專利名稱：癌癥調節抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及癌癥調節抗體(CDMAB)的分離和生產，以及CDMAB在治療和診斷過程中的應用，可選擇的與一種或多種化學療劑聯合使用。本發明還涉及利用本發明的CDMAB進行的結合測定(binding assays)。
本發明特別涉及癌癥的診斷和治療，利用5LAC-23單克隆抗體(或從中衍生的抗原性結合片斷)與層粘連蛋白受體1前體蛋白37LRP的結合能力；尤其涉及肝細胞癌的診斷和治療，通過各種依賴于5LAC-23和特定抗原殘基直接結合的方法，所述抗原殘基由5LAC-23特異性識別并通常在肝細胞癌細胞中過量表達。
背景技術：
每一患有癌癥的個體都是獨特的，跟其身份一樣，每個人所患的癌癥都不同于其它癌癥。盡管如此，現有療法都是在同樣的時期、以同樣的方式來治療患有同種癌癥的患者。至少30％的患者的一線治療是失敗的，從而增加了額外的療程以及治療失敗、病毒轉移和最終死亡的可能性。治療的優選方法將是針對特定個體的個性化治療。目前唯一的個性化治療方法是手術。化學治療和放射治療無法針對患者具體情況，而在大多數情況下單靠手術不足以治愈癌癥。
隨著單克隆抗體的出現，開發個性化治療方法的可能性變得更加現實，因為每個抗體能夠針對單一的抗原表位。而且，也可以生產針對多個相關抗原表位的組合抗體，所述多個相關抗原表位唯一確定了某一特定個體的腫瘤。
已經認識到癌細胞和正常細胞之間的顯著差別是癌細胞含有對變異細胞來說具有特異性的抗原，科技界長期認為通過與癌抗原特異性結合，單克隆抗體能夠被設計來特異靶向變異細胞；因此產生了這樣的觀點單克隆抗體能夠作為“神奇子彈(Magic Bullets)”來消滅癌細胞。然而，現在普遍認為沒有一個單克隆抗體能夠用于所有的癌癥，單克隆抗體可以作為一類被開發為目標癌癥的療法。
依照本發明方法分離的單克隆抗體已經顯示出通過對患者有益的方式(如通過降低腫瘤負荷)來調節癌癥過程，在本文將被稱為癌癥調節抗體(CDMAB)或“抗癌”抗體。
目前，癌癥的治療手段很少。已有的癌癥治療方法已經對全球的癌癥存活率有所改善。然而，對于特定個體而言，這些改善的統計數據與他們的個人狀況不是必然相關的。
因此，如果有一種方法學能夠使醫師單獨處理同類腫瘤患者的每個腫瘤，將使每個患者可以用適合自己的獨特方法進行治療。理論上，這種治療過程將提高治愈率，產生更好的結果，從而滿足人們長期感受到的需要。
過去，多克隆抗體已經被應用于人類癌癥的治療，但只取得了有限的成功。已經用人血漿來治療淋巴瘤和白血病，但是很少獲得持久的改善或應答。而且，缺乏重現性，也沒有比化療多出額外的優點。實體瘤(如乳癌、黑素瘤和腎細胞癌)也已經采用人血液、猩猩血清、人血清和馬血清來治療，但是相應的結果是不確定的和無效的。
有很多用單克隆抗體治療實體瘤的臨床實驗。在20世紀80年代，對人乳腺癌進行了至少4次利用抗體針對特異抗原或基于組織選擇性的臨床實驗，在至少47例患者中只產生了1例應答者。直至1998年，才有1次成功的臨床實驗，該實驗聯合使用了人源化的抗Her2/neu抗體(HERCEPTIN)和順鉑(CISPLATIN)。在這次實驗中，評價了37例患者的反應，其中約1/4患者具有部分緩解率(partial responserate)，還有1/4患者疾病進展輕微或穩定。應答者中的中位腫瘤進展時間(median time to progression)為8.4個月，中位緩解期(medianresponse duration)為5.3個月。
HERCEPTIN于1998年被批準一線用藥，與Taxol結合使用。臨床研究結果顯示了中位腫瘤進展時間的增加，接受抗體治療+Taxol的患者(6.9個月)與只接受了Taxol治療的患者(3.0個月)相比較。中位存活時間也有所增加，HERCEPTIN+Taxol治療方式為22個月，Taxol單獨治療為18個月。另外，抗體+Taxol聯合治療組與Taxol單獨治療組相比，完全應答者(8％2％)和部分應答者(34％15％)的數目都有所增加。但是，采用抗體+Taxol治療相比于Taxol單獨治療，導致了較高的心臟毒發病率(13％1％)。在臨床實驗中，Her2/neu的表達水平(通過免疫組織化學方法測定)預示了對HERCEPTIN治療的響應。在轉移性乳腺癌患者中，只有那些過量表達Her2/neu的患者(在病理評分級指示為2-3+)從抗體治療中獲益。大約25％的轉移性乳腺癌患者過量表達Her2/neu而能夠用HERCEPTIN治療；那些沒有過量表達的患者將不會獲益，不能用抗體治療。對HERCEPTIN治療的選擇代表了一種選擇患者的方法，所選患者適合于以疾病分子標志識別為基礎的治療，該方法作為診斷測驗已經被美國FDA批準。但是，還遠未滿足乳腺癌患者的需求。甚至是那些能夠從HERCEPTIN治療獲益的患者，依然需要化療并因此依然不得不面對(至少在某種程度上)這種療法的副反應。
研究結腸直腸癌的臨床實驗涉及同時抗糖蛋白和糖脂類靶的抗體。對腺癌有一定特異性的抗體，如17-1A，已經進行了超過60例患者的2期臨床實驗，其中僅有1例患者有部分反應。在其他應用17-1A的實驗中，使用了附加的環磷酰胺，52例受試患者中僅有1例完全反應和2例輕微反應。其它涉及17-1A的實驗得到了類似的結果。目前為止，17-1A的3期臨床實驗沒有證明其作為輔助療法對III期結腸癌的改善效能。使用首次批準用于影像的人源化鼠單克隆抗體也沒有產生腫瘤消退。
只有近期，在應用單克隆抗體的結腸癌臨床研究中得到了一些正面的結果。2004年，ERBITUX被批準用于表達EGFR的轉移性結腸癌患者的二線治療，這些患者對基于依立替康(irinotecan)的化療是耐受的。雙臂II期臨床研究和單臂研究的結果表明，ERBITUX與依立替康結合使用的緩解率分別為23％和15％，中位腫瘤進展時間分別為4.1個月和6.5個月。同樣的雙臂II期臨床研究和另外一個單臂研究表明，ERBITUX單獨治療的緩解率分別為11％和9％，中位緩總瘤進展時間分別為1.5個月和4.2個月。
因此，ERBITUX與依立替康結合治療在瑞士和美國，以及ERBITUX單獨治療在美國，都已經被批準作為那些在依立替康一線治療中失敗的結腸癌患者的二線治療。因此，與HERCEPTIN一樣，ERBITUX治療在瑞士只被批準作為單克隆抗體和化療的聯合使用。另外，在瑞士和美國，ERBITUX治療都是被批準用于患者的二線療法。在2004年，AVASTIN(阿瓦斯汀)也被批準與靜注為基礎的化療結合使用，作為轉移性結腸癌的一線治療。III期臨床研究結果表明了患者中位存活時間的延長，AVASTIN+5-氟尿嘧啶治療與5-氟尿嘧啶單獨治療相比較(分別為20個月和16個月)。然而，還是與HERCEPTIN和ERBITUX一樣，AVASTIN治療只被批準作為單克隆抗體和化療的結合使用。另外，美國FDA批準了基于HERCEPTIN和ERBITUX抗原性靶的診斷檢測，用于基于免疫組織化學平臺的癌癥診斷。
同樣，對于肺癌、腦癌、卵巢癌、胰腺癌前列腺癌和胃癌，存在同樣差的結果。使用抗GD3單克隆抗體治療黑素瘤獲得了某種有限的成功。因此，可以看到盡管作為人類臨床實驗前的小動物實驗取得了成功，但是迄今為止，試驗過的抗體絕大部分是沒有作用的。
對于肺癌、腦癌、卵巢癌、胰腺癌前列腺癌、胃癌和肝細胞癌的較差結果依然繼續著。在II期臨床實驗中，得到了近期對于非小細胞癌最有希望的結果，其中治療涉及了與細胞殺傷藥物阿霉素交聯的單克隆抗體(SGN-15；doxBR96，抗Sialyl-LeX)，與化學療劑TAXOTERE結合使用。TAXOTERE是唯一經FDA批準用于肺癌二線治療的化學療劑。最初數據表明比單獨使用TAXOTERE具有提高的總存活。該研究的62例受試患者中，三分之二接受了SGN-15和TAXOTERE結合應用，而留下三分之一接受單獨的TAXOTERE。接受SGN-15和TAXOTERE結合應用的患者的中位總存活時間為7.3個月，而接受單獨TAXOTERE的患者為5.9個月。對于接受SGN-15+TAXOTERE的患者在1年和18個月時的總存活分別為29％和18％，相比較的接受單獨TAXOTERE的患者分別為24％和8％。為該藥計劃了進一步的臨床實驗。盡管SGN-15還沒有獲準上市，但自2000年以來，已經有幾個其他的用于癌癥的抗體復合物獲得FDA的批準。這些抗體包括用于治療復發的急性髓細胞樣白血病的MYLOTARG(吉姆單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)，一種人源化抗CD33單克隆抗體)，用于治療非何杰金淋巴瘤的ZEVALIN(替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)，Yttrium偶聯立妥昔單抗(RITUXEVIAB)，人源化抗CD20單克隆抗體)，這些抗體被開發成抵抗癌癥的特異性分子，使它們適于結合毒素或放射同位素。顯然，目前只有血原性疾病得到了偶聯抗體的成功治療，而實體瘤(例如肝細胞癌)更需要這樣的治療。
腫瘤侵入和轉移的特征是一系列涉及癌細胞和宿主細胞外基質的過程。基膜是專門的細胞外機構，在組織位于它上面的細胞過程中起重要作用。腫瘤細胞的轉移包括細胞與細胞外基質(ECM)之間的相互作用。層粘連蛋白是基膜的主要成分，促進細胞附著、增殖、生長、分化和遷移(Kleinman HK等人J Cell Biochem 1985，217317-25.Martin G等人，Annual Rev Cell Biol 1987，357-85.BeckK等人，FASEB J 1990，4148-60)。體外和體內模型顯示，結合于層粘連蛋白的腫瘤細胞與腫瘤侵入、遷移和轉移能力有關(Terranova VP等人，Cancer Res 1982，422265-2269.Varani J等人，Am J pathol 1983，11127-34.Barsky SH等人，J Clin Invest 1984，74843-848.MalinoffHL，Int J Cancer 1984，33651-655.Kanemoto K等人，ProcNatl AcadSci USA 1990，872279-2283)。67kD的層粘連蛋白受體(67LR)是一種非整聯(non-integrin)高親和的層粘連結合蛋白，它在癌細胞中的表達顯著提高并與其他細胞表面蛋白中的層粘連蛋白相互作用(Malinoff HL等人Int J Cnacer 1984，33651-655.Rao CN等人Bicohem Biophys Res Commun 1983，111804-808.Terranova VP等人Proc Natl Acad Sci USA 1983，80444-448.MalinoffH等人J Cell Biol1983，961475-1480.Ruyman RB等人J Cell Biol 1988，1071863-1871.Albelda SM等人FASEB J 1990，42868-2880.Hail DE等人J CellBiol 1990，1102175-2184)。已經表明，67LR的表達在腫瘤(如乳腺、結腸和胃癌)中的表達比正常組織有所增加(Cioce V等人J NatlCancer Inst 1991，8329-36.Castronovo V等人Am J Pathol 1990，1371373-1381.D′Errico A等人Mod Pathol 1991，4239-246)。67kD層粘連蛋白受體(67LR；表1)最初從鼠黑素瘤(Rao等人，1983.Biochem Biophys Res.Commun.111804-808)，fibrosarcoma cells(Malinoff & Wicha，1983.J Cell Biol 961475-1479)和正常牛肌肉細胞(Lesot等人，1983.EMBO J 2861)的細胞膜中分離。此后，在許多種屬中發現了該受體，并存在于廣泛的人體組織中(Barsoum Rohrer andCoggin 2000.Cell MoI Biol Lett.5207-230；Menard等人，1998 J.Cell.Biochem.67155-165；Mecham 1991 Annu Rev Cell Biol 771-91)。
表1層粘連蛋白受體1和前體的類似物
編碼67LR的人cDNA最初是從惡性結腸癌中分離出來的(因此該蛋白也已知為結腸癌層粘連蛋白結合蛋白；Yow等人，l988.856394-6398)，它且比最初所預期的要小。該cDNA預示了295個氨基酸蛋白質的序列編碼，計算分子量為32kD。但是，它在SDS-PAGE凝膠上的位置是37-44kD，這可能是由于酸性蛋白質電泳泳動度的降低(計算pI為4.83)。少數(16)疏水性氨基酸朝向N末端(Castronovo，Taraboletti & Sobel，1991.J.Biol.Chem.26620440-20446)，可能跨越細胞膜。37kD蛋白質和67kD蛋白質表現出抗原性關聯(Rao等人，1989；Biochemistry 287476-7486)，而對黑色素瘤細胞所做的脈沖追蹤實驗表明產生的37kD蛋白被加工成67kD產物(Castronovo等人，1991.Biochem.Biophys.Res.Commun.177177-183)。這些結果表明，這兩種蛋白之間存在直接的前體-產物關系。因此，37kD蛋白被稱為37kD層粘連蛋白受體前體(37LRP；表1)。脈沖追蹤實驗沒有揭示所述前體和最終67LR之間的任何中間形式(Castronovo等人，1991)，盡管檢測到了一種50kD降解產物。37kD多肽在細胞質和細胞膜中可能具有多重功能性作用，并可能是67LR的配體結合組分(Elias Campo等人Am J pathol 1992，141No.5 1073-1083)。癌細胞中，已經表明抗67kD蛋白的抗體結合到細胞表面和細胞質(Wever UM等人CancerRes 1987，475691-5698)。
還沒有完全了解細胞是如何生成最終的受體來獲得67kD受體的，但是可能涉及脂肪酸軟脂酸、油酸和硬脂酸的酰化作用(Landowski，Dratz，& Starkey，1995.3411276-87；Buto等人，1998 J.Cell Biochem.69244-251)。不涉及廣泛的糖基化。預測的cDNA序列不包含N聯糖基化的共有位點，而且盡管存在絲氨酸和蘇氨酸殘基，但沒有O聯糖基基團的證據(Castronovo等人，1991.Biochem.Biophys.Res.Commun.177177-183；Landowski，Dratz，&Starkey，1995.3411276-87)。然而，Castronovo(Castronovo，1993 Invasion Metastasis131-30)表明67LR表達與β-半乳糖苷酶結合外源凝集素交叉反應的抗原決定簇。67LR可以包括聯有脂類的前體多肽二聚物(Landowski，Dratz & Starkey，1998)。已經表明異二聚體可以與一種凝集素樣蛋白或半乳凝素-3一起存在(Castronovo等人，1991；Buto等人，1998)(Castronovo等人，1991；Buto等人，1998)。抗半乳凝素3抗體不僅識別半乳凝素3，還識別67LR(Buto等人，1998)。該受體的最終結構還有待闡明。當67LR從培養液中的細胞表面脫落后，保持其與層粘連蛋白的結合能力(Karpatova等人，1996.J.Cell.Biochem.60226-503)。還不確定67LR是怎樣與細胞膜結合的。雖然該受體具有16個朝向其N末端的疏水氨基酸，但它也可能與締合分子相互作用，而不是以膜內在蛋白的形式存在。但是，已經確定多肽氨基酸的氨基末端在非通透細胞中是難以接觸的，這表明實際上該區域與其他分子相互作用(Castronovo等人，1991.J.Biol.Chem.3020440-20446；Wewer等人，1987 Cancer Res.475691-5698)。
已經表明輔助因子可能與67LR結合，或者其本身作為輔助分子。這些性質可能幫助向細胞表面轉運和/或層粘連蛋白結合。已經注意到67LR和α6β1在小細胞肺癌細胞系中的共表達與細胞對層粘連蛋白的粘附直接相關(Pellergrine等人，1994.Int J Cancer Suppl 8116-120)。當用層粘連蛋白出來人黑素瘤細胞時，67LR和α6β1共易位到質膜(Romanov等人，1994.Cell Adhes Commun.2201-209)。與α6β1結合的67LR介導了大量人記憶T細胞對層粘連蛋白的高親和力的粘附(Clanfield andKhakoo，1999.J.Immunol.1633430-3440)。Ardini等人在1997年發現67LR和α6β4不僅共集中，而且被共調節，通過α6亞基和67LR之間的物理相互作用(Ardini等人，1997；J.Biol.Chem.2722342-2345)。但是，在卵巢癌中，37LRP的mRNA和蛋白質的表達不依賴于α6亞基(Givant-Horwitz，2003 Clin.Exp.Metastasis20599-609；Skubitz等人，1996.Am J pathol 1481445-1461)。綜合這些結果表明，67LR可以與細胞質中的層粘連蛋白特異性整聯蛋白(特別是α6亞基)相結合，從而作為復合體到達細胞膜，在那里兩個受體都參與了層粘連蛋白的識別，并決定相互作用是高親和還是低親和力(Landowski，Dratz，Starkey，1995)。
有效的人類37LRP基因圖譜是3p21.3，那些經常涉及遺傳改變的染色體位點與癌癥相關聯(Jackers等人，1996.Oncogene 13495-503)。有效的基因包含7個外顯子和6個內含子(Jackers等人1996.Oncogene 13495-503；avian gene Clausse等人，1996 DNA CellBiol 151009-1023)。它不包含經典的TATA盒，但是可能具有多個轉錄起始位點。在啟動子區域有4個Sp1位點，內含子1中有6個Sp1位點，內含子3中有2個Alu序列，可能影響選擇剪接。內含子4含有編碼核內小RNA E2的序列(Jackers等人1996.Oncogene 13495-503)。人類基因組中存在至少26個該基因的拷貝，所有都表現出與功能基因的高度同源性(Jackers etal，1996.Biochem Biophys Acta.130598-104)。19個拷貝被分析顯示為是經過加工的擬基因，產生無功能的轉錄物。這些擬基因被認為最可能是由復位生成的(Jackers等人，1996.Biochem Biophys Acta.130598-104)。cDNA在整個進化過程中是高度保守的，鼠、牛和人類序列之間至少有98.3％的同源性，而鼠和人序列共有99％的同源性(Menard等人，1997.J Cell Biochem67155-165)。
37LRP基因似乎產生了大量不同于37LRP的功能性蛋白。37LRP蛋白和參與翻譯結構的p40核糖體結合蛋白(p40多肽；p40；核糖體蛋白SA；ItPSA)之間的同源性為99％(Makrides等人，1988.NucleicAcid Res.162349；Tohgo等人，1994.FEBS Lett.340133-138；Rosenthal & Wordeman 1995.J.Cell Sci.108245-256)。在胚眼發育過程中的一個位置標志物也是由與37LRPcDNA相同的基因編碼的(Rabacchi等人，1990.Development 109521-531；McCafferey，Neveand Drager，1990.PNAS 878570-8574)。
癌胚抗原(OFA；37-44kD)是一種在嚙齒類動物和人類腫瘤和早期胎兒中表達的免疫原性糖蛋白。幼鼠37LRP與OFA的同源性達到99.5％(Coggin，Barsoum，Rohrer 1999.Anticancer Research 195535-5542)。OFA已經被視為37LRP的自身免疫同系物。已經表明OFA刺激鼠和人體內的T和B淋巴細胞，并在癌癥中起免疫原作用，特別是在腎癌中(Zelle-Rieser等人，2001.J.Urol.1651705-9；Holt等人，2002.Clin.Cancer Res.83369-3376；Rohrer等人，1992；J.Natl.CancerInst.(Bethesda)84602-609；Rohrer etal，1994.J.Immunol.155755-764；Rohrer等人，1995.J.Immunol.1555719-5727；Rohrer等人，2001.Mod.Aspects Immunibiol.1191-195；Rohrer等人，1999.J.Immunol1626880-6892)。
有證據表明，可能存在37LRP和67LR的亞型或同系物。在人和牛上皮細胞中鑒定出了55kD蛋白，與37LRP同源(Ireland etal，1998.Clin.Exp.Immunol.112255-261)，并且已經在幼鼠腦組織中發現了大量亞型(Simoneau等人，2003.Biol.Chem.384243-246)。這些蛋白質可能產生于37LRP，該37LRP以多種方式被翻譯后修飾和/或與其他分子相互作用，或者可能產生于其他高度同源的基因。
在許多腫瘤中已經證明了67LR的過量表達和異常表面分布，通過mRNA和蛋白質水平上的各種技術手段得到檢測(For review seeMenard等人1998；Barsoum等人，2000)。已經表明37LRP和/或67LR水平上的變化以疾病進展、侵襲、轉移、惡化和預后等方式來影響腫瘤生物學。
雖然67LR的過量表達與在腫瘤進展中起作用的受體相關聯，但進展的時期可能依賴于腫瘤類型(Campo等人，1992.Am J Pathol 411073-83；Demeter等人，1992 Cancer Res.521561-1567；Martignone等人，1992.Clin.Exp.Metastasis 10379-386breast cancer；Vasso等人，1993；Cancer 15455-461melanoma；Boukerche等人，2004.Gene343191-201melanoma；Waltregny等人1997.J.Natl.Caner Inst891224-1227)。與腺瘤相比，腺癌中可以看到冷凍的直腸結腸組織中37LRP mRNA的增加，但是水平在正常和腺瘤組織之間是恒定的。這些結果表明，37LRP或67LR的表達是從腺瘤到腺癌/Dukes C癌的疾病進展過程中的后期結果(Campo等人，1992.Am J Pathol 411073-83.)。相反，37LRP mRNA在腺瘤頸部損傷中有所增加，表明了一種疾病進展過程的早期結果(Demeter等人，1992 Cancer Res.521561-1567)。67LR作為一種譜系相關抗原也被牽涉入單核細胞系的急性髓性白血病中(AML；Montouri等人，1999.Clin.Cancer Res.51465-1472)。
其他研究已經表明67LR可能在侵襲和轉移中起作用，意味著它在多種腫瘤中的轉移表型的獲取中起著重要作用(Wewer等人，1987.Cancer Res 475691-8；Castronovo & Sobel 1990.Biochem Biophys ResCommun 681110-1117；Cioce等人，1991.J Natl Cancer Inst 8329-36；Sobel，1993 Semin.Cancer Biol.4311-317；Castronovo InvasionMetastasis 1993 131-30；You等人，1988.PNAS 856394-6398；Pelosi等人，1997.J.Pathol.18362-69；Boukerche等人，2004.Gene343191-201).例如，已經顯示，在具有更大的惡性潛力的人結腸細胞系和組織中mRNA水平增加(Kondah等人，1992.Cancer Res 52791-796)。當細胞經過血漿的一種IgG餾分預處理后出現了人纖維肉瘤細胞系的轉移抑制，所述血漿來源于經37LRP-GST融合蛋白免疫的兔(345bp cDNA；13kD；Narumi等人，1999.Jpn J.Cancer Res.90425-431)。上述血漿還減少了細胞與層粘連蛋白的附著，以一種劑量依賴方式。37LRP的反義RNA還體外抑制了分化不良的人結腸癌細胞系(Mafune and Ravikumar，1992.J.Surg.Res.52340-346)。
轉移過程中67LR表達的增加經常相應有另一個非整聯的層粘連蛋白結合蛋白(半乳凝素3)表達的減少(van den Brule etal，1994.Eur.J.Cancer 32A1598-1602；Xu etal，1995.Am.J.Pathol.147815-822；Castronovo等人，1995.J.Pathol.17943-48；Lotz等人，1993.PNAS903466-3470)。這些結果表明這兩個層粘連蛋白受體是被反向調節的，這可以解釋層粘連蛋白結合親和力的變化，取決于哪個受體被使用。相反，已經觀察到了半乳凝素3表達增加與結腸癌惡性之間的直接關聯(Schoeppner.等人，1995 Cancer 752818-2826)。
67LR表達可能也是腫瘤侵襲性的一個標志，因為增加的表達經常與增殖和顯著的腫瘤生長相關聯。在快速增殖中的人肺癌組織和胰腺內分泌腫瘤(Pelosi等人，1997.J.Pathol.18362-69)中檢測到了增加的37LRP mRNA水平(Satoh等人，1992.Biochem.Biophys.Res.Commun 182746-752)。人乳頭狀瘤病毒相關的頸部新生物中，37LRPmRNA的水平與細胞的增殖特性相關聯而不是與細胞的侵襲特性相關聯(Demeter等人，1992)。將反義37LRP RNA導入幼鼠肺癌細胞系T11中，延長了它們的倍增時間(Satoh等人，1999.Br.J.Cancer 801115-1122)。這些細胞還與層粘連蛋白產生較弱的相互作用，在皮下注射經反義RNA處理過的細胞后，小鼠的存活時間被延長了。67LR在腫瘤侵襲中也起作用，因為它可以增強層粘連蛋白-1的溶蛋白性裂解，從而提高基膜的降解速度(Ardini等人，2002.Cancer Res.621321-1325)。
37LRP和/或67LR的過量表達也可能與幾種腫瘤中的預后不良有關(Barsoum Rohrer and Coggin 2000.Cell MoI Biol Lett.5207-230；Menard等人，1998 J.Cell.Biochem.67155-165；Menard，Tagliabue andColnaghi，1998.Breast Cancer Res.Treatment 52137-145)。在生成層粘連蛋白的乳腺癌中，預后是不利的(Martigone等人1993.J Natl.Cancer Inst.85379-386；Pellegrini等人，1985 Breast Cancer Res Treat35195-199)。人淋巴瘤中，67LR在CD30+間變性大細胞淋巴瘤細胞表面以及在高級B細胞非霍其金(non-Hodgkin′s)或霍其金(Hodgkin′s)淋巴瘤的小亞基中被檢測到(Carbone等人，1995.Hum.Pathol.2541-546)。
最近，67LR已經被牽涉入與腫瘤生物學不同的生物過程。發現該受體得到了細胞因子、炎性試劑、與包括層粘連蛋白和類固醇在內的細胞外基質之間相互作用的正向調節(Menard等人，1998)，這表明37LRP和67LR可以在正常情況下得到調節。67LR在淋巴細胞趨化、粘附和尋靶中和/或在宿主防御機制中起著作用。已經在一部分(10-15％)人類活化的外周血液記憶T細胞(CD4+和CD8+單陽性)表面發現了67LR。它還顯示在響應神經肽過程中被正向調節(Chen等人，2002Nat.Med.81421-1426)。Ferrarini等人在1996年的一項研究支持了該受體的免疫作用，因為，集中在肺腫瘤位置的γδ+淋巴細胞通過與67LR相互作用而能夠殺傷肺癌細胞(Ferrarini等人，1996.J.Natl.Cancer Inst.88436-441)。這種殺傷顯示出不依賴于自然殺傷細胞(NK)、淋巴因子活化細胞(LAK)和T細胞受體(TCR)，而層粘連蛋白能夠提供一種協同刺激信號。67LR也可以影響其他類型細胞的生長、遷移和轉運。67LR與GM-CSF受體的α(αGMR)和β(βGMR)亞基相互作用(Chen等人，2003.PNAS 10014000-14005)并抑制GM-CSF受體復合物的形成。GM-CSF調節骨髓前體細胞的生長、分化和成熟，并增強成熟的中性白細胞、嗜酸性粒細胞和單核吞噬細胞的功能。67LR可以通過防止GM-CSF復合物的生成來抑制這些活性。由于已經在上皮細胞和Paneth細胞分泌粒中發現了67LR，從而暗示了67LR的分泌和胞吞作用(Shmakov等人，2000.J.Pathol.191318-322)。
67LR與層粘連蛋白相互作用的確切方式還未明確。67LR的兩個肽結構域被認為是可能的層粘連蛋白結合位點。其中之一是G肽，一種衍生于37LRP序列的合成肽，含有回文序列LMWWML。研究表明，它與層粘連蛋白結合，抑制腫瘤細胞與上皮細胞的結合，并在裸鼠中增加人黑素瘤細胞的轉移(Castronovo等人，199l J Biol.Chem.26620440-20446；Castronovo，Taraboletti and Sobel 1991.Cancer Res.515672-5678；Taraboletti等人，1993.J.Natl.Cancer.Inst.85235-240)。研究發現，G肽增加并穩定了層粘連蛋白與腫瘤細胞的結合(Magnifico等人，1996.J.Biol.Chem.27131179-31184)。第二個可能的層粘連蛋白結合域是從37LRP的C末端序列(a.a.205-229；Landowski，Uthayakumar，Starkey，1995.Clin.Exp.Metastasis 13357-372)的疏水性而預測的。它也可能是67LR與層粘連蛋白相互作用的一個凝集素結構域，因為受體對層粘連蛋白的識別依賴于乳糖(Castronovo等人，1991.Biochem.Biophys.Res.Commun.177177-183)。
67LR可以與層粘連蛋白殘基YIGSR(a.a.929-933；β1鏈；Massi，Rao和Hubbell，1993.J.Biol.Chem.2688063-8059；Landowski，Uthayakumar，Starkey，1995.13357-72)、IKVAV(a.a.2091-2108；α鏈；Kibbey等人，1993.PNAS 9010150-10153)和LGTIPG(a.a.442-446；β1鏈；Mechametal 1989 J.Biol.Chem.26416652-16657)結合。67LR也可以與層粘連蛋白的疏水成分結合，特別是聚合(乳糖-氨基)結構、半乳糖((α1，3)半乳糖鍵合和末端非還原的β-半乳糖殘基(Mecham，1991 Annu.Rev.Cell.Biol.771-91)。與YIGSR殘基的結合抑制轉移(Iwamoto等人，1996.Br.J.Cancer 73589-595)，而與IKVAV的相互作用刺激轉移(Bresalier等人，1995.Cancer Res.552476-2480)。由于自從1983年發現了67LR這第一個層粘連蛋白受體以來，至少14個其他的層粘連蛋白受體(Mecham 1991)被公開，并可以利用同樣的層粘連蛋白結合位點。
67LR也與除了層粘連蛋白以外的其他分子相互作用，這些分子包括彈性蛋白(Grosso等人，1991.Biochemistry 303346-3350)、纖維結合素(FN)、IV型膠原(Narasimhan等人，1994.PNAS 917440-7444；Iwabuchi等人，1996 Blood 87365-372)和肝素(Guo等人，1992.PNAS 893040-3044)。其他研究還顯示67LR作為辛德比斯病毒(sindbis virus)受體(Wang等人，1992 J.Virol.664992-5001)，而37LRP能實現阮病毒蛋白的攝取(Rieger等人，1997.Nat.Med.31383-1387)。
肝癌最普通的肝臟原發惡性腫瘤是肝細胞癌(HCC)。HCC發病率在乙型和丙型肝炎病毒的高危人群中是增加的。已經患有慢性肝炎、肝硬化、血色沉著病和兩種先天性肝功能障礙(α-1-抗胰蛋白酶缺陷和酪氨酸血癥)的患者也是發生HCC的高危人群。某種毒素或化學試劑也可能導致原發性肝癌，包括黃曲霉毒素，在非洲未適當貯存的花生中發現的一種霉菌產物。即使通過切除而成功去除HCC，還是很可能復發和轉移的。大量研究顯示了多種關于原發性肝癌及轉移復發的預后標志(Qin和Tang，2004.J Cancer Res Clin Oncol 130497-513)。
與HCC并發的肝臟疾病表明，結構改變可以增加發生原發性肝癌的機率。在正常情況下，肝細胞的特征是沒有基膜(Schaffher和Popper 1963 Gastroenterology 44230-242)。細胞外基質蛋白(包括層粘連蛋白)作為肝硬化的發展產物而生成并聚集在竇狀隙周圍，形成了一種結構基膜。研究發現，層粘連蛋白5存在于原發性HCC根瘤中，而不在正常或外周腫瘤性硬化組織中(Giannelli等人，2003.Clin.Can.Research.93684-3691)。研究顯示層粘連蛋白誘導細胞角蛋白19的表達，這表明層粘連蛋白沉著物導致了其他蛋白的異常表達(Su等人，2003.World J Gastroenterol921-929)。有可能層粘連蛋白的表達提高了其任何受體的表達。
1990年，發現67LR在肝細胞中表達(Clement等人，1990.J.CellBiol.110185-192)，盡管它不是存在的唯一層粘連蛋白受體。在取自HCC和肝硬化患者的肝臟樣本中發現，新生腫瘤區域的67LR陽性細胞數目比相鄰軟細胞組織有所增加(Grigioni等人，1991，Am J Pathol138647-654)。另外一項研究(Ozaki等人，1998.Gut 43837-842)在正常肝組織中檢測到了37LRP mRNA的弱表達。mRNA水平在具有慢性肝病的非癌性肝組織中有所增加，而在腫瘤區域增加的更多。37LRP的翻譯及表達的蛋白質在該項研究中沒有被確定(Ozaki等人，1998.Gut 43837-842)。在轉移的HCC組織中觀察到了增加的67LR生物合成，RNA增加和蛋白質增加之間具有直接關系(Zheng等人，1997.J Tongji Medical University.17200-202)。L-02正常肝細胞和癌細胞系HepG2和SMMC-7721顯示了37LRP mRNA和67LR不同的表達模式，這與細胞系的腫瘤狀態無關(Zheng等人，2002.Chinese JCancer 22248-252)。但是，癌細胞系SMMC-7721可以表達比其他細胞系更高的層粘連蛋白結合親和力，盡管這不能單獨歸功于67LR，因為使用了整個細胞用于結合研究。但是，一項蛋白組學研究顯示，67LR在高度轉移的細胞系MHCC97-H中被正向調節，與低轉移的對照MHCC97-L相比較(Li等人，2001.World J Gastroenterol 7630-636；Ding等人，2004.Proteomics 4；982-994)。67LR在HCC轉移中是否起直接作用還不確定。
現有專利US5750102公開了一種方法，用MHC基因轉染患者腫瘤細胞，MHC基因可以從患者的組織或細胞中克隆。然后將這些經轉染的細胞用于接種患者。
US4861581公開了一種方法，該方法包括如下步驟獲得單克隆抗體，該抗體對哺乳動物的腫瘤細胞及正常細胞的內部細胞成分有特異性而對外部成分沒有特異性；標記單克隆抗體；將標記抗體與已經接受過腫瘤細胞殺滅治療的哺乳動物組織接觸；以及通過測定標記抗體與退化腫瘤細胞內部細胞成分的結合來確定治療的效果。在制備導向人類細胞內抗原的抗體的過程中，專利權人認識到癌細胞是這類抗原的一個方便來源。
US5171665提供了一種新型抗體和該抗體的生產方法。具體的，該專利說明了單克隆抗體的制備，所述單克隆抗體具有與人類腫瘤相關蛋白抗原(如結腸和肺的)牢固結合的性質，而與正常細胞的結合程度要小得多。
US5484596提供了一種癌癥的治療方法，該方法包括手術去除腫瘤患者的腫瘤組織；處理腫瘤組織以獲得腫瘤細胞；照射腫瘤細胞，使其存活但沒有致瘤性質；以及用這些細胞為患者制備疫苗，該疫苗能夠抑制原發性腫瘤的復發并同時抑制病灶轉移。該專利公開了與腫瘤細胞表面抗原具有反應性的單克隆抗體的研制。如第4欄第45行等處說明，專利權人在對人類腫瘤具有活性特異的免疫治療的單克隆抗體研發過程中，利用了自體腫瘤細胞。
US5693763說明了人類癌細胞的糖蛋白抗原特性不依賴于原發的上皮組織。
US5783186說明了誘導Her2表達細胞凋亡的抗Her2抗體，產生抗體的雜交瘤細胞系，使用抗體和含有所述抗體的藥物組合物治療癌癥的方法。
US5849876描述了用于生產單克隆抗體的新型雜交瘤細胞系，所述抗體針對從腫瘤和非腫瘤組織來源中提純的粘蛋白抗原。
US5869268公開了生成人體淋巴細胞的方法，該淋巴細胞產生對目標抗原具有特異性的抗體，同時公開了一種生產單克隆抗體的方法及由該方法生產的單克隆抗體。該專利特別公開了用于診斷和治療癌癥的抗HD人類單克隆抗體的生產。
US5869045涉及和人體癌細胞反應的抗體、抗體片段、抗體偶聯物和單鏈免疫毒素。這些抗體的功能機理是雙重的，因為這些抗體一方面與展示在人體癌細胞表面的膜抗原具有反應性，另外這些抗體還能夠陷入癌細胞，隨后結合，使它們特別用于形成抗體-藥物和抗體-毒素結合物。以未修飾形式出現的抗體在特定濃度下也表現出細胞毒性質。
US5780033公開了自體抗體用于腫瘤治療和預防。不過，該抗體是從成年哺乳動物中得到的抗細胞核自體抗體。這里，自體抗體是指在免疫系統中發現的一種天然抗體。因為自體抗體來源于“成年哺乳動物”，因此就不要求自體抗體真正來源于受治患者。此外，該專利公開了來自成年哺乳動物的天然的單克隆抗細胞核自體抗體以及生成單克隆抗細胞核自體抗體的雜交瘤細胞系。
發明內容
本發明的發明人在此之前已經被授予了名稱為“個體化患者特異抗癌抗體”的美國專利6180357，是關于一種用于治療癌癥的個體化篩選個性化抗癌抗體的方法。基于本文目的，術語“抗體”和“單克隆抗體”(mAb)可以互換使用，是指雜交瘤(如鼠或人)生成的完整的免疫球蛋白、免疫交聯物，以及從所述免疫球蛋白衍生的適當的免疫球蛋白片斷和重組蛋白，如雜合的和人源化的免疫球蛋白、F(ab′)和F(ab′)2片斷、單鏈抗體、重組免疫球蛋白可變區(Fv)s、融合蛋白等。基于本文目的，術語“組織樣品”是表示從哺乳動物中獲得的至少一種細胞或細胞凝聚物。現有技術公認一些氨基酸序列在多肽中是可變的，并對蛋白質結構或功能沒有顯著影響。在抗體的分子重排中，骨架區的核苷酸或氨基酸序列變化通常是可以接受的，這些變化包括(但不限于)置換(優選為保守置換)、缺失或增加。另外，本發明還包括將本發明的CDMAB和標準的化學治療藥征(如放射性核素)結合起來，從而集中了所述化療的作用。CDMAB還能與毒素、細胞毒殘基、酶(如生物素結合酶)或造血細胞結合，藉此形成抗體結合物。本文描述了這種結合部分與來源于雜交瘤細胞系(命名為6BD-25)的單克隆抗體相結合；利用來源于命名為5LAC-23的雜交瘤細胞系的單克隆抗體能夠形成類似的抗體結合物。
腫瘤相關單克隆抗體作為細胞毒素劑載體的使用在過去幾年已經得到很多關注。這項工作的主要目的是提高結合藥物或毒素的抗癌藥物的效力，同時減少不希望的和經常發生的毒性副反應。
為使該方法有效，抗體必需有高度的腫瘤選擇性，藥物必需以有效的細胞毒形式給入。細胞毒藥物(如甲氨喋呤、柔紅霉素、絲裂霉素C(MMC)和長春藥屬(VINCA))已經被連接到抗體上并考察了由此得到的復合物的抗腫瘤活性。另外，生物制品(如假單胞菌外毒素)和新型毒素(如刺孢霉素和Auristatins)已經被分別用來提高抗CD33和抗CD30抗體的效力。現有技術中有許多實施例，描述了抗體與藥物通過多種相對穩定的化學鍵的連接，具有較慢的非特異性釋放。放射性核素，如碘131、釔90或銦111也能夠與抗體連接，用于殺滅腫瘤或診斷成像。不論什么方法，根本目的是要消滅腫瘤特異性方法能通過特定的抗37LR抗體來確定，利用所述抗體的目的是能夠顯著改變那些表達37LR抗原的細胞的靶向方法。
本發明利用了美國專利6180357中公開的生產患者特異性抗癌抗體的方法，用以分離編碼癌癥調解單克隆抗體的雜交瘤細胞系。可以為一種腫瘤而專門制備這些抗體，從而使癌癥的個性化治療成為可能。在本發明公開的內容中，具有殺滅細胞(細胞毒素的)或抑制細胞生長(細胞生長抑制的)性能的抗癌抗體將在下文中被稱為細胞毒。這些抗體能夠用于幫助癌癥分期和診斷，也可用于治療腫瘤轉移和原發性腫瘤。
個性化抗癌治療的前景將給患者的治療方式帶來變化。一種可能的臨床情境是在一種腫瘤出現時就取樣并入庫。通過該樣品，能夠通過已有的癌癥調節抗體庫對該腫瘤進行分類。患者將被常規分期，但可用的抗體可以對患者進一步分期。可以用已有的抗體立即對患者進行治療，和/或腫瘤特異性抗體庫可以使用本發明公開的方法或者使用噬菌體展示庫并結合本發明公開的篩選方法來生成。生成的所有抗體將被添加入抗癌抗體庫，因為其它的腫瘤細胞可能具有與被治療的腫瘤相同的抗原表位。根據本方法生成的抗體可以用于治療任何數量的、患有與這些抗體結合的癌癥的患者。
本發明實質上利用了美國專利6180357中說明的生產患者特異性抗癌抗體的方法，用以分離編碼癌癥調解單克隆抗體的雜交瘤細胞系。可以為一種腫瘤而專門制備這些抗體，從而使癌癥的個性化治療成為可能。在本發明公開的內容中，具有殺滅細胞(細胞毒素的)或抑制細胞生長(細胞生長抑制的)性能的抗癌抗體將在下文中被稱為細胞毒。這些抗體能夠用于幫助癌癥分期和診斷，也可用于治療腫瘤轉移和原發性腫瘤。
個性化抗癌治療的前景將給患者的治療方式帶來變化。一種可能的臨床情境是在一種腫瘤出現時就取樣并入庫。通過該樣品，能夠通過已有的癌癥調節抗體庫對該腫瘤進行分類。患者將被常規分期，但可用的抗體可以對患者進一步分期。可以用已有的抗體立即對患者進行治療，和/或腫瘤特異性抗體庫可以使用本發明公開的方法或者使用噬菌體展示庫并結合本發明公開的篩選方法來生成。生成的所有抗體將被添加入抗癌抗體庫，因為其它的腫瘤細胞可能具有與被治療的腫瘤相同的抗原表位。根據本方法生成的抗體可以用于治療任何數量的、患有與這些抗體結合的癌癥的患者。
實際上利用US 6180370和US 6657048中描述的方法，用患者的乳腺和肺腫瘤活組織檢查細胞對鼠進行免疫接種之后，分別得到小鼠單克隆抗體6BD-25和5LAC-23。利用細胞ELISA/FACS，最初并沒有在許多種人類正常和癌細胞系中檢測到6BD-25抗原。通過將6BD-25抗體與生物素結合而提高了實驗靈敏度之后，在乳腺癌細胞系MDA-MB-231和卵巢癌細胞系C-13、OVCA-429和OV2008中檢測到了該抗原。乳腺癌細胞系Hs574.T對未純化的6BD-25的細胞毒作用是敏感的。受試細胞系，只有乳腺癌細胞系MCF-7、卵巢癌細胞系OVCAR-3和結腸癌細胞系SW1116這3種癌細胞系對純化的6BD-25的細胞毒作用敏感。通過使用FACS分析，在SW620結腸癌細胞系上檢測到了針對5LAC-23的抗原，而在任何其他受試細胞系上都沒有檢測到該抗原。乳腺(Hs574.T)、肺(NCI-H661)和皮膚(A2058)癌細胞系對未純化的5LAC-23的細胞毒作用是敏感的。卵巢癌細胞系OVCAR-3是受試癌細胞系中唯一對純化的5LAC-23的細胞毒作用敏感的。
當移植入鼠體內后，6BD-25在培養液中的抗OVCAR-3和SW1116的細胞毒作用被進一步擴大，通過其對這些細胞的抗腫瘤活性。在體內結腸癌模型中，人類SW1116細胞經頸背皮下注入，而對于卵巢癌體內模型，人類OVCAR-3細胞經腹腔注入。對于兩種模型來說，都使用了免疫缺陷小鼠，因為它們由于缺乏特定免疫細胞而不能排斥人類腫瘤細胞。臨床前的異種移植腫瘤模型被認為是治療效力懶得有效預測手段。小鼠中的異種移植物長成實體瘤，發展了基質、中心性壞死和新生血管。腫瘤細胞系OVCAR-3和SW1116作為體內異種移植模型在免疫缺陷的小鼠體內被評價。OVCAR-3和SW1116腫瘤良好的植入或“成活率”以及它們對標準化學療劑的敏感性，使它們成為合適的模型。親本細胞系及細胞系的變種已經被應用于異種移植模型中，來評價各種治療劑。
在人類結腸癌的預防性體內模型中，6BD-25在腫瘤細胞植入前一天給入小鼠，隨后每周注射一次，持續7周。治療期間，6BD-25治療在抑制腫瘤生長方面比緩沖液對照明顯有效(p＝0.001)。在治療期末，給入6BD-25的小鼠的腫瘤生長只有對照組的54％。在治療后的隨訪期間，6BD-25的治療效果依然持續，受治組的平均腫瘤體積基序顯著小于對照組，直到檢測期結束(p＝0.002)。6BD-25治療顯示出是安全的，因為它沒有誘導任何毒性體征，包括體重降低或臨床不良應激的其他體征。因此，6BD-25治療是有效的，因為與對照治療組相比，它在完備的人類結腸癌模型中延緩了腫瘤生長。
除了預防性的結腸癌體內腫瘤模型，6BD-25在預防性卵巢癌體內腫瘤模型中表現出抗OVCAR-3細胞的抗腫瘤活性。在這一異種移植腫瘤模型中，OVCAR-3卵巢癌細胞經腹膜植入免疫缺陷鼠，在植入后開始治療，總共10個劑量。將6BD-25治療與緩沖液對照相比較。體重被用作腫瘤進展的替代量度標準。增加的體重指示了腫瘤負擔，因為體重增加是由腹水形成導致的。在植入后80天(治療結束后16天)，治療組的小鼠體重明顯低于對照組(p＝0.002)。而且6BD-25治療比對照組具有顯著的存活受益(p＜0.02)。另外，6BD-25治療表現的安全，因為它沒有引發任何毒性或臨床不良應激的體征。6BD-25的抗腫瘤活性及其明顯無毒性使其成為一種令人關注的抗腫瘤治療劑。
如果患者的初期治療沒有效果或發生了轉移，則可以重復腫瘤特異抗體生成過程來進行治療。而且，抗癌抗體可以和患者的紅細胞結合并再次注入來治療病灶轉移。目前對轉移癌癥的有效治療很少，轉移通常預示著糟糕的出院率而導致死亡。不過，轉移的腫瘤通常有較好的血管生成，通過紅細胞進行的抗癌抗體的輸送具有將抗體聚集在腫瘤位置的作用。甚至在轉移前，大多數癌細胞依靠宿主血液供應來存活，而與紅細胞結合的抗癌抗體同樣能有效抵抗原位腫瘤。可選擇的，抗體可以和其它造血細胞結合，如淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞、自然殺傷細胞，等等。
目前有五類抗體，每類抗體具有一種其重鏈所賦予的功能。通常認為通過裸露抗體的癌細胞殺傷作用由抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)或補體依賴性細胞毒作用(CDC)來介導。例如，鼠IgM和IgG2a抗體能夠通過與補體系統中的C-1組分結合來激活人類補體，從而激活補體激活的經典途徑，這能導致腫瘤細胞溶解。對于人類抗體，最有效的補體激活抗體通常是IgM和IgG1。鼠同種型抗體IgG2a和IgG3在俘獲具有Fc受體的細胞毒性細胞過程中起作用，導致由單核細胞、巨噬細胞、粒細胞和某些淋巴細胞的細胞殺傷作用。人類同種型抗體IgG1和IgG3都介導ADCC。
抗體介導的癌細胞殺傷作用的另一種可能的機制是可以通過利用抗體催化功能，來水解細胞膜與其結合的糖蛋白或糖脂之間的化學鍵，即所謂的催化抗體。
還有兩種被普遍接受的抗體調節癌細胞殺傷的機理。第一種是利用抗體作為疫苗來誘導機體對腫瘤細胞表面的特定癌抗原產生免疫反應。第二種是利用抗體來靶向生長受體并干擾其功能或下調該受體以使其功能喪失。
在與疾病發病明確有關的30000個已知基因的產物中，缺少相關變點的識別而阻礙了治療疾病新藥的發現。在腫瘤學研究中，潛在的藥物靶點經常被容易的選出，因為它們在腫瘤細胞中過量表達。然后，將上述被識別的靶點與大量化合物進行相互作用篩選。對于可能的抗體治療，這些候選化合物一般通過單克隆抗體生成的傳統方法而獲得，根據Kohler和Milstein制定的基本原理(1975，Nature，256，495-497，Kohler and Milstein)。脾細胞從抗原免疫小鼠中被收集(如全細胞、細胞餾分、純化的抗原)并與永生化雜交瘤配偶體融合。所得到的雜交瘤經過篩選，獲得能分泌與靶點最有效結合的抗體的雜交瘤。許多導向抗癌細胞的治療性和診斷性抗體(包括HERCEPTIN和RITUXIMAB)已經通過這些方法而被生成并基于它們與靶點的親和力和特異性而被選擇。對腫瘤細胞具有細胞毒作用的抗原特異性試劑能與表達所述抗原的細胞相結合，通過自身或者與其他分子(如毒素、藥物或放射性同位素)結合而具有細胞水平上的體內生理活性，從而抑制腫瘤細胞的生長、進展和轉移，且對正常細胞群沒有明顯的損害作用，作為潛在的治療和/或診斷工具，這些抗原特異性試劑的開發將是非常有益的。
為了確認5LAC-23抗原表位是癌癥相關靶點，檢測了5LAC-23抗原在冷凍的正常人組織中的表達。通過免疫組織化學顯示，5LAC-23在正常組織中表達有限。這一點通過檢測5LAC-23抗原在組織芯片中經福爾馬林固定、石蠟包埋的正常器官中的表達而得到證實。總之，5LAC-23對正常組織是弱染色，表明該抗原在正常肝臟、胃、腦和腎組織中的表達是受限制和減少的，相對于在腫瘤(如HCC)中(見下)。在體內，這種表達有時還被限制在細胞質中，完成的抗體一般難以進入細胞質。在同樣的組織芯片中，5LAC-23抗原在HCC中的表達是顯著的，雖然在胃腺癌中也有表達。
對HCC中的靶點進行更廣泛的研究，利用免疫組織化學來檢驗5LAC-23抗原在這種癌中的普遍性。令人驚訝的是，55個肝癌樣品中有73％表達了這個靶點。為了證明作為靶點在診斷、治療診斷、預后或治療中的效用，比較了該靶點在相應的正常肝臟和肝癌中的分布。顯然，5LAC-23只染色了腫瘤樣品并特別針對這些切片中代表惡性組織的中心區域。這些切面在用同種型對照染色時呈陰性，表明5LAC-23的結合是特異性的，支持了5LAC-23抗原的腫瘤專一性觀點。而且，已經表明，可以使用多種測定法來檢測5LAC-23抗原，一些非限制性的具體實施方式
將以實施例的方式納入本文，例如通過Western雜交、FACS分析和免疫組織化學。其他測定法對于所屬領域技術人員來說是顯而易見的并包含在本發明范圍內，包括ELISA、免疫組織化學、基于免疫親和的實驗(如SELDI質譜分析)、表面細胞質基因組共振測定(surface plasmon resonance determinations)、放射性免疫測定和分子診斷實驗。如這里所述，額外的生化數據還表明5LAC-23識別的抗原是37LRP的一個表位。這一點通過使用雙向電泳、Western雜交和質譜分析來鑒定5LAC-23抗原而得到支持。靶點抗原的鑒定通過證明靶點與抗體的共區域化而得到確認，已知所述抗體與37LRP結合，如在Western雜交以及組織和細胞的免疫組織化學研究中的H-150，已知所述組織和細胞表達37LRP或者經37LRP的cDNA轉染。重要的是，與其他抗37LRP抗體(H-150)相比，5LAC-23表現出獨特的結合模式。這表明兩種抗體所識別的表位是不同的，使用5LAC-23具有更嚴格的結合。另外，在實施例12中，H-150檢測所有細胞系中的37LRP，但是5LAC-23所識別的抗原表位的表達在不同的細胞裂解物中有變化，而且在一些細胞裂解物中不存在。抗體間的這種差別不是由于5LAC-23與其抗原的親和力相對于H-150更低，因為兩個抗體與CHO細胞裂解物的結合是相似的。支持5LAC-23和H-150所檢測的表位之間的差異，5LAC-23在非還原條件下檢測到了LS174T裂解物中獨特的、大約110kD的斑點(圖16B，泳道12)。該斑點在還原條件下消失，而對應于37LRP前體的譜帶沒有增強。這些結果提供了進一步的證據與已知的抗LRP抗體H-150相比，5LAC-23在37LRP上識別的表位是獨特的。這些IHC和生化結果證明5LAC-23導向一種獨特的37LRP抗原表位。
腫瘤藥物的臨床應用基于該藥物在可接受的危險評估之下的受益。在癌癥的治療中，存活率通常是最重要的受益目標，但是除了延長壽命外，還有一些其它公認的受益。這些對存活沒有負面影響的其它受益包括癥狀的減輕、防止負面影響、延長復發周期或無瘤存活時間和延長疾病進程。這些標準被普遍接受，美國食品藥品監督管理局(FDA)等管理機構批準產生這些受益的藥物(Hirschfeld等人.Critical Reviews in Oncology/Hematology 42137-143 2002)。除了這些標準外，人們充分認識到還有其他特征可以預示這些受益類型。部分的，美國FDA的快速審批程序確認了有替代特征可能預測患者的受益。到2003年末，有16個藥物被批準進入這個程序，其中四個已經進入全面審批，即，后續研究證明了替代特征所預示的直接的患者受益。確定實體瘤藥物療效的一個重要指標是通過測試治療效果來評價腫瘤負荷(Therasse等人.Journal of the National Cancer Institute 92(3)205-216 2000)。這種評價的臨床標準(RECIST標準)已經由實體瘤療效評價標準工作組頒布，該工作組由國際癌癥專家組成。和參照RECIST標準的客觀療效所顯示的一樣，與適當的對照組相比，對實體瘤有確切療效的藥物易于最終產生直接的患者受益。在臨床前條件下，腫瘤負荷通常更容易被評估和記錄。因為臨床前研究可以被轉化為臨床條件，所以在臨床前模型中產生存活延長的藥物具有最大的、所期望的臨床效用。與產生對臨床治療有益反應相類似，在臨床前條件下降低腫瘤負荷的藥物也可能對疾病具有顯著的直接影響。盡管延長生命是癌癥藥物治療最重要的目標，但是還有其他受益具有臨床效用，顯然，腫瘤負荷的降低也能夠導致直接的受益并具有臨床效果(Eckhardt等人.Developmental TherapeuticsSuccesses and Failuresof Clinical Trial Designs of Targeted Compounds；ASCO EducationalBook，39thAnnual Meeting，2003，pages 209-219)。
總之，本發明說明了6BD-25和5LAC-23抗原作為治療劑靶點的應用。實驗證明，給藥后，6BD-25能夠減輕患有表達該抗原的癌癥的哺乳動物的腫瘤負擔，還能導致受治哺乳動物延長的存活。6BD-25體內治療的效力以及分別在SW1116和OVCAR-3細胞上檢測不到的或低水平的抗原表達，說明抗原表達的水平不必然與體內效力相關聯。另外，本發明還說明了在癌細胞中檢測6BD-25和5LAC-23抗原能有助于患有表達該抗原的腫瘤的哺乳動物的診斷、治療的預測和預后。本發明進一步說明了5LAC-23抗原作為靶點用于診斷、治療診斷、預后或治療。
因此，本發明的目的是利用一種從特定個體的細胞中生產腫瘤調節抗體的方法，該抗體對癌細胞有細胞毒性而同時對非癌細胞相對無毒，為了分離雜交瘤細胞系和該雜交瘤細胞系編碼的相應的單克隆抗體及其抗原結合片段。
本發明另外一個目的是通過37LRP特定表位與一種分離的單克隆抗體(命名為5LAC-23)或其片斷(命名為抗原片斷)相結合的方式來識別層粘連蛋白受體1前體蛋白(命名為37LRP)，所述分離的單克隆抗體是通過一種從特定個體的細胞中生產腫瘤調節抗體的方法而生成的，該抗體對癌細胞有細胞毒性而同時對非癌細胞相對無毒。
本發明的另外一個目的是提供一種能夠與5LAC-23所識別的37LRP的特定表位相結合的偶合殘基，本文稱之為藥物-抗體結合物，其中所述抗體是與所述特定表位相結合的5LAC-23或其片斷，所述結合物可以是生物或化學毒素形式的放射性核素或一種抗腫瘤藥物，或者是一種具有等效抗腫瘤活性的化合物，包括但不限于化學治療藥物。
本發明的另外一個目的是提供一種傳輸活性抗腫瘤藥物、酶或放射性核素(作為抗腫瘤藥物或診斷顯影方法中的輔劑而起作用)至哺乳動物體內腫瘤細胞位置的方法，包括為該哺乳動物注入本發明的偶合殘基，從而發生所述偶合殘基與抗原表位之間的選擇性結合。
本發明還有一個目的是提供一種確定癌細胞存在的方法，通過任何方式來證明5LAC-23抗體和37LRP前體蛋白之間的選擇性結合水平足以表明惡性腫瘤的存在。
本發明還有一個目的是提供癌細胞或癌前細胞的診斷、預后、治療、顯影和監測的方法，利用5LAC-23(一種抗原結合片斷，如前文所定義的)或偶合殘基(如前文所定義的)與37LRP特定抗原殘基相結合。
本發明的另一個目的是提供癌癥調節抗體(CDMAB)及其抗原結合片段。
本發明另一個目的是生成CDMAB，其細胞毒通過抗體依賴性細胞毒(ADCC)來介導。
本發明另一個目的是生成CDMAB，其細胞毒通過補體依賴性細胞毒來(CDC)介導。
本發明另一個目的是生成CDMAB，其細胞毒是其因為其能夠催化細胞化學鍵的水解。
本發明另一個目的是生成CDMAB，該CDMAB在癌癥的診斷、預后和監測的結合試驗中是有用的。
本發明其它的目的和優點通過本發明下述的說明、舉例和實施例將變得顯而易見。
圖1.6BD-25、5LAC-23和抗Fas(陽性對照)抗體靶向抗幾種癌和非癌細胞系的典型FACS圖。
圖2.6BD-25在預防性SW1116結腸癌模型中對腫瘤生長的影響。陰影線表示抗體給藥的時間。數據點表示平均+/-SEM。
圖3.6BD-25在預防性OVCAR-3卵巢癌模型中對體重的影響。陰影線表示抗體給藥的時間。數據點表示平均+/-SEM。
圖4.患有腫瘤的小鼠在用6BD-25或緩沖液對照治療后的存活率。在治療后的240天里監測小鼠的存活。
圖5A和5B.OVCAR-3細胞的總細胞裂解物(T)和細胞質餾分(C)的Western雜交，采用同種型對照(A)或5LAC23(B)染色。5LAC-23檢測到了不同的條帶，如黑色箭頭所示。
圖6A和6B.通過2-D電泳分離的OVCAR-3細胞質蛋白的Western雜交。A顯示了探針為IgM同種型對照的雜交帶，而B顯示了探針為5LAC-23的雜交帶。箭頭指示由5LAC-23識別的斑點。
圖7A、7B和7C.OVCAR-3細胞質蛋白的二維SDS-PAGE和Western雜交。A顯示細胞質餾分的銀染膠。C說明了由5LAC-23識別的蛋白質位置，而B說明了一種同種型抗體探針雜交相似斑點。箭頭指示由5LAC-23識別的斑點。
圖8A、8B、8C和8D.OVCAR-3細胞質餾分的Western雜交，探針為抗37LRP抗體H-150(A)、抗37LRP抗體F-18(B)、IgM同種型對照(C)和5LAC-23(B)。
圖9A和9B.來自OVCAR-3細胞的細胞質蛋白的二維Western雜交。雜交A上的箭頭表示5LAC-23結合的主要斑點。雜交B中的線條表示針對抗37LRP(H-150)抗體的斑點。雜交帶上揭示的其他斑點是由于與抗體的同種型或使用的二級抗體相互作用的結果。
圖10A、10B、10C和10D.CHO細胞的免疫染色(10倍放大)，所述CHO細胞被編碼37LRP(pCMV-XL537LRP)的人cDNA克隆表達質粒所轉染，5LAC-23(底排)和IgM同種型對照(頂排)。細胞被Fugene試劑單獨(A)或增加數量的pCMV-XL537LRP(1微克B；2微克C；4微克D)所轉染。當用5LAC-23對細胞染色時，可以看到質粒數目的增加伴隨著增加數目的陽性細胞(棕色)。
圖11A、11B和11C.CHO細胞的免疫染色(40×)，所述CHO細胞被編碼37LRP(pCMV-XL537LRP；2微克)的人cDNA克隆的表達質粒所轉染。細胞被5LAC-23(A)、抗37LRP抗體H-150(B)和抗67LR抗體MLuC5(C)染色，可以在所有免疫染色中發現陽性細胞。
圖12A、12B和12C.通過Western分析，用多種抗體檢測人37LRP在大腸桿菌(E.coli)中的表達。被包含在細菌反應混合物中的質粒包括具有C末端His6標記的對照載體GFP、pIVEX2.3dLRP(37LRP；泳道2)和pIVEX2.4dLRPNHis6(具有N末端His6標記的37LRP；泳道3)。雜交探針為IgM同種型對照(A)、5LAC-23(B)和抗37LRP抗體H-150(C)。
圖13A、13B和13C.用5LAC-23(底排)和IgM同種型對照(頂排)對石蠟包埋組織進行染色。切片來自正常胃(A)、正常肝(B)和肝細胞癌(C)。
圖14A、14B和14C.多種抗體與凍存的配對正常肝組織(頂排)和配對腫瘤組織(底排)的結合。使用的抗體是IgM同種型對照(A)5LAC-23(B)和抗細胞角蛋白8(C)。
圖15A和15B.使用5LAC-23()和IgM同種型對照對正常肺上皮細胞系Beas-2B進行免疫組織化學染色。細胞用Vitrogen培養(B)或不用Vitrogen培養(A)。
圖16A和16B.非還原條件下用Western雜交檢測抗37LRP抗體H-150(A)和5LAC-23(B)表位在大量腫瘤及變異細胞系中的表達。細胞系包括野生型CHO細胞(泳道1)和人細胞系HB4aR4.a(泳道2)、HMT 3522(泳道3)、MCF-7(泳道4)、MDA-MB-231(泳道5)、MDA-MB-361(泳道6)、OVCAR-3(泳道7)、Chang′s Liver(泳道8)、HepG2(泳道9)、A375(泳道10)、DLD-I(泳道11)、LS174T(泳道12)和SW620(泳道13)。
具體實施例方式
實施例1雜交瘤生產-雜交瘤細胞系6BD-25和5LAC-23
根據布達佩斯條約，雜交瘤細胞系6BD-25和5LAC-23于2003年12月9日保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，地址10801University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，保藏號分別是PTA-5691和PTA-5690。根據37 CFR 1.808的規定，保藏者保證在專利授權時永久取消對公眾獲取該保藏材料的所有限制。6BD-25和5LAC-23的克隆衍生、上清液和細胞ELISA篩選之前已經在US6657048中描述過。
通過在CL-1000瓶(BD Biosciences，Oakville，ON)中培養雜交瘤來生成單克隆抗體，每星期兩次收集和再接種。然后用瓊脂糖凝膠Protein G Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences，Baie d′Urfé，QC)，依照標準的抗體純化過程來純化抗體。
細胞毒性實驗試驗中，將6BD-25和5LAC-23與許多陽性(抗Fas(EOS9.1，IgM，kappa，20μg/mL，eBioscience，San Diego，CA)、抗EGFR(C225，IgG1，kappa，5μg/mL，Cedarlane，Hornby，ON)、環己酰亞胺(100μmol，Sigma，Oakville，ON)、NaN3(0.1％，Sigma，Oakville，ON))和陰性(107.3(抗TNP)，IgG1，kappa，20μg/ml，BD Bioscience，Oakville，ON)、G155-178(抗TNP,IgG2a，kappa，20μg/mL，BDBiosciences，Oakville，ON)、MPC-11(抗原特異性未知，IgG2b，kappa，20μg/mL)、J606(抗果聚糖，IgG3，kappa，20μg/mL)、IgG緩沖液(2％)、IgM緩沖液(2％))對照進行了比較(表2)。乳腺癌(MDA-MB-231(MB-231)，MAD-MB-468(MB-468)，MCF-7)、結腸癌(HT-29，SW1116，SW620)、肺癌(NCI-H460)、卵巢癌(OVCAR-3)、前列腺癌(PC-3)和非癌(CCD-27sk，Hs888.Lu)細胞系都進行了測試(全部來自ATCC，Manassas，VA)。Live/Dead細胞毒性測定法獲自Molecular Probes公司(Eugene，OR)。根據生產者的要求進行測定，做了下述改變。測定前將細胞以預先確定的適當濃度進行鋪板。2天后，將100μl純化的抗體或對照稀釋后轉移至細胞孔板，于5％CO2的培育箱中培養5天。孔板經倒空并吸干。通過多通道塑料擠壓瓶將室溫下的、含有MgCl2and CaCl2的DPBS分入每個孔中，輕敲三次，倒空，然后吸干。將用含有MgCl2和CaCl2的DPBS稀釋的50微升的熒光鈣黃綠素染料加入到每個孔中，在5％CO2培養箱中37℃培養30分鐘。Perkin-Elmer HTS7000熒光讀板機讀板，數據用Microsoft Excel進行分析。結果在表1中列出。數據代表了四組試驗(每組實驗有三次平行測定值)的平均值，用下述方式定性表示4/4的實驗高出閾值細胞毒性(++++)；3/4的實驗高出閾值細胞毒性(++)；2/4的實驗高出閾值細胞毒性(+)。表1中未標記的細胞表示不連續或作用未達到閾值細胞毒性。化學細胞毒性試劑產生了預期的細胞毒性，而許多其他用來比較的抗體也預期表現出對生物細胞實驗的限制。6BD-25抗體在乳腺、卵巢和結腸癌細胞系中表現出選擇性的細胞毒性，而對非變異的正常細胞沒有毒性。5LAC-23抗體在卵巢癌細胞系中具有選擇性細胞毒性，而對非變異的正常細胞也沒有毒性。6BD-25和5LAC-23抗體的活性是選擇性的，因為不是所有的癌細胞系都受影響。另外，6BD-25和5LAC-23抗體表現出功能特異性，因為它們沒有產生對非癌細胞的細胞毒性，這是一個重要的治療因素。
表26BD-25和5LAC-23抗體的體內細胞毒性
通過流式細胞計量術(FACS)評價了6BD-25與上述所列癌細胞及正常細胞系的結合。開始用DPBS(不含Ca++和Mg++)洗滌單層細胞，準備進行FACS。然后用細胞離解緩沖液(INVITROGEN，Burlington，ON)在37℃條件下將細胞從細胞培養板上分離出來。離心收集細胞，用4℃的、含有MgCl2、CaCl2和2％胎牛血清的Dulbecco′s磷酸鹽緩沖液(洗滌介質)懸浮細胞，計數，稀釋至適當的細胞濃度，離心沉淀細胞后懸浮于含有6BD-25(未偶合或與生物素偶合)、5LAC-23或對照抗體(同種型對照或抗Fas)的濃度為20μg/mL的染色介質(含有MgCl2和CaCl2的DPBS)中，冰上放置30分鐘。使用生物素酰化試劑(Pierce E2-Link Sulfo-NHS-LC-biotin，Rockford，IL)偶合6BD-25和生物素。加入比6BD-25摩爾數多20倍的生物素酰化試劑，室溫下振動培養2小時。然后將生物素酰化的6BD-25在PBS中40℃下透析過夜。在加入結合了熒光染料Alexa Fluor 488的二抗(針對未結合的原始抗體)或結合了抗生物素蛋白鏈霉素R-藻紅蛋白的二抗(針對生物素酰化的6BD-25)之前，細胞用洗滌液洗滌一次。然后加入適當的染色介質中的二抗，經過30分鐘。最后洗滌一次細胞，并懸浮于含有1μg/mL碘化丙啶的染色介質中。通過在FACSan上跑樣并使用CellQquest軟件(BD Biosciences，Oakville，ON)來評價流式細胞計數的細胞獲取。通過調節FSC和SSC檢測器的電壓和幅度(amplitude)來設置細胞的前向散射(FSC)和測向散散(SSC)。通過經純化的同種型對照抗體及隨后適當二抗染色的細胞來調整三個熒光通道(FL1、FL2和FL3)的檢測器，以便細胞具有均勻的峰，中位熒光強度大約為1-5單位。篩選獲得活細胞用于FSC和碘化丙啶排除。對于每個樣品，大約需要10000個活細胞用于分析，結果如表3所示。表3列出了高出同種型對照的平均熒光強度倍增，定性表示如下1.5(-)；1.5-2(+)；2-3(++)；3-10(+++)和＞10(++++)。
圖1匯集了有代表性的6BD-25和5LAC-23抗體直方圖。未偶合的6BD-25最初沒有結合任何被測細胞系。但是，在6BD-25與生物素結合而提高了實驗靈敏度后，證明低水平抗原存在于MDA-MB-231、C-13、OVCA-429和OV2008癌細胞表面。通過FACS，5LAC-23表現出與結腸癌細胞系SW620高水平和特異性的結合。對于6BD-25和5LAC-23來說，這進一步證明了結合程度未必預示了抗體與其相關抗原連接的結果，這是一個非顯而易見的發現。這表明在不同細胞中的抗體連接情況決定了細胞毒性，而不僅僅是抗體結合。
表36BD-25和5LAC-23的FACS分析
實施例2體內結腸預防性腫瘤實驗參考圖2數據，給4-8周的雌性SCID小鼠頸背皮下注射100微升含有5百萬SW1116人結腸癌細胞的生理鹽水。小鼠被隨機分為兩個治療組，每組10只。植入前一天，腹腔注射300微升的6BD-25測試抗體溶液(20mg/kg)或對照緩沖液，所述抗體溶液由保存濃縮液稀釋而來，所用稀釋劑含有500mMNaCl、20mMNa2HPO4·H2O和20mMNaH2PO4·H2O。然后，以同樣方式每周注射一次抗體，持續7周。
大約每7天用測量儀測定腫瘤的生長，持續至16周，或直至個體動物達到加拿大動物護理委員會(CCAC)規定的極限或112天。在研究的持續過程中記錄動物的體重。在研究結束時，所有的動物都根據CCAC指南進行安樂死。
在整個研究中，沒有臨床毒性癥狀。使用獨立的樣品測試來分析數據，使用均值差異性t檢驗來確定顯著性。在第50天(最終治療后1天)，6BD-25治療組的腫瘤體積是緩沖液對照組的54％(p＝0.001)。延緩的腫瘤生長在治療期后持續。在第112天(治療后63天)，抗體治療組的腫瘤體積是緩沖液對照組的59％(p＝0.002)。總之，在公認的人結腸癌腫瘤模型中，6BD-25抗體治療與對照組相比減輕了腫瘤負擔。這些結果表明該抗體(6BD-25)在其他哺乳動物(包括人)中作為治療方法的潛在的藥理學和藥劑學益處。
實施例3體內卵巢預防性腫瘤實驗參考圖3和4數據，給4-8周的雌性SCID小鼠頸背皮下注射1000微升含有5百萬OVCAR-3人卵巢癌細胞的生理鹽水。小鼠被隨機分為兩個治療組，每組10只。植入后一天，腹腔注射300微升的6BD-25測試抗體溶液(20mg/kg)或對照緩沖液，所述抗體溶液由保存濃縮液稀釋而來，所用稀釋劑含有500mMNaCl、20mMNa2HPO4·H2O和20mMNaH2PO4·H2O。然后，以同樣方式每周注射一次抗體，持續9周。
大約每7天用測量儀測定腫瘤的生長，持續至11周，或直至個體動物達到加拿大動物護理委員會(CCAC)規定的極限或76天。在研究的持續過程中記錄動物的體重。在研究結束時，所有的動物都依照CCAC指南進行安樂死。
在整個研究中，沒有臨床毒性癥狀。體重作為腫瘤進展的替代量度(圖3)。增加的體重代表腫瘤負擔，因為體重增加是因為腹水形成。Dunnett′st檢驗來測定顯著性。植入后80天(治療結束后16天)，6BD-25治療組中的小鼠體重顯著低于緩沖液對照組(p＝0.002)。6BD-25治療與緩沖液對照相比還具有提高的存活率(圖4)，如時序實驗檢測的。對照組小鼠中位存活時長為87.0天，而6BD-25治療組為107.5天(p＜0.02)。同時，緩沖液對照組的所有小鼠都在植入后120內死亡(治療后56天)。抗體治療組中，治療后250天(治療后186天)依然有1只小鼠存活。總結，在另一個公認的人類癌疾病模型中，6BD-25抗體治療與緩沖液對照相比，抑制了腫瘤負擔。6BD-25還提高了卵巢癌異種移植模型中的存活。
總體上，在小鼠的結腸和卵巢癌預防性腫瘤異種移植模型中，6BD-25在抑制腫瘤生長方面比緩沖液對照明顯更加有效。6BD-25治療在公認的人卵巢癌疾病模型中還顯示出存活受益，表明了該抗體治療其他哺乳動物(包括人)的藥理學和藥劑學益處。另外，在SW1116和OVCAR-3上檢測不到的或低水平的抗原表達，說明抗原表達水平并不必然與體內效力有關。
實施例4Western雜交確認結合蛋白為確認由抗體5LAC-23所識別的抗原，將表達該抗原的細胞裂解物和細胞質成分進行凝膠電泳，轉膜。使用Western雜交來確定由這一抗體檢測的蛋白質。
1.一維SDS-PAGE之前通過FACS分析證明了5LAC-23與卵巢癌細胞系的弱結合，5LAC-23表現出對這一細胞系的細胞毒作用(美國專利申請號10/810163，以參考文獻的方式將其內容并入本文)。總細胞裂解物在RIPA緩沖液[50mM Tris-HCl，pH7.2；150mM NaCl；0.1％(w/v)SDS；1％(w/v)去氧膽酸鈉；1％(w/v)Triton X-100]中制備，而細胞成分使用Mem-PER真核膜蛋白提取試劑盒(Cat.No.89826；Pierce；Tattenhall，Cheshire，UK)來制備。生成的親水性成分經過去除膜組分而得到基本的濃縮，并被認為是細胞質成分。蛋白酶抑制因子(SIGMA P8340)被加入所有裂解步驟中。部分細胞制品上12％凝膠，在60V下電泳30分鐘，然后150V，直至染料前沿到達膠底部。通過NOVEX XCeI1 II點模式(Invitrogen，Paisley，UK)，在30伏的電壓下經過2小時，蛋白質從凝膠轉移到PVDF膜上。轉膜后，使用含有0.5％吐溫(TBST)、5％脫脂奶粉的Tris-緩沖鹽水4℃下對膜封閉過夜。膜用初級抗體室溫培養4小時。初級抗體包括5LAC-23(5μg/mL)和同種型對照(鼠抗-三硝基酚、IgM、κ；克隆G155-228；Cat.No.553472；BD PharMingen；Oxford，Oxon，UK；5μg/ml)。膜經TBST洗滌3次之后，用辣根過氧化物酶(HRP)結合的山羊抗鼠IgM、μ鏈特異性抗體(1/10,0000；Cat.No.115-035-075；Jackson Immunologicals West Grove，PA，USA)培養1小時。洗滌膜5次，使用ECL Western雜交檢測試劑(Amersham)來檢測HRP。
5LAC-23與OVCAR-3細胞質成分的結合產生了大約40kDa的電泳條帶(圖5)，如黑色箭頭所示。該條帶在OVCAR-3細胞制成的總細胞裂解物中非常弱，表明該抗原可以通過產生細胞質成分而被富集。該條帶沒有被同種型對照檢測出來，表明與5LAC-23的相互作用是特異性的。盡管在大約70kD也觀察到了明顯條帶，但同種型對照檢測該條帶的量度較低。根據這一實驗，5LAC-23顯示出與大約kD的蛋白質特異性結合。
2.2二維SDS-PAGE使用Plus One 2-D Clean-Up試劑盒(Cat.No.80-6484-51；Amersham，Little Chalfont，Bucks，UK)對上述制備的總細胞質蛋白進行沉淀，然后懸浮于含有兩性電解質的再水合緩沖液，pH3-10。第一向等電聚焦(IEF)在IPGphor(Amersham)上進行，7cm固定pH3-10梯度干膠條(Amersham，Little Chalfont，Bucks，UK)，含有再水合溶液(8M urea，2％CHAPS；Amersham)。電壓限制為30V持續14小時來實現再水合，然后200V持續1小時、500V持續1小時、1000V持續30分鐘和8000V直至達到8000Vh。在IEF分離之后，在不含DTT、含有2.5％IAA的SDS-PAGE平衡緩沖液中平衡干膠條15分鐘。干膠條被置于10％凝膠的頂端，然后用0.5％瓊脂糖密封。SDS-PAGE電泳在60V下進行30分鐘，然后150V直至染料前沿到達凝膠底端。使用Hoefer TE 77 Semi-Dry Transfer Unit(Amersham)，將蛋白質從凝膠轉移到PVDF膜上。
在轉膜之后，使用含有0.5％吐溫(TBST)、5％脫脂奶粉的Tris-緩沖鹽水4℃下對膜封閉過夜。膜與初級抗體一起室溫下培養4小時。初級抗體包括5LAC-23(5μg/mL)和同種型對照(鼠抗-三硝基酚、IgM、κ；克隆G155-228；Cat.No.553472；BD PharMingen；Oxford，Oxon，UK；5μg/ml)。膜經TBST洗滌3次之后，與辣根過氧化物酶(HRP)結合的山羊抗鼠IgM、μ鏈特異性抗體(1/5000-1/10,0000；Cat.No.115-035-075；Jackson Immunologicals West Grove，PA，USA)培養1小時。洗滌膜5次，使用ECL Western雜交檢測試劑(Amersham)來檢測HRP。
圖6說明與5LAC-23一起培養的OVCAR-3細胞質成分的Western雜交。與同種型對照培養的雜交(Figure 6a)相比，在與5LAC-23探針的雜交中能夠發現一個不同的斑點(Figure 6b)。該獨特的斑點如箭頭所示，具有酸性pI，分子量與36kD的蛋白質標記相似。使用較大的干膠條(18cm；Amersham)重復雙向電泳，目的是確認與酸性蛋白結合的5LAC-23，來提高蛋白斑的分離并能獲得足量蛋白用于隨后的質譜分析。依照程序化的設置進行再水合作用和IEF30V 14h；200V 30min；500V 30min；1000V 1h梯度；6500V 3h梯度；8000V。總Vh為54000-60000。隨著IEF的分離，在含有2.5％IAA的SDS-PAGE平衡緩沖液中平衡干膠條15分鐘。干膠條置于12％凝膠上并用0.5％的瓊脂糖密封，SDS-PAGE在60V下過夜。依照生產商的說明書，使用PlusOne銀染試劑盒(PlusOne Sliver Staining kit)(Cat.No.17-1150-01；Amersham)對一個凝膠進行蛋白質染色，與MS分析相一致。其他膠如上所述進行蛋白質轉PVDF膜。同上，探針5LAC-23和同種型對照與膜雜交。轉膜后，凝膠也被進行如上的蛋白質染色，來幫助校正蛋白質斑點。
圖7中，能夠清晰可見5LAC-23與之結合的OVCAR-3細胞質成分的蛋白質斑點。圖7a顯示了銀染色的OVCAR-3細胞質成分的凝膠。圖7b說明同種型對照沒有與任何蛋白質斑點結合，而與5LAC-3探針雜交的斑點中明顯存在一個不同的斑點(圖7c)，分子量與36kD蛋白標記相似。5LAC-3的結合是特異性的，因為用同種型對照沒有檢測到該斑點(圖7b)。這一實驗證實了5LAC-23與之結合的抗原性殘疾大約為36kD并具有酸性等電點(pI)。
實施例5通過質譜鑒定結合蛋白質用無菌吸管頭將對應于5LAC-23所識別的37-40kD蛋白質斑點的凝膠區域切下。然后使用凝膠塞，通過質譜進行蛋白質鑒定。將樣品在凝膠內進行胰蛋白酶水解，使用aMWGRoboseq 4204 robot(MWG Biotech)。多肽從凝膠塞中釋放，使用1％甲酸和2％乙腈。在MicroMass Q-TOF Global上分析一部分水解上清液，使用75mm、Cl8柱用于肽分離。使用MASCOT檢索數據。
MS分析鑒定的、5LAC-23所識別的凝膠區域中的蛋白質列在表4中。質譜鑒定的5LAC-23抗原是層粘連蛋白受體1。
表4.5LAC-23從人卵巢癌細胞系OVCAR-3識別的經鑒定的蛋白質
實施例65LAC-23抗原的確認1.通過共區域化研究確認推定抗原的確認是通過測定已知的抗37LRP抗體是否能與5LAC-23共區域化。來自OVCAR-3細胞質成分中的蛋白質經SDS-PAGE被分離并雜交印跡到硝酸纖維素膜上。如上所述，對一維SDS-PAGE進行了Western雜交。初級抗體包括5LAC-23(5μg/mL)、IgM同種型對照(如前所述；5μg/mL)、抗37LRP抗體H-150(0.2μg/mL；Cat.No.sc-20979；Santa Cruz Biotechnology；Santa Cruz，CA，USA；該抗體用來抵抗相應于人37LRP的AA 110-250的重組蛋白質)、抗37LRP抗體F-18(0.4μg/mL；Cat.No.sc-21534；Santa Cruz)和正常兔IgG(0.2μg/mL；Cat.No.AB-105-C；R&D Systems；Abingdon，Oxon，UK)。二級抗體包括前述的HRP結合的山羊抗鼠IgM(1/5000-10000；Jackson Immunologicals)用于IgMs檢測、HRP結合的抗兔免疫球蛋白(1/2000；Cat.no.P0448；DAKO，Carpentaria，CA，USA)和HRP結合的抗山羊免疫球蛋白(1/2000；Cat.No.P0449)。
兩種抗37LRP抗體，H-150和F-18，與分子量約為40kD的條帶結合(圖8A和8B)。5LAC-23也與類似大小的條帶結合(圖4D)，而IgM同種型對照沒有，證明5LAC-23與該蛋白的相互作用是特異性的。
OVCAR-3細胞的胞質蛋白準備進一步的二維Western，如二維SDS-PAGE部分所述，除了IEF的進行是使用pharmylates(pI3.5-5)來限制pH范圍。用于雜交的初級和次級抗體如前所述。
圖9顯示了5LAC-23和H-150與Western雜交的結合，并與適當同種型對照探針雜交做了比較(數據未顯示)。5LAC-23識別的蛋白質斑點顯示在圖9中，黑色箭頭所示。抗37LRP抗體、H-150結合到黑線突出顯示的較廣的蛋白質斑(圖9)，與凝膠上5LAC-23結合區域相一致。可能H-150識別的斑點包含至少3個蛋白質斑，可能表明OVCAR-3細胞的胞質蛋白中含有不同的蛋白質亞型。斑點上檢測到的其他蛋白質是源于同種型抗體或次級抗體間的相互作用，而非特異性的針對5LAC-23或H-150。抗37LRP抗體和5LAC-23與約40kD蛋白質相結合，進一步證明了37LRP確實是針對5LAC-23的抗原。然而，盡管分子量相似，但5LAC-23表現出獨特的結合模式，與其他抗37LRP抗體相比。這表明兩個抗體識別的表位是不同的，5LAC-23表現了更嚴格的結合。
2.通過轉染研究確認通過測定5LAC-23能否與經37LRP的cDNA克隆轉染的細胞相結合來實現推定抗原的確認。在質粒pCMV6-XL5(被稱為pCMV-XL537LRP；產品號TC107938；訪問號NM-002295；ORIGENE Technologies；Rockville，MA，USA)中獲得一個編碼37LRP的cDNA克隆。中國倉鼠卵巢(CHO)細胞在6孔板中生長至60-70％融合(F12 Ham營養混合物；10％FBS；2mM谷氨酰胺)。根據生產商說明書(Cat.No.1988387；Roche Diagnostics；Lewes，East Sussex，UK)，利用Fugene轉染試劑用pCMV-XL537LRP轉染細胞。細胞在免疫染色前生長至少48小時。用PBS洗滌細胞2次，然后與冰冷丙酮∶甲醇(1∶1)混合3分鐘。去除丙酮∶甲醇，風干細胞。用PBS洗滌3次，然后使用2％FBS在PBS中封閉30分鐘。加入初級抗體，室溫下培養1小時。初級抗體包括5LAC-23(5μg/mL)、IgM同種型對照(如前所述；5μg/mL)、抗37LRP抗體(H-150；0.2μg/mL；SantaCruz Biotechnology)、抗67LR抗體(MLuC5；Cat.no.ab3099；4μg/mL；Abeam limited，Cambridge，Cambs，UK)和正常兔IgG(0.2μg/mL；Cat.No.AB-105-C；R&D Systems；Abingdon，Oxon，UK)。細胞經PBS洗滌3次后，加入二級抗體(HRP結合的山羊抗鼠IgM，1/1000；JacksonImmunologicals)培養1小時。二級抗體包括前述的HRP結合的山羊抗鼠IgM(1/5000-10000；Jackson Immunologicals)用于檢測IgMs和HRP結合的抗兔免疫球蛋白(1/200；DAKO)。洗滌細胞3次，使用DAB底物試劑盒(Cat.No.SK4-4100；Vector laboratories；Peterborough，Cambs.，UK)依照生產商說明書檢測HRP。
免疫染色說明5LAC-23染色呈陽性(棕色)的細胞增加了，因為DNA(pCMV-XL537LRP)的數量增加了(圖10)。同種型對照染色的CHO細胞帶一些背景染色，但這是相似的，不論轉染過程中使用的DNA質量如何(圖10，頂排)，表明5LAC-23與瞬間轉染的細胞之間的結合是特異性的。這些結果證實了針對5LAC-23的結合蛋白是37kd LRP。
除了轉染細胞的5LAC-23染色外，一些細胞也用靶向37LRP和67LP的兩種其他抗體來染色(圖11)。抗37LRP抗體H-150識別一些集中于細胞質的轉染細胞(圖11B)。識別67LR的二級抗體MLuC5也結合一些細胞(圖11C)，盡管結合方式不同于5LAC-23和H-150(圖11A和11C)。其他研究者已經發現，MLuC5未能與轉染的CHO細胞相結合。這可能是由于實驗性差異，如使用不同的啟動子、二級抗體或克隆、或染色技術的不同。注意，MLuC5染色可能被限制在溶酶體膜區室，實現受體的釋放，用于結合層粘連蛋白。這些結果證實了轉染蛋白，37LRP，成功表達于CHO細胞中。這些結果也證明67LR與37LRP多肽相關，它能夠在CHO細胞中被合成。SDS-PAGE結果表明，5LAC-23結合前體分子，而不是67kD的層粘連蛋白受體，因為5LAC-23結合的蛋白大約為37-45kD(實施例4)。這一揭示轉染細胞免疫染色模式的實驗的結果表明，5LAC-23主要位于細胞質，更類似于H-150結合，相對于MluC5結合。總之，這一證據表明針對5LAC-23的抗原是37LRP前體分子，而非67LR。
3.通過37LRP細菌表達的確認為了進一步評價假定的5LAC-23，37LRP cDNA被克隆入表達載體，用于在無細胞的體外翻譯系統中進行蛋白質合成。質粒pCMV-XL537LRP(前述；ORIGENE)被用作模板來擴增37LRPcDNA，引物為5′-GGGAAATTTTCCATATGTCCGGAGC-3′(包括一個合成Nde I位點)和5′-CCTATGC AAGCCCGGGTTAAGACCAG-3′(包括一個終止密碼子和合成Sma I位點)。使用Turbo DNA聚合酶(Stratagem)進行PCR擴增。DNA模板在94℃下變性5分鐘，隨后30個循環(94℃、45分鐘，60℃、45分鐘，72℃、1分鐘)并延長10、72℃。利用Nde I和Sma I位點，將37LRP PCR產物克隆入pIVEX2.3d和pIVEX2.4d(Cat.no.03 269 019 001；Roche)。生成的質粒包括pIVEX2.3dLRP(沒有His6-標記的37LRP)和prVEX2.4dLRPNHis6(在N末端帶有His6-標記的37LRP)。按照生產商的說明(RTS 100 E.coli HYKit；Cat no.3186 148；Roche Diagnostics，Lewes，UK)，使用無細胞的體外翻譯系統在細菌中表達37LRP蛋白。一部分反應混合物上10％凝膠，然后轉硝酸纖維素膜。使用5％脫脂乳在TBST中4℃下封閉過夜。加入初級抗體，室溫培養3小時。TBST洗滌5次后，加入二級抗體，室溫1小時。初級抗體包括5LAC-23(5μg/mL)、IgM同種型對照(如前所述；5μg/mL)、抗37LRP抗體(H-150；0.2μg/mL；SantaCruz Biotechnology)和正常兔IgG(0.2μg/mL；R&D Systems)。二級抗體包括前述的HRP結合的山羊抗鼠IgM(1/5000-10000；JacksonImmunologicals)用于檢測IgMs和HRP結合的抗兔免疫球蛋白(1/200；DAKO)。洗滌5次后，用ECL Western雜交檢測試劑檢測HRP結合抗體(Amersham)。
Western雜交分析表明，只有當反應混合物中含有37LRP(pIVEX2.3dLRP(37LRP和prVEX2.4dLRPNHis6)的模板時，抗37LRP抗體、H-150和5LAC-23才與細菌反應混合物中合成的蛋白質相結合(圖12)。當反應混合物中含有表達GFP的對照質粒時，5LAC-23和H-150沒有與反應混合物結合。針對C末端His6標記的抗體證實了GFP蛋白是合成的(數據未顯示)。反應混合物從pIVEXLRP構建質粒上至少產生2鐘蛋白質產物，可能由于這些構建質粒中含有兩個起始密碼子(一個緊隨核糖體結合位點之后，一個位于用于克隆的Nde I位點)，或者由于翻譯后的修飾。雖然5LAC-23和H-150識別兩種相似的蛋白條帶，但結合模式完全不同。5LAC-23優先結合頂部條帶，該條帶更多的以涂帶形式出現，表明可能的翻譯后修飾。H-150結合不同的條帶(注意每個條帶是成對的；在照片中不明顯)。出現IgM同種型對照與上部37LRP的一些結合(圖8，A)，可能是由于蛋白質超載而產生的非特異性結合。這些結果進一步證實了5LAC-23與37kD LRP的結合，并進一步證明了該抗體結合針對的獨特表位，不同于已知的抗37LRP抗體H-150。
使用羅氏的RTS系統，大量翻譯后修飾被排除在37LRP產物合成之外。這些修飾包括N-和O-糖基化、磷酸化和雙硫鍵生成。其他分子(如脂類和硫酸基團)可能被加入多肽并成為5LAC-23結合表位的一部分。ScanProsite(Expasy)預測，37LRP序列具有大量的磷酸化位點、2N-肉豆蔻酮酰化位點和酪氨酸硫酸化位點。潛在的肉豆蔻基能夠被排除在5LAC-23表位之外，因為大腸桿菌不能調節這一修飾。磷酸化的缺乏也許是有趣的，因為如果5LAC-23結合到多肽序列，該序列可能在正常人類細胞中被磷酸化并在腫瘤細胞中被去磷酸化，從而暴露5LAC-23抗原。
實施例7冷藏保存的正常人組織中抗原分布的IHC研究對冷藏保存的組織進行IHC研究來表現5LAC-23抗原在正常人組織中的分布特征。冷藏保存的正常人組織切片可以從Covance(UK)獲得。它們在丙酮中固定10分鐘，然后在洗滌緩沖液(含有0.02％吐溫20的PBS)中洗滌2次。通過在含有0.6％過氧化氫的甲醇中培養15分鐘來封閉內源性過氧化物酶的活性。切片經緩沖液洗滌，在含1％馬血清的洗滌緩沖液中室溫封閉20分鐘。然后在2％BSA(SP-5050；Vector Laboratories Ltd)中進一步封閉20分鐘。使用卵白素/生物素封閉試劑盒(SP-2001；Vector Laboratories Ltd)，依照生產商說明，封閉內源性生物素位點。5LAC-23、抗細胞角蛋白8(M0631；Dako Cytomation)和IgM抗KLH同種型對照(550340；BD PharMingen)和切片一起以5μg/mL于含2％BSA的洗滌緩沖液中室溫培養60分鐘。切片洗滌3次，與山羊抗鼠IgM生物素酰化的二級抗體(B9265；Sigma-AldrichCompany Ltd)一起以1∶100的比例于含1％馬血清的洗滌緩沖液中室溫培養30分鐘。切片被洗滌3次，然后與卵白素-HRP一起室溫培養30分鐘，所述卵白素-HRP是根據鼠IgG Vectastain ABC試劑盒(PK-6102；Vector Laboratories Ltd)制備。洗滌3次后，切片被DAB染色，依照生產商的說明(SK-4100；Vector Laboratories Ltd)。在水洗滌后，切片經Harris′s蘇木紫復染，大量水洗滌，然后脫水并裝入DPX封固劑(M/Dl 10/08；Fischer Scientific Ltd)。
在冷藏的正常組織上，5LAC-23與正常的腦和腎小管結合，而與受試的其他組織都不結合(表5)。
表5.冷藏的正常組織切片染色
g＝顆粒狀的；epi＝上皮組織；mc＝膜的/細胞質的；c＝細胞質的；bv＝血管；heps＝肝細胞這些結果表明，5LAC-23的抗原不是廣泛表達于正常組織上，且該抗體只與人體中有限數目的組織結合。
實施例8人類正常和腫瘤IHC通過檢測更廣范圍的福爾馬林固定人類組織的結合而擴展了人類組織結合的結果。福爾馬林固定的石蠟包埋的正常器官和腫瘤陣列芯片(B A3；AMS Biotechnology Ltd)通過乙醇脫臘。切片短暫浸泡于洗滌緩沖液(PBS with 0.02％Tween-20)中。抗原回收是通過在低pH的靶回收溶液(S1699；Dako Cytomation)中以最大功率進行微波20分鐘。通過在含有0.6％過氧化氫的甲醇中保溫15分鐘，內源性過氧化物活性被阻斷。阻斷前，切片在含1％馬血清的洗滌緩沖液中室溫洗滌20分鐘。依照生產商說明書使用卵白素/生物素阻斷試劑盒(SP-2001；Vector Laboratories Ltd)阻斷內源性生物素位點。5LAC-23和IgM抗KLH同種型對照(550340；BD PharMingen)與0.75μg/mL切片一起在含有1％馬血清的洗滌緩沖液中室溫培養90分鐘。切片在培養前被洗滌兩次，洗滌緩沖液為山羊抗鼠IgM生物素酰化二抗(B 9265；Sigma-Aldrich Company Ltd)1∶100稀釋于含有1％馬血清的洗滌緩沖液，室溫30分鐘。洗滌兩次后，切片在依照小鼠IgG Vectastain ABC試劑盒(PK-6102；Vector Laboratories Ltd)制備的卵白素-HRP中室溫培養30分鐘。切片洗滌兩次，然后依照試劑盒(SK-4100；VectorLaboratories Ltd)使用DAB進行染色。切片洗滌一次后，用Harris′s蘇木紫復染，然后大量水洗滌，然后脫水并在DPX固定介質(MfDl 10/08；Fischer Scientific Ltd)中固定。
表6說明，當組織被石蠟包埋時，5LAC-23與骨骼肌、正常肝和正常胃弱結合。在前述實施例中，5LAC-23的結合被限制在正常組織中。5LAC-23與肝細胞癌(HCC)有最強的結合，而與胃腺癌有弱結合。它沒有與受試的其他正常或腫瘤組織結合。這些IHC研究表明，與正常肝和絕大部分其他正常組織相比，5LAC-23與HCC有明顯區別的結合。
表6.5LAC-23對人正常器官和腫瘤陣列芯片的染色
sc＝分散細胞；ctis＝結締組織；g＝顆粒性的；epi＝上皮組織mc＝膜的/細胞質的；c＝細胞質的；bv＝血管；heps＝肝細胞圖13中可以看到使用5LAC-23染色的正常胃(A)、正常肝(B)和肝腫瘤(C)的實例。同種型對照沒有結合任何組織，說明5LAC-23的結合是特異性的。5LAC-23主要與細胞質結合，但也觀察到一些細胞膜上的聚集。5LAC-23與正常肝和正常胃的結合非常弱，但與惡性肝的結合強。
實施例95LAC-23與人肝腫瘤切片的結合進行了IHC研究，來確定5LAC-23抗原與人類肝癌的關聯。福爾馬林固定的石蠟包埋的肝陣列芯片(CSl；AMS Biotechnology Ltd)通過乙醇被脫臘。芯片被短暫浸泡于洗滌緩沖液(含0.02％吐溫20的PBS)中。抗原回收是通過在低pH的靶回收溶液(S1699；DakoCytomation)中以最大功率進行微波20分鐘。通過在含有0.6％過氧化氫的甲醇中保溫15分鐘，內源性過氧化物活性被阻斷。阻斷前，切片在含1％馬血清的洗滌緩沖液中室溫洗滌20分鐘。依照生產商說明書使用卵白素/生物素阻斷試劑盒(SP-2001；Vector Laboratories Ltd)阻斷內源性生物素位點。5LAC-23和IgM抗KLH同種型對照(550340；BD PharMingen)與0.75μg/mL切片一起在含有1％馬血清的洗滌緩沖液中室溫培養90分鐘。切片在培養前被洗滌兩次，洗滌緩沖液為山羊抗鼠IgM生物素酰化二抗(B 9265；Sigma-Aldrich Company Ltd)1∶100稀釋于含有1％馬血清的洗滌緩沖液，室溫30分鐘。洗滌兩次后，切片在依照小鼠IgG Vectastain ABC試劑盒(PK-6102；VectorLaboratories Ltd)制備的卵白素-HRP中室溫培養30分鐘。切片洗滌兩次，然后依照試劑盒(SK-4100；Vector Laboratories Ltd)使用DAB進行染色。切片洗滌一次后，用Harris′s蘇木紫復染，然后大量水洗滌，然后脫水并在DPX固定介質(MfDl 10/08；Fischer Scientific Ltd)中固定。
5LAC-23結合了一個HCC組織陣列芯片上73％的HCC切片(表7)，但在一個或兩個樣品中只有幾個細胞被染色。染色主要是細胞質。這些結果表明，5LAC-23抗原不僅在肝癌中高度表達(相對于其他組織類型)，而且它在多數來自不同患者的人類肝癌中表達。
表7.人類肝陣列芯片與5LAC-23和IgM同種型對照的IHC
實施例10配對的正常和肝腫瘤染色配對的正常和原發人類肝癌細胞組織的冷藏芯片(T6235149；AMS Biotechnology Ltd)經解凍后風干。在丙酮中固定10分鐘，然后在洗滌緩沖液(含有吐溫20的PBS)中洗滌兩次。在含有0.6％過氧化氫的甲醇中保溫15分鐘，內源性過氧化物活性被阻斷。阻斷前洗滌芯片，在含1％馬血清的洗滌緩沖液中室溫20分鐘。在2％BSA(SP-5050；Vector Laboratories Ltd)中進一步阻斷20分鐘。依照生產商說明書使用卵白素/生物素阻斷試劑盒(SP-2001；Vector LaboratoriesLtd)阻斷內源性生物素位點。5LAC-23、抗細胞角蛋白-8(M0631；Dako Cytomation)和IgM抗KLH同種型對照(550340；BD PharMingen)與5μg/mL切片一起在含有2％BSA的洗滌緩沖液中室溫培養60分鐘。切片在培養前被洗滌3次，洗滌緩沖液為山羊抗鼠IgM生物素酰化二抗(B 9265；Sigma-Aldrich Company Ltd)1∶100稀釋于含有1％馬血清的洗滌緩沖液，室溫30分鐘。洗滌3次后，切片在依照小鼠IgG Vectastain ABC試劑盒(PK-6102；Vector Laboratories Ltd)制備的卵白素-HRP中室溫培養30分鐘。切片洗滌3次，然后依照試劑盒(SK-4100；Vector Laboratories Ltd)使用DAB進行染色。切片洗滌后，用Harris′s蘇木紫復染，大量水洗滌，然后脫水并固定于DPX固定介質(MfDl 10/08；Fischer Scientific Ltd)中。
圖14顯示了來自同一個體的配對的正常和腫瘤組織的冷藏肝切片。注意，細胞角蛋白8(C)集中于正常肝細胞，結合限制于正常組織，表明一些切片是正常組織和癌組織的混合物。5LAC-23只結合腫瘤樣品，并針對代表該切片惡性組織的中心區域。切片經同種型對照染色為陰性，表明5LAC-23的結合是特異性的。5LAC-23的染色模式表明，在患者樣品中，該抗體高度特異性的針對惡性細胞，從而使它成為令人關注的藥靶。
實施例11改變生長條件而誘導的正常細胞中的結合進行了條件實驗來考察能否在選定條件下誘導5LAC-23表達。β-2B“正常”肺上皮細胞生長在未包被或經vitrogen(0.03mg/mlvifrogel；Cohesion Technologies Inc.)包被的培養瓶上。細胞被培養于支氣管上皮生長培養基(CC-3170；Clonetics)中，濕潤的空氣環境(95％空氣/5％CO2)，37℃。當大約80％融合的時候，將細胞與細胞裂解溶液(SIGMA Cat.No.C5914)一起移出，PBS中洗滌2次，10％福爾馬林中固定30分鐘。細胞沉淀于乙醇中脫水，之后懸浮于石蠟中45℃培養60分鐘，期間更新石蠟3次。冷卻并靜置后，Leica RM 2135切片機上切下3μm切片并固定于載玻片上。切片經5μg/mL的5LAC-23或IgM同種型對照染色，作為如上所述的成對肝樣品。只有當細胞與Vitrogen一起培養時才能看見5LAC-23與正常肺上皮細胞系β-2B的結合(Figure 15)。沒有發現IgM同種型對照的結合，表明在一定的條件下，如存在生長因子、粘附分子和細胞外基質分子，5LAC-23的抗原能夠被誘導，甚至是在正常細胞中。這些生長條件的異常經常發生在惡化和惡化前的狀態，可以促成37LRP表達的改變，如在肝細胞癌中所觀察到的。
實施例12Western分析5LAC-23在各種人類細胞系中的分布通過Western分析對人類細胞系進行了考察，來評價37LRP和5LAC-23表位的分布。細胞裂解物是在含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液中從大量人類腫瘤或變異細胞系制備而得，Western雜交的進行如一維SDS-PAGE章節所述。裂解物從如下細胞系制備乳腺細胞系HB4aR4.a(經Ras轉化的正常乳腺細胞)、HMT 3522(正常細胞)、MCF-7(腫瘤細胞)、MDA-MB-231(腫瘤細胞)；MDA-MB-361(源自乳腺腫瘤的腦轉移)；卵巢腫瘤細胞系OVCAR-3；肝細胞系Chang′sLiver和HepG2；黑素瘤細胞系A375；和結腸腫瘤細胞系DLD-I、LS174T和SW620。野生型的CHO細胞也被包括在內，因為之前已經報道了來自中國倉鼠的37LRP蛋白(Cricetulus griseus；NCBIAccession number298088)。雜交探針為H-150或5LAC-23，如共區域化章節所述。
抗37LRP抗體H-150識別所有受試細胞中的蛋白帶，包括野生型CHO細胞(圖16A)。注意，H-150檢測到在結腸細胞系DLD-I中至少存在2條蛋白帶，表明存在不同的人類亞型。Western中，雖然H-150和5LAC-23結合相似大小的條帶，但5LAC-23以不同于H-150的方式與細胞裂解物結合(圖16B)。H-150檢測所有細胞系中的37LRP，5LAC-23表位的表達在不同細胞裂解物中有所變化并在一些細胞裂解物中不存在。抗體間的這種差別不是歸因于5LAC-23對其抗原的親和力比H-150與其抗原的親和力低，因為兩種抗體與CHO細胞裂解物的結合是相似的。5LAC-23檢測了LS174T裂解物在非還原條件下約110kD的獨特條帶(圖16B，泳道12)。該條帶在還原條件下消失，但對應于37LRP前體的條帶沒有增強(數據未顯示)。這些結果進一步證明37LRP上由5LAC-23所識別的表位是獨特的，相對于已知的抗LRP抗體H-150。通過免疫組織化學分析(轉染章節，實施例6)，5LAC-23沒有結合野生型CHO細胞，但Western表明它在還原和非還原條件下都與wt CHO裂解物結合(圖16)。這表明5LAC-23的表位可以是構型依賴性的和/或該表位在天然條件下是不暴露于抗體或抗體無法與之接近的。
總之，數據表明5LAC-23是癌相關抗原并表達于人體中，也是病理學相關的癌靶點。另外，數據還說明5LAC-23抗體與人類癌組織的結合，并能被適當使用于診斷、治療預測或預后的測定中。另外，該抗原的細胞區域化指示著細胞的癌狀態，因為該抗原在大部分非惡性細胞中缺少表達，這一發現允許該抗原、它的基因或衍生物、它的蛋白或變型用于診斷、治療預測或預后的測定中。
本說明書中提到的所有專利和公開出版物代表了本發明所屬技術領域的技術人員的水平。所有專利和出版物都以參考資料的方式并入本文，其引用程度如同每個出版物被特別單獨指明以參考資料的方式并入本文。
需要理解盡管本發明以某一方式被說明，這不是要將本發明限制在本文所描述或顯示的特定形式或部分安排。對現有技術人員來說顯而易見的是在不偏離本發明范圍的情況下可以做出不同的變化，不能認為本發明局限于本說明書所顯示和描述的內容。一個現有技術人員將容易理解適當調整本發明來實現目的并獲得所提到的及其固有的結果和優點。本文描述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物學相關化合物、方法、程序和技術都是目前代表性的優選實施方式，目的是可效仿實現而不是對范圍的限制。對現有技術人員來說一些變化和其他使用，這些變化和使用都包含在本發明的構思之內并被權利要求書的范圍所限定。盡管本發明以特定的優選實施方式被描述，但是應該理解所要求保護的發明不應當被不適當的限制在這些特定實施方式中。實際上，為實施本發明所描述的方式的各種對現有技術人員來說是顯而易見的修改都要在權利要求的保護范圍之內。
權利要求
1.一種通過治療哺乳動物中的人類腫瘤來延長存活和/或延緩疾病進展的方法，其中所述腫瘤表達一種與單克隆抗體或其抗原結合片斷特異性結合的抗原，所述單克隆抗體或其抗原結合片斷具有保藏在ATCC、保藏號為PTA-5691的克隆所編碼的單克隆抗體的識別特性，該方法包括給所述哺乳動物注入有效降低所述哺乳動物腫瘤負擔的量的所述單克隆抗體，從而延緩疾病進展和/或延長存活。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述抗體與細胞毒殘基相結合。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述細胞毒殘基是放射性同位素。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述抗體激活補體。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述抗體介導抗體依賴性細胞毒作用。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述抗體是鼠抗體。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述抗體是人源化抗體。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所述抗體是嵌合抗體。
9.一種由保藏在ATCC、保藏號為PTA-5691的克隆所編碼的分離的單克隆抗體。
10.根據權利要求9所述的抗體，該抗體是人源化抗體。
11.根據權利要求9所述的抗體，該抗體是嵌合抗體。
12.權利要求9所述的分離的單克隆抗體的抗原結合片斷。
13.權利要求10所述的人源化抗體的抗原結合片斷。
14.權利要求11所述的嵌合抗體的抗原結合片斷。
15.根據權利要求9、10、11、12、13和14中任意一項所述的分離的抗體或抗原結合片斷，與選自細胞毒殘基、酶、放射性化合物和造血細胞中的一種物質相交聯，從而形成抗體交聯物。
16.保藏在ATCC、保藏號為PTA-5691的分離的克隆。
17.一種檢測人類腫瘤組織樣品中癌細胞存在的結合測定法，包括提供來自所述人類腫瘤的組織樣品；提供ATCC保藏號為PTA-5691的克隆所編碼的分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷或其抗體交聯物；將所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷或其抗體交聯物與所述組織樣品接觸；和，測定所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷或其抗體交聯物與所述組織樣品的結合；從而指示所述癌細胞存在于所述組織樣品中。
18.根據權利要求17所述的結合測定法，其中所述人類腫瘤組織樣品獲自組織中生成的腫瘤，所述組織選自卵巢和乳腺組織。
19.從選自人類腫瘤的組織樣品中分離或篩選癌細胞的方法，包括提供來自所述人類腫瘤的組織樣品；提供ATCC保藏號為PTA-5691的克隆所編碼的分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷或其抗體交聯物；將所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷或其抗體交聯物與所述組織樣品接觸；和，測定所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷或其抗體交聯物與所述組織樣品的結合；從而，所述癌細胞通過所述結合而被分離，并證實它們存在于所述組織樣品中。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述人類腫瘤組織樣品獲自組織中生成的腫瘤，所述組織選自卵巢和乳腺組織。
21.由保藏在ATCC、保藏號為PTA-5690的克隆所編碼的分離的單克隆抗體。
22.根據權利要求21所述的抗體，該抗體是人源化的抗體。
23.根據權利要求21所述的抗體，該抗體是嵌合抗體。
24.權利要求21所述的分離的單克隆抗體的抗原結合片斷。
25.權利要求22所述的人源化抗體的抗原結合片斷。
26.權利要求23所述的嵌合抗體的抗原結合片斷。
27.根據權利要求21、22、23、24、25和26中任意一項所述的分離的抗體或抗原結合片斷，與選自細胞毒殘基、酶、放射性化合物和造血細胞中的一種物質相結合，從而形成抗體交聯物。
28.保藏在ATCC、保藏號為PTA-5690的分離的克隆。
29.一種測定人類腫瘤組織樣品中癌細胞存在的結合測定法，包括提供來自所述人類腫瘤的組織樣品；提供ATCC保藏號為PTA-5690的克隆所編碼的分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷或其抗體交聯物；將所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷或其抗體交聯物與所述組織樣品相接觸；和，測定所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷或其抗體交聯物與所述組織樣品的結合；從而表明所述癌細胞存在于所述組織樣品中。
30.根據權利要求29所述的結合測定法，其中所述人類腫瘤組織樣品獲自組織中生成的腫瘤，所述組織選自結腸組織。
31.從人類腫瘤組織樣品中分離或篩選癌細胞的方法，包括提供來自所述人類腫瘤的組織樣品；提供ATCC保藏號為PTA-5690的克隆所編碼的分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷或其抗體交聯物；將所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷或其抗體交聯物與所述組織樣品接觸；和，測定所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷或其抗體交聯物與所述組織樣品的結合；從而，所述癌細胞通過所述結合而被分離，并證實它們存在于所述組織樣品中。
32.根據權利要求31所述的方法，其中所述人類腫瘤組織樣品獲自組織中生成的腫瘤，所述組織選自結腸組織。
33.一種識別組織樣品中層粘連蛋白受體1前體(37LRP)的方法，包括提供組織樣品；將所述組織樣品與由ATCC保藏號為PTA-5690的雜交瘤細胞系所生成的、與37LRP所表達的抗原殘基相結合的分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷相接觸，所述抗原殘基的特征是與所述分離的單克隆抗體獨特結合；和，測定所述抗原殘基的結合；從而識別37LRP。
34.一種診斷肝細胞癌患者的方法，包括提供肝細胞癌疑似患者的組織樣品；將所述組織樣品與由ATCC保藏號為PTA-5690的雜交瘤細胞系所生成的、與37LRP表達的抗原殘基相結合的分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷相接觸，所述抗原殘基的特征是與所述分離的單克隆抗體獨特結合；和，測定所述抗原殘基的結合；從而確認肝細胞癌的診斷。
35.一種用于37LRP表達細胞的區分、處理或診斷顯像的方法，包括提供所述細胞的樣品；提供包含分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷的交聯殘基，所述抗體或其抗原結合片斷是一種與被表達的37LRP抗原殘基相結合的分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷，所述抗原殘基的特征是被一種抗體結合，該抗體具有ATCC保藏號為PTA-5690的克隆所編碼的單克隆抗體的識別特性，所述分離的抗體或其抗原結合片斷與藥物、毒素、酶和放射性化合物中的至少一種物質相結合；從而，所述交聯殘基與所述細胞的結合促成了對所述細胞的區分、處理或診斷顯像。
36.一種治療癌癥患者的方法，包括提供包含分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷的交聯殘基，所述抗體或其抗原結合片斷是一種與被表達的37LRP抗原殘基相結合的分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷，所述抗原殘基的特征是被一種抗體結合，該抗體具有ATCC保藏號為PTA-5690的克隆所編碼的單克隆抗體的識別特性，所述分離的抗體或其抗原結合片斷與選自藥物、毒素、酶和放射性化合物中的至少一種物質相結合；和，將所述交聯的殘基給入所述患者。
37.一種測定37LRP抗原殘基的表達細胞存在的結合測定法，所述抗原殘基與ATCC保藏號為PTA-5690的克隆所編碼的分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷特異性結合，包括提供細胞樣品；所述抗體或其抗原結合片斷是與所述被表達的37LRP抗原殘基相結合的分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷，所述抗原殘基的特征是被一種抗體結合，該抗體具有ATCC保藏號為PTA-5690的克隆所編碼的單克隆抗體的識別特性；將所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷與所述細胞樣品相接觸；和，測定所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷與所述細胞樣品的結合；從而測定表達與所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷相結合的37LRP抗原殘基的細胞的存在。
38.根據權利要求33所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷是人源化的。
39.根據權利要求33所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷是嵌合的。
40.根據權利要求34所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷是人源化的。
41.根據權利要求34所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷是嵌合的。
42.根據權利要求35所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷是人源化的。
43.根據權利要求35所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷是嵌合的。
44.根據權利要求36所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷是人源化的。
45.根據權利要求36所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷是嵌合的。
46.根據權利要求37所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷是人源化的。
47.根據權利要求37所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷是嵌合的。
48.一種通過治療哺乳動物的人類腫瘤來延長存活和/或延緩疾病進展的方法，其中所述腫瘤表達與單克隆抗體或其抗原結合片斷特異性結合的抗原，所述單克隆抗體或其抗原結合片斷具有保藏在ATCC、保藏號為PTA-5690的克隆所編碼的單克隆抗體的識別特性，該方法包括給所述哺乳動物注入能有效降低所述哺乳動物腫瘤負擔的量的所述單克隆，從而延緩疾病進展和/或延長存活。
49.具有ATCC保藏號為PTA-5690的克隆所編碼的單克隆抗體的識別特性的單克隆抗體或其抗原結合片斷在生產治療哺乳動物人類腫瘤的藥劑中的應用，其中所述腫瘤表達與所述單克隆抗體或其抗原結合片斷特異性結合的抗原，所述單克隆抗體以有效降低所述哺乳動物腫瘤負擔的量被給入，從而延緩疾病進展和/或延長存活。
50.具有ATCC保藏號為PTA-5691的克隆所編碼的單克隆抗體的識別特性的單克隆抗體或其抗原結合片斷在生產治療哺乳動物人類腫瘤的藥劑中的應用，其中所述腫瘤表達與所述單克隆抗體或其抗原結合片斷特異性結合的抗原，所述單克隆抗體以有效降低所述哺乳動物腫瘤負擔的量被給入，從而延緩疾病進展和/或延長存活。
51.包含分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷的交聯殘基在生產治療癌癥患者的藥劑中的應用，所述抗體或其抗原結合片斷是與被表達的37LRP抗原殘基相結合的分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷，所述抗原殘基的特征是被一種抗體結合，該抗體具有ATCC保藏號為PTA-5690的克隆所編碼的單克隆抗體的識別特性，所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷與藥物、毒素、酶和放射性化合物中的至少一種物質相交聯。
52.包含分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷的交聯殘基在生產治療癌癥患者的藥劑中的應用，所述抗原殘基的特征是被一種抗體結合，該抗體具有ATCC保藏號為PTA-5691的克隆所編碼的單克隆抗體的識別特性，所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷與藥物、毒素、酶和放射性化合物中的至少一種物質相交聯。
53.從腫瘤患者中選出那些對分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷治療敏感的患者的方法，所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷與37LRP所表達的抗原殘基相結合，該方法包括提供來自腫瘤患者的組織樣品；將所述組織樣品與由ATCC保藏號為PTA-5690的雜交瘤細胞系所生成的、與37LRP表達的抗原殘基相結合的分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷相接觸，所述抗原殘基的特征是與所述分離的單克隆抗體獨特結合；和，測定所述抗原殘基的結合；從而實現患者的選擇。
54.根據權利要求6所述的方法，進一步包括用一種分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷治療患者，所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷與37LRP所表達的抗原殘基相結合。
全文摘要
本發明涉及使用新型篩選方案來生成患者的癌癥調節抗體的方法。該抗體能夠用于幫助腫瘤分期和診斷，還能用來治療原發性腫瘤和腫瘤轉移。抗癌抗體能夠與毒素、酶、放射性化合物和造血細胞交聯。本發明進一步涉及這樣的診斷和治療，利用5LAC23單克隆抗體(或來源自它們的抗原結合片斷)與層粘連蛋白受體1前體蛋白37LRP相結合的能力；特別涉及肝細胞癌的診斷和治療，利用依賴于5LAC－23與特定抗原殘基直接結合的各種方法，所述抗原殘基被特異性識別并通常在肝細胞癌細胞中過量表達。
文檔編號A61K47/48GK101023164SQ200580016953
公開日2007年8月22日 申請日期2005年3月29日 優先權日2004年3月26日
發明者大衛·S·F·楊, 蘇姍·E·哈恩, 海倫·P·芬德利, 福圖納·麥康基, 米歇爾·凱萊赫, 安德魯·沃納 申請人:阿里烏斯研究公司, 英國牛津生物醫藥有限公司