分離蛋白。
凝膠過濾層析法或分子篩層析法是基于分子大小的特殊類型的分配層析法。凝膠層析法背后的原理是由包含小孔的惰性物質(zhì)的微小顆粒制備的柱子在分子取決于其大小通過小孔或繞過小孔時(shí)將較大的分子和較小的分子分離。只要制備顆粒的材料不吸附分子，確定流速的唯一因素是大小。因此，只要形狀相對恒定，分子以大小減小的順序從柱子上洗脫。凝膠色譜法在用于分離不同大小的分子上非常優(yōu)越，因?yàn)榉蛛x不依賴于所有其他因素，例如pH、離子強(qiáng)度、溫度等。實(shí)際上也不存在吸附，區(qū)域擴(kuò)散較小，洗脫體積以簡單的方式和分子量相關(guān)。
此外，可使條件培養(yǎng)基通過具有特定分子量截止值的過濾器。例如，可通過具有特定分子量截止值的Centricon濾器制備本發(fā)明的一些級分。
也可使用基于電荷的分離技術(shù)。一種這樣的技術(shù)是離子交換層析法。在使用離子交換層析的情況下，樣品和帶電荷的基質(zhì)可逆地結(jié)合。一般使用包含二乙基氨乙基(DEAE)和羧甲基(CM)纖維素的基質(zhì)。然后通過增加鹽濃度或改變流動(dòng)相的的pH來產(chǎn)生解吸脫附?；诖颂幑_的層析數(shù)據(jù)確定，LGG-CM中的細(xì)胞保護(hù)性因子在低pH下是穩(wěn)定的，其等電點(diǎn)預(yù)期較低，因此，該蛋白應(yīng)當(dāng)帶負(fù)電荷，這使其成為基于電荷的分離技術(shù)的良好候選者。因此一個(gè)分離的方法包括將條件培養(yǎng)基在恰當(dāng)衍生的(例如，引入在想要的pH下帶正電荷的官能團(tuán))MonoS柱上接受陰離子交換層析法，如本領(lǐng)域熟知的。為加速分離，可將這些柱子用于FPLC系統(tǒng)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于基于電荷分離化合物的另一種技術(shù)是IEF(等電聚焦)。一種通常使用IEF的方法是雙向電泳法?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法進(jìn)行雙向凝膠電泳(參見，例如，美國專利號5,534,121和6,398,933)。一般地，首先通過等電聚焦分離樣品的蛋白，在該階段，在pH梯度中通過pI分離樣品中的蛋白直至其到達(dá)其凈電荷為0(即，等電點(diǎn)或pI)時(shí)所處的點(diǎn)。該第一分離步驟產(chǎn)生了蛋白的一維排列。使用一般不同于第一分離步驟中所用的技術(shù)在第二維中進(jìn)一步對一維排列中的蛋白進(jìn)行分離。例如，在第二維中，使用聚丙烯酰胺凝膠，例如在十二烷基硫酸鈉存在下的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，對通過等電聚焦分離的蛋白進(jìn)一步分離。SDS-PAGE凝膠使得可以進(jìn)一步進(jìn)行基于蛋白分子量的分離。
可使用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法檢測二維排列中的蛋白。可用比色染料(例如，考馬斯)、銀染和熒光染色(例如，Ruby Red)，完成對蛋白的染色。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的，可從凝膠上切下蛋白點(diǎn)并用氣相離子光譜測定法進(jìn)行分析?？蛇x擇地，可通過例如施加電場將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至惰性膜上，然后通過氣相離子光譜測定法進(jìn)行分析。
可單獨(dú)地或以任何組合的方式使用上述蛋白質(zhì)分離技術(shù)。在純化或分離過程中，可能想要檢測級分以追蹤保留細(xì)胞保護(hù)活性的級分。例如，可就誘導(dǎo)至少一種細(xì)胞保護(hù)性熱激蛋白表達(dá)的能力對培養(yǎng)基或級分進(jìn)行篩選。在下面更加詳細(xì)地描述這些測定法?？梢缘确值男问嚼鋬鼍哂猩飳W(xué)活性的制劑以在日后用于抗炎性和細(xì)胞保護(hù)性化合物的鑒定、純化和將來的生產(chǎn)。
2.細(xì)胞保護(hù)性化合物的鑒定通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的蛋白質(zhì)鑒定方法鑒定本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)性化合物。
例如，首先將條件培養(yǎng)基分級分離，就生物學(xué)活性(例如，誘導(dǎo)熱激蛋白表達(dá)的能力)對級分進(jìn)行檢測。例如通過PAGE，然后通過銀染分析，可確定保留活性的級分的純度。如果活性成分已分離成均一的狀態(tài)，那么可以至少兩種方法分析蛋白。第一，通過將所述樣品接受6N水解(在真空管中用HC1進(jìn)行24小時(shí))，然后進(jìn)行HPLC-質(zhì)譜測序以鑒定組成目的肽的所有單個(gè)氨基酸，來進(jìn)行氨基酸序列分析。第二，可根據(jù)容易鑒定的胰蛋白酶處理片段確定內(nèi)部氨基酸序列。一般將分離的蛋白濃縮，然后用胰蛋白酶進(jìn)行處理。干燥片段，然后將其在C18反相HPLC上進(jìn)行分離，通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)確定這些峰的氨基酸序列。然后將氨基酸序列和一種或多種已知序列(例如在任何已知的數(shù)據(jù)庫(SwissPrott，Genbank)中發(fā)現(xiàn)的序列)比較以鑒定目的蛋白或肽。
3.細(xì)胞保護(hù)性化合物的表征可使用此處描述的或本領(lǐng)域已知的方法就細(xì)胞保護(hù)特性對在LGG-條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的化合物進(jìn)行測定。細(xì)胞保護(hù)活性的指征包括，例如，誘導(dǎo)熱激蛋白表達(dá)的能力和在患有炎性病癥的受治療者中減輕炎癥的能力。
(a)熱激蛋白此處公開的數(shù)據(jù)顯示LGG-條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)熱激蛋白特別是至少Hsp72和Hsp25的表達(dá)。熱激蛋白是保護(hù)細(xì)胞免受環(huán)境應(yīng)激因子傷害的蛋白家族。Hsp72結(jié)合和穩(wěn)定至關(guān)重要的細(xì)胞蛋白，防止其變性。其也具有通過保持線粒體的完整性、抑制細(xì)胞色素C滲漏和阻斷半胱天冬酶8活性來抗細(xì)胞凋亡的作用(Liu等人，2003)。Hsp25/27是肌動(dòng)蛋白穩(wěn)定劑，其保存細(xì)胞骨架和緊密連接的功能。誘導(dǎo)熱激蛋白表達(dá)的能力表明LGG-條件培養(yǎng)基中的活性化合物具有細(xì)胞保護(hù)性。
分析熱激蛋白的誘導(dǎo)的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。例如，可通過標(biāo)準(zhǔn)的蛋白印跡分析法使用抗特定同種型的單克隆抗體(Stressgen)進(jìn)行Hsp72和Hsp25的誘導(dǎo)。可進(jìn)行針對組成型熱激關(guān)聯(lián)蛋白(cognates)Hsp60和Hsc73的免疫印跡法，以檢查反應(yīng)的特異性和確保泳道的相同上樣量(這些蛋白的表達(dá)通常保持恒定)。此外，可通過免疫熒光法和ELISA使用抗體檢測熱激蛋白的表達(dá)。
分析熱激蛋白的誘導(dǎo)的其他方法包括使用例如，RT-PCR、基因組微陣列和實(shí)時(shí)PCR測定HspmRNA的水平。用于分析熱激蛋白的誘導(dǎo)的另一種方法是使用電泳遷移率變動(dòng)分析法觀察轉(zhuǎn)錄因子HSF-1的結(jié)合。另外，可使用HSE螢光素酶報(bào)告分子檢測法來測量轉(zhuǎn)錄因子HSF-1的活性。
(b)動(dòng)物模型對本發(fā)明的化合物的表征可包括使用各種動(dòng)物模型，包括這樣的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通過基因工程改造具有特定缺陷或攜帶這樣的標(biāo)志物，該標(biāo)志物可用于測量候選物質(zhì)到達(dá)和影響生物體內(nèi)不同細(xì)胞的能力。由于大小、操作的容易性、關(guān)于其生理和遺傳組成的信息、和本領(lǐng)域內(nèi)承認(rèn)的作為人炎癥的模型的有效性，小鼠是優(yōu)選的動(dòng)物模型，特別是在轉(zhuǎn)基因的研究中尤其如此。然而，其他動(dòng)物也同樣適合，包括大鼠、兔子、倉鼠、豚鼠、沙土鼠、旱獺、貓、狗、綿羊、山羊、豬、母牛、馬和猴子(包括黑猩猩、長臂猿和狒狒)。可使用來源于這些物種中的任一種的動(dòng)物模型進(jìn)行檢測。
用于結(jié)腸炎的小鼠模型的一些示例包括DSS誘發(fā)的結(jié)腸炎模型、敲除IL-10的小鼠、敲除A20的小鼠、TNBS誘發(fā)的結(jié)腸炎模型、敲除IL-2的小鼠、敲除TCRα受體的小鼠和敲除上皮細(xì)胞鈣粘蛋白的小鼠。
用試驗(yàn)或候選化合物治療動(dòng)物包括以適當(dāng)?shù)男问浇o動(dòng)物施用化合物。預(yù)期本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的炎性疾病的任何動(dòng)物模型?？赏ㄟ^可用于臨床或非臨床目的的任何途徑進(jìn)行施藥。例如，可通過管飼法或通過直腸給藥來遞送化合物。此外，通過在動(dòng)物模型中誘發(fā)例如結(jié)腸炎之前施用化合物來檢測化合物的保護(hù)性效果?？蛇x擇地，通過在動(dòng)物模型中誘導(dǎo)例如結(jié)腸炎之后施用化合物來測定該化合物的治療效果。
在體內(nèi)確定化合物的功效涉及許多不同的標(biāo)準(zhǔn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉大量可獲得的用于測定受治療者(無論該受治療者是動(dòng)物或是人受治療者)中的炎癥的技術(shù)。例如，通過組織學(xué)評定和對結(jié)腸炎的嚴(yán)重性分級評分來測量炎癥。用于測定受治療者中炎癥的其他方法包括，例如，測量髓過氧化物酶(MPO)活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、絨毛蛋白的表達(dá)、或跨皮膚的電阻(TER)。
也可使用評估細(xì)胞增殖的試驗(yàn)來測定化合物的功效。例如，可通過測量5-溴-2’-脫氧尿苷(BrdU)的攝取來測定細(xì)胞增殖。確定化合物功效的另一個(gè)方法是評估編程性細(xì)胞死亡的程度。用于研究編程性細(xì)胞死亡的方法在本領(lǐng)域是熟知的，包括例如TUNEL測定法。
此外，可以比以體外或細(xì)胞內(nèi)測定法更有意義的方式在動(dòng)物中進(jìn)行毒性和劑量反應(yīng)的測量，所述測量法在本領(lǐng)域內(nèi)是常規(guī)方法。
C.藥物組合物本發(fā)明的組合物包含有效量的細(xì)胞保護(hù)性化合物，其可溶解和/或分散在藥物可接受的載體和/或含水介質(zhì)中。
可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法(參見，例如，“Remington′s Pharmaceutical Sciences”第15版)遞送本發(fā)明的細(xì)胞保護(hù)性化合物。例如，可經(jīng)口、經(jīng)直腸、經(jīng)腸胃外或局部遞送藥物組合物。
可在適當(dāng)?shù)嘏c表面活性劑(例如聚乙二醇(PEG)或羥丙基纖維素)混合的水中制備包含本發(fā)明的化合物的溶液。在普通的貯存和使用條件下，這些制劑包含阻止微生物生長的防腐劑。適合用于注射用途的藥物形式包括無菌水溶液或分散體以及用于臨時(shí)配制無菌注射液或分散體的無菌粉劑。所述形式一般應(yīng)當(dāng)是無菌的并且必須是達(dá)到可操作的可注射性程度的流體。其在生產(chǎn)和貯存條件下必須是穩(wěn)定的并且必須經(jīng)過防腐處理以防止微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用。
對于以水溶液的形式經(jīng)胃腸外給藥，例如，如果需要，適當(dāng)?shù)貙θ芤哼M(jìn)行緩沖，首先用充足的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。這些特殊水溶液特別適合用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、瘤內(nèi)和腹膜內(nèi)給藥。在這方面，根據(jù)本公開內(nèi)容，可使用的無菌含水介質(zhì)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。
也可使用栓劑。栓劑是固體，包括凝膠，一般含藥，用于插入直腸、陰道和/或尿道的具有各種重量和/或形狀的劑型。在插入后，栓劑變軟、熔化和/或溶解在腔液中。一般地，對于栓劑，常規(guī)的粘合劑和/或載體可包括，例如，聚烷撐二醇和/或甘油三酯；可從以例如0.5％至10％、優(yōu)選地1％-2％的范圍含有活性化合物的混合物形成這些栓劑。也可通過灌腸法遞送本發(fā)明的藥物組合物。
口服制劑包括一般使用的賦形劑例如，藥物級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂和/或諸如此類。這些組合物采用溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊劑、持續(xù)釋放的制劑和/或粉劑的形式。在某些確定的實(shí)施方案中，口服藥物組合物包含惰性稀釋劑和/或可同化食用的載體，和/或其可包封在硬和/或軟殼明膠膠囊中，和/或其可壓制成片劑，和/或其可直接被摻入飲食的食物中。對于口服治療給藥，可將活性化合物和賦形劑一起整合和/或以可攝取的片劑、口含片劑、藥錠、膠囊、酏劑、混懸液、糖漿劑、糯米紙囊劑和/或諸如此類形式使用。這些組合物和/或制劑應(yīng)當(dāng)包含至少0.1％的活性化合物。當(dāng)然，組合物和/或制劑的百分比可以是變化的和/或可方便地在單位重量的大約2至大約75％之間，優(yōu)選地在25至60％之間。這些治療上有用的組合物中的活性化合物的量是使得可獲得如本領(lǐng)域中已知的或可確定的合適的劑量。
片劑、藥錠、丸劑、膠囊和/或諸如此類也可包含下列物質(zhì)粘合劑，如西黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉、和/或明膠；賦形劑，例如磷酸二鈣；崩解劑，例如玉米淀粉、土豆淀粉、藻酸和/或諸如此類；潤滑劑，例如硬脂酸鎂；和/或也可加入甜味劑，例如蔗糖、乳糖和/或糖精和/或增香劑例如薄荷、冬青油和/或櫻桃調(diào)味劑。當(dāng)單位劑型是膠囊時(shí)，除了上述類型的材料外，其可包含液體載體。許多其他材料也可以包衣的形式存在和/或以其他方式修飾劑量單位的物理形式。例如，可用紫膠、糖和/或兩者包被片劑、丸劑和/或膠囊。酏劑的糖漿可包含活性化合物、用作甜味劑的蔗糖、用作防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯和/或?qū)αu基苯甲酸丙酯、染料和/或調(diào)味劑例如櫻桃和/或柑橘香料。
局部制劑包括包含活性化合物的乳膏劑、軟膏劑、膠凍劑、凝膠劑、表皮溶液或混懸液等。
對于人施用，制劑應(yīng)當(dāng)滿足由FDA生物標(biāo)準(zhǔn)辦公室所要求的無菌性、致熱原性、總體安全性和純度的標(biāo)準(zhǔn)。
術(shù)語“藥物可接受的”和“藥理學(xué)可授受的”是指當(dāng)給人施用時(shí)不產(chǎn)生過敏或類似的不良反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。
考慮到例如因素例如受治療者的體重和年齡、要治療的疾病的類型、疾病狀況的嚴(yán)重性、先前和并存的治療干預(yù)、給藥方式等，細(xì)胞保護(hù)性化合物的劑量和劑量方案以受治療者個(gè)案為基礎(chǔ)而變化，這可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。
以和劑量制劑相容的任何方式和以將在治療上有效的量給藥。要施用的量取決于要被治療的受治療者。要求施用的活性成分的精確量取決于醫(yī)師的判斷。
D.實(shí)施例下列實(shí)施例包括在內(nèi)用于說明本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到，下面的實(shí)例中公開的技術(shù)代表此處公開的在本發(fā)明的實(shí)施中良好地發(fā)揮作用的技術(shù)。然而，根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到在公開的具體的實(shí)施方案中可作許多變化，而仍能獲得類似的或相似的結(jié)果而不背離本發(fā)明的精神和范圍。
下列實(shí)施例中報(bào)道的所有實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)最少重復(fù)3至6次。所有數(shù)值表示為平均值+/-平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。當(dāng)進(jìn)行多重比較時(shí)，利用使用邦弗朗尼校正法的ANOVA分析評估組之間差異的顯著性。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)上的顯著意義。
實(shí)施例1培養(yǎng)組織培養(yǎng)。YAMC(年輕成年小鼠結(jié)腸)細(xì)胞是從Immortimouse衍生的條件永生化小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞系。這些細(xì)胞在II型MHC啟動(dòng)子的γ干擾素敏感部分的控制下表達(dá)溫度敏感型SV40大T抗原的轉(zhuǎn)基因(tsA58)(Whitehead等人，1993，此處引用作為參考)。該特殊性質(zhì)使YAMC細(xì)胞能夠在非允許(非轉(zhuǎn)化的)條件下，在37℃下、在不存在γ干擾素(IFN-γ)的情況下進(jìn)行培養(yǎng)。在允許條件(33℃)下在RPMI1640培養(yǎng)基(含有5％(體積/體積)胎牛血清、5U/ml鼠IFN-γ(GibcoBRL，Grand Island，NY)、50μg/ml鏈霉素和50U/ml青霉素，補(bǔ)充 ITS-X Premix(Collaborative Biomedical Products，Bedford，MA))中維持培養(yǎng)YAMC細(xì)胞。
在非允許(非轉(zhuǎn)化)條件下在37℃下不存在IFN-γ的條件下，這些細(xì)胞經(jīng)歷分化并發(fā)展成熟上皮細(xì)胞的功能和特性，包括緊密連接的形成、極性、微絨毛頂膜和轉(zhuǎn)運(yùn)功能。
在各研究開始之前，以每60mm組織培養(yǎng)皿2×105的密度將細(xì)胞進(jìn)行涂板。為制備RNA，以每100mm組織培養(yǎng)皿7.5×105個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞進(jìn)行涂板。在33℃下培養(yǎng)24小時(shí)后，用不含IFN的培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至37℃(非允許條件)培養(yǎng)24小時(shí)以使分化的結(jié)腸細(xì)胞表型得到發(fā)展。用LGG-條件培養(yǎng)基(1∶10的稀釋度，或600μl)處理細(xì)胞過夜，然后第二天進(jìn)行收獲。在42℃下對熱激對照熱激23分鐘，然后在收獲前置于37℃下2小時(shí)。
細(xì)菌培養(yǎng)。將益生菌-乳桿菌GG(ATCC 53103)在MRS肉湯(每升肉湯包含10g Bacto Proteose Peptone #3、10g Bacto牛肉膏、5gBacto酵母提取物、20g Bacto葡萄糖、1.0g聚山梨酯80、2.0g檸檬酸銨、5.0g醋酸鈉、0.1g硫酸鎂、0.05g硫酸錳、2.0g磷酸氫二鉀)中培養(yǎng)16小時(shí)至大約3×109CFU/ml的濃度(如通過菌落計(jì)數(shù)所確定的)，然后在4℃下在臺式Sorvall離心機(jī)中以低速(3000xg)離心10分鐘。將上清液(條件培養(yǎng)基)通過0.22微米的低蛋白結(jié)合Millex濾膜(Millipore，Billerica，MA)過濾以進(jìn)行滅菌和除去所有細(xì)菌細(xì)胞。將LGG-條件培養(yǎng)基的等分在-80℃下貯存在無菌微量離心管中直至進(jìn)一步使用。
實(shí)施例2LGG-CM在腸上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)Hsp25和Hsp72的表達(dá)－Western分析用來自益生菌LGG的條件培養(yǎng)基處理腸上皮細(xì)胞，然后就可誘導(dǎo)的熱激蛋白的表達(dá)對其進(jìn)行測定。為進(jìn)行表達(dá)的蛋白印跡分析，在冰冷的PBS(137mM NaCl、2.7mM KCl、8 mM Na2HPO4，pH 7.4)中洗滌細(xì)胞兩次，然后刮入其中。沉淀細(xì)胞(在室溫下14,000xg下進(jìn)行20秒)，然后將其重懸浮于冰冷的裂解緩沖液(10mM Tris、pH 7.4、5mMMgCl2、DNA酶和RNA酶各50U/ml、和完全蛋白酶抑制劑混合物(RocheMolecular Biochemicals，Indiahapolis，IN))。使用雙辛可寧酸法(Smith等人，1985)確定蛋白濃度。在加入3X Laemmli終止緩沖液后將樣品加熱至75℃5分鐘，然后在-80℃下貯存直至使用。
將每泳道20微克的蛋白在12.5％SDS-PAGE上進(jìn)行分離。如先前所描述的(Kojima等人，2003)，將樣品在1X Towbin緩沖液(25mMTris、192mM甘氨酸、pH 8.8、15％體積/體積甲醇)中轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Perkin-Elmer NEN，Boston，MA)上。在5％(重量/體積)的脫脂奶TBS-Tween溶液(含有0.01％(體積/體積)Tween 20的Tris緩沖鹽溶液(150mM NaCl、5mM KCl、10mM Tris，pH 7.4))中在室溫下封閉膜1小時(shí)。將一抗即特異性抗Hsp25抗體(SPA801，Stressgen，Victoria，BC，Canada)、抗Hsp72抗體(SPA 810，Stressgen)或抗Hsc73抗體(SPA 815，Stressgen)加入至TBS-Tween并在4℃下溫育過夜。在用二抗溫育之前，在TBS-Tween中洗滌印跡5次。用綴合至辣根過氧化物酶的二抗(Jackson Immunoresearch Labs，Inc.，F(xiàn)ortWashington，PA)在室溫下溫育膜1小時(shí)，然后在TBS-Tween中洗滌5次，接著在TBS(無Tween)中進(jìn)行最后的洗滌。然后按照廠商說明書用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)ECL試劑(Supersignal，Pierce，Rockford，IL)處理膜和進(jìn)行顯影。
來自益生菌LGG的條件培養(yǎng)基以時(shí)間依賴性方式在培養(yǎng)的鼠結(jié)腸YAMC細(xì)胞中誘導(dǎo)熱激蛋白Hsp25和Hsp72的表達(dá)，18-20小時(shí)后開始表達(dá)Hsp25，Hsp72表達(dá)稍微早些，最初在6-8小時(shí)出現(xiàn)(圖1A)。在該處理期間，組成型表達(dá)的管家基因hsc73的表達(dá)沒有改變，表明LGG-CM的效果對于可誘導(dǎo)形式的熱激蛋白是特異性的。此外，上皮細(xì)胞以濃度依賴性的方式對LGG-CM作出反應(yīng)，在1∶10的稀釋度觀察到最強(qiáng)的反應(yīng)(圖1B)。在未處理的細(xì)胞(NOTX)(圖1B，第1泳道)中或在與非條件MRs肉湯接觸的細(xì)胞(圖1B，第2泳道)中沒有觀察到熱激反應(yīng)。
和在熱應(yīng)激(所述熱應(yīng)激在大概2小時(shí)內(nèi)在YAMC細(xì)胞中誘導(dǎo)熱激蛋白)的情況下看到的快速反應(yīng)不同，對LGG-CM的反應(yīng)需要顯著更長的時(shí)間。因此，LGG-CM對Hsp的誘導(dǎo)的潛在機(jī)制和熱應(yīng)激的機(jī)制不同。
也確定在短暫地暴露于LGG-CM之后是否能夠啟動(dòng)Hsp的誘導(dǎo)。換句話說，如果在處理過程的早期洗去LGG-CM，問題就是該短暫的暴露是否足以產(chǎn)生對Hsp的誘導(dǎo)，或Hsp誘導(dǎo)是否需要延長對LGG-CM的暴露。將細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)暴露于LGG-CM，洗去LGG-CM，然后照常收獲細(xì)胞并就Hsp的產(chǎn)生對其進(jìn)行分析(圖10A)。即使幾分鐘的暴露時(shí)間也足以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的Hsp誘導(dǎo)反應(yīng)，表明在上皮細(xì)胞中啟動(dòng)誘導(dǎo)熱激蛋白的信號所需的時(shí)間很短。
實(shí)施例3MAP激酶測定法為評估信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與由LGG-CM誘導(dǎo)的Hsp的表達(dá)，進(jìn)行MAP激酶測定法。為進(jìn)行這些測定法，在室溫下在TBS-Tween中的3％重量/體積牛血清白蛋白中封閉PVDF膜1小時(shí)。將一抗加入TBS-Tween并在4℃下溫育過夜。一抗對于MAP激酶或相關(guān)分子的形式中的一種是特異性的，其包括抗p38 MAP激酶(MAPK)抗體(#9212，Cell Signaling，Beverly，MA)、抗磷酸p38 MAPK抗體(#9211S，Cell Signaling)、抗p44/42 MAPK抗體(#9102，Cell Signaling)、抗磷酸p44/42 MAPK抗體(#9101S)、抗SAPK/JNK抗體(#9252，Cell Signaling)、和抗磷酸SAPK/JNK抗體(#9251S，Cell Signaling)。激酶的磷酸化形式表示激活的形式。作為陽性對照，使用37.7μM茴香霉素(Alexis，SanDiego，CA)激活p38和SAPK/JNK，使用100nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA[Sigma，St.Louis，MO])激活ERK1/2。
使用MAP激酶抑制劑的實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了通過MAP激酶測定法獲得的結(jié)果。在MAP激酶抑制劑的研究中，在加入LGG-CM之前，將YAMC細(xì)胞暴露于幾種已知的MAP激酶抑制劑即p38抑制劑SB203580(20μM；Alexis Biochemicals，Carlsbad，CA)、JNK抑制劑SP600125 (20μM；Alexis Biochemicals)或ERK抑制劑PD98059(50μM；AlexisBiochemicals)中的一種，進(jìn)行2小時(shí)。在加入LGG-CM之后，將細(xì)胞溫育15分鐘。然后用新鮮的RPMI更換培養(yǎng)基，4小時(shí)后收獲YAMC細(xì)胞進(jìn)行蛋白印跡分析。
鑒于對LGG-CM的快速反應(yīng)，數(shù)據(jù)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在上皮細(xì)胞中參與建立反應(yīng)一致。為調(diào)查該可能性，用LGG-CM處理細(xì)胞15分鐘，然后進(jìn)行激酶測定法。
已知許多蛋白激酶通過應(yīng)激例如LPS、TNFα、熱、紫外照射、化學(xué)物質(zhì)和滲透壓休克而被激活，這些激酶中的幾種屬于MAP激酶家族(Keyse，Stress Responsemethods and protocols，TotowaHumanaPress，2000)。因此，選擇對該組激酶的效應(yīng)作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活的讀出。即使是在短暫的暴露時(shí)間之后，也可清楚地顯現(xiàn)經(jīng)處理的和未處理的細(xì)胞之間在激酶活化上的差異(圖10B)。單獨(dú)地用LGG-CM預(yù)處理細(xì)胞激活所有被調(diào)查的三種MAP激酶。盡管在YAMC細(xì)胞中存在基線水平的激活的ERK1/2，但由LGG-CM導(dǎo)致的ERK1/2的激活幾乎和由佛波酯PMA導(dǎo)致的激活一樣強(qiáng)烈，而LGG-CM處理導(dǎo)致清晰的但不如使用茴香霉素(一種已知的激活p38和SAP/JNK的有力刺激劑)時(shí)觀察到的那樣顯著的p38和JNK的激活。使用所有被調(diào)查的三種MAP激酶的抑制劑來確定MAP激酶途徑的激活是否是LGG-CM對Hsp的誘導(dǎo)所必需的。在LGG-CM處理之前將YAMC細(xì)胞暴露于p38和JNK的抑制劑導(dǎo)致Hsp72表達(dá)受阻，從而確認(rèn)了在上皮細(xì)胞中，MAP激酶信號傳導(dǎo)途徑在LGG-CM對Hsp的誘導(dǎo)中的作用(圖10C)。
已報(bào)道在應(yīng)激條件下由Hsp72(Hsp70)提供的細(xì)胞保護(hù)作用部分地通過抑制p38和JNK來發(fā)揮作用，這賦予對應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抗性(Gabai等人，J Biol Chem 27218033-18037，1997；Mosser等人，Mol Cell Biol 175317-5327，1997)。然而，此處公開的數(shù)據(jù)確定在LGG-CM處理后觀察到的p38和JNK的激活的抑制不可能是由Hsp72(Hsp70)造成的，因?yàn)樾Ч谌绱硕痰臅r(shí)間內(nèi)發(fā)生，而LGG-CM處理后Hsp的出現(xiàn)需要數(shù)小時(shí)。已顯示JNK的激活在化學(xué)和物理應(yīng)激條件下介導(dǎo)細(xì)胞死亡中起著重要作用，JNK的阻斷提供了對由各種形式的應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抗性(Zanke等人，Curr Biol 6606-613，1996)。對于激酶p38已獲得了相似的觀察資料(Gabai等人，1997)，研究表明p38和JNK都通過共同的與ERK1/2不同的途徑發(fā)揮作用(Liu等人，F(xiàn)ree Radic Biol Med 21771-781，1996)。因此，預(yù)計(jì)LGG-CM中的可溶性因子具有其自身的細(xì)胞保護(hù)性質(zhì)，除了其誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)性Hsp的能力外，所述因子還通過其他的機(jī)制起作用。
和Yan等人，J Biol Chem 27750959-50965，2002報(bào)道的相反，乳桿菌GG確實(shí)產(chǎn)生至少一種可從條件培養(yǎng)基中回收的生物活性因子。生長研究顯示當(dāng)在MRS培養(yǎng)基中生長時(shí)細(xì)菌要花8小時(shí)才能產(chǎn)生這些生物活性因子，而當(dāng)在組織培養(yǎng)基中生長時(shí)，該生物不產(chǎn)生這些生物活性因子。
實(shí)施例4RNA分離和反轉(zhuǎn)錄在冰冷的HBS中洗滌細(xì)胞兩次，然后如上所述收獲細(xì)胞，之后按照廠商說明書加入1.0ml TRIzol_(Invitrogen，Carlsbad，CA)和按每1ml用于均質(zhì)化的TRIzol加入200μL的氯仿(Fisher，F(xiàn)air Lawn，NJ)，將材料在4℃下以14,000xg離心15分鐘。移出水相，使用異丙醇沉淀RNA，然后用75％乙醇洗滌2次。干燥RNA沉淀，將其溶解在不含RNA酶的水中，然后按照廠商說明書使用RNeasy spin柱(QIAGEN，Valencia，CA)進(jìn)一步純化RNA。在1％的瓊脂糖凝膠上和通過280nm和260nm的吸光度分析樣品的完整性。使用SuperScript IIRT(Invitrogen，Carlsbad，CA)合成cDNA。使用3μg總RNA在20μl的總體積(包含下列物質(zhì)1X第一鏈緩沖液、250ng隨機(jī)六核苷酸序列引物、3μg RNA、500μM dNTPs、10mM DTT、40個(gè)單位的無RNA酶的(Rnase out)核糖核酸酶抑制劑，和200個(gè)單位的SuperScriptIIRT)中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在25℃下溫育反應(yīng)混合物15分鐘，然后在42℃下溫育50分鐘，然后在70℃加熱15分鐘使反轉(zhuǎn)錄酶失活。將cDNA用作模板通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。將cDNA模板稀釋至15并在-20℃下貯存直至進(jìn)一步研究。使用異丙醇沉淀RNA，然后用75％的乙醇/DEPC處理的水洗滌2次。在1％的瓊脂糖凝膠上和通過分析在280nm和260nm的UV波長吸光度分析樣品的完整性；然后，如在本領(lǐng)域中已知的，將該比率用于驗(yàn)證RNA的純度。
實(shí)施例5實(shí)時(shí)PCR使用實(shí)時(shí)PCR確定Hsp表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程。使用從Genbank下載的序列設(shè)計(jì)針對小鼠Hsp25和Hsp72編碼區(qū)的引物。使用Primer Express軟件(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)設(shè)計(jì)引物。針對小鼠Hsp25的有義和反義引物是5′-CCA TGT TCG TCC TGC CTT TC-3′(SEQID NO1)和5′-GAG GGC TGC TTC TGA CCT TCT-3′(SEQ ID NO2)；針對小鼠Hsp725′-GGC TGA TCG GAC GGA AGT T-3′(SEQ ID NO3)和5′-GGA ACG GCC AGT GCT TCA T-3′(SEQ ID NO4)；針對小鼠GAPDH5′-GGC AAA TTC AAC GGC ACA GT-3′(SEQ ID NO5)和5′-AGA TGGTGA TGG GCT TCC C-3′(SEQ ID NO6)。在iCycler(Bio-Rad，Hercules，CA)用iQSYBR Green PCR supermix (Bio-Rad，Hercules，CA)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，重復(fù)三次。通過測量由SYBR綠色染料與雙鏈(ds)DNA的結(jié)合產(chǎn)生的熒光的增加來監(jiān)測PCR產(chǎn)物的直接檢測。25μl終體積含有1X SYBR Green PCR supermix 和終濃度為300nM的引物。將3μl稀釋(1∶5)的cDNA加入至23μl的PCR主混合物(master mixture)中。使用下列定量循環(huán)實(shí)驗(yàn)方案在95℃下進(jìn)行4分鐘以活化Taq DNA聚合酶，然后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)在95℃下變性15秒，在60℃下退火-延伸15秒。將閾值循環(huán)參數(shù)(Ct)定義為熒光超過高于基線的固定閾值的循環(huán)分?jǐn)?shù)。通過從平均Hsp 25或Hsp72 Ct值減去平均GAPDH Ct值來確定ΔCt值。ΔΔCt的計(jì)算用于靶的相對定量，而無需在樣品板上運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線。這包括減去任意常數(shù)，這樣ΔΔCt的標(biāo)準(zhǔn)偏差和ΔCt值的標(biāo)準(zhǔn)偏差相同。使用下列公式倍數(shù)變化＝2-ΔΔct來確定YAMC RNA(靶基因)相對于GAPDH內(nèi)源對照的倍數(shù)變化。
使用實(shí)時(shí)PCR，發(fā)現(xiàn)Hsp25和Hsp72的mRNA水平在LGG-CM處理后都增加了，表明LGG-CM對這兩種Hsp的誘導(dǎo)在性質(zhì)上是轉(zhuǎn)錄性的(圖12)。
實(shí)施例6電泳遷移率變動(dòng)檢測法為進(jìn)一步調(diào)查LGG-CM對Hsp的誘導(dǎo)的性質(zhì)，進(jìn)行電泳遷移率變動(dòng)檢測法(EMSA)(圖8)。如上所述用LGG-條件培養(yǎng)基(LLG-CM)或熱激處理細(xì)胞。通過在干冰/乙醇浴中冷凍一次，在冰上融化，用移液器移液頭輕輕地剪切，在4℃下以50,000xg離心5分鐘來在裂解緩沖液(25％體積/體積甘油、420mM NaCl、1.5mM MgCl2、0.2mM EDTA、0.5mMDTT、20mM HEPES，pH 7.4，和完全蛋白酶抑制劑混合物)中制備全細(xì)胞提取物。(參見Mosser等人(1988)，此處引用作為參考)。將10微克全細(xì)胞提取物和γ-32P-ATP標(biāo)記的HSE寡核苷酸(包含熱激元件的4串聯(lián)反向重復(fù)(nGAAn)5′-CTAGAAGCTTCTAGAAGCTTCTAG-3′；SEQ IDNO7)和0.5μg聚(dI-dC)加上20個(gè)單位的T4多核苷酸激酶(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)在1X結(jié)合反應(yīng)緩沖液(終濃度為20mM Tris、pH 7.4，100mM NaCl、1mM EDTA、10％體積/體積甘油)中混合。讓結(jié)合反應(yīng)在37℃下溫育60分鐘，按照廠商說明書使用G50spin柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)將標(biāo)記的寡核苷酸和游離的探針分離。在95℃下進(jìn)行標(biāo)記的寡核苷酸和未標(biāo)記的寡核苷酸鏈的退火5分鐘，然后讓其慢慢冷卻過夜。然后將樣品在0.5X TBE緩沖液中在4％非變性聚丙烯酰胺凝膠上跑膠來進(jìn)行分析。干燥凝膠，并進(jìn)行放射自顯影以檢測DNA-蛋白復(fù)合物。為進(jìn)行超遷移實(shí)驗(yàn)(supershift experiments)，用LGG-CM溫育YAMC細(xì)胞，然后在HSE結(jié)合反應(yīng)前將1μg大鼠單克隆抗HSF-1抗體(SPA 950，Stressgen，Victoria，BC，Canada)、1μg大鼠單克隆抗HSF-2(SPA 960，Stressgen)或1μg兔免疫前血清和細(xì)胞提取物在25℃下預(yù)溫育30分鐘。在該預(yù)溫后，使用本領(lǐng)域已知的或此處描述的標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)和分析。
結(jié)果顯示響應(yīng)LGG-CM的HSF-1的結(jié)合在暴露于LGG-CM的第1個(gè)小時(shí)內(nèi)發(fā)生，表明該誘導(dǎo)在性質(zhì)上是至少部分地轉(zhuǎn)錄性的(圖7)。使用針對HSF-1和HSF-2的抗體的超遷移分析顯示HSF-1是參與的首要轉(zhuǎn)錄因子(圖8)。
實(shí)施例7微陣列分析Hsp是在對LGG-CM暴露起反應(yīng)時(shí)最高度上調(diào)的基因。在已確定LGG-CM處理誘導(dǎo)強(qiáng)烈的熱激蛋白誘導(dǎo)和確定上皮細(xì)胞中LGG-CM對Hsp的誘導(dǎo)的背后機(jī)制在性質(zhì)上至少很大程度是轉(zhuǎn)錄性的之后，通過DNA微陣列分析來確定和其他上皮細(xì)胞基因相比Hsp上調(diào)的幅度。使用2種不同的微陣列芯片(一種包含19,000種鼠基因探針，另一種包含12,000種鼠基因探針)比較經(jīng)LGG-CM處理的和經(jīng)MRS-處理的(模擬處理)的細(xì)胞。
如上所述制備RNA，然后按照廠商說明書使用RNeasy Mini試劑盒(QIAGEN，Valencia，CA)將其接受一步額外的純化步驟。通過在1％的瓊脂糖凝膠上分離來檢查RNA的完整性。只使用具有1.8至2.0的280nm/260nm比的RNA。
一式兩份運(yùn)行含有19,000種鼠基因的Affymetrix微陣列芯片430A；使用含有12,000個(gè)鼠基因的U74Av2芯片(但其使用不同的探針組)確認(rèn)用芯片430A獲得的結(jié)果。使用Affymetrix MicroarraySuite 5.0版本(MAS 5.0)分析數(shù)據(jù)。在各情況下，將LGG處理和模擬處理對照進(jìn)行比較。結(jié)果表示為與對照相比，經(jīng)處理的細(xì)胞的倍數(shù)變化，該倍數(shù)變化通過使用GENESPRING軟件(版本4.2.1，SiliconGenetics，Mountain View，CA)得以計(jì)算。使用D芯片軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。參見Tusher等人(2001)和Li等(2001)?；谙铝虚撝颠x擇差異表達(dá)的基因相對差異大于1.5倍，絕對差異大于100個(gè)信號強(qiáng)度單位并且統(tǒng)計(jì)學(xué)差異p＜0.05。已將來自Affymetrix 430A微陣列芯片的數(shù)據(jù)保藏在可通過互聯(lián)網(wǎng)獲得的Gene ExpressionOmnibus數(shù)據(jù)庫中(參見series登錄，GSE1940)。
根據(jù)散布圖可以看出，響應(yīng)LGG-CM處理，上調(diào)最顯著的基因是熱激蛋白基因(圖9)。為確認(rèn)這些發(fā)現(xiàn)，使用另一含有12,000個(gè)鼠基因和使用不同探針組的基因芯片，再次發(fā)現(xiàn)Hsp是在對LGG-CM處理的反應(yīng)中上調(diào)最高的基因。下面的表6中提供了前10位上調(diào)的基因。
表1中列出了24個(gè)這樣的基因，所述基因在芯片430A和芯片U74Av2上都表現(xiàn)出LGG-CM處理細(xì)胞與對照之間的變化大于2倍。列于表1和列于之前段落中的對應(yīng)于GenBank目錄號的所有序列在此引用作為參考。
芯片探針組 基因 GenBank 倍數(shù)變化Accession430A1416041_at 血清/糖皮質(zhì)激素NM_011361 4.15調(diào)節(jié)的激酶U74Av2 97890_at血清/糖皮質(zhì)激素AW046181 3.48調(diào)節(jié)的激酶430A1416855_at 生長停滯特異性1NM_008086 -2.69430A1448494_at 生長停滯特異性1BB550400 -2.33U74Av2 94813_at生長停滯特異性1X65128-3.06430A1417516_at DNA-損傷可誘導(dǎo)的 NM_007837 4.04轉(zhuǎn)錄物3U74Av2 101429_at DNA-損傷可誘導(dǎo)的 X6708310.55轉(zhuǎn)錄物3430A1453851_a_at生長停滯和DNA- AK007410 2.45損傷可誘導(dǎo)的45γU74Av2 101979_at 生長停滯和DNA- AF055638 2.73損傷可誘導(dǎo)的45γ430A1448830_at 雙重特異性磷酸酶1 NM_013642 3.34U74Av2 104598_at 雙重特異性磷酸酶1 X619403.01430A1418930_at 趨化因子(C-X-C基序)NM_021274 2.47配體10U74Av2 93858_at趨化因子(C-X-C基序)M332664.72配體10430A1449363_at 活化轉(zhuǎn)錄因子3 BC019946 3.76U74Av2 104155_f_at 活化轉(zhuǎn)錄因子3 U191185.76
芯片探針組 基因 GenBank 倍數(shù)變化Accession430A1419149_at 絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶 NM_008871 3.15抑制劑，進(jìn)化支E，成員1U74Av2 94147_at絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶 M339602.43抑制劑，進(jìn)化支E，成員1430A1419291_x_at生長停滯特異性5 NM_013525 2.44U74Av2 98531_g_at 生長停滯特異性5 AI849615 2.61430A1449519_at 生長停滯和DNA- NM_007836 3.28損傷可誘導(dǎo)的45αU74Av2 102292_at 生長停滯和DNA- U009374.09損傷可誘導(dǎo)的45α430A1419665_a_at核蛋白1 NM_019738 3.36430A1419666_x_at核蛋白1 NM_019738 2.79U74Av2 160108_at 核蛋白1 AI852641 5.8430A1422557_s_at金屬硫蛋白1 NM_013602 -2.15U74Av2 93573_at金屬硫蛋白1 V008352.53430A1422990_at met原癌基因 NM_008591 -3.43U74Av2 100309_at met原癌基因 Y00671-2.68430A1423062_at 胰島素樣生長因子 AV175389 -2.35結(jié)合蛋白3U74Av2 95082_at胰島素樣生長因子 AI842277 -3.74結(jié)合蛋白3430A1423100_at FBJ骨肉瘤癌基因 AV026617 2.96U74Av2 160901_at FBJ骨肉瘤癌基因 V007274.54430A1451313_a_atRIKEN cDNA 1110067D22BC019131 2.32基因U74Av2 160704_at RIKEN cDNA 1110067D22AW121603 2.17基因430A1426559_at cDNA 序列 BC021875 BG065326 2.59U74Av2 104106_at cDNA 序列 BC021875 AI837830 -5.64430A1427585_at 小鼠DNA胞嘧啶AF071754 25.2甲基轉(zhuǎn)移酶mRNAU74Av2 95396_at小鼠DNA胞嘧啶AF071754 5.86甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA430A1428529_at RIKEN cDNA 2810026P18AK012825 2.18基因U74Av2 104089_at RIKEN cDNA 2810026P18AW045664 3.01
芯片 探針組 基因 GenBank 倍數(shù)變化Accession基因430A 1430271_x_al RIKEN cDNA 4930553M18AA672926 2.07基因U74Av2104640_f_at RIKEN cDNA 4930553M18AI464596 2.1基因430A 1436549_a_at 異源核 BE685966 2.17核糖核蛋白A1U74Av292724_at 異源核 AI183202 2.08核糖核蛋白A1430A 1436791_at 無翼相關(guān)的MMTV BB067079 -2.61整合位點(diǎn)5AU74Av299390_at 無翼相關(guān)的MMTV M89798-2.16整合位點(diǎn)5A430A 1455904_at 生長停滯特異性5 BI650268 2.66U74AV298531_g_at 生長停滯特異性5 AI849615 2.61430A 1449773_S_at 生長停滯和DNA- AI323528 2.41損傷可誘導(dǎo)的45βU74Av2161666_f_at 生長停滯和DNA- AV138783 2.52損傷可誘導(dǎo)的45β表1在表2至表5中顯示芯片430A和芯片u74AV2之間的4個(gè)常見基因本體(ontology)組。只顯示在LGG-CM處理細(xì)胞和對照之間表現(xiàn)大于2倍變化的基因。表2至5中所列的對應(yīng)于Genbank目錄號的所有序列在此引用作為參考。
芯片 探針組 基因GenBank 倍數(shù)變化Accession430A1416855_at生長停滯特異性1 NM_008086 -2.691448494_at生長停滯特異性1 BB550400-2.331417516_atDNA-損傷可誘導(dǎo)的 NM_007837 4.04轉(zhuǎn)錄物31418936_atv-maf肌腱膜 BC0229522.27纖維肉瘤癌基因家族，蛋白F(鳥)1419291_x_at 生長停滯特異性5 NM_013525 2.441449519_at生長停滯和DNA-NM_007836 3.28損傷可誘導(dǎo)的45α1450016_at細(xì)胞周期蛋白G1NM_009831 -2.651450017_at細(xì)胞周期蛋白G1BG065754-2.351421679_a_at 細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶NM_007669 -2.15抑制劑1A(P21)
1450533_a_at 多形腺瘤基因樣1 NM_009538 -3.051422990_at met原癌基因 NM_008591 -3.431423100_at FBJ骨肉瘤癌基因 AV026617 2.961426208_x_at 多形腺瘤基因樣1 AF147785 -2.221455904_at 生長停滯特異性5 BI650268 2.66U74Av2 94813_at 生長停滯特異性1 X65128 -3.0698531_g_at 生長停滯特異性5 AI849615 2.61103048_at 成神經(jīng)細(xì)胞瘤myc-相關(guān)的M12731 -2.09癌基因194338_g_at 生長停滯特異性2 M21828 3.23101429_at DNA-損傷可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物3 X67083 10.55102292_at 生長停滯和DNA-U00937 4.09損傷可誘導(dǎo)的45α92502_at 凋亡和細(xì)胞周期停滯的 X95504 -2.56鋅指蛋白調(diào)節(jié)劑95348_at 趨化因子(C-X-C基序)配體1 J04596 -2.61100309_at met原癌基因 Y00671 -2.68160901_at FBJ骨肉瘤癌基因 V00727 4.54表2.細(xì)胞周期調(diào)控基因。對于430A芯片，在125-組(全部212/13281，p值0.000000)中發(fā)現(xiàn)14個(gè)基因本體“細(xì)胞周期調(diào)控”基因。對于U74Av2芯片，在96-組(全部146/6741，p值0.000038)中發(fā)現(xiàn)10個(gè)基因本體“細(xì)胞周期調(diào)控”基因。
芯片探針組基因GenBank倍數(shù)變化Accession430A1416120_at核糖核苷酸還原酶M2 BF119714-2.311448458_at拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNA)IIβ BB166592-2.41416855_at生長停滯特異性1 NM_008086 -2.691448494_at生長停滯特異性1 BB550400-2.331417516_atDNA-損傷可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物3 NM_007837 4.041448830_at雙重特異性磷酸酶1 NM_013642 3.341418936_atv-maf肌腱膜 BC0229522.27纖維肉瘤癌基因家族，蛋白F(鳥)1419291_x_at 生長停滯特異性5 NM_013525 2.441449519_at生長停滯和DNA- NM_007836 3.28損傷可誘導(dǎo)的45α1450016_at細(xì)胞周期蛋白G1 NM_009831 -2.651450017_at細(xì)胞周期蛋白G1 BG065754-2.351421679_a_at 細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 NM_007669 -2.15抑制劑1A(P21)1450533_a_at 多形腺瘤基因樣1 NM_009538 -3.05
芯片探針組 基因 GenBank倍數(shù)變化Accession1422990_at met原癌基因 NM_008591 -3.431423100_at FBJ骨肉瘤癌基因 AV0266172.961426208_x_at多形腺瘤基因樣1 AF147785-2.221434496_at 細(xì)胞因子可誘導(dǎo)的激酶 BM9478552.61455904_at 生長停滯特異性5 BI6502682.66U74Av2 94813_at生長停滯特異性1 X65128 -3.0698531_g_at 生長停滯特異性5 AI8496152.61103048_at 成神經(jīng)細(xì)胞瘤myc-相關(guān)的 M12731 -2.09癌基因1104598_at 雙重特異性磷酸酶1X61940 3.0194338_g_at 生長停滯特異性2 M21828 3.23101429_at DNA-損傷可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物3 X67083 10.55101930_at 核因子I/XY07688 -2.4102292_at 生長停滯和DNA- U00937 4.09損傷可誘導(dǎo)的45α92502_at凋亡和細(xì)胞周期停滯的 X95504 -2.56鋅指蛋白調(diào)節(jié)劑95348_at趨化因子(C-X-C基序)配體1 J04596 -2.61100309_amet原癌基因 Y00671 -2.68101180_at 共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥 U43678 -2.49突變的同源物(人)160859_s_at 核因平I/BY07685 -2.27160901_at FBJ骨肉瘤癌基因 V00727 4.54表3.細(xì)胞周期基因。對于430A芯片，在125-組(全部465/13281，p值0.000000)中發(fā)現(xiàn)18個(gè)基因本體“細(xì)胞周期”基因。對于U74Av2芯片，在96-組(全部326/6741，p值0.000188)中發(fā)現(xiàn)14個(gè)基因本體“細(xì)胞周期”基因。
芯片探針組 基因 GenBank 倍數(shù)變化Accession430A1416855_at 生長停滯特異性1NM_008086 -2.691448494_at 生長停滯特異性1BB550400 -2.331417516_at DNA-損傷可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物3NM_007837 4.041419291_x_at生長停滯特異性5NM_013525 2.441449519_at 生長停滯和DNA- NM_007836 3.28損傷可誘導(dǎo)的45α1421679_a_at細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 NM_007669 -2.15抑制劑1A(P21)1455904_at 生長停滯特異性5BI650268 2.66U74Av2 94813_at生長停滯特異性1X65128 -3.0698531_g_at 生長停滯特異性5AI849615 2.6194338_g_at 生長停滯特異性2M21828 3.23101429_at DNA-損傷可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物3X67083 10.55
102292_at生長停滯和DNA-U009374.09損傷可誘導(dǎo)的45α表4.細(xì)胞周期停滯基因。對于430A芯片，在125-組(全部26/13281，p值0.000000)中發(fā)現(xiàn)7個(gè)基因本體“細(xì)胞周期停滯”基因。對于U74Av2芯片，在96-組(全部22/6741，p值0.000011)中發(fā)現(xiàn)5個(gè)基因本體“細(xì)胞周期停滯”基因。
芯片探針組 基因 GenBank 倍數(shù)變化Accession430A1453851_a_at生長停滯和DNA-AK0074102.45損傷可誘導(dǎo)的45γ1449519_at 生長停滯和DNA-NM_007836 3.28損傷可誘導(dǎo)的45α1449773_s_at生長停滯和DNA-AI3235282.41損傷可誘導(dǎo)的45βU74Av2 101979_at 生長停滯和DNA-AF0556382.73損傷可誘導(dǎo)的45γ102292_at 生長停滯和DNA-U00937 4.09損傷可誘導(dǎo)的45α161666_f_at 生長停滯和DNA-AV1387832.52損傷可誘導(dǎo)的45β表5.核糖體蛋白L7Ae/L30e/Gadd45基因。對于430A芯片，在118-組(全部14/13714，p值0.000211)中發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因本體“核糖體蛋白L7Ae/L30e/S12e/Gadd45”基因。對于U74Av2芯片，在99-組(全部77/7501，p值0.000075)中發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因本體“核糖體蛋白L7Ae/L30e/S12e/Gadd45”基因。
對于這些微陣列研究，使用Tusher等人(2001)和Li等人(2001)(兩者都在此引用作為參考)中描述的“D芯片”和“Sam”軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
表6.
實(shí)施例851鉻釋放測定法LGG-CM也保護(hù)上皮細(xì)胞免受氧化劑的損傷。鑒于LGG-CM上調(diào)可誘導(dǎo)的Hsp，采取功能測定法以確定熱激誘導(dǎo)是否促成對抗氧化劑損傷的保護(hù)作用。當(dāng)從先天免疫細(xì)胞釋放出來的次氯酸和氨反應(yīng)時(shí)，通常產(chǎn)生氧化劑單氯胺，該氧化劑通過造成細(xì)胞骨架的崩潰、削弱的膜運(yùn)輸、緊密屏障功能的喪失和最終細(xì)胞的死亡來影響上皮細(xì)胞(Grisham等人，Inflammation 14531-542，1990；Musch等人，AmJ Physiol 270C429-436，1996；Musch等人，Gastroenterology 117115-122，1999)。研究已顯示可誘導(dǎo)的Hsp提供在腸道上皮細(xì)胞中對抗由單氯胺產(chǎn)生的氧化劑應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)作用(Musch等人，1996；Musch等人，1999)。
將YAMC細(xì)胞培養(yǎng)在24孔板中，不用LGG-CM處理(對照)或用LGG-CM處理1小時(shí)，然后更換培養(yǎng)基，將細(xì)胞在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中放置過夜。然后用51Cr (50μCi/ml；Sigma Chemical Co.)裝載細(xì)胞，進(jìn)行60分鐘，洗滌細(xì)胞，并在含有0.6mM的氧化劑單氯胺的培養(yǎng)基中溫育以誘發(fā)細(xì)胞損傷。60分鐘后，收獲培養(yǎng)基，用1N HNO3提取細(xì)胞中保留的51Cr，進(jìn)行4小時(shí)。通過液體閃爍光譜學(xué)對釋放級分和細(xì)胞級分中的51Cr進(jìn)行計(jì)數(shù)。通過將釋放的量除以釋放的量和細(xì)胞內(nèi)保留量的總和來計(jì)算釋放的51Cr。匯集數(shù)據(jù)并使用Instat軟件(Graphpad，San Diego，CA)進(jìn)行分析，使用成對Student’s T檢驗(yàn)來進(jìn)行比較。
使用LGG-CM預(yù)處理上皮細(xì)胞提供了統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著意義的對抗氧化劑損傷的保護(hù)作用，其通過在面臨來自單氯胺的氧化劑損傷時(shí)提高上皮細(xì)胞的存活力來提供，這一點(diǎn)已通過鉻釋放測定法得以證明(圖11A)。
實(shí)施例9G/F肌動(dòng)蛋白測定法用F/G肌動(dòng)蛋白測定法進(jìn)一步研究了LGG-CM在上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)性作用的能力，該測定法是另一種對LGG-CM處理保護(hù)上皮細(xì)胞免受氧化劑應(yīng)激傷害的能力的功能性讀出，該測定法更特異性地評估抗細(xì)胞骨架破壞的保護(hù)作用(圖11B)。
將匯合的YAMC細(xì)胞單層轉(zhuǎn)換至37℃下的不含IFN-γ培養(yǎng)基中，用LGG-CM處理1小時(shí)，之后更換培養(yǎng)基，或不作處理(對照)。將細(xì)胞放置過夜，然后用氧化劑單氯胺(0.6mM進(jìn)行30分鐘)處理以誘發(fā)細(xì)胞損傷(Musch等人，1996；Musch等人，1999)。在PBS中漂洗細(xì)胞，收獲細(xì)胞，離心(在室溫下在14,000xg下進(jìn)行20秒)，將沉淀重懸浮于200μl、30℃的裂解緩沖液(1mM ATP、50mM PIPES，pH 6.9，50mMNaCl、5mM MgCl2、5mM EGTA、5％(體積/體積)甘油、0.1％(體積/體積)Nonidet P-40、Tween 20和Triton X-100，含有完全蛋白酶抑制劑混合物)。通過輕輕地用移液器上下吹打10次均質(zhì)化細(xì)胞，然后在30℃下溫育10分鐘，將其在100,000xg下離心60分鐘(30℃)。取出上清液以測定G肌動(dòng)蛋白，將沉淀(包含F(xiàn)肌動(dòng)蛋白)重懸浮于200μl4℃的含有1μM細(xì)胞松弛素D的蒸餾水中并在冰上放置60分鐘。該處理使F肌動(dòng)蛋白級分解聚，這樣在隨后的蛋白印跡分析中只觀察到45kDa的單體形式。然后，取出20μl各提取物，加入Laemmli終止液并將樣品加熱至65℃進(jìn)行10分鐘。通過SDS-PAGE將樣品在12.5％的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分離并立即轉(zhuǎn)移至PVDF膜(更詳細(xì)內(nèi)容參見關(guān)于蛋白印跡分析的部分)。轉(zhuǎn)移后，使用多克隆抗肌動(dòng)蛋白抗體(Cytoskeleton，Denver，CO)進(jìn)行肌動(dòng)蛋白的免疫印跡分析。
如所預(yù)期的，未經(jīng)處理的對照(C)顯示F肌動(dòng)蛋白多于G肌動(dòng)蛋白，單獨(dú)用LGG預(yù)處理不改變該比例。用單氯胺(NH2Cl)處理細(xì)胞產(chǎn)生了從肌動(dòng)蛋白的纖絲狀(F)至球狀(G)形式的轉(zhuǎn)變，因?yàn)槠淦茐牧思?dòng)蛋白細(xì)胞骨架的完整性。在單氯胺暴露之前用LGG-CM進(jìn)行處理導(dǎo)致F肌動(dòng)蛋白的保留和對抗單氯胺誘導(dǎo)的對肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的破壞的部分保護(hù)作用(最后兩個(gè)泳道，和經(jīng)NH2Cl處理的泳道相比)。
實(shí)施例10具有生物活性的益生劑的性質(zhì)LGG-CM的主要生物學(xué)活性似乎存在于低于10kDa的化合物中。如圖3中所示，主要的活性，如通過誘導(dǎo)Hsp25的能力所測量的，存在于通過具有10kDa分子量截止值的Centricon過濾器制備的濾出液(F)中。(也參見圖12B)。將細(xì)胞和過濾截留物質(zhì)接觸不誘導(dǎo)Hsp25的表達(dá)。此外，濾出液和截留物質(zhì)(R+F)的組合不增強(qiáng)活性。然而，更大分子量的多聚體組分對于活性可能是需要的。
LGG-CM的生物學(xué)活性的其他性質(zhì)是其在熱或酸存在的情況下的穩(wěn)定性。如圖4(第2泳道)中所示，LGG-CM在煮沸20分鐘后仍保持其生物學(xué)活性。同樣如圖4中(第3泳道)所示，LGG-CM在酸性pH下最具活性。應(yīng)當(dāng)指出，圖4中標(biāo)示的pH(pH4)是條件培養(yǎng)基的pH。當(dāng)被加入至YAMC細(xì)胞的浸浴培養(yǎng)基時(shí)，產(chǎn)生1∶10的稀釋度，終pH在6.5至6.9之間，接近在腸上皮細(xì)胞的頂膜的酸性微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的pH。當(dāng)將條件培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至7.0時(shí)，生物學(xué)活性喪失(第4泳道)。當(dāng)將pH調(diào)節(jié)至4.0時(shí)，活性未恢復(fù)(第5泳道)，這表明活性化合物在近中性pH時(shí)不穩(wěn)定，盡管在中性pH時(shí)活性的喪失并不是絕對不可逆的。如果讓條件培養(yǎng)基在pH 4.0下“恢復(fù)”2天，活性部分恢復(fù)，表明該作用不是完全不可逆轉(zhuǎn)的，對近中性pH的暴露可能涉及活性化合物的可逆的、部分的解折疊或變性。
使用蛋白水解酶-胃蛋白酶，使LGG生物活性化合物失活。在使用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方案用胃蛋白酶進(jìn)行處理后，將反應(yīng)混合物通過10kDa分篩柱進(jìn)行過濾以除去任何殘留的胃蛋白酶。在該情況下使用胃蛋白酶是因?yàn)槠浠钚?和其他蛋白酶相反)在酸性pH下是最佳的。如圖5中所示，對LGG-條件培養(yǎng)基的胃蛋白酶處理顯著地降低了生物學(xué)活性(比較泳道2和3)，如通過Hsp25和Hsp72的誘導(dǎo)所評估的。(也參見圖12A)。平行地進(jìn)行的未過濾的對照實(shí)驗(yàn)確定胃蛋白酶自身不直接影響Hsp的表達(dá)。(參見圖12A的泳道5、6和7)。這些作用是特異性的，因?yàn)闆]有在組成型Hsp同源物Hsc73中觀察到變化。
然后將LGG-CM接受選擇性超濾以確定活性因子的分子質(zhì)量。之后使用濾出液(包含小于10kDa的分子)和截留物質(zhì)(包含大于10kDa的分子)或兩者一起處理YAMC細(xì)胞并制備Hsp25和Hsp72的免疫印跡。只有濾出液(泳道3)或一起施用的兩個(gè)級分(泳道4，R+F)在YAMC細(xì)胞中誘導(dǎo)Hsp表達(dá)，這表明所述生物活性因子是小于即10kDa的小分子質(zhì)量的蛋白或肽。對活性肽的進(jìn)一步表征顯示其是熱穩(wěn)定的，即使在煮沸后仍然保持活性(圖12C，比較泳道2和3)。
使用還原劑二硫蘇糖醇(DTT)處理LGG-CM導(dǎo)致生物學(xué)活性的喪失，由蛋白印跡分析顯示的可誘導(dǎo)的Hsp25和Hsp72的表達(dá)喪失闡明了這一點(diǎn)(圖6)。這些數(shù)據(jù)表明所述活性化合物是這樣的蛋白，所述蛋白可能含有半胱氨酸殘基并且二硫鍵可能在維持該生物活性因子的二級結(jié)構(gòu)上起著極重要的作用。
對所述活性肽的表征顯示其在低pH下也是穩(wěn)定的。為確定其在各種pH下的穩(wěn)定性，改變LGG-CM的pH(圖13)。在7.0中性pH下，如果立即使用LGG-CM處理細(xì)胞，其活性消失(圖13A)，但如果將其返回至pH 4.0并讓其平衡過夜，則其可能重新產(chǎn)生其誘導(dǎo)Hsp的能力(圖13B)。這表明該肽在pH 7.0是不穩(wěn)定的，但該不穩(wěn)定性不是該肽的不可逆變性的結(jié)果，因?yàn)閷GG-CM返回pH 4.0導(dǎo)致生物學(xué)活性的至少部分恢復(fù)(圖13B)。
根據(jù)本公開內(nèi)容可制備和執(zhí)行此處公開的和要求保護(hù)的所有組合物和方法而無需過多的實(shí)驗(yàn)。盡管已根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案描述了本發(fā)明的組合物和方法，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，可對所述組合物和方法以及在此處描述的方法的步驟或步驟的順序進(jìn)行改變而不背離本發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍。更明確地，很顯然的是，可用某些在化學(xué)和生理學(xué)上都相關(guān)的試劑替代此處描述的試劑而獲得相同或類似的結(jié)果。如按照所附權(quán)利要求所定義的，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯然的所有這些類似的替代物和改變都被認(rèn)為在本發(fā)明的精神、范圍和構(gòu)思之內(nèi)。
參考文獻(xiàn)下面的文獻(xiàn)在此明確引用作為參考，其程度為它們提供示例性的方法或?qū)@里公開的內(nèi)容進(jìn)行補(bǔ)充的其它細(xì)節(jié)內(nèi)容。
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序列表<110>Chang，et al.
<120>來自乳桿菌GG的益生化合物及其用途<130>27373/40049A<150>US 60/564,049<151>2004-04-20<160>7<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>1ccatgttcgt cctgcctttc 20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>2gagggctgct tctgaccttc t21<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>3ggctgatcgg acggaagtt 19<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>4ggaacggcca gtgcttcat 19
<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>5ggcaaattca acggcacagt 20<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>6agatggtgat gggcttccc 19<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>7ctagaagctt ctagaagctt ctag 2權(quán)利要求
1.包含分離的來源于乳桿菌GG的細(xì)胞保護(hù)性化合物的組合物。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述細(xì)胞保護(hù)性化合物來源于乳桿菌GG-條件培養(yǎng)基。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述細(xì)胞保護(hù)性化合物保護(hù)上皮細(xì)胞對抗選自熱和氧化的應(yīng)激。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述化合物誘導(dǎo)至少一種熱激蛋白的表達(dá)。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述熱激蛋白選自Hsp25和Hsp72。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述細(xì)胞保護(hù)性化合物是蛋白。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述蛋白是熱穩(wěn)定的、酸穩(wěn)定的或具有小于10kDa的分子量。
8.包含由下列性質(zhì)表征的蛋白的分離的細(xì)胞保護(hù)性化合物，所述性質(zhì)是(a)從乳桿菌GG分離的能力；(b)在腸上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)Hsp25和Hsp72的表達(dá)的能力；(c)小于10kDa的分子量；(d)酸穩(wěn)定性；和(e)熱穩(wěn)定性。
9.用于治療患有炎性病癥的受治療者的方法，其包括給患者施用治療有效劑量的分離的來源于乳桿菌GG-條件培養(yǎng)基的細(xì)胞保護(hù)性化合物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述受治療者是人患者。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述炎性病癥是炎性腸病。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述炎性腸病選自克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述化合物誘導(dǎo)至少一種熱激蛋白的表達(dá)。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述熱激蛋白選自Hsp25和Hsp72。
15.在細(xì)胞中誘導(dǎo)Hsp25和Hsp72中至少一種的表達(dá)的方法，其包括將所述細(xì)胞與分離的來源于乳桿菌GG的細(xì)胞保護(hù)性化合物接觸。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述細(xì)胞保護(hù)性化合物存在于乳桿菌GG-條件培養(yǎng)基中。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述細(xì)胞是腸上皮細(xì)胞。
18.一種藥物組合物，其包含分離的來源于乳桿菌GG-條件培養(yǎng)基的細(xì)胞保護(hù)性化合物和至少一種藥物可接受賦形劑。
19.權(quán)利要求18的藥物組合物，其中所述化合物誘導(dǎo)至少一種熱激蛋白的表達(dá)。
20.權(quán)利要求18的藥物組合物，其中所述熱激蛋白選自Hsp25和Hsp72。
21.生產(chǎn)分離的細(xì)胞保護(hù)性化合物的方法，其包括(a)獲得乳桿菌GG；和(b)從乳桿菌GG分離細(xì)胞保護(hù)性化合物。
22.權(quán)利要求21的方法，其還包括培養(yǎng)乳桿菌GG至少8小時(shí)。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述細(xì)胞保護(hù)性化合物是蛋白。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述蛋白是熱穩(wěn)定的、酸穩(wěn)定的或具有小于10kDa的分子量。
25.用于改善炎性病癥的癥狀的方法，其包括給受治療者施用治療有效劑量的權(quán)利要求18的藥物組合物。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述受治療者是人。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述炎性病癥是炎性腸病。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述炎性腸病選自克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。
29.權(quán)利要求1的組合物，其中所述化合物在上皮細(xì)胞中激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致選自Hsp25和Hsp72的熱激蛋白的表達(dá)。
30.權(quán)利要求29的組合物，其中所述激活由熱激因子-1(HSF-1)介導(dǎo)。
31.權(quán)利要求29的組合物，其中所述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包含選自MAP激酶、SAP激酶、ERK1和ERK2的激酶。
32.權(quán)利要求31的組合物，其中所述途徑的激活包括選自MAP激酶、SAP激酶、ERK1和ERK2的激酶的激活。
33.在上皮細(xì)胞中激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的方法，其包括將所述細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求29的化合物接觸。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包含選自MAP激酶、SAP激酶、ERK1和ERK2的激酶。
35.預(yù)防對細(xì)胞的氧化劑損傷的方法，包括對上皮細(xì)胞施用有效量的權(quán)利要求1的化合物。
36.穩(wěn)定細(xì)胞骨架的方法，包括對上皮細(xì)胞施用有效量的權(quán)利要求1的化合物。
37.預(yù)防炎性病癥的方法，包括給受治療者施用治療有效劑量的權(quán)利要求18的藥物組合物。
38.藥盒，其包含權(quán)利要求18的藥物組合物和向受治療者施用所述組合物的方案。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于治療炎性病癥例如炎性腸病(IBD)的方法和組合物。使用不含細(xì)菌的、從益生菌衍生的化合物而不用活細(xì)菌提供了優(yōu)于使用活細(xì)菌的安全性優(yōu)點(diǎn)。此外，已顯示分離的化合物的臨床功效比益生菌更一致，后者依賴于建立和維持細(xì)菌定殖的能力。
文檔編號A61K35/74GK1997748SQ200580019583
公開日2007年7月11日 申請日期2005年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月20日
發(fā)明者E·B·常, E·O·彭托夫 申請人:芝加哥大學(xué)