專利名稱：：治療胰腺癌的組合物和方法本申請要求了2004年3月24日提交的美國臨時申請No.60/555,809的權利，在此并入它的全部內容作為參考。
背景技術：
：本發明涉及生物科學的領域，更具體地是涉及癌癥研究的領域。具體地說，本發明涉及了組合物，該組合物包含能抑制編碼PCDH1、CDH3或GPR107的基因的表達的核酸。在一些實施方案中，該化合物是對應于這些基因的子序列的小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)。
背景技術：
：西方國家中，胰管腺癌(Pancreaticductaladenocarcinoma，PDACa)是癌癥死亡的第五個主要的原因，在任何惡性程度下都是致死率最高的幾種癌癥之一，5年的存活率僅有4％。在美國，每年估計有30700名病人被診斷為胰腺癌，而且近30000名病人死于胰腺癌。絕大部分患者在該疾病的晚期得到診斷，在這個階段該疾病對現有的療法都不起反應，而病人只能生存幾個月。只有手術切除才有可能治愈PDACa，但是只有10-20％的PDACa患者能接受可能根治的切除，而且即使在根治性手術后，也有80-90％的患者會出現復發而死于PDACa。在也接受吉西他濱(gemcitabine)和/或放射線化學治療的患者中，術后的結果或生活質量出現一些改善，但是這些方法對患者長期生存的影響卻極小，因為PDACa會對任何一種治療方法都有強烈的抗性。基于這種原因，對大多數患者的治療都集中于緩解病情上。因此，當前對于胰腺癌的治療來說十分緊迫的問題是建立一種新的PDACa分子治療方法和鑒定出新的PDACa治療性分子靶物。發明的公開本發明是基于一個驚人的發現，即抑制PCDH1，CDH3或GPR107的表達可以有效地抑制多種癌細胞的細胞生長，包括那些PDACa中涉及的細胞。本申請中所描述的發明部分地基于這一發現。本發明提供了抑制細胞生長的方法。在所述方法中，提供了包括將細胞與包含小干擾RNA(siRNA)的組合物接觸，該siRNA抑制PCDH1，CDH3或GPR107的表達的方法。本發明也提供了抑制受試者中腫瘤細胞生長的方法。這些方法包括給受試者施用包含小干擾RNA(siRNA)的組合物，其中siRNA可與來自PCDH1，CDH3或GPR107的序列特異性地雜交。本發明的另一方面，提供了在生物樣本的細胞中抑制PCDH1，CDH3或GPR107基因表達的方法。通過以足夠抑制PCDH1，CDH3或GPR107基因的表達的量將雙鏈核糖核酸(RNA)分子導入細胞，可以抑制所述基因的表達。另一方面，本發明涉及例如在所提供的方法中有用的產品，其包括核酸序列，載體以及包含它們的組合物。在所述產品中提供了siRNA分子，所述siRNA分子具有這樣的性質當它們被導入到表達PCDH1，CDH3或GPR107基因的細胞中時，抑制這些基因的表達。這樣的分子中包括那些包含了有義和反義鏈的分子，其中所述有義鏈包含與PCDH1，CDH3或GPR107靶序列相對應的核糖核苷酸序列，而其中所述反義鏈包含與該有義鏈互補的核糖核苷酸序列。所述分子的有義鏈和反義鏈互相雜交形成雙鏈分子。本申請中使用的術語“生物體”是指任何有生命的、包括至少一個細胞的實體。有生命的生物體可以像例如單真核細胞那樣簡單，或者像哺乳動物包括人那樣復雜。本申請中使用的術語“生物樣本”是指一個完整的生物體或生物體的組織、細胞或組成部分的亞類(subset)(如體液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、腦脊液、唾液、羊水、羊膜索(amnioticcord)血、尿液、陰道液和精液)。此外，“生物樣本”還可指勻漿、裂解產物、提取物、細胞培養物或組織培養物，其由完整的生物體或其組織、細胞或組成部分的亞類，或其級分或部分制備。最后，“生物樣本”指培養基，例如在其中生物體已經增殖的營養肉湯或凝膠，該培養基中包含細胞組分，例如蛋白質或核酸分子。本發明重點描述了抑制細胞生長的方法。通過使細胞同PCDH1，CDH3或GPR107的小干擾RNA(siRNA)的組合物接觸來抑制細胞生長。該細胞進一步同轉染增強劑相接觸。細胞以體外、體內或離體提供。受試者是哺乳動物，如人、非人的靈長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或牛。所述細胞是胰管細胞。或者，所述細胞是腫瘤細胞(即癌細胞)，如癌細胞或腺癌細胞。例如，所述細胞是胰管腺癌細胞。抑制細胞生長意味著處理的細胞與未處理的細胞相比，增殖的速率較低，或生存力(viability)降低。通過本領域中已知的增殖測定法來測定細胞生長。術語“siRNA”是指一種雙鏈的RNA分子，它阻斷目標mRNA的翻譯。采用了將siRNA導入細胞的標準技術，其中包括DNA為模板由其轉錄RNA的技術。siRNA包含有義的PCDH1，CDH3或GPR107核酸序列、反義的PCDH1，CDH3或GPR107核酸序列、或二者。所述siRNA可能包含兩個互補的分子，或者可以如此構建，以使得單個轉錄本同時具有來自目的基因的有義和互補的反義序列，例如發夾結構，在一些實施方案中，這導致微小RNA(miRNA)的產生。本方法用來改變例如由于細胞的惡性轉化而導致PCDH1，CDH3或GPR107的表達上調的細胞中的基因表達。在靶細胞中，siRNA同PCDH1，CDH3或GPR107的轉錄本相結合導致細胞產生PCDH1，CDH3或GPR107的減少。該寡核苷酸的長度為至少約10個核苷酸，并可與天然存在的PCDH1，CDH3或GPR107轉錄本一樣長。優選地，該寡核苷酸的長度為大約19個到大約25個核苷酸。最優選地，該寡核苷酸的長度少于大約75個，大約50個，或大約25個核苷酸。在哺乳動物細胞中抑制PCDH1，CDH3或GPR107表達的PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA寡核苷酸的例子包括分別含有靶序列例如SEQIDNOs22，23或24的核苷酸的寡核苷酸。設計具有在靶細胞中抑制基因表達的能力的雙鏈RNA的方法是已知的(參見如美國專利No.6,506,559，在此并入它的全部內容作為參考)。例如，由Ambion網站可得到用于設計siRNAs的計算機程序(http//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)。該計算機程序可從Ambion，Inc.獲得，其根據下面的步驟來選擇用于siRNA合成的核苷酸序列。siRNA目標位點的選擇1.以轉錄本的起始密碼子AUG開始，向下游尋找AA二核苷酸序列。記錄每一處AA和其3’端相鄰的19個核苷酸的出現作為可能的siRNA目標位點。Tuschl等人不推薦在5’和3’非翻譯區(UTR)和起始密碼子附近區域(75個堿基以內)設計siRNA(TargetedmRNAdegradationbydouble-strandedRNAinvitro.GenesDev13(24)3191-7(1999))，因為這些區域可能更富含調節蛋白的結合位點。UTR結合蛋白和/或翻譯起始復合物可干擾siRNA核酸內切酶復合物的結合。2.將可能的目標位點同適當的基因組數據庫(人、小鼠、大鼠等等)進行對比，并排除任何與其他編碼序列具有顯著的同源性的靶序列。推薦使用BLAST，其可以在NCBI服務器上找到，網址為www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。3.選擇合格的靶序列用于合成。通常沿著基因的長度來選擇幾個靶序列來評價。本發明還包含分離的核酸分子，其包含靶序列的核酸序列，例如SEQIDNOs22，23和24的核苷酸，或者與SEQIDNOs22，23和24的核苷酸的核酸序列互補的核酸分子。本文使用的“分離的核酸”是指脫離它們的原本的環境(如，若其為天然存在的，則指自然環境)，并由此合成性地由其自然狀態改變的核酸。本發明中，分離的核酸包括DNA、RNA以及它們的衍生物。當分離的核酸是RNA或它的衍生物時，核苷酸序列中的堿基“t”應被替換為“u”。本文使用的術語“互補”是指核酸分子的核苷酸單位之間的Watson-Crick或Hoogsteen堿基配對，而術語“結合”是指兩個核酸或化合物或相關的核酸或化合物或者其組合之間的物理或化學的相互作用。互補核酸序列在適當的條件下雜交以形成穩定的雙螺旋(duplex)結構，其包含極少的錯配或不包含錯配。對本發明而言，具有5個或更少的錯配的兩個序列被認為是互補的。而且本發明的分離的核苷酸的有義和反義鏈通過雜交可以形成雙鏈核苷酸或發夾環結構。在優選的實施方案中，這樣的雙螺旋在每10個配對中包含不多于1個錯配。在一個特別優選的實施方案中，雙螺旋的兩條鏈完全互補，這樣的雙螺旋不含有錯配。對于PCDH1，CDH3或GPR107，核酸分子的長度分別小于3851，3205或6840個核苷酸。例如，所述核酸分子的長度小于約500，約200或約75個核苷酸。本發明還包括含有一種或多種本文所述的核酸的載體，以及含有該載體的細胞。本發明的分離的核酸用于抗PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA，或者編碼該siRNA的DNA。當所述核酸用于siRNA或者編碼siRNA的DNA時，有義鏈優選長于約19個核苷酸，更優選長于21個核苷酸。本發明部分地基于下面的發現在胰管腺癌(PDACa)中，同非癌性胰組織相比，編碼PCDH1，CDH3或GPR107的基因過量表達。PCDH1，CDH3或GPR107的cDNA長度為3851，3205或6840個核苷酸。PCDH1，CDH3或GPR107的核酸序列和多肽序列分別顯示在SEQIDNO1和2，3和4或5和6。這些序列數據也可通過下面的登錄號得到。PCDH1(CFUPC)L11370，NM_002587CDH3X63629，NM_001793GPR107NM_032925，NM_020960，(KIAA1624R39794)AB046844包含SEQIDNOs22，23和24的siRNAs的轉染導致PDACa細胞系的生長抑制。PCDH1(CFUPC)屬于原鈣黏著蛋白家族(protocadherinfamily)，其是鈣依賴的細胞-細胞粘附的分子的鈣黏著蛋白超家族(cadherinsuperfamily)中最大的亞族。許多原鈣黏著蛋在中樞神經系統中高表達，它們可能在神經回路發生和突觸傳遞調節中發揮作用(SanoK，TaniharaH，HeimarkRL，ObataS，DavidsonM，StJohnT，TaketaniS，SuzukiS.Protocadherinsalargefamilyofcadherin-relatedmoleculesincentralnervoussystem.EMBOJ.，122249-56，1993.FrankM，andKemlerR.Protocadherins.CurrOpinCellBiol.，14557-62，2002)。但是，PCDH1在胰腺癌細胞中十分豐富，中樞神經系統中卻不豐富(圖3A)，它的功能還不清楚。CDH3也是鈣黏著蛋白家族中一個典型成員(ShimoyamaY，YoshidaT，TeradaM，ShimosatoY，AbeO，HirohashiS.MolecularcloningofahumanCa2+-dependentcell-celladhesionmoleculehomologoustomouseplacentalcadherinitslowexpressioninhumanplacentaltissues.JCellBiol.，1091787-94.1989)，它們通過其保守的胞內域與聯蛋白(catenins)和細胞骨架(cytoskeletons)連接，介導控制細胞極性、分化、運動和細胞生長的信號轉導(ChristoforiG.Changingneighbors，changingbehaviorcelladhesionmolecules-mediatedsignalingduringtumorprogression.EMBOJ.，22，2318-2323，2003)。但是，與E-鈣黏著蛋白或N-鈣黏著蛋白不同，CDH3的功能還不清楚。在乳腺和卵巢中觀察到了它的表達，在乳腺癌和前列腺癌中報道了表達的喪失(loss)，盡管乳腺癌中的P-鈣黏著蛋白的表達與較差的預后相關聯((PeraltaSolerA，KnudsenKA，SalazarH，HanAC，KeshgegianAA.P-cadherinexpressioninbreastcarcinomaindicatespoorsurvival.Cancer，861263-1272.1999)。GPR107(KIAA1624)是有七次跨膜結構(seventransmembrane)的G蛋白偶聯受體(Gprotein-coupledreceptors，GPCR)的一種。當前有很大一部分處方藥靶向一個或多個GPCR，而對于大部分主要的治療區域，在某種程度上通過幾種以GPCR為基礎的藥物起作用。很明顯，就藥物發現的潛力而言，GPCRs的排位是最高的。如Northern印跡分析(圖3C)所示，GPR107在正常的心臟、胎盤、骨骼肌、前列腺、睪丸、卵巢和脊髓中無限制地表達。但是，GPR107在重要的生命器官中豐度較低，這說明靶向這些分子可望在人體內產生較低的毒性。抑制細胞生長的方法本發明涉及通過抑制PCDH1，CDH3或GPR107的表達來抑制細胞生長，即癌細胞生長。PCDH1，CDH3或GPR107的表達，例如，通過特異性地靶向PCDH1，CDH3或GPR107基因的小干擾RNA(siRNA)而被抑制。PCDH1，CDH3或GPR107靶物包括，例如，SEQIDNOs22，23和24的核苷酸。在非哺乳動物細胞中，已顯示雙鏈RNA(dsRNA)對基因表達發揮很強的特異的沉默作用，這被稱為RNA干擾(RNAi)(SharpPA.RNAianddouble-strandRNA.GenesDev.1999Jan15；13(2)139-41.)。dsRNA被含有RNaseIII基序的酶加工成20-23個核苷酸的dsRNA，稱為小干擾RNA(siRNA)。所述siRNA與多組分核酸酶復合物一起特異地靶向互補的mRNA(HammondSM，BernsteinE，BeachD，HannonGJ.AnRNA-directednucleasemediatespost-transcriptionalgenesilencinginDrosophilacells.Nature.2000Mar16；404(6775)293-6；HannonGJ.RNAinterference.Nature.2002Jul11；418(6894)244-51.)。在哺乳動物細胞中，由20或21-merdsRNA構成的、具有19個互補的核苷酸和3’末端非互補的胸腺嘧啶或尿嘧啶二聚體的siRNA，已顯示具有基因特異性的knock-down作用而不導致基因表達的全局性變化(ElbashirSM，HarborthJ，LendeckelW，YalcinA，WeberK，TuschlT.Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells.Nature.2001May24；411(6836)494-8.)。另外，含有核內小RNA(smallnuclearRNA，snRNA)U6或聚合酶IIIH1-RNA啟動子的質粒有效地產生這種募集第III類RNA聚合酶III的短RNA，從而能夠組成性地抑制其目標mRNA(MiyagishiM，TairaK.U6promoter-drivensiRNAswithfoururidine3′overhangsefficientlysuppresstargetedgeneexpressioninmammaliancells.NatBiotechnol.2002May；20(5)497-500.；BrummelkampTR，BernardsR，AgamiR.ASystemforStableExpressionofShortInterferingRNAsinMammalianCellsScience.296(5567)550-553，April19，2002.)。通過將細胞與含有PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA的組合物接觸來抑制細胞生長。進一步將該細胞與轉染試劑接觸。合適的轉染試劑是本領域已知的。抑制細胞的生長意味著同沒有暴露于所述組合物的細胞相比，細胞以更低的速率增殖或具有降低的生存力。通過本領域已知的方法，如MTT細胞增殖試驗來測定細胞生長。所述PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA定向于PCDH1，CDH3或GPR107基因序列的單一靶物。或者，所述siRNA定向于PCDH1，CDH3或GPR107基因序列的多個靶物。例如，所述組合物含有定向于PCDH1，CDH3或GPR107的2個，3個，4個，或5個或者更多靶序列的PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA。PCDH1，CDH3或GPR107靶序列是指與PCDH1，CDH3或GPR107基因的一部分相同的核苷酸序列。靶序列可包括人PCDH1，CDH3或GPR107基因的5’端非翻譯(UT)區、開放閱讀框(ORF)或者3’端非翻譯區。或者，所述siRNA是同PCDH1，CDH3或GPR107基因表達的上游或下游調節序列(modulator)互補的核酸序列。上游和下游調節序列的例子包括同PCDH1，CDH3或GPR107基因啟動子結合的轉錄因子、同PCDH1，CDH3或GPR107多肽相互作用的激酶或磷酸酶、PCDH1，CDH3或GPR107啟動子或者增強子。同目標mRNA雜交的PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA減少或抑制由PCDH1，CDH3或GPR107基因編碼的PCDH1，CDH3或GPR107多肽產物的產生，這是通過與正常的單鏈mRNA轉錄本結合，從而干擾翻譯，并由此干擾所述蛋白的表達。所以本發明的siRNA分子可定義為它們在嚴格的條件下，同來自PCDH1，CDH3或GPR107基因的mRNA或cDNA特異性雜交的能力。對本發明而言，術語“雜交”或“特異性雜交”用于指在“嚴格的雜交條件”下，兩種核酸分子雜交的能力。術語“嚴格的雜交條件”是指在此條件下，通常是在核酸的復雜混合物中，核酸分子與其靶序列雜交，而與其它序列不發生可檢測的雜交。嚴格的條件是序列依賴性的，而且在不同的環境下是不同的。序列越長，特異性雜交的溫度越高。詳細的關于核酸雜交的指導見于Tijssen，TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleicProbes，“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays”(1993)。一般而言，在特定的離子強度和pH值條件下，嚴格條件選擇為比特定序列的熔點(Tm)低大約5-10℃。所述Tm是指(在特定離子強度、pH值和核酸濃度下)大約50％的與靶物互補的探針同靶序列在平衡狀態雜交的溫度(由于靶序列過量存在，在Tm下，平衡時50％的探針被占據)。嚴格的條件也可以通過添加去穩定試劑如甲酰胺達到。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號至少為背景的2倍，優選是背景雜交的10倍。下面可為示例性的嚴格雜交條件50％的甲酰胺，5xSSC和1％SDS，孵育溫度為42℃；或者5x的SSC和1％SDS，孵育溫度為65℃，在0.2x的SSC和0.1％SDS在50℃洗滌。本發明的siRNA的長度小于約500個，約200個、約100個、約50個，或約25個核苷酸。優選地，該siRNA長度為約19個到約25個核苷酸。示例性的用于生產PCDH1，CDH3或GPR107siRNA的核酸序列分別包含SEQIDNos22，23或24的核苷酸序列作為靶序列。此外，為了增強siRNA的抑制活性，可在靶序列的反義鏈的3’末端添加核苷酸“U”。待添加的“U”的數目最少為約2個，一般情況是約2個到約10個，優選約2個到約5個。添加的“U”在該siRNA的反義鏈的3’末端形成單鏈。細胞是任何表達或過表達PCDH1，CDH3或GPR107的細胞。該細胞是上皮細胞如胰管細胞。或者，該細胞是腫瘤細胞，例如如癌、腺癌、母細胞瘤、白血病、骨髓瘤或者肉瘤。所述細胞是胰管腺癌細胞。PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA以能同mRNA轉錄本相結合的形式直接導入細胞。或者，編碼PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA的DNA在載體中。載體通過例如下面的方式來產生將PCDH1，CDH3或GPR107靶序列克隆到表達載體中，其可操作地連接于調控序列，所述調控序列以使得兩條鏈都(通過DNA分子的轉錄)表達的方式位于該PCDH1，CDH3或GPR107序列的側翼，(Lee，N.S.，Dohjima，T.，Bauer，G.，Li，H.，Li，M.-J.，Ehsani，A.，Salvaterra，P.，andRossi，J.(2002)ExpressionofsmallinterferingRNAstargetedagainstHIV-1revtranscriptsinhumancells.NatureBiotechnology20500-505.)。由第一個啟動子(如克隆的DNA的3’啟動子序列)轉錄與PCDH1，CDH3或GPR107mRNA反義的RNA分子，另外由第二個啟動子(如克隆的DNA的5’啟動子)轉錄出PCDH1，CDH3或GPR107mRNA的有義鏈的RNA分子。有義和反義鏈在體內雜交以產生siRNA構建體用于使PCDH1，CDH3或GPR107基因沉默。或者，用兩種構建體來產生siRNA構建體的有義和反義鏈。克隆的PCDH1，CDH3或GPR107也可編碼具有二級結構，如發夾結構的構建體，其中單個轉錄本同時具有來自靶基因的有義序列和互補的反義序列。由任意的核苷酸序列組成的環序列可以位于有義和反義序列之間以形成發夾環結構。因此，本發明也提供了具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’的siRNA，其中[A]是與同來自PCDH1，CDH3或GPR107的mRNA或cDNA特異性雜交的序列相對應的核糖核苷酸序列。在更優選的實施方案中，[A]是與選自SEQIDNos22，23和24的核苷酸的序列相對應的核糖核苷酸序列，[B]是由3-23個核苷酸組成的核糖核苷酸序列，且[A’]是由[A]的互補序列組成的核糖核苷酸序列。[A]區同序列[A’]雜交，然后形成由[B]區組成的環。環序列的長度優選可為約3個到約23個核苷酸。例如，環序列可選自下列序列(http//www.ambion.com/techlib/tb/tb506.html)。此外，由23個核苷酸組成的環序列也提供具活性的siRNA(Jacque，J.-M.，Triques，K.，andStevenson，M.(2002)ModulationofHIV-1replicationbyRNAinterference.Nature418435-438)。CCC，CCACC或者CCACACCJacque，J.M.，Triques，K.，andStevenson，M(2002)ModulationofHIV-1replicationbyRNAinterference.Nature，Vol.418435-438。UUCGLee，N.S.，Dohjima，T.，Bauer，G.，Li，H.，Li，M.-J.，Ehsani，A.，Salvaterra，P.，andRossi，J.(2002)ExpressionofsmallinterferingRNAstargetedagainstHIV-1revtranscriptsinhumancells.NatureBiotechnology20500-505.Fruscoloni，P.，Zamboni，M.，andTocchini-Valentini，G.P.(2003)Exonucleolyticdegradationofdouble-strandedRNAbyanactivityinXenopuslaevisgerminalvesicles.Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(4)1639-1644。UUCAAGAGADykxhoorn，D.M.，Novina，C.D.，andSharp，P.A.(2002)KillingthemessengerShortRNAsthatsilencegeneexpression.NatureReviewsMolecularCellBiology4457-467。例如，本發明優選的帶有發夾環結構的siRNAs如下所示。在下列的結構中，所述環序列可選自CCC，UUCG，CCACC，CCACACC和UUCAAGAGA。優選的環序列是UUCAAGAGA(DNA序列為ttcaagaga(SEQIDNO35))。GACAUCAAUGACAACACAC-[B]-GUGUGUUGUCAUUGAUGUC(SEQIDNO22的靶序列)GGAGACAGGCUGGUUGUUG-[B]-CAACAACCAGCCUGUCUCC(SEQIDNO23的靶序列)GUGGCUCUACCAGCUCCUG-[B]-CAGGAGCUGGUAGAGCCAC(SEQIDNO24的靶序列)PCDH1，CDH3或GPR107序列側翼的調控序列是相同的或者是不同的，使得它們的表達可以被獨立地調節，或者以時間的或空間的方式調節。通過將PCDH1，CDH3或GPR107基因模板克隆到載體中，可以在細胞內轉錄出siRNAs，其中所述表達載體包括，例如，來自于核內小RNA(snRNA)U6或者人H1RNA啟動子的RNA聚合酶III轉錄單位。為了將載體引入到細胞中，可使用轉染促進劑(transfectionenhancingagent)。將FuGENE(RocheDiagnostices)，Lipofectamine2000(Invitrogen)，Oligofectamine(Invitrogen)，和Nucleofector(WakopureChemical)用作轉染促進劑。根據標準的方法，在體外檢測PCDH1，CDH3或GPR107mRNA中多個部分的寡核苷酸和互補寡核苷酸在腫瘤細胞(如使用胰腺細胞系，例如胰管腺癌(PDACa)細胞系)中減少PCDH1，CDH3或GPR107的能力。利用PCDH1，CDH3或GPR107的特異性抗體或其它檢測策略測定，與沒有候選siRNA組合物存在下培養的細胞相比，與候選siRNA組合物接觸的細胞中PCDH1，CDH3或GPR107基因產物減少。然后，檢測在體外的基于細胞或無細胞的分析中使PCDH1，CDH3或GPR107的產生減少的序列對于細胞生長的抑制作用。在小鼠或大鼠體內檢測在體外基于細胞分析中抑制細胞生長的序列，以確證在具有惡性新生物的動物中PCDH1，CDH3或GPR107產生的減少及腫瘤細胞生長的降低。治療惡性腫瘤的方法患有以過表達PCDH1，CDH3或GPR107為特征的腫瘤的患者通過施用PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA來治療。在患有或具有發生例如胰管腺瘤(PDACa)的危險的患者中，siRNA療法被用來抑制PCDH1，CDH3或GPR107的表達。通過標準的方法來鑒定這些患者的具體腫瘤類型。胰管腺瘤(PDACa)例如通過CT，MRI，ERCP，MRCP，計算機X線斷層攝影術(computertomography)或超聲波來診斷。如果治療在受試者中產生臨床有益效果，例如PCDH1、CDH3或GPR107的表達減少，或腫瘤的大小、患病率(prevalence)或轉移可能性的降低等等，則該治療是有效的。當預防性應用治療時，“有效”是指治療阻礙或防止腫瘤的形成，或者防止或緩解腫瘤的臨床癥狀的癥狀。有效性是結合任何用于診斷或治療特定的腫瘤種類的已知方法來確定的。siRNA治療是通過以編碼本發明的siRNA的標準載體和/或基因遞送系統，例如通過遞送合成的siRNA分子對患者施用siRNA來進行的。通常，合成的siRNA分子被化學穩定化，以防止體內核酸酶降解。制備化學穩定化的RNA分子的方法在本領域是已知的。通常，這樣的分子包含修飾的骨架(backbones)和核苷酸以防止核糖核酸酶的作用。其它的修飾也是可能的，如膽固醇結合的siRNA已顯示了改善的藥學性質(Songetal.NatureMed.9347-351(2003))。合適的基因遞送系統可包括脂質體，受體介導的遞送系統(receptormediateddeliverysystems)，或病毒載體例如皰疹病毒、逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒等等。治療的核酸組合物被配制到可藥用的載體中。治療的組合物也可以包括如上所述的基因遞送系統。可藥用的載體是適合施用于動物的生物相容性賦形劑(vehicle)，例如生理鹽水。化合物的治療有效量是能產生醫學上預期效果的量，所述醫學上預期效果例如在受治療的動物中減少PCDH1，CDH3或GPR107的產生，減少細胞生長如增殖，或者減少腫瘤生長。胃腸外施用，如靜脈內、皮下、肌肉內和腹膜內遞送途徑，可以用來遞送PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA組合物，對于胰腺癌的治療，腹腔動脈、脾動脈或肝總動脈直接注入都是有用的。任一患者的劑量取決于許多因素，包括患者身材的大小(size)、身體的表面積、年齡、所施用的具體核酸、性別、施用的時間和途徑、一般健康狀況和同時施用的其它藥物。靜脈內施用的核酸的劑量為大約106至1022個拷貝的所述核酸分子。以標準方法施用多核苷酸，如通過注射到如肌肉或皮膚組織的間質間隙(interstitialspace)中、導入到循環系統中或體腔中，或者通過吸入或吹入。多核苷酸也與可藥用的液體載體，例如水性或部分水性的液體載體一起通過注射或其他途徑遞送給動物。多核苷酸同脂質體(如陽離子或陰離子脂質體)相結合。多聚核酸中包括靶細胞表達所需要的遺傳信息，如啟動子。除非另外限定，本文使用的所有技術和科學術語具有同本發明所屬領域中普通技術人員的所通常理解的相同的意義。雖然與本文所描述的方法和材料類似或等價的方法和材料可用于本發明的實施或測試，但是合適的方法和材料如下所述。這里所提到的出版物、專利申請、專利和其它的參考文獻全部以其全文并入本文作為參考。在矛盾的情況下，以包括定義的本說明書為準。另外，所述材料、方法和實例僅僅是說明性的，而不是限制性的。附圖簡述圖1描述了通過RT-PCR顯示在PDACa細胞中過量表達PCDH1(A)和CDH3(B)的確認結果的照片。來自同一個體的顯微切割的正常胰管上皮細胞(正常)和生命器官(肺、心臟、肝、腎和骨髓)的樣品，通過半定量RT-PCR進行對比。圖2描述了顯示PDACa組織中免疫組織化學結果的照片。在胰管腺癌細胞中觀察到CDH3蛋白過量表達，但是正常的胰管中卻沒有。圖3描述了每個胰腺癌靶基因在正常成年組織中的表達譜的Northern印跡分析的照片。(A)PCDH1，(B)CDH3和(C)GPR107。圖4描述了顯示用siRNAknockdownPDACa細胞PK-45P中內源PCDH1的效果的照片。圖4(A)顯示RT-PCR的結果。該結果證實，通過轉染siRNA表達載體410si而不是通過EGFPsi，確認了PCH1mRNA的knockdown作用。410si被特異性地設計為用于PCDH1mRNA序列，而EGFP用于EGFPmRNA的序列。轉染48小時后收獲RNA進行分析。用ACTB將輸入的cDNA進行歸一化。圖4(B)是顯示集落形成試驗的結果的照片。其顯示用410si轉染載體一周后集落的數目急劇減少，其中410si已通過RT-PCR證明有效地knockdownPCDH1。圖4(C)是顯示MTT測定結果的條形圖。它也顯示了用410si轉染的而不是通過EGFPsi的生長細胞的數目急劇減少。圖5描述了顯示用siRNAknockdownPDACa細胞KLM-1中內源CDH3的效果的照片。圖5(A)顯示RT-PCR的結果。其通過轉染siRNA表達載體si24而不是通過EGFPsi轉染證實了CDH3mRNA的knockdown作用。si24被特異性地設計為用于CDH3mRNA序列，而EGFPsi則用于EGFPmRNA序列。轉染48小時后收獲RNA進行分析。用ACTB將輸入的cDNA進行歸一化。圖5(B)是顯示集落形成試驗的結果的照片。其顯示用si24轉染一周后細胞中集落的數目明顯減少，所述si42載體已通過RT-PCR證明有效地knockdownCDH3。圖5(C)是顯示MTT測定結果的條形圖。它也顯示用si24轉染的而不是通過EGFPsi的生長細胞數的急劇減少。圖6描述了用siRNAknockdownPDACa細胞KLM-1中內源GPR-107的效果的照片。圖6(A)顯示RT-PCR的結果。該結果通過轉染siRNA表達載體1003si而不是通過EGFPsi，證實了GPR-107mRNA的knockdown作用。1003si特異性地設計為用于GPR-107mRNA序列，而EGFPsi則用于EGFPmRNA序列。轉染48小時后收獲RNA進行分析。用ACTB將輸入的cDNA進行歸一化。圖6(B)是顯示集落形成試驗的結果的照片。其顯示用1003si轉染一周后細胞中集落的數目減少，所述1003si已通過RT-PCR證明有效地knockdownGPR-107。圖6(C)是顯示MTT測定結果的條形圖。它也顯示用1003si轉染的而不通過EGFPsi的生長細胞數減少。實施本發明的最佳方式本發明將在下面的實施例中做進一步的描述，其并沒有限制如權利要求中所述的本發明的范圍。[實施例1]通用方法細胞系和組織樣品人胰腺細胞系PK45P，KLM1和MIA-PaCa2(ATCC編號CRL-1420)得自日本東北大學發育、衰老和癌癥研究所生物醫學研究細胞資源中心(CellResourceCenterforBiomedicalResearch，InstituteofDevelopment，AgingandCancer，TohokuUniversity)。所有的細胞都是公眾可獲得的。利用cDNA微陣列分離PDACa細胞中過表達的基因cDNA微陣列玻片的制作方法已經有描述(OnoK，TanakaT，TsunodaT，KitaharaO，KiharaC，OkamotoA，OchiaiK，TakagiT，andNakamuraY.CancerRes.，605007-5011，2000)。對每個表達譜分析，都制備雙份的包含大約23040個DNA點的cDNA微陣列片，以減少實驗波動。簡單的說，從18個胰腺癌組織顯微切割的PDACa細胞和正常胰管上皮中純化出總RNA。進行基于T7的RNA擴增，以獲得足夠用于微陣列實驗的RNA。通過分別使用Cy5-dCTP和Cy3-dCTP(AmershamBiosciences)進行逆轉錄，對來自PDACa細胞和正常胰管上皮的擴增RNA的等分試樣進行標記。雜交、洗滌和檢測如前面描述進行(OnoK，TanakaT，TsunodaT，KitaharaO，KiharaC，OkamotoA，OchiaiK，TakagiT，andNakamuraY.CancerRes.，605007-5011，2000)。接著，在上調的基因中，關注PCDH1，CDH3和GPR107這三個基因，因為它們在超過50％的已知癌癥中的表達率超過5.0，而根據我們以前對29種正常人組織中基因表達的數據，它們在正常的主要生命器官中的表達水平相對比較低(Saito-HisaminatoA，KatagiriT，KakiuchiS，NakamuraT，TsunodaT，NakamuraY.Genome-wideprofilingofgeneexpressionin29normalhumantissueswithacDNAmicroarray.DNARes.，935-45，2002)。PCDH1和CDH3的半定量RT-PCR將來自顯微切割的PDACa細胞和正常胰管上皮細胞的RNA通過基于T7的體外轉錄(EpicentreTechnologies)經過兩輪擴增，并合成為單鏈cDNA。制備每個單鏈cDNA的合適的稀釋物用于隨后的PCR擴增，其通過監控β-肌動蛋白(ACTB)作為定量對照。本發明人采用的引物序列為對于PCDH1為5’-AGAAGGAGACCAAGGACCTGTAT-3’(SEQ.ID.NO.7)和5’-AGAACTTTATTGTCAGGGTCAAGG-3’(SEQ.ID.NO.8)對于CDH3為5’-CTGAAGGCGGCTAACACAGAC-3’(SEQ.ID.NO.9)和5’-TACACGATTGTCCTCACCCTTC-3’(SEQ.ID.NO.10)對于ACTB為5’-CATCCACGAAACTACCTTCAACT-3’(SEQ.ID.NO.11)和5’-TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG-3’(SEQ.ID.NO.12)所有的反應包括在GeneAmpPCR系統9700(PEAppliedBiosystems)上在94℃起始變性2分鐘；然后進行21個(對ACTB)或28-32個(對PCDH1和CDH3)94℃30秒，58℃30秒，和72℃1分鐘的循環。免疫組織化學將經甲醛固定和石蠟包埋的PDACa切片，用小鼠抗-CDH3單克隆抗體(BDTransductionLaboratories)進行免疫染色用于CDH3表達。將脫掉石蠟的組織切片置于pH6.0的10mM檸檬酸鹽緩沖液中，并在高壓滅菌器中加熱至108℃15分鐘用于抗原挽救(antigenretrieval)。將切片分別用稀釋度為1∶10或1∶100的CDH3的第一抗體在濕度箱中在室溫下溫育一小時，并用過氧化物酶標記的葡聚糖聚合物然后用二氨基聯苯胺(DAKOEnvisionPlusSystem；DAKOCorporation，Carpinteria，CA)來顯色。最后用蘇木精對切片進行復染。對于陰性對照的樣品，省略了第一抗體。Northern印跡分析將人的多組織Northern印跡(Clontech)與[α-32P]dCTP標記的PCR產物進行雜交，所述PCR產物是通過上面描述的引物擴增的。按照供應商推薦的方法進行預雜交、雜交和洗滌。印跡在-80℃下用增感屏放射自顯影5天。psiU6BX質粒的構建將編碼siRNA的DNA序列插入如下面的質粒序列(SEQIDNo26)中(-)表示的核苷酸485-490的缺口中。據報道snRNAU6基因由RNA聚合酶III轉錄，RNA聚合酶III產生在3’末端具有尿苷的短轉錄本。使用人胎盤DNA作為模板，及引物組5’-GGGGATCAGCGTTTGAGTAA-3’(SEQIDNo27)和5’-TAGGCCCCACCTCCTTCTAT-3’(SEQIDNo28)，通過PCR擴增包含啟動子區的snRNAU6基因的基因組片段。純化該產物并使用TA克隆試劑盒按照供應商(Invitrogen)的規程克隆到pCR質粒載體中。將含有snRNAU6基因的BamHI和XhoI片段純化并克隆到pcDNA3.1(+)質粒的核苷酸1257-56片段，該片段是用引物組5’-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’(SEQIDNo29)和5’-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3’(SEQIDNo30)通過PCR擴增的。將連接的DNA用作PCR的模板，其引物為5’-TTTAAGCTTGAAGACTATTTTTACATCAGGTTGTTTTTCT-3’(SEQIDNo31)和5’-TTTAAGCTTGAAGACACGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3’(SEQIDNo32)。將該產物用HindIII消化，其隨后自連接以產生psiU6BX載體質粒。作為對照，通過將雙鏈寡核苷酸5’-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQIDNo33)和5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQIDNo34)克隆到載體psiU6BX中的BbsI位點而制備psiU6BX-EGFP。表達siRNA的構建體siRNA的核苷酸序列是使用可從Ambion網站(http//www.ambion.com/techlib/misc/siRNAfinder.html)得到的siRNA設計計算機程序進行設計的。簡單地說，用于siRNA合成的核苷酸序列使用下面的規程來選擇。siRNA目標位點的選擇1.從每個基因轉錄本的起始密碼子AUG開始，向下游搜索AA二核苷酸序列。將每一處AA和3’端相鄰的19個核苷酸的出現記錄為可能的siRNA目標位點。Tuschl等不推薦在5’和3’非翻譯區(UTR)和起始密碼子附近區域(75個堿基以內)設計siRNA，因為這些區域可能更富含調節蛋白的結合位點。UTR結合蛋白和/或翻譯起始復合物會干擾siRNA核酸內切酶復合物的結合。2.將可能的目標位點同適當的基因組數據庫(人類、小鼠、大鼠等等)進行對比，以淘汰掉與其他編碼序列具有顯著的同源性的靶序列。3.選擇合格的靶序列用于合成。沿著基因的長度選擇幾個靶序列用于評價。下面顯示用于基因PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA的寡核苷酸。每個寡核苷酸是靶序列的有義核苷酸序列和反義核苷酸序列的組合。發夾環結構的核苷酸序列和靶序列分別顯示在SEQIDNO19到SEQIDNO21和SEQIDNO22到SEQIDNO24(從每一個發夾環結構序列中去除了核酸內切酶識別位點)。用于PCDH1的siRNA表達載體的插入序列410si5’-CACCGACATCAATGACAACACACTTCAAGAGAGTGTGTTGTCATTGATGTC-3’(SEQIDNO13)和5’-AAAAGACATCAATGACAACACACTCTCTTGAAGTGTGTTGTCATTGATGTC-3’(SEQIDNO14)用于CDH3的siRNA表達載體的插入序列si245’-CACCGGAGACAGGCTGGTTGTTGTTCAAGAGACAACAACCAGCCTGTCTCC-3’(SEQIDNO15)和5’-AAAAGGAGACAGGCTGGTTGTTGTCTCTTGAACAACAACCAGCCTGTCTCC-3’(SEQIDNO16)用于GPR107的siRNA表達載體的插入序列1003si5’-CACCGTGGCTCTACCAGCTCCTGTTCAAGAGACAGGAGCTGGTAGAGCCAC-3’(SEQIDNO17)和5’-AAAAGTGGCTCTACCAGCTCCTGTCTCTTGAACAGGAGCTGGTAGAGCCAC-3’(SEQIDNO18)作為對照的siRNA表達載體的插入序列EGFPsi(對照)5’-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQIDNO33)和5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQIDNO34)每個序列的序列號(SEQIDNO)在表1中列出集落形成/MTT測定將PK45P，KLM1和MIA-PaCa2之中的人PDACa細胞系鋪到直徑10-cm的盤中(5X105個細胞/盤)，并根據制造商的說明使用Lipofectamine2000(Invitrogen)或FuGENE6(Roche)以包含EGFP靶序列(EGFP)的psiU6BX和包含靶序列的psiU6BX進行轉染。通過500mg/ml的遺傳霉素(Geneticin)篩選細胞一周。最初的細胞在轉染48小時后收獲，并通過RT-PCR分析以證實對于PCDH1，CDH3和GPR107的knockdown。RT-PCR的引物與上面的相同。這些細胞也可用吉姆薩液(Giemsasolution)染色并進行MTT分析，從而分別評價集落的形成和細胞數。[實施例2]用siRNA方法減少基因PCDH1，CDH3或GPR107的表達和癌細胞的生長抑制在先前的研究中，通過結合激光顯微切割和點樣了27000個基因的全基因組cDNA微陣列，建立了PDACa精確的表達譜。本發明者通過與正常的胰管上皮(其被認為是PDACa的來源)的表達譜比較，在PDACa細胞中鑒定了超過200個基因作為上調的基因(NakamuraT，FurukawaY，NakagawaH，TsunodaT，OhigashiH，MurataK，IshikawaO，Ohgaki，KashimuraN，MiyamotoM，HiranoS，KondoS，KatohH，NakamuraY，andKatagiriT.Genome-widecDNAmicroarrayanalysisofgene-expressionprofilesinpancreaticcancersusingpopulationsoftumorcellsandnormalductalepitheliumcellsselectedforpuritybylasermicrodissection.Oncogene，2004Feb9，正式印刷前的電子發布稿(Epub))。根據這些PDACa細胞的表達譜，本發明人選擇了三個過量表達的基因，使用來自顯微切割的PDACa細胞的cDNA通過RT-PCR(圖1A，B)或通過免疫組織化學(圖2)，確證了PCDH1和CDH3在PDACa中的過量表達。(1)PCDH1(原鈣黏著蛋白，Protocadherin1)(Genbank登錄號NM_002587；SEQIDNo.1，2)為了研究PCDH1對PDACa細胞生長和存活的影響，本發明人通過基于哺乳動物載體的RNA干擾(RNAi)技術特異性地knockdownPCDH1在PDACa細胞系中的內源表達。如Northern印跡分析(圖3A)所示，PCDH1在正常的心臟、胎盤和前列腺中不受限制地表達。它在主要的生命器官中豐度不高，這說明靶向這些分子將預期在人體內產生較低的毒性。轉染產生siRNA的載體很清楚地導致一種設計用于PCDH1的siRNA，410si的內源性表達的減少(圖4A)。該siRNA對于PCDH1mRNA的knockdown作用在集落形成測定(圖4B)和MTT測定(圖4C)中導致了急劇的生長抑制。這些發現強烈地暗示PCDH1在PDACa細胞中的過表達與癌細胞生存力相關。PCDH1和其它原鈣黏著蛋白被支持在細胞表面上通過它們的鈣黏著蛋白結構域發生嗜同種受體相互作用(homophilicinteraction)，并且調節細胞骨架構象、細胞運動或細胞生長的胞內信號轉導(SanoK，TaniharaH，HeimarkRL，ObataS，DavidsonM，StJohnT，TaketaniS，SuzukiS.Protocadherinsalargefamilyofcadherin-relatedmoleculesincentralnervoussystem.EMBOJ.，122249-56，1993，FrankM，andKemlerR.Protocadherins.CurrOpinCellBiol.，14557-62，2002.)。根據我們的數據，PCDH1可能通過其在細胞-細胞粘附中的嗜同種受體相互作用調節胰腺癌細胞生長的正信號。(2)CDH3(P-鈣黏著蛋白，P-cadherin)(Genbank登錄號NM001793；SEQIDNo.3，4)本發明人通過RT-PCR(圖1B)和免疫組織化學(圖2)確證CDH3在PDACa細胞中的過量表達。并根據微陣列數據和RT-PCR(圖1B)，在我們的PDACa表達譜中超過200個上調的基因中CDH3過量表達是最顯著的譜之一。如Northern印跡分析(圖3B)所示CDH3在正常的胸腺、前列腺、卵巢和氣管中不受限制地表達。它在主要生命器官中豐度不高，這說明靶向這些分子將預期在人體內產生較低的毒性。為了探討CDH3對PDACa細胞生長或存活的影響，本發明人通過基于哺乳動物載體的RNA干擾(RNAi)技術特異性地knockdownCDH3在PDACa細胞系中的內源表達。轉染產生siRNA的載體清楚地導致一種設計用于CDH3的siRNA，si24的內源性表達(圖5A)。該siRNA對于PCDH1mRNA的knockdown作用在集落形成測定(圖5B)和MTT測定(圖5C)中導致了急劇的生長抑制。這些發現強烈地暗示了CDH3在PDACa細胞中過表達與癌細胞生存力以及細胞間相互作用相關，而且這個分子可涉及來自細胞間相互作用的信號轉導。PDACa有極強的侵略性，而且CDH3在PDACa細胞中的高表達也可與它們的侵略性和轉移潛力有關。(3)GPR107(G蛋白偶聯受體107)(Genbank登錄號AB046844；SEQIDNo.5，6)本發明人確定此孤兒(orphan)GPCR作為胰腺癌的靶物，但其功能和配體未知。如Northern印跡分析(圖3C)所示，GPR107在正常的心臟、胎盤、骨骼肌、睪丸、卵巢和脊髓中不受限制地表達。為了研究GPR107對于PDACa細胞生長或存活的影響，本發明人通過siRNA特異性地knockdown其GPR107在PDACa細胞系中的內源表達。轉染產生siRNA的載體清楚地導致一種設計用于GPR107的siRNA，1003si的內源性表達的減少(圖6A)。該siRNA對于PCDH1mRNA的knockdown作用在集落形成測定(圖6B)和MTT測定(圖6C)中導致了急劇的生長抑制。這些發現強烈地暗示了GPR107在PDACa細胞中的過表達與癌細胞生存力相關。總之，本發明人鑒定了三種在PDACa細胞中過量表達的膜型分子，而且這三個分子都可能與癌細胞生長相關，這說明這些膜型分子是治療致死性的胰腺癌的理想的分子靶物。工業適用性本發明人已顯示了特異性靶向PCDH1，CDH3或GPR107基因的小干擾RNA(siRNA)抑制細胞生長。因此，這種新的siRNA是用于開發抗癌藥物的有用的靶物。例如，阻礙PCDH1，CDH3或GPR107表達或者防止它們活性的試劑可以用作抗癌劑，特別是用于治療胰腺癌，例如胰管腺癌(PDACa)的抗癌劑。盡管已經結合本發明具體實施方案對本發明進行了詳細描述，但對于本領域技術人員顯而易見的是，在不脫離本發明實質和范圍的前提下可以對本發明進行各種變動和修改。序列表<110>腫瘤療法科學股份有限公司(OncotherapyScience，Inc.)<120>治療胰腺癌的組合物和方法<130>ONC-A0406P<150>US60/555,809<151>2004-03-24<160>35<170>PatentInversion3.1<210>1<211>3851<212>DNA<213>人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(118)..(3300)<223><400>1cgcaaagccgccgggctgctgcgcccagagccagccggagccggagccggagcccgaact60gcagctccagccccagccgtgcggagccgcagcccaggccggggccggcggcggctc117atggacagcggggcgggcggccggcgctgcccggaggcggccctcctg165MetAspSerGlyAlaGlyGlyArgArgCysProGluAlaAlaLeuLeu151015attctggggcctcccaggatggagcacctgaggcacagcccaggccct213IlcLeuGlyProProArgMetGluHisLeuArgHisSerProGlyPro202530ggggggcaacggctactgctgccctccatgctgctagcactgctgctc261GlyGlyGlnArgLeuLeuLeuProSerMetLeuLeuAlaLeuLeuLeu354045ctgctggctccatccccaggccacgccactcgggtagtgtacaaggtg309LeuLeuAlaProSerProGlyHisAlaThrArgValValTyrLysVal505560ccggaggaacagccacccaacaccctcattgggagcctcgcagccgac357ProGluGluGlnProProAsnThrLeuIleGlySerLeuAlaAlaAsp65707580tatggttttccagatgtggggcacctgtacaagctagaggtgggtgcc405TyrGlyPheProAspValGlyHisLeuTyrLysLeuGluValGlyAla859095ccgtaccttcgcgtggatggcaagacaggtgacattttcaccaccgag453ProTyrLeuArgValAspGlyLysThrGlyAspIlePheThrThrGlu100105110acctccatcgaccgtgaggggctccgtgaatgccagaaccagctccct501ThrSerIleAspArgGluGlyLeuArgGluCysGlnAsnGlnLeuPro115120125ggtgatccctgcatcctggagtttgaggtatctatcacagacctcgtg549GlyAspProCysIleLeuGluPheGluValSerIleThrAspLeuVal130135140cagaatggcagcccccggctgctagagggccagatagaagtacaagac597GlnAsnGlySerProArgLeuLeuGluGlyGlnIleGluValGlnAsp145150155160atcaatgacaacacacccaacttcgcctcaccagtcatcactctggcc645IleAsnAspAsnThrProAsnPheAlaSerProValIleThrLeuAla165170175atccctgagaacaccaacatcggctcactcttccccatcccgctggct693IleProGluAsnThrAsnIleGlySerLeuPheProIleProLeuAla180185190tcagaccgtgatgctggtcccaacggtgtggcatcctatgagctgcag741SerAspArgAspAlaGlyProAsnGlyValAlaSerTyrGluLeuGln195200205gctgggcctgaggcccaggagctatttgggctgcaggtggcagaggac789AlaGlyProGluAlaGlnGluLeuPheGlyLeuGlnValAlaGluAsp210215220caggaggagaagcaaccacagctcattgtgatgggcaacctggaccgt837GlnGluGluLysGlnProGlnLeuIleValMetGlyAsnLeuAspArg225230235240gagcgctgggactcctatgacctcaccatcaaggtgcaggatggcggc885GluArgTrpAspSerTyrAspLeuThrIleLysValGlnAspGlyGly245250255agccccccacgcgccagcagtgccctgctgcgtgtcaccgtgcttgac933SerProProArgAlaSerSerAlaLeuLeuArgValThrValLeuAsp260265270accaatgacaacgcccccaagtttgagcggccctcctatgaggccgaa981ThrAsnAspAsnAlaProLysPheGluArgProSerTyrGluAlaGlu275280285ctatctgagaatagccccataggccactcggtcatccaggtgaaggcc1029LeuSerGluAsnSerProIleGlyHisSerValIleGlnValLysAla290295300aatgactcagaccaaggtgccaatgcagaaatcgaatacacattccac1077AsnAspSerAspGlnGlyAlaAsnAlaGluIleGluTyrThrPheHis305310315320caggcgcccgaagttgtgaggcgtcttcttcgactggacaggaacact1125GlnAlaProGluValValArgArgLeuLeuArgLeuAspArgAsnThr325330335ggacttatcactgttcagggcccggtggaccgtgaggacctaagcacc1173GlyLeuIleThrValGlnGlyProValAspArgGluAspLeuSerThr340345350ctgcgcttctcagtgcttgctaaggaccgaggcaccaaccccaagagt1221LeuArgPheSerValLeuAlaLysAspArgGlyThrAsnProLysSer355360365gcccgtgcccaggtggttgtgaccgtgaaggacatgaatgacaatgcc1269AlaArgAlaGlnValValValThrValLysAspMetAsnAspAsnAla370375380cccaccattgagatccggggcatagggctagtgactcatcaagatggg1317ProThrIleGluIleArgGlyIleGlyLeuValThrHisGlnAspGly385390395400atggctaacatctcagaggatgtggcagaggagacagctgtggccctg1365MetAlaAsnIleSerGluAspValAlaGluGluThrAlaValAlaLeu405410415gtgcaggtgtctgaccgagatgagggagagaatgcagctgtcacctgt1413ValGlnValSerAspArgAspGluGlyGluAsnAlaAlaValThrCys420425430gtggtggcaggtgatgtgcccttccagctgcgccaggccagtgagaca1461ValValAlaGlyAspValProPheGlnLeuArgGlnAlaSerGluThr435440445ggcagtgacagcaagaagaagtatttcctgcagactaccaccccgcta1509GlySerAspSerLysLysLysTyrPheLeuGlnThrThrThrProLeu450455460gactacgagaaggtcaaagactacaccattgagattgtggctgtggac1557AspTyrGluLysValLysAspTyrThrIleGluIleValAlaValAsp465470475480tctggcaaccccccactctccagcactaactccctcaaggtgcaggtg1605SerGlyAsnProProLeuSerSerThrAsnSerLeuLysValGlnVal485490495gtggacgtcaatgacaacgcacctgtcttcactcagagtgtcactgag1653ValAspValAsnAspAsnAlaProValPheThrGlnSerValThrGlu500505510gtcgccttcccggaaaacaacaagcctggtgaagtgattgctgagatc1701ValAlaPheProGluAsnAsnLysProGlyGluValIleAlaGluIle515520525actgccagtgatgctgactctggctctaatgctgagctggtttactct1749ThrAlaSerAspAlaAspSerGlySerAsnAlaGluLeuValTyrSer530535540ctggagcctgagccggctgctaagggcctcttcaccatctcacccgag1797LeuGl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