專利名稱：脫脂治療性疫苗及其使用方法
技術領域：
本發明涉及一種治療性疫苗及一種預防性疫苗，一種制造治療性疫苗的方法和一種制造預防性疫苗的方法，一種治療受到含脂傳染性生物體感染的人或動物，一種在治療含脂傳染性生物體所致感染的方法中使用的物質或組合物，一種用于對人或動物接種抵抗含脂傳染性生物體所致感染的物質或組合物，一種在制造用于治療含脂傳染性生物體所致感染的藥物時一種物質或組合物的用途，以及一種在制造用于作為疫苗治療或預防含脂傳染性生物體所致感染的藥物時一種物質或組合物的用途。
背景技術：
熱帶非洲被認為是艾滋病(HIV/AIDS)、瘧疾、絲蟲病、結核以及其它無數種慢性熱帶及寄生性傳染病的故鄉。出現的問題是，為什么這些傳染病是慢性的，以及為什么受感染的人的免疫系統對它們不能有效應對。
在整個人類的歷史中，傳染性疾病已經導致人類承受巨大、長期的痛苦和死亡。某些感染原從開始就導致慢性感染。由它們所致的人類疾病包括例如結核、麻風病、身體不同部位的真菌病、瘧疾、導致“河盲癥”的盤尾絲蟲和微絲蚴。病毒包括有名的人類免疫缺陷病毒(HIV)、人類T-淋巴白血病病毒(HLTV1)、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、單純皰疹病毒、巨細胞病毒(CMV)、引起巴克氏淋巴瘤(Burkitt′s Lymphoma)的人皰疹IV型病毒(Epstein-Barr virus，EBV)以及引起淋巴瘤和其它惡性腫瘤疾病的其它病毒。
不同的動物物種具有相同或近似的可致其慢性感染和腫瘤的微生物和病毒，例如，牛結核病、逆轉錄酶病毒例如猴免疫缺損病毒(SIV)、綿羊“搔癢癥”或雞、鼠、貓和牛的惡性腫瘤。這個列表并非人類或動物疾病的全部。
以下，術語“微生物”應理解為包括影響人類和動物的細菌、真菌以及寄生蟲，但不包括病毒。
不受理論的限制，以下將作為理解本發明的基礎。大多數導致人類慢性感染的微生物必須從外界侵入人體。侵入機體之前，它們全部在地球環境中已經單獨并獨立存在和進化了數百萬年。在從一個人傳播到另一個人的過程中，這些微生物通常不得不在獲得新宿主之前再次作為獨立個體在外界環境中至少生存一個短暫的時期。因此，它們在進化的某些時間點上要全部暴露并生存在外界環境中。
這些微生物所暴露的地球環境，在某些方面對所有形式的生命都是不利的，因為作為我們環境恒久不變的一部分的陽光會使所有暴露在其中有的生物脫水。具體地說，陽光對微生物不利，因為這種生物體中極小量的機體水分很容易脫水而流失，而這會導致生物體的死亡。因此，設法在陽光下地球環境中生存下來的微生物是已經獲得了將水分保持和留存在其內能力的突變體。
脂質和類脂物質對脫水相對具有抵抗力，大多數暴露在太陽光線或熱中的生物表面上具有脂質物質，以減少水分流失。因此，在地球環境中作為獨立個體生存的微生物是獲得了用于阻止或減少水分從其表面流失的脂質覆蓋物的突變體。微生物脂質覆蓋物的數量顯然決定其在外界環境中的生存能力。具有厚脂質覆蓋物的微生物可以比那些具有薄脂質覆蓋物的微生物更好地存活，大多數作為獨立個體的微生物在地球環境中生存的不同能力與其脂質覆蓋物的厚度不同有關。例如，結核桿菌可以在塵埃中存活大約一年，其公知具有非常厚的脂質層。這種特性可以用齊耳-納耳遜二氏(Zeihl Nilsson)染色法清楚地說明。
防止水分從微生物流失的保護性脂質層覆蓋，在某些方式中最終隱藏，賦予有關微生物特性、特征或唯一性的真正抗原。當來自任何來源的真正的、可辨的抗原得以進入機體，作為第一道防線，自然殺傷細胞通常產生可以立即破壞它們的細胞因子。作為第二道防線，機體的長期免疫反應(通過抗體和細胞介導免疫反應)將決定這些真正抗原是否繼續留在體內。
在正常的感染中，當具有脂質覆蓋物的微生物侵入機體時，因為難以接近脂質層下的真正抗原，針對該微生物的由細胞因子做出的迅速反應，以及長期、有效的免疫反應，不會出現或出現很少。相反，由微生物表面的脂質層激發的免疫反應不涉及下面的真正抗原，不會真正影響到它們。因此，微生物作為慢性感染存活在體內。通過用脂質層掩蓋真正抗原，微生物因此可以留存其機體水分并確保它們首先存活在外界環境中，然后逃過機體的免疫反應，從而作為慢性或反復感染而持續。
微生物的脂質層可以在體外以脂質溶劑，例如氯仿或醚剝離，以暴露其真正抗原。脂質溶劑的作用時間依賴于欲除去的脂質層的數量和性質。一旦暴露，微生物的真正抗原可以作為一種疫苗重新注射到未受感染的機體中。它們會引起體內具有細胞因子的自然殺滅細胞的迅速反應和隨后具有抗體的長期免疫反應。當此后感染中面臨相同的微生物時，這些細胞因子和免疫反應會穿透脂質層，并破壞下面的真正抗原。通過這種方式，保護接種機體不會感染微生物。
試驗表明，對用于未受感染的機體獲得完全免疫保護的預防性疫苗來說，需要·疫苗暴露與有關微生物相關的真正抗原，并且免疫系統可以接近這些真正抗原；·待接種的人具有正常的免疫系統；以及·待接種機體的血清中沒有已有感染或有關微生物的抗體。
因為有關微生物的真正抗原從未暴露給免疫系統，人體內沒有針對真正抗原的抗體，所以已形成的感染可能會持續或反復。在這種情況下，疫苗上所暴露的真正抗原會激發細胞因子和物質迅速產生，其穿透傳染性微生物并在其脂質覆蓋物下將其殺滅。產生的細胞因子總量和殺滅的微生物數量取決于疫苗的使用量和可用的自然殺滅細胞的數量。此外，疫苗的真正抗原會激發首次免疫反應，其會加強和消除微生物。在合適的時間間隔中將足夠數量的這種疫苗直接注射到受感染人體中，可以作為治療性疫苗使用。
然而，在所有的慢性感染中，可證實的微生物抗體通常會出現在受感染機體中。盡管有這些抗體，持續感染仍是它們不相關或無力的證據。此外，這種抗體可以使任何直接引入受感染機體中與微生物相關的疫苗固定不動。在這種情況下，必須實施一種免疫療法的方式，激發新的有效免疫反應，其可以徹底破壞并防止被相同微生物進一步感染。
發明內容
本發明提供一種由現癥感染的微生物制備的新型疫苗，其通過用脂質溶劑除去其脂質層暴露其真正抗原而制得。利用正常免疫系統，其可以在受感染人體條件下體外人工繁殖，其與那些正常未受感染人的預防性接種類似。
根據本發明的方法，將取自受感染人具有正常免疫細胞的外周血白細胞洗滌至不含所有抗體。洗滌過的白細胞包含對現癥感染不定型并與新抗原自由反應的正常免疫細胞。將洗滌過的細胞在體外混懸于一種介質中，該介質包含去除了免疫球蛋白或抗體的受感染人血清。這樣體外的情況與感染之前未受感染人體所見情況相同或相近(無抗原的臍帶血清可以代替人血清)。將疫苗加入介質中與免疫活性細胞一起培養，然后將混合物重新注射到受感染的人體。重新注射的細胞及其子代在體內會繼續其在體外的起始過程，并且，所激發的新的免疫反應會逐漸并徹底殺滅微生物。這會意想不到地得到一種受感染人體的預防性接種，與將疫苗直接注射到未受感染人體中相似。以這種方法對已形成的感染使用疫苗就是感染的免疫療法。正常的預防性疫苗也是一種免疫療法，其在感染之前給予未受感染人體，并通過殺滅而賦予免疫，其為任何最終感染接種人體的微生物的免疫療法的一種方式。
因此，本發明可以使用疫苗預防及治療已被任何具有在體外去除了脂質層而暴露其真正抗原的微生物所形成的感染。
病毒公認是起源于原生細胞的核物質。雖然它們作為獨立個體存在，病毒的生理機能和存活完全依賴于活細胞。因此，它們不像游離生存的微生物那樣暴露在陽光的不利影響中。這些演變成人和動物慢性感染的病毒，例如HIV和其它逆轉錄酶病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、EBV、CMW、單純皰疹病毒以及人和動物致腫瘤病毒都為包膜病毒。病毒的包膜在它們的進化過程中從其宿主細胞獲取，以保證其在體內存活。
DNA病毒例如EBV、CMV以及B型肝炎病毒在離開其生長的核時，從宿主細胞的核膜中獲取其包膜。RNA病毒例如逆轉錄酶病毒和C型肝炎病毒在成熟病毒最終從其生長的宿主細胞中離開時，從細胞壁膜獲取其各自的包膜。因為它們攜帶的包膜源于宿主細胞，所以包膜病毒被認為是“雜交”病毒，其結合了對機體來說是外來的病毒核心和源于宿主的包膜。由于此原因，宿主免疫系統將包膜病毒認作是“部分自體”。
宿主殺滅病毒及其包膜的有效免疫反應也會殺滅所有那些病毒包膜所源自的宿主細胞。在B型和C型肝炎的情況中，肝細胞也會被同樣殺滅。在HIV的情況中，所有的CD4+細胞會被清除。在這樣的情況下，這會導致嚴重和致命的自身免疫性疾病。為了避免連同病毒一起殺滅機體，宿主的免疫反應因而被迫效率低下。在從宿主取得其包膜的過程中，這些病毒“有意”取得“人質”，并以其“脅迫”機體免疫系統使其反應效率低下。這些效率低下的免疫反應確保包膜病毒作為慢性感染在體內持續。
像其所源自的細胞膜一樣，病毒包膜包含可以很容易被脂質溶劑例如氯仿或醚破壞的磷脂蛋白。當包膜被破壞之后，將作為疫苗的殘留病毒抗原注射到未受感染的人體中時，會被免疫系統認為是非自體并且完全異質。激發適當免疫反應，其僅有效破壞與疫苗中所用病毒抗原一致的病毒核或病毒非包膜部分。任何由相同包膜病毒造成的對接種機體的后續感染將僅使其核遭到破壞，而留下其完整的包膜。空包膜在人體內沒有生物學價值。接種人體將對有關包膜病毒免疫。通過破壞包膜病毒的包膜，殘留病毒抗原形成有力高效的用于有關病毒的疫苗。這種疫苗給予未受感染的人體后，其將通過僅破壞后續感染機體的同類包膜病毒的病毒核獲得持久的免疫力。
在由包膜病毒形成的感染中，病毒包膜上的宿主特性脅迫自然殺傷細胞并阻斷所有能有效殺滅病毒的長期免疫反應。然而，當病毒包膜在體外被破壞，殘留抗原作為疫苗重新注射到已形成感染的人體中時，其被認為是完全異質并且非自體。疫苗激發快速細胞因子，其穿透容納包膜病毒的病毒包膜和細胞膜，并殺滅其中的病毒。所產生的細胞因子的數量取決于疫苗的使用量以及患者自然殺傷細胞的狀態和數量。當感染消除或減少到無顯著意義的水平時，患者的長效預防性接種或免疫療法如下獲得。
通過檢驗患者的免疫系統正常，并且病毒已明顯消除或減少(在HIV的情況中，CD4+量約為400-500，病毒量小于50復制數/毫升)之后，從患者體內抽取肝素血。將血中的外周血白細胞洗滌至不含所有痕量的病毒抗體。將未定型病毒的已洗滌白細胞中的免疫活性細胞混懸于介質中，該介質包含已除去免疫球蛋白和抗體的患者血清(無病毒抗體的臍帶血清可以代替患者的無抗體血清。混合物中的血清確保疫苗的抗原可以適當地呈現給免疫系統。)。將疫苗加入該混合物中，培養之后重新注射到患者體內。這就是對患者的免疫療法，其類似于將預防性疫苗注射到具有正常免疫系統，且無感染或無病毒抗體的未受感染的人體中。
重新注射的混合物將在體內繼續體外的起始過程，被免疫療法激發的新免疫反應從機體中消除所有病毒殘留，并防止未來任何由相同包膜病毒造成的再感染。因而可以通過破壞給定包膜病毒的包膜制備一種疫苗，其可以用于預防或治療由相同包膜病毒造成的感染。
所生物體內的免疫反應利用特定補體的一種或另一種形式。即使免疫反應效率很低時，像由微生物及包膜病毒造成的大多數慢性感染，也同樣使用補體。此時，特定的微生物或病毒補體耗盡造成的補給短缺，無法消除慢性感染。
始于體外的免疫療法激發患者新的有效免疫反應也需要補體。這種對補體的新需求只會使已有的慢性短缺加重并使患者的臨床狀況惡化。因此，有必要使患者的病毒載量或微生物以其它方式實質上減少，以使之后產生的補體可以用于完成新的由上述體外開始的免疫療法所激發的有效免疫反應。
一種用于減少如上所述微生物病毒載量的方法，開始首先給予患者簡單直接注射適當大劑量除去了病毒包膜而暴露真正抗原的疫苗。這發生在新系統仍正常時。其對患者并不真正接種，但激發自然殺傷細胞產生能殺滅大量病毒或微生物的細胞因子。這樣疫苗就與藥品類似。如果在合適的時間間隔里重復，這種殺滅可以顯著減少病毒載量或微生物和其對補體的需要，使其達到無顯著意義的水平。此后體內產生或游離的補體可用于后續始于體外的免疫療法，其激發體內有效的免疫反應。該后一步驟僅在有證據表明患者體內微生物病毒載量不能造成明顯的補體需求時才實施。
當免疫系統削弱時，對已給予疫苗患者的洗滌過的患者白細胞和疫苗進行一段時間的培養會提供細胞因子，其在注射到患者體內時會激發病毒數量或微生物下降。此步驟可以在一個月內重復2或3次。
另一種確保始于體外的免疫療法在正在慢性感染的患者體內有效的快速方法為，通過對患者輸入新鮮血液提供額外的補體。在新免疫反應開始出現時，通常在緊接免疫療法之后的10-14天，輸血是最有用的。輸血應反復進行，直到病毒或微生物完全清除。
具體實施例方式
因此，根據本發明的第一方面，提供一種制造疫苗的方法，該方法包括步驟
以含脂溶劑提取生物體液，該生物體液從受到含脂傳染性生物體感染的人或動物獲取，該生物體液包含含脂傳染性生物體和提取物，提取產生水相和含脂有機相，該水相包含實質上已除去脂質的傳染性生物體，以及分離水相。
脂質提取溶劑可以為氯仿或醚。
生物體液可以為全血、血漿、胸膜液、腦脊髓液、培養液或其它局部體液。含脂傳染性生物體可以為病毒、細菌、例如結核或麻風菌、原生動物、真菌或細胞壁中包含脂質或類脂物質的一類霉菌。具體地說，其可以為包膜病毒，例如免疫缺陷病毒如人類免疫缺陷病毒或HIV。可替換的地，其可以為包膜病毒，例如B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、人皰疹IV型病毒、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、人類T-淋巴白血病病毒(HTLV1)、癌癥病毒及其它任何類似的包膜病毒。
包含含脂傳染性生物體的生物體液的提取工藝可以采用混合、旋流、渦流、旋轉或其它所屬技術領域的技術人員所熟悉的合適工藝。提取時間應足夠長，以使氯仿溶解所有、或實質上所有傳染性生物體中所含的脂質，并且因提取工藝而不同。例如，在旋流混合的情況中，例如為HIV的情況，旋流可以進行30-60分鐘的時間，典型地為30分鐘。
該方法還可以包括濃縮水相生成包含傳染性生物體的濃縮物，或者，通過例如冷凍干燥法或所屬技術領域的技術人員所熟悉的技術分離實質上已除去脂質的傳染性生物體的步驟。
通過這種方式生成的疫苗可以作為自體疫苗用于生物體液所提自的人體。可替換地，該方法可以包括分離和培養來自居住在特定地理區域、受到感染的人的傳染性生物體的附加步驟。在該方式中，疫苗可以用于預防(作為真正疫苗)或用于治療來自該地理區域的人。本發明的這一方面在例如HIV在不同地理區域有不同形式的病毒的情況下十分重要。
該方法可以包括稀釋生物體液或稀釋水提物的步驟，其目的為獲取每ml約100-200個病毒粒子的抗原疫苗。
在提取步驟中所用的氯仿與生物體液的比例(體積∶體積)可以為3∶1至5∶1。最好為約3∶1。
根據本發明的另一方面，提供一種制造第一治療性疫苗的方法。該方法包括步驟以脂質提取溶劑提取從受到含脂傳染性生物體感染的人或動物中獲取的生物體液，該生物體液包含含脂傳染性生物體，提取產生水相和含脂相，該水相包含實質上已除去脂質的傳染性生物體，將水相從含脂相中分開，將白細胞部分從人或動物血中分離，控制分離使白細胞部分實質上不含血漿、游離含脂傳染性生物體或含脂傳染性生物體的游離抗體，以及將至少部分水相與至少部分白細胞部分結合生成疫苗。
應該認識到，白細胞部分的一部分會包含受感染細胞。
上述制備的第一治療性疫苗用于從其獲取生物體液和白細胞部分的患者。然而，本發明該實施例的發展例中，取自特定地理區域的受感染人的白細胞可能如上所述與疫苗結合生成第二治療性疫苗，該疫苗從取自該同一地理區域另一個受感染人的分離培養的病毒制備而成。
因此，本發明擴展到一種制造第二治療性疫苗的方法。該方法包括步驟分離并培養來自生物體液的傳染性生物體，該生物體液從至少一個受含脂傳染性生物體感染的人或動物獲取，以生成包含培養的含脂傳染性生物體的組合物，以脂質提取溶劑提取含脂傳染性生物體的水溶液，提取產生水相和含脂相，水相包含實質上已除去脂質的生物體，將水相從含脂相中分開，將白細胞部分從另一個被含脂傳染性生物體感染的人或動物的血中分離，控制分離使白細胞部分實質上不含血漿、游離含脂傳染性生物體或含脂傳染性生物體的游離抗體，以及將至少部分水相與至少部分白細胞部分結合生成第二治療性疫苗。
脂質提取溶劑可以是任何合適的溶劑，可以是氯化的碳氫化合物例如氯仿。可替換地，其可以是碳氫化合物或醚。具體地說，值得注意的是，氯仿適合用于本發明的方法，即使申請號為PCT/IB01/01099的專利清楚地表明氯仿會使很多血漿蛋白質變性，不適用于后續將給回到動物或人類的液體中。
白細胞部分可以這樣得到從人或動物抽取血液樣本，通過沉降從血漿中分離血紅細胞，通過例如離心從血漿中分離白細胞，以及洗滌白細胞使其不含殘留血漿以及帶有生理鹽水的抗體。
第二治療性疫苗用于從其取得白細胞部分的患者。
在本發明的另一實施方式中，從提取培養的含脂傳染性生物體產生的水相可以作為預防性疫苗直接用于正常未受感染的人，其生活在生物體液所取自的人或動物所生活、以及含脂傳染性生物體流行的地理區域。
根據本發明的另一方面，提供一種疫苗，其通過一種方法制備，該方法包括步驟以氯仿提取從受到含脂傳染性生物體感染的人或動物中獲取的生物體液，該生物體液包含含脂傳染性生物體，提取產生水相和含脂相，水相包含實質上已除去脂質的傳染性生物體，以及分離水相。
根據本發明的另一方面，提供一種第一治療性疫苗，其通過一種方法制備，該方法包括以脂質提取溶劑提取從受到含脂傳染性生物體感染的人或動物中獲取的生物體液，該生物體液包含含脂傳染性生物體，提取產生水相和含脂相，水相包含實質上已除去脂質的傳染性生物體，將水相從含脂相中分開，將白細胞部分從人或動物血中分離，控制分離使白細胞部分實質上不含血漿、游離含脂傳染性生物體和含脂傳染性生物體的游離抗體，以及將至少部分水相與至少部分白細胞部分結合生成疫苗。
根據本發明的另一方面，提供一種第二治療性疫苗，其通過一種方法制備，該方法包括分離并培養來自生物體液的傳染性生物體，該生物體液從一個受含脂傳染性生物體感染的第一人或第一動物獲取，以生成包含培養的含脂傳染性生物體的組合物，以脂質提取溶劑提取含脂傳染性生物體的水溶液，提取產生水相和含脂相，水相包含實質上已除去脂質的生物體，將水相從含脂相中分開，將白細胞部分從受到含脂傳染性生物體感染的第二人或第二動物的血中分離，控制分離操作，使白細胞部分實質上不含血漿、游離含脂傳染性生物體或含脂傳染性生物體的游離抗體，以及將至少部分水相與至少部分白細胞部分結合生成第二治療性疫苗。
根據本發明的另一方面，提供一種治療受到含脂傳染性生物體感染的人或動物的方法，該方法包括步驟以氯仿提取生物體液，該生物體液從受到含脂傳染性生物體感染的人或動物獲取，該生物體液包含含脂傳染性生物體和提取物，提取產生包含實質上已去除脂質的傳染性生物體的水相和含脂有機相，分離水相，以及將有效量的水相給予人或動物。
該方法還可以包括上述濃縮水相生成濃縮物，或相反，分離實質上已除去脂質的傳染性生物體的步驟，并將所得物質，可選擇地，與藥劑學上可接受的輔料或載體一起給予人或動物。
根據本發明的另一方面，提供一種治療受到含脂傳染性生物體感染的人或動物的方法，該方法包括步驟以脂質提取溶劑提取從人或動物中獲取的生物體液，該生物體液包含含脂傳染性生物體，提取產生包含實質上已除去脂質的傳染性生物體的水相和含脂相，
將水相從含脂相中分開，將白細胞部分從人或動物血中分離，控制分離使白細胞部分實質上不含血漿、游離含脂傳染性生物體或含脂傳染性生物體的游離抗體，將至少部分水相與至少部分白細胞部分結合生成一種組合物，以及將有效治療量的該組合物給予人或動物。
根據本發明的另一方面，提供一種治療受到含脂傳染性生物體感染的人或動物的方法，該方法包括步驟分離并培養來自生物體液的傳染性生物體，該生物體液從一個受含脂傳染性生物體感染的第一人或第一動物獲取，以生成包含培養的含脂傳染性生物體的組合物，以脂質提取溶劑提取含脂傳染性生物體的水溶液，提取產生包含實質上已除去脂質的生物體的水相和含脂相，將水相從含脂相中分開，將白細胞部分從被含脂傳染性生物體感染的第二人或第二動物的血中分離，控制分離使白細胞部分實質上不含血漿、游離含脂傳染性生物體或含脂傳染性生物體的游離抗體，將至少部分水相與至少部分白細胞部分結合生成一種組合物，以及將有效治療量的該組合物給予人或動物。
上述方法可以包括對人或動物輸入新鮮血液，以增加血液中補體或類補體蛋白的步驟。補體系統由一組血清蛋白組成，其在防御性免疫反應中充當主要角色(微生物學，第2版，Prescott，Harley及Klein著)，而且輸血增加免疫系統嚴重受損的人或動物的蛋白質水平。
根據本發明的另一方面，提供一種第三治療性疫苗，其包括在體外暴露到疫苗的白細胞，該疫苗由實質上除去了脂質部分的含脂傳染性生物體生成，暴露實質上在沒有游離含脂傳染性生物體存在，而有不含游離含脂傳染性生物體抗體血清的介質存在時發生。
白細胞典型地在37℃暴露約4個小時。
血清蛋白提供可以使治療性疫苗在體內發揮作用的調理素。
根據本發明的另一方面，提供一種預防性疫苗，其通過一種方法制備，該方法包括步驟培養由受到含脂傳染性生物體感染的人或動物獲取的生物體液，以脂質提取溶劑提取含有含脂傳染性生物體的培養物，提取產生包含實質上已除去脂質的傳染性生物體水相和含脂相，以及分離水相。
本發明提供一種物質或組合物，用于一種治療含脂傳染性生物體所致感染的方法，該物質或組合物包含如前所述的疫苗或第一或第二或第三治療性疫苗。
本發明還提供一種物質或組合物，用于對人或動物接種，抵抗含脂傳染性生物體所致的感染，該物質或組合物包含如前所述的分離并培養的傳染性生物體。
傳染性生物體可以包括實質上已除去脂質包膜的HIV、Aghbs、Acv、EBV、單純皰疹以及腫瘤病毒。
本發明還提供一種物質或組合物，用于預防含脂傳染性生物體所致的感染，該物質或組合物包含如前所述的預防性疫苗。
本發明還提供一種物質或組合物在制造用于治療含脂傳染性生物體所致感染的藥品中的用途，該物質或組合物包含如前所述的疫苗或治療性疫苗。
本發明還提供一種物質或組合物在制造作為疫苗用于預防含脂傳染性生物體所致感染的藥品中的用途，該物質或組合物包含如前所述分離并培養的傳染性生物體。
本發明還提供一種物質或組合物在制造用于預防含脂傳染性生物體所致感染的藥品中的用途，該物質或組合物包含如前所述的預防性疫苗。
本發明參照以下實施例、表格和附錄，通過舉例的方式進行說明。
實施例1
疫苗將取自HIV病毒陽性人的新鮮空腹血(5ml)(每ml含10000至20000個病毒粒子)連同500單位肝素抽入注射器中，室溫下放置30分鐘。該血漿與氯仿(5ml)同置已消毒的具旋蓋玻璃試管中。以旋渦混勻器混合該混合物5分鐘，然后在室溫下再放置25分鐘。加入生理鹽水(9ml)，并將混合物以旋渦混勻器混合該混合物5分鐘，然后在室溫下再放置10分鐘。將所得混合物轉移到已消毒的玻璃離心試管中，4000轉/分鐘離心15分鐘。將浮在表面的水層轉移到培養基直徑為10cm的已消毒玻璃培養皿中，置排風罩中放置30分鐘。所得10ml疫苗形成10個劑量，每ml疫苗含抗原1000-2000個病毒粒子。第一疫苗以單劑量在-200℃下儲存。
實施例2疫苗在本發明的另一實施方式中，將取自患者的每ml含10000至20000個病毒粒子的新鮮空腹血(5ml)連同500單位肝素抽入注射器中。該血漿(1ml)與氯仿(5ml)同置已消毒的具旋蓋玻璃試管中，以旋渦混勻器徹底混勻該混合物10-15分鐘。然后在室溫(20-25℃)下放置45分鐘。將生理鹽水(9ml)加入該混合物并以旋渦混勻器混合該混合物5分鐘，然后在室溫下放置10分鐘。將所得混合物轉移到已消毒的玻璃離心試管中，4000轉/分鐘離心15分鐘。將表面層轉移到培養基直徑為10cm的已消毒玻璃培養皿中，置排風罩中放置30分鐘。將表面層(1ml)以生理鹽水(9ml)稀釋，得到1/100的稀釋液。該最終稀釋液(1ml)所含抗原為每ml疫苗含抗原1000-2000個病毒粒子，以單劑量在-200℃下儲存。
實施例3自體疫苗對病毒數量的影響(見表1，附錄1)自體疫苗按照實施例1的方法制備，包含的抗原為有關患者體內病毒量的1/100。將自體疫苗(1ml)直接皮下注射給患者。除了7號患者之外，這明顯的使患者病毒數量產生下降。在1號和2號患者中，自體疫苗間隔4天2次注射，病毒數量明顯地分別下降91％和75％。
在另一個患者中(附錄1(b))，將1ml自體疫苗作為5個樣品分別在2001年4月17日、2001年4月21日、2001年6月21日、2001年8月21日和2001年10月21日進行5次簡單皮下注射。病毒數量從2001年4月16日的29566(4.5log10)下降到15個月之后2002年7月2日的低于50(1.5log10)，而且HIV血清反應已經難以分辨。但是，在2002年12月17日病毒數量升高到65(1.8log10)。這提示直接注射自體疫苗會導致病毒數量下降到血清反應難以分辨的點，但是無自體疫苗時病毒復制就重新啟動。
實施例4具有洗滌過的外周血白細胞的自體疫苗的影響(見附錄2)自體疫苗按照實施例1的方法制備，并稀釋100倍。將血液樣品連同1000單位肝素一起抽入注射器中。將該樣品轉移到具有直徑為1cm培養基的已消毒的具旋蓋長試管中，-37℃下垂直放置30分鐘。吸取紅細胞沉淀上方富含白細胞的血漿，在臺式離心機(Jouan C312型)中2000轉/分鐘離心10分鐘。棄去浮在上方的血漿，將生理鹽水(5ml)加入白細胞沉淀，混合器中旋渦振蕩1分鐘后，再次2000轉/分鐘離心10分鐘。
棄去上浮物，將新鮮的生理鹽水(5ml)加入沉淀。該洗滌白細胞的步驟重復2次以上，以從細胞沉淀中除去所有痕量的抗體。然后將自體疫苗(1ml)加入洗滌過的白細胞中，立即將混合物皮下注射給有關患者。在如下表2中所示日期重復該程序。患者CD4有顯著增加，而所有患者病毒數量有明顯下降，34位患者中9位降到50以下。
實施例5治療性疫苗和免疫療法洗滌過的外周血白細胞如實施例4制備。將根據實施例1的方法制備的自體疫苗(1ml)加入細胞沉淀，該細胞沉淀接著還加入具有10％人類臍帶血清的RPMI(GIBCO)(5ml)培養介質，該臍帶血清代替已除去免疫球蛋白的患者血清，不含HIV及其它病毒的抗體。該混合物在37℃下培養4小時。將治療性疫苗直接皮下重新注射到患者前臂，該患者為血液樣品抽取及自體疫苗制備的來源。整個程序在5天和30天時作為加強劑重復進行。
首次免疫療法后約10-14天，少數患者中出現輕微困倦、身體疼痛及輕微發燒形式的輕微免疫反應。這些癥狀通過退熱和抗過敏藥，例如阿司匹林和地塞米松控制。
如果這些癥狀一直持續，其通常通過輸入新鮮血液終止，其提供額外的補體用于治療性疫苗和免疫療法所激發的免疫反應。CD4+和病毒數量每3-4個月重復一次，直到病毒數量低于檢測水平。連續3年每年監控一次。在少數病例中，患者的血清反應陽性狀態數個周期之后變成HIV血清反應陰性。
對5個患者按實施例5治療的結果表示在下表1中。
時間指治療后再次測定CD4和病毒載量之前的月數。病毒粒子低于50時無法計數。
第六位患者在1992年十月發現，并根據實施例5進行治療，未測定其CD4+和病毒載量，三年后報告血清反應陰性。上述4號和5號病例以及第六位患者的血清反應陰性結果確證了HIV已完全從患者體內清除。
HIV為何不能通過免疫系統從體內清除，公認的原因是其為具有包膜的包膜病毒，該包膜在成熟病毒離開受到感染的細胞時從CD4+膜取得。關于此假設的全面討論發表在《醫學假說申請者》(Applicant in MedicalHypotheses，(1994)42，81-88)和《醫學假說》Medical Hypotheses(1997)48，517-521)上，其引用于此作為參考。因為HIV的包膜源自CD4+膜，所以免疫系統將病毒認定為“部分自體”。有效的免疫反應，其忽略包膜的存在而殺滅具有包膜的病毒，也會殺滅所有的病毒包膜來源CD4+細胞。HIV以含脂包膜的形式有效取得“人質”，并以其“脅迫”宿主免疫系統使其反應效率低下。
有效的預防性疫苗為預防性免疫療法，必須符合三個要求。這些要求為，首先，該疫苗必須激發殺滅病毒的免疫反應，第二，人體免疫系統必須正常，第三，待接種的人沒有對病毒的已有抗體。為了有效，用于治療已發生的HIV感染的免疫療法的治療性疫苗還必須在受到HIV感染的人體內產生預防性免疫療法。也就是說，HIV疫苗應在受到感染的人體內激發殺滅病毒的免疫反應，該人應該具有正常免疫能力，HIV抗體不應出現在受到感染的待接種人的免疫系統部分。在HIV感染初期，以及之后可接受的時間里，人體具有正常免疫系統，其內具有數個免疫單元。這些可以成功處理任何特定時間里侵襲機體的不同感染或抗原。有關于此的證據為，在HIV感染之后的最初幾年中，侵襲機體的感染原被免疫系統成功控制。
如果出現在外周血白細胞中的未定型HIV的免疫單元之一在體外經過洗滌，使其不含HIV抗體及感染原并與有效的HIV抗體結合，該免疫單元就會將疫苗認定為“非自體”及外來抗原，因為未出現病毒包膜。意識到“非自體”外來抗原的有效免疫反應會在體外啟動。當混合物重新注射到受到感染的人體，已接種的免疫細胞及其子代會繼續在體內該過程并僅殺滅人體內的HIV核。假如補體足夠，這最終會從機體中消除病毒，就像未受到感染的正常人接種所發生的一樣。本發明的一個本質特點是，人體包含在其外周血白細胞中的免疫系統的一部分在重新注射到人體中之前，可以在體外不含HIV抗體和含脂感染原的介質中接種。
附錄1一個劑量的自體疫苗后3-4周的病毒數變化。
*接受2個劑量的疫苗自體疫苗4周后病毒數附錄1BD.B.M/男51歲19/4/01 -HIV血清反應14/4/01 -病毒數29,566(4.5log10)17/4/01 -T3 1181-T4 877-T8 344-T4/T8 2.2(CPC N°13502)1ml血漿/白細胞@40℃24小時氯仿11/2小時+9ml mlN/S15分鐘離心。上層漂浮物1/100＝疫苗17/4/01-1ml疫苗s/c.
21/4/01-1ml疫苗s/c.
21/6/01-每2個月給予4個劑量疫苗21/8/0121/10/01.
13/12/01 -T3 1496-T4 1007-T8 453-T4/T8 2.4-病毒數＜50(1.7log10)-血清反應模糊(CPC22,443)17/12/02 -T3 1664-T4 1091-T8 539-T4/T8 2.0-病毒數65(1.8log10)
附錄2具有已洗滌外周血白細胞的自體疫苗
權利要求書(按照條約第19條的修改)根據19條(1)所做的聲明在國際檢索單位2006年3月2日郵寄的書面意見中，認為權利要求1-5、7以及13-29按照PCT條約33條(2)缺乏新穎性，已被“有效HIF疫苗及其免疫療法初步報告”(D1)所公開。此外，認為權利要求6以及8-12按照PCT條約33條(3)對D1是顯而易見的，缺乏創造性。
附件為修改替換頁33和34頁。
D1(實際上，所有的對比文件)沒有提供關于將水液部分(疫苗)從脂質部分(包膜)中分離的細節。而且，公知技術實質上沒有講解、暗示或者匯報明顯使用整個病原體，而是說明了使用病原體片斷，例如病毒的一部分而非整個病毒。
具體地說，獨立權利要求1已做了修改，其清楚地指明使用脂質提取溶劑提取生物液體，通過將上述脂質溶劑加入上述生物液體并將上述破壞包膜組分和上述生物液體機械結合，從而影響脂蛋白的破壞。
權利要求7也做了修改，將“提取”改變為一機械結合—更清楚地將本發明與公知技術進行區分。
以下簽名的發明人認為引用的已有技術不影響本發明的專利性。
對權利要求的修改權利要求1修改如下1.一種制造疫苗的方法，其特征是包含步驟從受到含脂傳染性有機體感染的人或動物獲取包含含脂傳染性有機體的生物液體；以含脂溶劑提取上述生物液體，其通過將上述脂質溶劑加入上述生物液體并將上述破壞包膜組分和上述生物液體機械結合，從而影響脂蛋白的破壞，上述提取操作產生水相和含脂有機相，上述水相包含上述傳染性有機體，以及分離上述水相。
權利要求7修改如下7.根據權利要求1所述的方法，其特征是機械結合步驟通過任一選自包含混合、旋流、渦流以及旋轉的組合的工藝完成。
替換頁權利要求1.一種制造疫苗的方法，其特征是包含步驟從受到含脂傳染性有機體感染的人或動物獲取包含含脂傳染性有機體的生物液體；以含脂溶劑提取上述生物液體，其通過將上述脂質溶劑加入上述生物液體并將上述破壞包膜組分和上述生物液體機械結合，從而影響脂蛋白的破壞，上述提取操作產生水相和含脂有機相，上述水相包含上述傳染性有機體，以及分離上述水相。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是上述生物液體選自包含全血、血漿、胸膜液、腦脊髓液、培養液以及局部體液的組合。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征是上述含脂傳染性有機體選自包含病毒、細菌、原生動物、真菌或細胞壁中包含脂質或類脂物質的一類霉菌的組合。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征是上述傳染性有機體為包膜病毒。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征是上述包膜病毒選自包含人類免疫缺陷病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、人皰疹IV型病毒、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、人類T-淋巴白血病病毒以及癌癥病毒的組合。
6.根據權利要求3所述的方法，其特征是上述傳染性有機體為細菌，選自包含結核菌和麻風病菌的組合。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征是[提取]機械結合步驟通過任一選自包含混合、旋流、渦流以及旋轉的組合的工藝完成。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征是包括濃縮上述水相生成包含實質上已除去脂質的傳染性有機體濃縮物的步驟。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征是包括通過冷凍干燥法濃縮水相的步驟。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征是包括稀釋上述生物液體和稀釋上述水提物的步驟，其目的為獲取每ml約100-200個病毒粒子的抗原。
11.根據權利要求1所述的方法，其特征是上述脂質提取溶劑為氯仿，其中提取步驟所用的氯仿與生物液體的比例(體積∶體積)可以為約3∶1至約5∶1。
權利要求
1.一種制造疫苗的方法，其特征是包含步驟從受到含脂傳染性生物體感染的人或動物獲取包含含脂傳染性生物體的生物體液；以含脂溶劑提取上述生物體液，上述提取產生水相和含脂有機相，上述水相包含上述傳染性生物體，以及分離上述水相。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是上述生物體液選自包含全血、血漿、胸膜液、腦脊髓液、培養液以及局部體液的組合。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征是上述含脂傳染性生物體選自包含病毒、細菌、原生動物、真菌或細胞壁中包含脂質或類脂物質的一類霉菌的組合。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征是上述傳染性生物體為包膜病毒。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征是上述包膜病毒選自包含人類免疫缺陷病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、人皰疹IV型病毒、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、人類T-淋巴白血病病毒以及癌癥病毒的組合。
6.根據權利要求3所述的方法，其特征是上述傳染性生物體為細菌，選自包含結核菌和麻風病菌的組合。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征是提取步驟通過任一選自包含混合、旋流、渦流以及旋轉的組合的工藝完成。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征是包括濃縮上述水相生成包含實質上已除去脂質的傳染性生物體濃縮物的步驟。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征是包括通過冷凍干燥法濃縮水相的步驟。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征是包括稀釋上述生物體液和稀釋上述水提物的步驟，其目的為獲取每ml約100-200個病毒粒子的抗原。
11.根據權利要求1所述的方法，其特征是上述脂質提取溶劑為氯仿，其中提取步驟所用的氯仿與生物體液的比例(體積∶體積)為約3∶1至約5∶1。
12.根據權利要求1所述的方法，其特征是上述脂質提取溶劑為氯仿，其中提取步驟所用的氯仿與生物體液的比例(體積∶體積)為約3∶1。
13.一種制造治療性疫苗的方法，其特征是包括步驟從受到含脂傳染性生物體感染的人或動物獲取包含含脂傳染性生物體的生物體液；以含脂溶劑提取上述生物體液，上述提取產生水相和含脂有機相，上述水相包含上述實質上已除去上述含脂傳染性生物體的脂質的上述傳染性生物體；將水相從含脂相中分開；將白細胞部分從上述人或動物血中分離，控制上述分離操作使上述白細胞部分實質上不含血漿、游離含脂傳染性生物體或上述含脂傳染性生物體的游離抗體；以及將至少部分上述水相與至少部分上述白細胞部分結合生成治療性疫苗。
14.根據權利要求13所述的方法，其特征是上述脂質提取溶劑選自包含氯化碳氫化合物、碳氫化合物及醚的組合。
15.根據權利要求13所述的方法，其特征是上述脂質提取溶劑為氯仿。
16.根據權利要求13所述的方法，其特征是上述白細胞部分通過從上述人或上述動物抽取血液樣品，從血漿中分離血細胞，從血漿中分離白細胞以及將白細胞洗滌至不含殘留血漿和抗體。
17.一種按照以下步驟制造治療性疫苗的方法從一個受含脂傳染性生物體感染的第一人或第一動物獲取包含含脂傳染性生物體的生物體液；分離并培養來自上述生物體液的傳染性生物體，以生成包含培養的含脂傳染性生物體的組合物；以脂質提取溶劑提取上述含脂傳染性生物體的水溶液，提取產生水相和含脂相，上述水相包含實質上已除去脂質的生物體；將水相從含脂相中分開；將白細胞部分從受到與上述第一人或上述第一動物相同的含脂傳染性生物體感染的第二人或第二動物的血中分離，控制分離操作，使上述白細胞部分實質上不含血漿、游離含脂傳染性生物體或含脂傳染性生物體的游離抗體；以及將至少部分上述水相與至少部分上述白細胞部分結合生成治療性疫苗。
18.根據權利要求17所述的方法，其特征是上述脂質提取溶劑選自包含氯化碳氫化合物、碳氫化合物及醚的組合。
19.根據權利要求17所述的方法，其特征是上述脂質提取溶劑為氯仿。
20.根據權利要求17所述的方法，其特征是上述白細胞部分通過從上述第二人或上述第二動物抽取血液樣品，從血漿中分離血細胞，從血漿中分離白細胞以及將白細胞洗滌至不含殘留血漿和抗體。
21.一種疫苗，其特征是通過以下步驟制備從受到含脂傳染性生物體感染的人或動物獲取包含含脂傳染性生物體的生物體液；提取上述生物體液，上述提取產生水相和含脂有機相，上述水相包含上述實質上已除去脂質的上述傳染性生物體；以及分離上述水相。
22.一種物質或組合物在制造用于治療含脂傳染性生物體所致感染的藥品中的用途，該物質或組合物包含如權利要求21所述的疫苗或治療性疫苗。
23.一種治療性疫苗，通過一種方法制備，其特征是包括步驟從受到含脂傳染性生物體感染的人或動物獲取包含含脂傳染性生物體的生物體液；以含脂溶劑提取上述生物體液，上述提取步驟產生水相和含脂有機相，上述水相包含上述實質上已除去脂質的上述傳染性生物體；將水相從含脂相中分開；將白細胞部分從上述人或上述動物血中分離，控制上述分離步驟使上述白細胞部分實質上不含血漿、游離含脂傳染性生物體以及上述含脂傳染性生物體的游離抗體；以及將至少部分上述水相與至少部分上述白細胞部分結合生成疫苗。
24.一種治療性疫苗，通過一種方法制備，其特征是包括步驟從一個受含脂傳染性生物體感染的第一人或第一動物獲取包含含脂傳染性生物體的生物體液；分離并培養上述傳染性生物體，以生成包含培養的含脂傳染性生物體的組合物；用脂質提取溶劑提取上述含脂傳染性生物體的水溶液，提取產生水相和含脂相，上述水相包括上述實質上已除去脂質的生物體；將上述水相從上述含脂相中分開；將白細胞部分從受到上述含脂傳染性生物體感染的第二人或第二動物的血中分離，控制上述分離步驟，使上述白細胞部分實質上不含血漿、游離含脂傳染性生物體或含脂傳染性生物體的游離抗體；以及將至少部分上述水相與至少部分上述白細胞部分結合生成治療性疫苗。
25.一種治療性疫苗，其包括在體外暴露到疫苗的白細胞，該疫苗由實質上除去了脂質部分的含脂傳染性生物體生成，暴露實質上在沒有游離含脂傳染性生物體存在，而有不含游離含脂傳染性生物體抗體血清的介質存在時發生。
26.一種預防性疫苗，通過一種方法制備，其特征是包括步驟從受到含脂傳染性生物體感染的人或動物獲取生物體液；培養上述生物體液；以脂質提取溶劑提取含有含脂傳染性生物體的培養物，提取步驟產生水相和含脂相，上述水相包含實質上已除去脂質的傳染性生物體；以及分離上述水相。
27.一種物質或組合物，用于預防含脂傳染性生物體所致的感染，該物質或組合物包含如權利要求26所述的預防性疫苗。
28.一種物質或組合物在制造用于預防含脂傳染性生物體所致感染的藥品中的用途，該物質或組合物包含如權利要求26所述的預防性疫苗。
29.一種物質或組合物，用于一種治療含脂傳染性生物體所致感染的方法，該物質或組合物包含通過如權利要求1所述方法制備的疫苗或治療性疫苗。
全文摘要
一種治療性疫苗，通過一種方法制備，該方法包括下列步驟以脂質提取溶劑提取從受到含脂傳染性生物體感染的人或動物中獲取的生物體液，該生物體液包含含脂傳染性生物體，提取產生水相和含脂相，上述水相包含實質上已除去脂質的傳染性生物體，將水相從含脂相中分開。將白細胞部分從人或動物血中分離，控制分離使白細胞部分實質上無血漿、游離含脂傳染性生物體和含脂傳染性生物體的游離抗體，將至少部分水相與至少部分白細胞部分結合生成疫苗。
文檔編號A61K39/12GK1972711SQ200580019241
公開日2007年5月30日 申請日期2005年4月8日 優先權日2004年4月12日
發明者維克托·阿諾瑪·恩古 申請人:維克托·阿諾瑪·恩古