用于癌癥免疫療法的基于mage－3和ny－eso－1的多價疫苗的制作方法

專利名稱：用于癌癥免疫療法的基于mage－3和ny－eso－1的多價疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及新型疫苗制劑，其含有(a)抗原成分，其含有修飾的MAGE-3抗原和NY-ESO-1抗原的組合，或其衍生物，和(b)佐劑。
盡管投入了大量的財力和人力資源，但癌癥仍然是主要的死亡原因之一。
在本領域，描述癌癥免疫療法已經很多年了，包括那些給患者主動接種腫瘤相關抗原的療法，其旨在提高這些個體中的免疫反應，該免疫反應識別和消滅癌細胞。針對該目的已描述了許多癌癥抗原，包括MAGE家族抗原和NY-ESO-1抗原。
盡管這些療法已經研究了很長時間，但實際上仍然需要改進策略以增強對抗原的免疫反應。這類策略包括將腫瘤抗原與有效的疫苗佐劑組合。
睪丸癌(CT)抗原是在多種癌癥中優勢表達的免疫原性蛋白，但其在除了配子形成組織(睪丸)之外的正常組織中并不表達(Kirkin，A等人，Cancer Investigation，2002，20(2)，222-236)。MAGE-3和NY-ESO-1被稱為是原型CT抗原。CT抗原的家族也包括NY-ESO-1的成員、PRAME、GAGE家族、PAGE家族、BAGE、XAGE家族、LAGE、SSX家族的成員(其中SSX-1、-2也稱為HOM-MEL-40、-4、-5)、SCP-1(也稱為HOM-TES-14)、SART-1和SART-3、HOM-TES-85、精子蛋白Sp17、CTp11、TSP50、CT9/BRDT、TRAG-3(紫杉醇抗性相關基因-3)、OY-MS-4MAGE(參見Kirkin A.等人，CancerInvestigation，2002，20(2)，222-236中的表1)。
發明概述本發明涉及新型疫苗制劑，其含有(a)抗原成分，其含有修飾的MAGE-3抗原和NY-ESO-1抗原的組合，或其衍生物，和(b)免疫刺激佐劑，其含有以下成分的一種或多種明礬鹽、膽固醇、水包油(oil-in-water)乳劑(O/W乳劑)、水包油乳劑低劑量型(low dose)、免疫刺激寡核苷酸、生育酚、脂質體、皂苷和脂多糖。
也提供了通過施用本發明的疫苗治療個體的方法，并且在具體的實施方案中，該疫苗用于治療黑素瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)或膀胱癌。
本發明的一個方面提供了疫苗組合物，其含有(a)抗原成分，其含有SEQ ID NO1(如本文及WO 99/40188中所述)的MAGE3與截短的蛋白D載體蛋白的融合蛋白(MAGE3-蛋白D 1/3)，NY-ESO-1蛋白抗原，和(b)佐劑組合物，其含有包含膽固醇和QS21的脂質體結構，所述結構結合了包含至少一個未甲基化的寡核苷酸的免疫刺激寡核苷酸。
與僅包含一種由腫瘤細胞表達的抗原的疫苗相比，本發明的疫苗可以增強癌癥疫苗的抗腫瘤作用。該增強的疫苗不但必然具有更大的患者覆蓋范圍(即，使得可用一種疫苗靶定更多的癌癥)，而且使針對靶定的腫瘤發生的免疫反應更好。另外，本發明的疫苗可減少腫瘤逃避(evasion)或逃脫(escape)的機會，即使在接種后其中一種抗原的表達減弱了。
發明詳述本發明涉及以下成分的具體組合(i)修飾的MAGE蛋白(MAGE3-蛋白D1/3)，如SEQ ID NO1中所示(ii)NY-ESO1基因產物的“免疫原性區域”，例如NY-ESO1蛋白；由包含NY-ESO1的I類(Class I)和/或II類(Class II)表位的蛋白C-末端部分組成或包含所述部分的蛋白、多肽或肽；含有該區域的重疊長肽；和/或特異的CD8肽。
(iii)免疫刺激佐劑，其含有以下成分的一種或多種明礬鹽、膽固醇、水包油乳劑(O/W乳劑)、水包油乳劑低劑量型、免疫刺激寡核苷酸(如CpG)、生育酚、脂質體、皂苷(如QS21)和脂多糖(如MPL)。適于本發明用途的佐劑實例包括含有或由以下成分組成的那些a.CpG；O/W乳劑/3D-MPL/QS21(高劑量)；b.CpG/O/W乳劑低劑量型/3D-MPL/QS21；c.CpG/脂質體/QS21；和
d.CpG/3D-MPL/QS21/脂質體；e.包含QS21的ISCOMS；f.含有QS21和QS7的ISCOMS在一個實施方案中，佐劑為CpG/MPL/QS21/脂質體。
成分(i)和(ii)可與成分(iii)共同配制以便伴隨施用，或每一種單獨與成分(iii)一起配制以便伴隨施用或順序施用。
在本發明的一個實施方案中，成分(i)與含有CpG/MPL/QS21/脂質體的佐劑成分(iii)一起配制，且成分(ii)與含有ISCOMS(如包含QS21的ISCOMS或含有QS21和QS7的ISCOMS)的佐劑成分(iii)一起配制。因此，成分(i)和(ii)提供用于伴隨施用或順序施用。
成分(i)和(ii)可表達為單獨的成分，或表達為融合蛋白。還可以考慮DNA/病毒載體的疫苗，其中疫苗含有編碼成分(i)和(ii)的核酸，而成分(iii)為DNA疫苗的合適佐劑。
疫苗組合物包括MAGE-3衍生抗原。在本發明的一個實施方案中，衍生物是包含了連接到異源配偶體上的MAGE-3抗原的融合蛋白。蛋白可被化學綴合，或表達為重組的融合蛋白，從而相比于非融合蛋白允許在表達系統中產生增加的水平。因此融合配偶體有助于提供T輔助表位(免疫融合配偶體)，例如由人識別的T輔助表位，或有助于表達比天然重組蛋白更高產量的蛋白(表達增強子)。在一個實施方案中，融合配偶體既是免疫融合配偶體又是表達增強配偶體。
在本發明的一種形式中，MAGE-3免疫融合配偶體源自蛋白D，蛋白D為革蘭氏陰性桿菌B型流感嗜血菌(Haemophilus influenza)(WO 91/18926)的表面蛋白。在一個實施方案中，蛋白D衍生物含有大約前1/3的蛋白，具體而言為大約N-末端前100-110個氨基酸。在一個實施方案中，蛋白D衍生物是脂質化的(lipidated)。在一個實施方案中，脂蛋白D融合配偶體的前109個殘基包括在N-末端上，以提供具有附加的外源T細胞表位的疫苗候選抗原，并增強在大腸桿菌(E.coli)中的表達水平(因此也可作為表達增強子)。脂質尾巴確保了抗原向抗原呈遞細胞的最佳呈遞。
其他的MAGE-3融合配偶體包括流感病毒的非結構蛋白NS1(血凝素)。一般可利用N末端81個氨基酸，然而可利用不同的片段，前提是它們包括T-輔助表位。
在另一個實施方案中，MAGE-3免疫融合配偶體為稱做LYTA的蛋白。在一個實施方案中，利用了分子的C末端部分。Lyta源自肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，后者合成N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶，即酰胺酶LYTA，(其由lytA基因編碼{Gene，43(1986)第265-272頁}，是一種能特異地降解肽聚糖主鏈上某些鍵的自溶素。LYTA蛋白的C-末端結構域負責對膽堿或一些膽堿類似物如DEAE的親和力。已經利用該特性來開發用于表達融合蛋白的大腸桿菌C-LYTA表達質粒。已經描述了在其氨基酸末端包含C-LYTA片段的雜交蛋白的純化{Biotechnology10，(1992)第795-798頁}。如本文所用，本發明的一個實施方案利用了Lyta分子從殘基178開始在C末端的重復部分。一種可利用的形式并入了殘基188-305。
在本發明的一個實施方案中，修飾后的MAGE-3組合物包括WO99/40188中所公開的抗原，或免疫原性片段，如保留了引發識別MAGE蛋白的免疫反應能力的肽。本疫苗的一個特異抗原是MAGE-3多肽，其具有在Gaugler B.等人，J.Exp.Med.，1994，179，921(MAGE-3)中或SEQ ID NO1(蛋白D1/3-MAGE-3)(本文和WO99/40188中都有)中所列的氨基酸序列。所述免疫原性組合物可依照WO99/40188中公開的方法制備，或用本領域技術人員已知的任何常規技術制備。
NY-ESO-1是WO98/14464中所述的腫瘤相關抗原，WO98/14464的內容被全文引用到此公開內容中。在Chen YT等人，Proc Natl AcadSci USA 1997，941914-18；Scanlan等人，2004，Cancer Immunity，4，1.中也描述了NY-ESO-1。NY-ESO-1的蛋白和多核苷酸的序列由Genbank ACCESSION No.U87459，Version U87459.1(SEQ ID Nos 2和3)提供。
構成本發明一部分的疫苗佐劑包括含有以下成分的一種或多種的免疫刺激佐劑明礬鹽、膽固醇、水包油乳劑(O/W乳劑)、水包油乳劑低劑量型、免疫刺激寡核苷酸、生育酚、脂質體、皂苷和脂多糖。在一個實施方案中，佐劑包含免疫刺激寡核苷酸、皂苷和任選脂多糖(LPS)的衍生物。任選地，本發明的疫苗還包含載體。
免疫刺激寡核苷酸包含未甲基化的CpG二核苷酸(“CpG”)，并且在本領域被認為在經全身途徑和粘膜途徑施用時作為佐劑(WO96/02555，EP468520，Davis等人，J.Immunol.，1998，160(2)870-876；McCluskie和Davis，J.Immunol.，1998，161(9)4463-6)。CpG是存在于DNA中的胞嘧啶-鳥苷二核苷酸基元的縮寫。在歷史觀察到BCG的DNA級分能發揮抗腫瘤作用。在進一步的研究中，源于BCG基因序列的合成寡核苷酸表現出能誘導免疫刺激作用(體外和體內均可)。這些研究的作者得出結論某些回文序列，包括中央CG基元，具有該活性。CG基元在免疫刺激中的中心作用在后面闡述于Krieg發表的文章Nature 374，P546，1995中。詳細的分析已表明CG基元必須是在一特定序列背景中，并且這種序列是細菌DNA中常見的，但在脊椎動物DNA中罕見。該免疫刺激序列經常是嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中該二核苷酸CG基元是未甲基化的，但其他未甲基化的CpG序列已知是免疫刺激的并且可用于本發明中。在這六種核苷酸的某些組合中，存在一個回文序列。幾個這些基元，或者是作為一個基元的重復，或者是不同基元的組合，可存在于相同寡核苷酸中。一個或多個這些含有寡核苷酸的免疫刺激序列的存在可激活各種免疫亞群，包括天然殺傷細胞(其產生干擾素γ并具有細胞溶解活性)和巨噬細胞(Wooldrige等人，Vol 89(no.8)，1977)。當制成疫苗時，CpG一般與游離抗原一起在游離溶液中施用(WO96/02555；McCluskie和Davis，見上文)，或與抗原共價綴合(PCT公開No.WO98/16247)，或與載體如氫氧化鋁一起配制((肝炎表面抗原)Davis等人，見上文；Brazolot-Millan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1998，95(26)，15553-8)。
在本發明的一方面，用于本發明疫苗的寡核苷酸包含至少一個由至少三個或至少六個或更多核苷酸隔開的未甲基化的CpG基元。本發明的寡核苷酸一般為脫氧核苷酸。在一個實施方案中，寡核苷酸內核苷酸間為二硫代磷酸酯。在另一個實施方案中，核苷酸間為硫代磷酸酯鍵。可是，磷酸二酯和其他核苷酸間鍵在本發明的范圍內，包括含有混合核苷酸間鍵合的寡核苷酸。在US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204中描述了生產硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法。
可用的寡核苷酸實例具有以下序列。該序列可包含硫代磷酸酯修飾的核苷酸間鍵合。
OLIGO 1(SEQ ID NO4)TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)OLIGO 2(SEQ ID NO5)TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)OLIGO 3(SEQ ID NO6)ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACGOLIGO 4(SEQ ID NO7)TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)OLIGO 5(SEQ ID NO8)TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)備選的CpG寡核苷酸可包含上述序列，因為它們存在序列上無關緊要的缺失或添加。
本發明所用的CpG寡核苷酸可通過任何本領域公知的方法合成(如EP468520)。為方便起見，該寡核苷酸可使用自動合成儀合成。其長度通常為10到50個堿基。
本發明所用的寡核苷酸一般為脫氧核苷酸。在一個實施方案中，寡核苷酸內的核苷酸間鍵是二硫代磷酸酯，或更多的是例如硫代磷酸酯鍵，而磷酸二酯在本發明的范圍內。預期含有不同核苷酸間鍵合的寡核苷酸，如混合的硫代磷酸酯磷酸二酯。能穩定寡核苷酸的其他核苷酸間鍵也可利用。
可用于本發明疫苗組合的皂苷包括源自皂皮樹(QuillajaSaponaria Molina)的樹皮的那些皂苷(稱為Quil A)，和其級分，它們在US5,057,540和“Saponins as vaccine adjuvant”，Kensil，C.R.，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，1996，12(1-2)1-55；和EP0362279B1中闡述。合適的Quil A級分的實例為QS21、QS7和QS17。溶血皂苷QS21和QS17(Quil A的HPLC純化級分)被稱為強效的全身性佐劑，且它們的生產方法在U.S.Pat.No.5,057,540和EP0362279B1中公開。在這些參考文獻中也闡述了QS7(Quil A的非溶血性級分)的用途，QS7作為全身性疫苗的強效佐劑。QS21的用途在Kensil等人，(1991，J.Immunology vol 146，431-437)中進一步加以闡述。QS21和聚山梨醇酯或環糊精的組合也是為人熟知的(WO99/10008)。
包含Quil A級分的被稱為免疫刺激復合物(ISCOMS)的顆粒結構是溶血性的，并且已被用于疫苗生產(Morein，B.，EP0109942B1)。已經報道這些結構具有佐劑活性(EP0109942B1；WO96/11711)。QS21和聚山梨醇酯或環糊精的組合也是為人熟知的(WO99/10008)。在WO96/33739和WO96/11711中闡述了含有Quil A級分如QS21和QS7的顆粒佐劑系統。
在本發明的一個實施方案中，佐劑成分包括包含QS21的ISCOM。在另一個實施方案中，佐劑成分包括含有QS21和QS7的ISCOMS。
本發明的佐劑組合還可包括載體，所述載體可與佐劑簡單地混合在一起，或者佐劑與顆粒載體實體結合以增強組合的佐劑活性。例如，全身性疫苗可含有載體分子。示例性的載體包括無機鹽(例如，但不限于鋁鹽或鈣鹽)、脂質體、ISCOMs、乳劑(水包油、油包水、水包油包水)、聚合物(例如，但不限于聚乳酸、聚乙醇酸、聚磷腈(polyphosphazine)、聚氨基酸、藻酸鹽、脫乙酰殼多糖)或微粒。本發明的疫苗還包含抗原，所述抗原可與CpG-載體復合物結合，或不與CpG-載體復合物結合。在這種情況下，抗原可以是游離懸浮液或與單獨的載體結合。
構成本發明部分的皂苷可以以微團的形式分離，或者是大的有序結構如ISCOMs(EP0109942B1)或當用膽固醇和脂質制備時脂質體的形式(“DQ”，闡述于WO96/33739)，或者是水包油乳劑(WO95/17210)的形式。皂苷可以與金屬鹽結合，如氫氧化鋁或磷酸鋁(WO98/15287)。可選擇地是，皂苷可與顆粒載體如脫乙酰殼多糖結合。皂苷也可以是干燥狀態的，如粉末。處于施用于疫苗接種者粘膜表面的形式的最終制劑實際上是溶血性的。皂苷可以通過直接連接或和相同顆粒載體分子互作與或不與抗原物理結合(GB9822712.7；WO98/16247)。
可用于本發明的佐劑或疫苗中的CpG和皂苷本身是分開的或結合的。例如，CpG和皂苷可以是游離懸浮液，或經載體(例如，顆粒載體如氫氧化鋁)或通過陽離子脂質體或ISCOM結合在一起。
根據本發明的佐劑組合的一個實例是由在兩個鄰近的CG基元之間包含至少3個或至少6個核苷酸的一個或多個CpG寡核苷酸以及QS21和選自水包油乳劑或DQ的顆粒載體組成的。脂多糖可能是二或一磷酰脂質衍生物。脂多糖可能是3脫O-酰基(de-O-acylated)的，具體來說為3脫O-酰基一磷酰脂質A。在一個實施方案中，佐劑組合包含與QS21和選自水包油乳劑或DQ的顆粒載體混合的CpG2006(SEQ ID NO4)或CpG1758(SEQ ID NO2)或CPG1826(SEQID NO1)。因此，本發明的疫苗可以，例如，包含這樣的佐劑組合和抗原。本發明的疫苗在以全身途徑方式施用于個體后可用于產生全身性免疫反應。
在WO00/62800中闡述了可構成本發明疫苗部分的示例性佐劑組合物。
本發明的佐劑組合可包括基于油的乳劑。油性乳劑佐劑已被認識很多年了，包括關于弗氏完全和不完全礦物油性乳劑佐劑方面的工作。從那時起就進行許多工作來設計這些強效但反應原性的佐劑制劑的穩定和良好耐受性的替代品。
已經闡述了許多單一的或多相的乳劑系統。提示水包油乳劑佐劑本身可用作佐劑組合物(EP0399843B)，而且水包油乳劑與其他活性試劑的組合也被描述為疫苗佐劑(WO95/171210；WO98/56414；WO99/12565；WO99/11241)。還闡述了其他油性乳劑佐劑，諸如油包水乳劑(US5,422,109；EP0480982B2)和水包油包水乳劑(US5,424,067；EP0480981B)。
用于本發明的油性乳劑佐劑可以是天然的或合成的，且可以是無機的或有機的。無機油和有機油的實例對本領域的技術人員來說是顯而易見的。
為了使任一種水包油組合物都適于人類施用，乳劑系統的油相可含有可代謝油。術語可代謝油的意思在本領域是公知的。可代謝的被定義為“能被代謝作用轉化的”(Dorland’s Illustrated MedicalDictionary，W.B.Sanders Company，25thedition(1974))。該油可以是任何植物油、魚油、動物油或合成油，這些油對受體是無毒的并且能被代謝作用轉化。堅果(如花生油)、種子和谷物是植物油的常用來源。合成油也是本發明的一部分，并且可包括商品油如NEOBEE等。角鯊烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯)是被發現在鯊魚肝油中大量存在而在橄欖油、麥胚油、米糠油和酵母中量較少的不飽和油，并且是適用于本發明的一種油。角鯊烯是可代謝油，這依據了角鯊烯是膽固醇生物合成過程中的中間體的事實(Merck index，10thEdition，entry no.8619)。
用于本發明的油性乳劑的實例是水包油乳劑，且具體而言是水包角鯊烯乳劑。
另外，本發明的油性乳劑佐劑含有抗氧化劑，其可能是油性α-生育酚(維生素E，EP0382271B1)。
WO95/17210和WO99/11241公開了基于角鯊烯、α-生育酚和TWEEN 80的乳劑佐劑，其任選地與免疫刺激劑QS21和/或3D-MPL一起配制。WO99/12565公開了通過將固醇加入到油相中而改進這些角鯊烯乳劑。另外，可將甘油三酯如甘油三辛酸酯(C27H50O6)加入互油相以穩定乳劑(WO98/56414)。
在穩定的水包油乳劑中發現的油滴大小可小于1微米，可在基本上30-600納米范圍內，例如直徑基本上約30-500納米，和例如直徑基本上150-500納米，和具體地直徑為約150納米，如按光子相關光譜學所測量的。在這點上，數目上80％的油滴應該在這些示例的范圍內，或例如數目上90％以上或95％以上的油滴應該在限定的尺寸范圍內。按照常規，本發明的油性乳劑中存在的成分的量為2-10％的油如角鯊烯，且如果有α生育酚，則為2-10％，以及0.3-3％的表面活性劑如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。油α生育酚的比率可等于或小于1，因為這樣提供了更穩定的乳劑。Span 85也可以以約1％的水平存在。在某些情況下，本發明的疫苗還包含有穩定劑可能是有利的。
生產水包油乳劑的方法是本領域技術人員熟知的。一般來說，該方法包括將油相與表面活性劑如PSB/TWEEN 80TM溶液混合，然后用勻漿器進行勻漿，本領域技術人員很清楚，包括將混合物兩次通過注射器針頭的方法將會適于將小體積液體勻漿。同樣地，本領域技術人員可修改在微流化床裝置(microfluidiser)(M110S微流體機器，最多為50個通道，在6巴的最大壓力輸入下2分鐘的時間段(輸出壓力為約850巴))中的乳化方法以產生更小體積或更大體積的乳劑。這種修改可通過常規實驗完成，所述實驗包括測量所得乳劑，直到得到具有所需直徑的油滴的制劑。
本發明的疫苗可通過全身或腸胃外途徑施用，如肌內、皮內、經皮、皮下、腹膜內或靜脈內施用。
本發明的全身性疫苗制劑以經肌內、腹膜內、皮內、經皮、靜脈內或皮下施用所述疫苗的方式可用以保護或治療易患或患有癌癥的哺乳動物。本發明的疫苗可用來治療患有非小細胞肺癌(NSCLC)、黑素瘤或膀胱癌的個體。
因此，提供了一種用于在個體中誘導針對MAGE-3和NY-ESO-1的免疫反應的方法，包括給個體施用依據本發明的疫苗。
用于本發明佐劑的皂苷的量可以為每劑1-1000微克，例如每劑1-500微克，或例如每劑1-250微克，或例如每劑1-100微克。所以，CpG∶皂苷的比率(w/w)在1∶1000至1000∶1的范圍內，且一般在1∶100至100∶1的范圍內，或例如在1∶10至1∶1或1∶1至10∶1的范圍內。在一個實施方案中，比率為1∶1、4∶1或10∶1。
本發明佐劑或疫苗中的CpG或免疫刺激寡核苷酸的量一般很小，但取決于疫苗制劑，可為每劑1-1000微克，例如每劑1-500微克，或例如每劑1-100微克。
在New Trends and Developments in Vaccines，Voller等人編，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978中全面地闡述了疫苗制劑。
因此，本發明提供了預防個體感染選自NSCLC、黑素瘤和膀胱癌的疾病的方法，該方法包括通過所述個體的全身途徑施用基本上按本文所述的組合物。
用于本發明組合的合適的藥學可接受的賦形劑的實例包括水、磷酸緩沖鹽水、等滲緩沖溶液。
任選地，疫苗佐劑成分還可包括LPS衍生物，如3D-MPL。此類佐劑實例包括CpG、3D-MPL和QS21的組合(EP0671948B1)，含有CpG、3D-MPL和QS21的水包油乳劑(WO95/17210，WO98/56414)，或與如本文所述的CpG寡核苷酸組合的與其他載體一起配制的3D-MPL(EP0689454B1)。
本發明的佐劑組合可包括至少一個腸桿菌脂多糖來源的佐劑。
早就知道腸桿菌脂多糖(LPS)是免疫系統的強效刺激物，然而它在佐劑中的用途已經被其毒性作用所限制。通過去除還原末端的葡糖胺上的核心糖基和磷酸鹽得到的LPS的非毒性衍生物----一磷酰脂質A(MPL)已由Ribi等人闡述(1986，Immunology andImmunopharmacology of bacterial endotoxins，Plenum Publ.Corp.，NY，p407-419)，并具有如下結構
其他的解毒的MPL由去除二糖主鏈3位上的酰基鏈生成，并稱為3-O-脫酰基一磷酰脂質A(3D-MPL)。通過GB 2122204B中所教導的方法能純化和制備3D-MPL，該參考文獻也公開了二磷酰脂質A及其3-O-脫酰基變體的制備。3D-MPL的一種形式的實例是具有直徑小于0.2μm的小顆粒大小的乳劑形式，其生產方法在WO94/21292中公開。含有一磷酰脂質A和表面活性劑的水性制劑在WO98/43670A2中闡述。
可在本發明的佐劑組合中配制的細菌脂多糖來源的佐劑可從細菌來源純化和加工，或另一種選擇是對其進行合成。例如，純化的一磷酰脂質A在Ribi等人1986中(見上文)闡述，而來源于沙氏門菌屬物種(Salmonella sp.)的3-O-脫酰基一磷酰或二磷酰脂質A在GB2220211和US4912094中闡述。其他純化和合成的脂多糖已都得以闡述(WO98/01139；US6,005,099和EP0729473B1；Hilgers等人，1986，Int.Arch.Allergy.Immunol.，79(4)392-6；Hilgers等人，1987，Immunology，60(1)141-6；和EP0549074B1)。細菌脂多糖佐劑可能是US6,005,099和EP0729473B1中所闡述的3D-MPL和β(1-6)葡糖胺二糖。
因此，可用于本發明的LPS衍生物是結構上與LPS或MPL或3D-MPL類似的那些免疫刺激劑。在本發明的另一方面，LPS衍生物可為酰基化單糖，其是上述MPL結構的亞部分。
二糖佐劑的一個實例為如下式的純化的或合成的脂質A 其中R2可以是H或PO3H2；R3可以是酰基鏈或β-羥基肉豆蔻酰基(β-hydroxymyristoyl)或具有如下式的3-酰氧基酰基(3-acyloxyacyl)殘基 其中 并且其中X和Y的值為0至最大約20一種示例性的疫苗制劑含有0.5ml佐劑組合物，該佐劑組合物包括水包油乳劑，其包含，油相中約12mgα-生育酚、約11mg角鯊烯和約5mg tween 80；且在水相中50μg 3D-MPL和50μg QS21和500μgCpG。另一個示例性的疫苗制劑含有水包油乳劑，其包含，油相中約2mgα-生育酚、約2mg角鯊烯和約1mg tween 80；且在水相中50μg 3D-MPL和50μg QS21。
在另一個實施方案中提供了一種疫苗組合物，其含有修飾的MAGE蛋白，如WO9940188中所述；NY-ESO1基因產物的“免疫原性區域”，如NY-ESO1蛋白；由包含NY-ESO1的I類和/或II類表位的蛋白C末端部分組成或包含所述部分的蛋白、多肽或肽；含有該區域的重疊長肽；和/或特異的CD8肽；含有明礬鹽、水包油乳劑(O/W乳劑)的一種或多種的免疫刺激佐劑。
序列表SEQID NO 1MAGE3/蛋白D 1/3多肽序列Met Asp Pro Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu1 5 10 15Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys20 25 30Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro35 40 45Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala phe Ala Gln Gln Ala Asp50 55 60Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val65 70 75 80Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe85 90 95Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr100 105 110Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met115 120 125Asp Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu Glu130 135 140Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala Thr145 150 155 160Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val Thr165 170 175Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser Pro180 185 190Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp Ser195 200 205Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr210 215 220Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys Val225 230 235 240Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro245 250 255Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln Tyr260 265 270Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu Val275 280 285Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr Ile290 295 300Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn305 310 315 320Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile Ile325 330 335Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu Leu340 345 350Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly Asp355 360 365Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu370 375 380Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu Trp385 390 395 400Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His His405 410 415Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu His420 425 430Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu Thr Ser Gly Gly His His His435 440 445His His His450
SEQID NO 2，NY-ESo-1多肽序列MQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAARASGPGGGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR″SEQ ID NO 3NY-ESO-1多核苷酸序列1 atcctcgtgg gccctgacct tctctctgag agccgggcag aggctccgga gccatgcagg61 ccgaaggccg gggcacaggg ggttcgacgg gcgatgctga tggcccagga ggccctggca121 ttcctgatgg cccagggggc aatgctggcg gcccaggaga ggcgggtgcc acgggcggca181 gaggtccccg gggcgcaggg gcagcaaggg cctcggggcc gggaggaggc gccccgcggg241 gtccgcatgg cggcgcggct tcagggctga atggatgctg cagatgcggg gccagggggc301 cggagagccg cctgcttgag ttctacctcg ccatgccttt cgcgacaccc atggaagcag361 agctggcccg caggagcctg gcccaggatg ccccaccgct tcccgtgcca ggggtgcttc421 tgaaggagtt cactgtgtcc ggcaacatac tgactatccg actgactgct gcagaccacc481 gccaactgca gctctccatc agctcctgtc tccagcagct ttccctgttg atgtggatca541 cgcagtgctt tctgcccgtg tttttggctc agcctccctc agggcagagg cgctaagccc601 agcctggcgc cccttcctag gtcatgcctc ctcccctagg gaatggtccc agcacgagtg661 gccagttcat tgtgggggcc tgattgtttg tcgctggagg aggacggctt acatgtttgt721 ttctgtagaa aataaaactg agctacgaaa aa
權利要求
1.一種疫苗組合物，其包括(a)抗原成分，其含有修飾的MAGE-3抗原和NY-ESO-1抗原的組合，或其衍生物，和(b)佐劑成分，其包括含有以下成分中的一種或多種的免疫刺激佐劑明礬鹽、膽固醇、水包油乳劑(O/W乳劑)、水包油乳劑低劑量型、免疫刺激寡核苷酸、生育酚、脂質體、皂苷、ISCOMS和脂多糖。
2.一種如權利要求1所請求保護的疫苗，其中所述佐劑成分包括免疫刺激寡核苷酸和皂苷的組合。
3.一種如權利要求1或2所請求保護的疫苗，其中所述修飾的MAGE-3抗原具有如SEQ ID NO 1中所述的多肽序列。
4.一種如前述任一項權利要求所請求保護的疫苗，其中所述NY-ESO-1抗原具有如SEQ ID NO 2中所述的多肽序列。
5.一種如前述任一項權利要求所請求保護的疫苗，其中所述皂苷是在包含膽固醇的脂質體中制備的QS21。
6.一種如前述任一項權利要求所請求保護的疫苗，其中所述免疫刺激寡核苷酸為CpG。
7.一種如前述任一項權利要求所請求保護的疫苗組合物，其還含有3-脫O-酰基一磷酰脂質A。
全文摘要
本發明提供了用于治療癌癥抗原的新型疫苗制劑。該疫苗含有修飾的MAGE－3抗原、NY－ESO－1抗原和佐劑，該佐劑包含皂苷和免疫刺激寡核苷酸。
文檔編號A61K39/39GK1980691SQ200580013797
公開日2007年6月13日 申請日期2005年5月2日 優先權日2004年5月4日
發明者C·E·M·布魯克, V·布里查德, R·M·帕爾曼捷, M·米德爾斯 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司