專利名稱：使腫瘤細胞致死的人α－乳清蛋白(HAMLET)在治療病毒感染中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及病毒感染的治療方法，并涉及生物活性復合物在制備用于治療病毒感染的藥物中的用途。
HAMLET(humanα-lactalbumin made lethal to tumour cells，使腫瘤細胞致死的人α-乳清蛋白)(以前稱為MAL)是一種α-乳清蛋白的活性折疊變異體，它在轉化細胞中能誘導細胞凋亡，但卻不損傷健康的分化細胞(M.Svensson等，(2000)Proc Natl Acad Sci USA，97，4221-6)。已經知道，HAMLET能與腫瘤細胞表面結合，易位到細胞質并聚集在細胞核內，在此引起DNA斷裂(M.Svensson等，(2000)Proc NatlAcad Sci USA，97，4221-6)。這類生物活性復合物得自乳汁，尤其是人乳，可用作抗細菌藥物，參見例如EP-0776214。
迄今為止，有關HAMLET的研究報道已經表明，轉化細胞在體外對HAMLET敏感，這表明它可用于癌癥治療(參見例如C.Svanborg等，Advances in Cancer Research.United States，25 2003，88，1-29)。也發現它具有抗菌效果，具體地講，當進行體外試驗時，它能抑制肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)和流感嗜血桿菌(H.influenzae)附著到人呼吸道上皮細胞(WO96/04929)。相反，某些病毒(例如某些類型的腺病毒)看來卻增加某些細菌的體外粘附力(A.Hakansson等，Infection andImmunity，(1994)第62卷，72707-2714)。
本申請人已經發現了，HAMLET和這類復合物當用于治療病毒感染時，獲得了預料不到的良好結果。
根據本發明，提供選自HAMLET或其生物活性修飾物或它們的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性復合物在制備用于治療病毒感染的藥物中的用途。
看來，HAMLET或其生物活性修飾物的作用是靶向特定細胞類型，這其中除了包括以前已經報道過的腫瘤細胞之外，還包括已經感染病毒的細胞。
因此，這些復合物可用于治療病毒感染。如果及時治療的話，在病毒有機會復制之前，HAMLET就已導致含有病毒(例如逆轉錄病毒)的細胞死亡。結果限制了病毒的擴散。
各種各樣的病毒都可采用這種方式進行治療，包括人類病毒和獸醫病毒。這些病毒列表如下。
1.腺病毒科(Adenoviridae)，包括哺乳動物腺病毒屬(Mastadenovirus)，模式種人腺病毒2型(human adenovirus 2)；禽腺病毒屬(Aviadenovirus)，模式種禽腺病毒1型(fowl adenovirus 1)和非洲豬熱病樣病毒(African swine fever-like viruses)。
2.沙粒病毒科(Arenaviridae)，包括沙粒病毒屬(Arenaviruses)，模式種淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitisvirus)；動脈炎病毒屬(Arterivirus)，模式種馬動脈炎病毒(equinearteritis virus)。
3.星狀病毒科(Astroviridae)，包括星狀病毒屬(Astrovirus)，模式種人星狀病毒1型(human astrovirus 1)。
4.雙節段雙鏈RNA病毒科(Birnaviridae)，包括水生動物雙節段雙鏈RNA病毒屬(Aquabirnavirus)，模式種傳染性胰腺壞死病毒(infectious pancreatic necrosis virus)；禽雙節段雙鏈RNA病毒屬(Avibirnavirus)，模式種傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal diseasevirus)。
5.布尼亞病毒科(Bunyaviridae)，向括布尼亞病毒屬(Bunyavirus)，模式種布尼安維拉病毒(Bunyamwera virus)；漢坦病毒屬(Hantavirus)，模式種漢坦病毒(Hantaan virus)；內羅畢病毒屬(Nairovirus)，模式種內羅畢綿羊病病毒(Nairobi sheep disease virus)；白蛉熱病毒屬(Phlebovirus)，模式種白蛉熱西西里病毒(sandfly feverSicilian virus)。
6.杯狀病毒科(Caliciviridae)，包括杯狀病毒屬(Calicivirus)，模式種豬小泡疹病毒(vesicular exanthema of swine virus)。
7.圓環病毒科(Circoviridae)，包括圓環病毒屬(Circovirus)，模式種雞貧血病毒(chicken anemia virus)。
8.冠狀病毒科(Coronaviridae)，包括冠狀病毒屬(Coronavirus)，模式種禽類傳染性支氣管炎病毒(avian infectious bronchitis virus)；環狀病毒屬(Torovirus)，模式種伯爾尼病毒(Berne virus)；丁型病毒屬(Deltavirus)，模式種丁型肝炎病毒(hepatitis delta virus)。
9.目單分子負鏈RNA病毒目(Mononegavirales)，包括絲狀病毒科(Filoviridae)，包括絲狀病毒屬(Filovirus)，模式種馬爾堡病毒(Marburg virus)。
10.黃病毒科(Flaviviridae)，包括黃病毒屬(Flavivirus)，模式種黃熱病病毒(yellow fever virus)；蟲媒病毒屬(Pestivirus)，模式種牛腹瀉病毒(diarrhea virus)和“丙型肝炎樣病毒”屬(Genus“Hepatitis C-like viruses”)，模式種丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)。
11.嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，包括正嗜肝病毒屬(Orthohepadnavirus)，模式種乙型肝炎病毒(hepatitis B virus)；禽嗜肝DNA病毒屬(Avihepadnavirus)，模式種鴨乙型肝炎病毒(duckhepatitis B virus)。
12.皰疹病毒科(Herpesviridae)，包括皰疹病毒亞科皰疹病毒甲亞科(Alphaherpesvirinae)，例如單純皰疹病毒屬(Simplexvirus)，模式種人皰疹病毒1型(human herpesvirus 1)；水痘病毒屬(Varicellovirus)，模式種人皰疹病毒3型(human herpesvirus 3)；皰疹病毒乙亞科(Betaherpesvirinae)，包括巨細胞病毒屬(Cytomegalovirus)，模式種人皰疹病毒5型(human herpesvirus 5)；鼠巨細胞病毒屬(Muromegalovirus)，模式種小鼠巨細胞病毒1型(Mouse cytomegalovirus 1)；玫瑰疹病毒屬(Roseolovirus)，模式種人皰疹病毒6型(human herpesvirus 6)；皰疹病毒丙亞科(Gammaherpesvirinae)，包括淋巴濾泡病毒屬(Lymphocryptovirus)，模式種人皰疹病毒4型(human herpesvirus 4)；蛛猴皰疹病毒屬(Rhadinovirus)，模式種蛛猴皰疹病毒2型(ateline herpesvirus 2)。
13.虹彩病毒科(Iridoviridae)，包括蛙病毒屬(Ranavirus)，模式種蛙病毒3型(frog virus 3)；淋巴囊腫病毒屬(Lymphocystivirus)，模式種flounder virus；“金魚病毒樣病毒”屬(Genus“Goldfish virus-likeviruses”)，模式種金魚病毒1型(goldfish virus 1)。
14.目單分子負鏈RNA病毒目(Mononegavirales)，包括絲狀病毒科(Filoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)。
15.正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，包括甲型流感病毒屬(Influenzavirus A)、乙型流感病毒屬(Influenzavirus B)，模式種甲型流感病毒(influenza A virus)；丙型流感病毒屬(Influenzavirus C)，模式種丙型流感病毒(influenza C virus)；“托高土樣病毒”屬(Genus“Thogoto-Like viruses”)，模式種托高土病毒(Thogoto virus)。
16.乳多空病毒科(Papovaviridae)，包括多瘤病毒屬(Polyomavirus)，模式種鼠多瘤病毒(murine polyomavirus)；乳頭瘤病毒屬(Papillomavirus)，模式種棉尾兔乳頭瘤病毒(cottontail rabbitpapillomavirus)(Shope)。
17.目單分子負鏈RNA病毒目(Mononegavirales)，包括副粘病毒科(Paramyxoviridae)及副粘病毒亞科(Paramyxovirinae)，包括副粘病毒屬(Paramyxovirus)，模式種人副流感病毒1型(humanparainfluenxa virus 1)；麻疹病毒屬(Morbillivirus)，模式種麻疹病毒(measles virus)；腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)，模式種腮腺炎病毒(mumps virus)，以及肺病毒亞科(Pneumovirinae)，包括肺病毒屬(Pneumovirus)，模式種人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytialvirus)。
18.細小DNA病毒科(Parvoviridae)，包括細小DNA病毒亞科(Parvovirinae)，包括細小DNA病毒屬(Parvovirus)，模式種小鼠細小病毒(mice minute virus)；紅病毒屬(Erythrovirus)，模式種B19病毒(B19 virus)；依賴病毒屬(Dependovirus)，模式種腺伴隨病毒2型(adeno-associated virus 2)。
19.小RNA病毒科(Picornaviridae)，包括腸道病毒屬(Enterovirus)，模式種脊髓灰質炎病毒1型(poliovirus 1)；鼻病毒屬(Rhinovirus)，模式種人鼻病毒1A型(human rhinovirus 1A)；肝病毒屬(Hepatovirus)，模式種甲型肝炎病毒(hepatitis A virus)；心臟病毒屬(Cardiovirus)，模式種腦心肌炎病毒(encephalomyocarditisvirus)；和口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)，模式種口蹄疫病毒O型(foot-and-mouth disease virus 0)。
20.痘病毒科(Poxviridae)，包括脊椎動物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae)，包括正痘病毒屬(Orthopoxvirus)，模式種痘苗病毒(vaccinia virus)；副痘病毒屬(Parapoxvirus)，模式種口瘡病毒(orfvirus)；禽痘病毒屬(Avipoxvirus)，模式種雞痘病毒(fowlpox virus)；山羊痘病毒屬(Capripoxvirus)，模式種羊痘病毒(sheeppox virus)；野兔痘病毒屬(Leporipoxvirus)，模式種粘液瘤病毒(myxoma virus)；豬痘病毒屬(Suipoxvirus)，模式種豬痘病毒(swinepox virus)；軟疣痘病毒屬(Molluscipoxvirus)，模式種接觸傳染性軟疣病毒(Molluscumcontagiosum virus)；和亞塔痘病毒屬(Yatapoxvirus)，模式種亞巴猴腫瘤病毒(Yaba monkey tumor virus)。
21.呼腸孤病毒科(Reoviridae)，包括正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus)，模式種呼腸孤病毒3型(reovirus 3)；環狀病毒屬(Orbivrus)，模式種藍舌病毒1型(bluetongue virus 1)；輪狀病毒屬(Rotavirus)，模式種猿猴輪狀病毒SA11(simian rotavirus SA11)；Coltivirus屬，模式種科羅拉多蜱傳熱病毒(Colorado tick fever virus)；和水生動物呼腸孤病毒屬(Aquareovirus)，模式種金體美洲鳊魚病毒(golden shiner virus)。
22.逆轉錄病毒科(Retroviridae)，包括“哺乳動物B型逆轉錄病毒”屬(Genus“mammalian type B retroviruses”)，模式種小鼠乳腺瘤病毒(mouse mammary tumor virus)；“哺乳動物C型逆轉錄病毒”(Genus“mammalian type C retroviruses”)，模式種鼠白血病病毒(murineleukemia virus)；“禽C型逆轉錄病毒”屬(Genus“avian type Cretroviruses”)，模式種禽白血病病毒(avian leukosis virus)；“D型逆轉錄病毒”屬(Genus“type D retroviruses”)，模式種Mason-Pfizer猴病毒(Mason-Pfizer monkey virus)；“blv-htlv逆轉錄病毒”屬(Genus“blv-htlv retroviruses”)，模式種牛白血病病毒(bovine leukemia virus)；慢病毒屬(Lentivirus)，模式種人免疫缺陷病毒1型(humanimmunodeficiency virus 1)；和泡沫病毒屬(Spumavirus)，模式種人泡沫病毒(human spumavirus)。
23.目單分子負鏈RNA病毒目(Mononegavirales)，包括彈狀病毒科(Rhabdoviridae)，包括水泡性病毒屬(Vesiculovirus)，模式種水泡性口膜炎印地安那病毒(vesicular stomatitis Indiana virus)；狂犬病病毒屬(Lyssavirus)，模式種狂犬病病毒(rabies virus)；和暫時熱病毒屬(Ephemerovirus)，模式種牛暫時熱病毒(bovine ephemeral fevervirus)。
24.衛星病毒(Satellites)，包括dsDNA衛星病毒(dsDNA Satellites)和ssRNA衛星病毒(ssRNA Satellites)。
25.披膜病毒科(Togaviridae)，包括甲病毒屬(Alphavirus)，模式種辛德比斯病毒(Sindbis virus)；和風疹病毒屬(Rubivirus)，模式種風疹病毒(rubella virus)。
用所述生物復合物治療的具體病毒包括呼吸道病毒、胃腸道病毒、免疫缺陷病毒(例如人免疫缺陷病毒(HIV))和腦病毒(例如病毒性腦膜炎病毒)或其它內臟器官病毒。
在性質(例如pH等)方面，粘膜表面的情況相當獨特。然而，本發明的復合物在這樣的條件下仍能保持活性。尤其在以下部位中都存在有粘膜表面鼻道、口腔、咽喉、食道、肺、胃、結腸、陰道和膀胱。尤其可以用本發明治療的粘膜表面包括咽喉、肺、結腸和膀胱表面。本發明尤其適用于治療影響這些部位的病毒，例如HSV。
可按本發明治療的具體的呼吸道病毒包括腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒、鼻病毒、冠狀病毒。
本文所用的術語“HAMLET”是指α-乳清蛋白的生物活性復合物，所述蛋白是按下述方法獲得的按照例如EP-A-0776214所述，使乳汁的酪蛋白部分在pH4.6沉淀出來，通過離子交換層析和凝膠層析進行分離；或者按照WO99/26979所述，在來自人乳酪蛋白的輔因子(以C18:1脂肪酸為特征)存在下，對α-乳清蛋白進行離子交換層析。
α-乳清蛋白可得自不同來源的哺乳動物，包括人、牛、綿羊和山羊的乳汁，但是優選人乳或牛乳，最優選人乳。也可使用該蛋白的重組形式。
已經知道，其它試劑、尤其是脂質(例如油酸)可用于將人α-乳清蛋白轉化成HAMLET。具體地講，先前已報道，油酸(C18:1:9順式)是產生HAMLET所需要的(M.Svensson等，(2000)Proc Natl Acad SciUSA，97，4221-6)。最近發現，其它脂肪酸也可以類似方式作為輔因子。將α-乳清蛋白轉化成HAMLET的最佳輔因子是C18:1脂肪酸，在9位或11位具有順式構象的雙鍵。
α-乳清蛋白是一種14.2kDa的球狀蛋白，帶有4個α-螺旋(殘基1-34，86-123)和反平行β-折疊(殘基38-82)，由4個二硫鍵(61-77；73-91；28-111和6-120)連接在一起(K.R.Acharya等，(1991)J Mol Biol，221，571-81)。α-乳清蛋白的天然構象是由高親和性Ca2+結合位點限定，與Asp82、Asp87和Asp88的側鏈羧基、Lys79和Asp84的羰基氧和2個水分子配位(K.R.Acharya等，(1991)J Mol Biol，221，571-81)。當暴露在低pH時，或者在螯合劑存在下，在HAMLET中發現該蛋白質采用所謂的apo-構象，釋放強結合的Ca2+離子(D.A.Dolgikh等，(1981)FEBS Lett，136，311-5；K.Kuwajima，(1996)Faseb J，10，102-09)。
為了形成生物活性復合物，α-乳清蛋白通常需要構象變化或折疊變化并需要脂質輔因子的存在。從α-乳清蛋白上除去鈣離子，會適當影響構象變化。在一個優選的實施方案中，采用沒有功能性鈣結合位點的α-乳清蛋白變異體，適當地簡化了該過程。
含有所述變異體的生物活性復合物包括在本文所用的術語HAMLET的“修飾物”之內。然而，申請人已經發現，一旦形成了復合物，功能性鈣結合位點的存在和/或鈣的存在，就不會影響復合物的穩定性或生物活性。已經發現，生物活性復合物保留對鈣的親和力，同時也不喪失活性。因此，本發明的復合物還可包含鈣離子。
因此，具體地講，本發明使用生物活性復合物，所述復合物包括α-乳清蛋白、或呈apo折疊狀態的α-乳清蛋白變異體、或它們的任何片段以及使復合物穩定保持生物活性形式的輔因子，前提條件是α-乳清蛋白或其變異體的任何片段包括對應于在α和β結構域之間形成界面的α-乳清蛋白區的區域。
合適的輔因子是順式C18:1:9脂肪酸或順式C18:1:11脂肪酸或具有類似構型的不同脂肪酸。
在一個特別簡便的實施方案中，用于本發明的生物活性復合物包括(i)順式C18:1:9脂肪酸或順式C18:1:11脂肪酸或具有類似構型的不同脂肪酸；和(ii)已除去鈣離子的α-乳清蛋白，或者已釋放鈣離子或沒有功能性鈣結合位點的α-乳清蛋白變異體；或它們的任何片段，前提條件是任何片段都包含對應于在α和β結構域之間形成界面的α-乳清蛋白區的區域。
本文所用的術語“變異體”是指與基礎蛋白(basic protein)同源的多肽或蛋白質，它們適宜是人α-乳清蛋白或牛α-乳清蛋白，但是它們所來源的堿基序列不同，所述序列中一個或多個氨基酸被其它氨基酸取代。氨基酸取代可被認為是“保守的”，其中一個氨基酸被具有大致相似特性的不同氨基酸取代。非保守取代則是氨基酸被不同類型的氨基酸取代。一般而言，少數非保守取代可能不會改變多肽的生物活性。合適的變異體可具有至少60％的同一性，優選至少70％、甚至更優選80％或85％、特別優選90％、95％或98％或更高同一性。
當為了確定同一性程度而對氨基酸序列進行比較時，可以使用例如BESTFIT和GAP(都來自Wisconsin Genetics Computer Group(GCG)軟件包)等程序。例如，BESTFIT比較兩個序列并產生最相似區段的最佳比對。GAP能通過在各序列中合適地插入空位，而比對序列的全長并找到最佳比對。在本發明的內容中，當討論序列同一性時，適宜通過序列的全長比對而進行比較。
術語“其片段”是指給定氨基酸序列的任何部分，所述部分可形成具有與包括完整α-乳清蛋白氨基酸序列的復合物類似活性的復合物。片段可包括不止一個來自全長蛋白質并連接在一起的部分。各部分適宜包括來自基礎序列(basic sequence)的至少5個、優選至少10個連續氨基酸。合適的片段將是缺失突變體，其長度適宜包含至少20個氨基酸，更優選至少100個氨基酸。它們包含來自蛋白質或它們的組合的小區域。
在人α-乳清蛋白中，在α和β結構域之間形成界面的區域限定在結構中的氨基酸34-38和82-86。因此，合適片段包括這些區域，優選來自天然蛋白質的氨基酸34-86的整個區。
在一個具體的優選實施方案中，生物活性復合物包括α-乳清蛋白變異體，其中鈣結合位點已被修飾，使得對鈣的親和力降低，或者不再具有功能。
已經發現，在牛α-乳清蛋白中，鈣結合位點是與殘基K79、D82、D84、D87和D88配位。因此在非牛α-乳清蛋白中，對該位點或其等同位點的修飾(例如去除一個或多個酸性殘基)可以使該位點對鈣的親和力降低，或者完全消除該功能，這類突變體是本發明的優選方面。
牛α-乳清蛋白的Ca2+-結合位點是由310螺旋和α-螺旋組成，兩個螺旋之間具有短轉角區(Acharya K.R.等，(1991)J Mol Biol 221，571-581)。它鄰接兩個二硫橋，使分子的這一部分相當剛硬。與Ca2+配位的7個氧基團中有5個是由Asp82、87和88的側鏈羧基或Lys79和Asp84的羰基氧貢獻出來的。兩個水分子提供余下的兩個氧(Acharya K.R.等，(1991)J Mol Biol 221，57l-581)。
先前已經知道，通過定點誘變將87位天冬氨酸變成丙氨酸(D87A)，能鈍化強鈣結合位點(Anderson P.J.等，(1997)Biochemistry 36，11648-11654)，突變蛋白可采用apo構象。
因此，在一個具體實施方案中，在牛α-乳清蛋白的蛋白質序列中87位氨基酸的天冬氨酸殘基，突變成非酸性殘基，尤其是非極性或不帶電荷的極性側鏈。
非極性側鏈包括丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸或半胱氨酸。尤其優選的實例是丙氨酸。不帶電荷的極性側鏈包括天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸。
為了使突變蛋白的結構變形最小化，D87也已被天冬酰胺(N)取代(Permyakov S.E.等，(2001)Proteins Eng 14，785-789)，其缺乏非補償的羧基負電荷，但具有相同的側鏈體積和幾何結構。已經知道，突變蛋白(D87N)以低親和力結合鈣(K-Ca2×105M-1)(Permyakov S.E.等，(2001)Proteins Eng 14，785-789)。在另一個本發明的優選實施方案中，這樣的突變體構成生物活性復合物的要素。
因此，用于本發明復合物的特別優選的變異體是α-乳清蛋白D87A變異體和D87N變異體，或包含該突變的片段。牛蛋白和人蛋白分子的該區是不同的，因為在牛α-乳清蛋白中3個堿性氨基酸中有一個(R70)變成S70，因而消除了一個配位側鏈。因此，優選當牛α-乳清蛋白用于本發明的復合物時，采用S70R突變體。
在不同物種的α-乳清蛋白中，Ca2+結合位點是100％保守的(Acharya K.R.等，(1991)J Mol Biol 221，571-581)，說明該功能對蛋白質的重要性。它由5個不同氨基酸和2個水分子配位。D87以及D88的側鏈羧基最初減少了鈣離子進入陽離子結合區，并形成穩定其結構的內部氫鍵(Anderson P.J.等，(1997)Biochemistry 36，11648-11654)。已經知道，D87或D88的缺乏會削弱Ca2+的結合，并使分子穩定在部分未折疊狀態中(Anderson P.J.等，(1997)Biochemistry 36，11648-11654)。
此外，也可使用在牛α-乳清蛋白鈣結合位點中具有兩個不同點突變的突變蛋白。例如，已經發現，87位的天冬氨酸被丙氨酸取代(D87A)完全消除了鈣的結合并破壞蛋白質的三級結構。天冬氨酸被天冬酰胺取代，蛋白質(D87N)仍能結合鈣，但親和力較低，并顯示出喪失三級結構，雖然不象D87A突變體那樣明顯(Permyakov S.E.等，(2001)Proteins Eng 14，785-789)。突變蛋白在堆積體積(packingvolume)上表現出最小變化，因為兩個氨基酸都具有相同的平均體積1253，天冬酰胺的羧基側鏈允許蛋白質與鈣配位，但效果較差(Permyakov S.E.等，(2001)Proteins Eng 14，785-789)。兩個突變蛋白在生理溫度下、在apo構象中是穩定的，但是盡管有該構象變化，它們仍是無生物活性的。結果證明，僅有apo構象的構象變化并不足以誘導生物活性。
α-乳清蛋白的結構是本領域已知的，本文所用殘基的準確氨基酸編號可以根據以下文獻所述的結構而確定例如Anderson等，出處同上；Permyakov等，出處同上。
按照本發明制備的藥物適宜是藥物組合物，其形式適于局部給予受病毒感染的特定部位。
例如，對于呼吸道感染而言，該組合物可適于吸入或吹入給予。口服組合物可用于治療胃腸道病毒感染，尤其是胃部感染。治療其它粘膜表面的病毒感染，例如陰道或結腸，可用局部制劑(例如栓劑)進行治療。
局部溶液劑或乳膏劑適宜含有用于蛋白質復合物的乳化劑以及稀釋劑，或者乳膏基質可以更適用于粘膜表面的其它病毒感染。所述制劑可直接施用于粘膜表面。
另外，所述局部組合物可用于治療皮膚病毒感染。
在另一個實例中，組合物的形式適于滴注到膀胱內，以治療膀胱病毒。
累及內臟器官的其它病毒感染可通過輸注到受累部位而進行治療。所述部位可以包括腦、肝、腎、前列腺和卵巢。同樣，免疫缺陷病毒可通過將復合物輸注到負責免疫系統的器官(例如淋巴腺和骨髓)而進行治療。
復合物適于用對流增強給藥(CED)來輸注。
組合物可包含公知的藥學上可接受的載體、填充劑和/或賦形劑(expedient)。
例如，滴注或輸注到膀胱或其它內臟器官的組合物包括活性劑用無菌水或鹽水制成的溶液劑。
本發明的活性劑將會攻擊受病毒感染的細胞，使它們死亡(可能是通過細胞凋亡)，但卻不損傷健康細胞。結果阻止了病毒擴散。
活性化合物的日用量可以變化，這取決于正常臨床實踐中的患者、待治療病毒的性質等。通常采用每天給予200mg/劑至1g/劑的生物活性復合物，每周期至少3天，優選至少5天。
在本發明的另一方面，提供病毒感染的治療方法，所述方法包括給予有需要的患者選自以下的α-乳清蛋白生物活性復合物HAMLET或其生物活性修飾物或它們的生物活性片段。
具體地講，可以將復合物直接給予受病毒感染的細胞。例如，就治療粘膜表面的病毒感染而言，可以將復合物以治療有效量給予所述表面。
生物活性復合物的優選實例如上所述。優選以局部組合物的形式給予生物活性復合物，也同樣如上所述。
權利要求
1.一種選自使腫瘤細胞致死的人α-乳清蛋白(HAMLET)或其生物活性修飾物或它們的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性復合物在制備用于治療病毒感染的藥物中的用途。
2.權利要求1的用途，其中所述病毒感染是呼吸道病毒感染、胃腸道病毒感染、免疫缺陷病毒感染和腦或其它內臟器官的病毒感染。
3.權利要求1或2的用途，其中所述生物活性復合物包括α-乳清蛋白、或呈apo折疊狀態的α-乳清蛋白變異體、或它們的任何片段以及使復合物穩定保持生物活性形式的輔因子，前提條件是α-乳清蛋白或其變異體的任何片段包含對應于在α和β結構域之間形成界面的α-乳清蛋白區的區域。
4.權利要求3的用途，其中所述輔因子是順式C18:1:9脂肪酸或順式C18:1:11脂肪酸或具有類似構型的不同脂肪酸。
5.權利要求1-4中任一項的用途，其中所述生物活性復合物包含按下述方法獲得的HAMLET使乳汁的酪蛋白部分在pH4.6沉淀出來，通過陰離子交換層析和凝膠層析進行分離；或者在來自人乳酪蛋白并以C18:1脂肪酸為特征的輔因子存在下，對α-乳清蛋白進行離子交換層析。
6.權利要求1-4中任一項的用途，其中所述α-乳清蛋白生物活性復合物包含(i)順式C18:1:9脂肪酸或順式C18:1:11脂肪酸或具有類似構型的不同脂肪酸；和(ii)已除去鈣離子的α-乳清蛋白，或者已除去鈣離子或沒有功能性鈣結合位點的α-乳清蛋白變異體；或它們的任何片段，前提條件是任何片段都包含對應于在α和β結構域之間形成界面的α-乳清蛋白區的區域。
7.權利要求6的用途，其中所述生物活性復合物包括α-乳清蛋白變異體，其中所述鈣結合位點已經被修飾，使得對鈣的親和力降低，或者不再具有功能。
8.權利要求7的用途，其中所述變異體在牛α-乳清蛋白中的一個相當于K79、D82、D84、D87和D88的氨基酸上具有突變。
9.權利要求8的用途，其中所述修飾是在D87上，所述修飾物包括具有D87A變異體或D87N變異體的α-乳清蛋白變異體。
10.權利要求1-4中任一項的用途，其中所述生物活性復合物包含α-乳清蛋白或其變異體的片段，其中所述片段包含天然蛋白的氨基酸34-86的整個區。
11.前述權利要求中任一項的用途，其中所述α-乳清蛋白是人α-乳清蛋白或牛α-乳清蛋白或它們的變異體。
12.權利要求11的用途，其中所述α-乳清蛋白是人α-乳清蛋白。
13.權利要求11的用途，其中所述α-乳清蛋白是包含S70R突變的突變型牛α-乳清蛋白。
14.一種治療病毒感染的方法，所述方法包括給予有需要的患者選自以下的α-乳清蛋白生物活性復合物HAMLET或其生物活性修飾物或它們的生物活性片段。
15.權利要求14的方法，所述方法用于治療粘膜表面的病毒感染，并且包括給予有需要的患者的所述表面選自以下的α-乳清蛋白生物活性復合物HAMLET或其生物活性修飾物或它們的生物活性片段。
全文摘要
選自使腫瘤細胞致死的人α－乳清蛋白(HAMLET)或其生物活性修飾物或它們的生物活性片段的α－乳清蛋白生物活性復合物在制備用于治療病毒感染的藥物中的用途。
文檔編號A61P31/12GK1980688SQ200580019236
公開日2007年6月13日 申請日期2005年4月20日 優先權日2004年4月20日
發明者C·斯范博格 申請人:哈姆雷特藥品公司