肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑的制作方法

專利名稱：肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及肽基精氨酸脫亞胺酶4(peptidyl arginine deiminase 4)抑制劑。
背景技術：
肽基精氨酸脫亞胺酶(PAD)是一種廣泛分布于動物組織內的蛋白質修飾酶，對依托鈣離子(即在鈣離子存在下)將蛋白質中的精氨酸殘基脫亞氨基化，變換為瓜氨酸殘基的反應進行催化。由于蛋白質的脫亞氨基化改變了蛋白質分子內正電荷分布，因而立體結構改變，對蛋白質生理功能產生很大的影響。
PAD最早被確認存在于嚙齒類動物中，發現在其組織中存在3種類的PAD(非專利文獻1，2，3，4)。然后中島等人用視黃酸、DMSO或1，25-二羥基維生素D3處理人類骨髓性白血病HL-60細胞，在分化為粒細胞的細胞中檢測到PAD的活性，并克隆其cDNA進行分析(非專利文獻5)。結果發現，其cDNA由2238bp形成，對663氨基酸殘基進行編碼。以及和已知的人類的PAD的氨基酸序列約50～55％一致，將人類HL-60細胞的PAD命名為PAD4(起初命名為PAD V，后來改名為PAD4)。然后，在人類末消血粒細胞中也證實發現了PAD4(非專利文獻6)。
迄今為止，在人體中鑒別出PAD 1，2，3，4，6型的5種異構體(非專利文獻7，8，9，10，11，12，13，14，25，26)。PAD1與皮膚的分化有關(非專利文獻15，16，17)，PAD2與髓磷脂堿性蛋白質的脫亞氨基化有關(非專利文獻18，19)，PAD3與毛囊的角蛋白化有關(非專利文獻14，20，21)。若進行鈣離子預處理使細胞內的鈣濃度升高，則人體HL-60細胞和存在于人體末端梢血中的PAD4(舊名肽基精氨酸脫亞胺酶V，PAD V)使核仁磷蛋白(nuleophosmin)B/23和組蛋白H2A、H3、H4脫亞氨基化(非專利文獻22，23)。此外，由于PAD4具有稱作56PPAKKKST63的核轉移信號，因而它是4種異構體PAD中唯一分布在核內的。由此認為，PAD4是一種依托鈣離子作用于染色質，以控制核的機能的新型組蛋白修飾酶(非專利文獻23)。此外，比較人體PAD的異構體之間的氨基酸序列，由于C末端的3分之2的區域的同源性較高，C末端3分之2的區域的結構在PAD的異構體之間是共通的，因而認為該區域內具有活性部位。還有，有報道指出，最近PAD4基因的單核苷酸多態性(SNPs)使mRNA的分解減少，生成過量的瓜氨酸殘基，在風濕性關節炎患者的血液中發現針對該瓜氨酸化的蛋白質的自身抗體，顯示PAD4與風濕性關節炎具有很強的關聯性(非專利文獻24)。
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Suzuki，A.，Yamada，R.，Chang，X.，Tokuhiro，S.，Sawada，T.，Suzuki，M.，Nagasaki，M.，Nakayama-Hamada，M.，Kawaida，R.，Ono，M.，Ohtsuki，M.，Furukawa，H.，Yoshino，S.，Yukioka，M.，Tohma，S.，Matsubara，T.，Wakitani，S.，Teshima，R.，Nishioka，Y.，Sekine，A.，Iida，A.，Takahashi，A.，Tsunoda，T.，Nakamura，Y.and Yamamoto，K.(2003)Functional haplotypes of PADI4，encoding citrullinating enzyme peptidylarginine deiminase 4，are associatedwith rheumatoid arthritis.Nature Genetics，34，395-402[非專利文獻25]Wright，P.W.et al.(2003)ePAD，an oocyte and early embryo-abundantpeptidylarginine deiminase-like protein that localizes to egg cytoplasmicsheets.Dev Biol.256，74-89[非專利文獻26]Chavanas，S.et al.(2004)Comparative analysis of the mouse and humanpeptidylarginine deiminase gene clusters reveals highly conserved non-coding segments and a new human gene，PADI6.Gene 330，19-27發明內容本發明旨在設計抑制PAD4的酶活性的新型物質，并開發出針對風濕性關節炎的新藥。
本發明的發明者們通過X射線結晶結構分析法，對在鈣離子不存在的情況下的PAD4(以下有時也記作Ca2+-free PAD4。)的立體結構、在將作為活性殘基之一的Cys645置換為Ala而失活的變異體(C645A)中結合鈣離子的物質(以下有時也記作Ca2+-bound PAD4(C645A))以及將作為活性殘基之一的Cys645置換為Ala而失活的變異體(C645A)中結合鈣離子和基質(苯甲酰基-L-精氨酸酰胺(benzoyl-L-arginineamide)BA，苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(benzoyl-L-arginineethylester)BAEE，苯甲酰基-甘氨酰-L-精氨酸(benzol-glycyl-L-arginine)BGA，KQTARKSTGGH3肽1，KAPRKQLATKH3肽2和SGRGKGGKGLH4肽)的復合體(以下有時分別記作Ca2+-bound PAD4(C645A)-BA復合物，Ca2+-bound PAD4(C645A)-BAEE復合物，Ca2+-bound PAD4(C645A)-BGA復合物，Ca2+-bound PAD4(C645A)-H3肽1復合物，Ca2+-bound PAD4(C645A)-H3肽2復合物，Ca2+-bound PAD4(C645A)-H4肽復合物。)的立體結構進行分析，確定了其分解能分別為2.80埃、2.60埃、2.30埃、2.20埃、2.25埃、2.10埃、2.10埃和2.25埃(特愿2003-358459號和特愿2004-259125號)。經過結構分析的上述8個立體結構除了含有鈣離子結合部位的活性部位附近以外基本相同。PAD4具有近似靴型的細長形態，形成與晶格內的最接近分子在晶體學上成二重對稱軸關系的功能性二聚體。PAD4分子可以分為N末端區域和C末端區域2部分，N末端區域可以進一步分出2個子區域(亞區)，2個子區域合并的結構與具有免疫球蛋白式結構的T-細胞表面糖蛋白CD4(T-cell surface glycoprotein CD4)類似，而且1個子區域結構還和p53的DNA結合區域類似。另一方面，C末端區域由5個ββαβ螺旋結構組成，在其中心部存在帶負電的大溝。溝的內部存在2個作為活性殘基的Asp350、His471、Asp473、Cys645和鈣離子，活性殘基部位附近的結構與脒基轉移酶(amidinotransferase，AT))和N(G)，N(G)-dimethyl-L-arginine amidinohydrorase類似。若與不存在鈣離子的PAD4比較活性殘基附近的結構，發現通過2個鈣離子與帶負電的大溝結合，C645(A645)和Asp350附近的結構大幅變化形成裂口，基質結合于此處。此外，還與每個鈣離子的結合方式均已知的Ef hand結構(hand motif)明顯不同。根據以上的結果可知，PAD4雖然是屬于精氨酸修飾酶總科的蛋白質，活性部位的2個鈣離子控制催化活性，但由于其結合方式與具有已知的EF hand結構(作為鈣離子結合結構的一種)的蛋白質不同，因而是一種具有迄今為止全新的依托鈣離子的酶活化結構的蛋白質。
另外，白井等人通過程序PSI-BLAST、FUGUE推測精氨酸加工酶(processing enzyme)具有共通的折疊，提出了精氨酸脫亞氨基化的反應機理(Shirai，H.，Blundell，T.L.and Mizuguchi，K.(2001)A novelsuperfamily of enzymes that catalyze the modification of guanidino groups.TIBS，26，465-468)。進而，Das等人對來源于Mycoplasma arginini的精氨酸脫亞胺酶與反應中間體的復合體的X射線結晶結構進行了分析，提出了L-精氨酸的脫亞氨基化的反應機理(Das et al.(2004)Crystalstructures of arginine deiminase with covalent reaction intermediatesImplication for catalytic mechanism)。根據本發明者們對BA-Ca2+PAD4(C645A)的結構分析，顯示肽基精氨酸(PAD4的反應基質)的脫亞氨基化反應機理中的基質識別機理與Das等人提出的模型一致，因而認為通過PAD4的蛋白質的脫亞氨基化反應為由Das等人提出的2階段反應機理，即，在第1階段，Cys645硫醇基對肽基精氨酸的胍基的碳Cζ進行親核攻擊，形成tetrahedral adduct，然后，Asp350和Asp473通過形成基質、氫鍵和鹽橋，使胍基的炭素Cζ的親核性提高，胍基的Cζ和Nh2之間的健被切斷而生成氨。接著，在第2階段，通過His471活化的水分子對Cζ進行親核攻擊，再次形成tetrahedral adduct后，Cζ和Cys645的硫原子Sγ之間的鍵斷裂生成肽基瓜氨酸殘基(PAD4的反應產物)。本發明者們提出的PAD4的脫氨基化反應機理如圖1所示。
基于以上事實，本發明者們設計和制備了抑制PAD4的酶活性的新型的化合物，測定了PAD4抑制活性。結果發現這些化合物具有PAD4抑制活性，從而完成了本發明。
本發明的內容如下所述。
(1)、下述通式(I)所示的化合物或其鹽。

(式中，R1、R2和R3分別獨立地表示氫原子或碳原子數1～3的烷基，其中，R1、R2和R3中的至少1個不是氫原子，R4為取代的氨基，R5為可被取代的羧基)(2)、如(1)所示的化合物或其鹽，其中R4為如下式 (式中，R41為R401CO-〔式中，R401為氫原子、可被取代的烴基或可被取代的雜環基〕所示的基團、R402S(O)m-〔式中，R402為氫原子，可被取代的烴基或可被取代的雜環基，m為1或2的整數〕所示的基團、R405N(R406)-CHR404-CO-[NH-CHR403-CO]n-〔式中，R403、R404、R405和R406分別獨立地表示氫原子、可被取代的烴基或可被取代的雜環基，n為1～50的任一整數〕所示的基團或可被取代的肽基，R42為氫原子或碳原子數1～3的烷基)所示的基團。
(3)、(2)所示的化合物或其鹽，其中R41為可被取代的苯甲酰基、可被取代的苯甲酰基肽基、可被取代的丹磺酰(dansyl)基或可被取代的丹磺酰基肽基，R42為氫原子。
(4)、(1)～(3)中任一項所述的化合物或其鹽，其中R1，R2和R3分別獨立地表示氫原子或甲基，其中，R1，R2和R3中的至少1個為甲基。
(5)、(4)所述的化合物或其鹽，其為下述(Ia)、(Ib)或(Ic)所示的化合物或其鹽。

(6)、一種含有下述物質作為有效成分的肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑，所述物質能夠抑制如下圖所示在具有序號1的氨基酸序列的肽基精氨酸脫亞胺酶4與其反應基質的反應機理中步驟1～5中的任一步驟。
(圖中，Asp350、His471、Asp473和Cys645分別表示序號1的氨基酸序列中350位的天冬氨酸殘基、471位的組氨酸殘基、473位的天冬氨酸殘基和645位的半胱氨酸殘基)(7)、(6)所述的肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑，所述能夠抑制在具有序號1的氨基酸序列的肽基精氨酸脫亞胺酶4與其反應基質的反應機理中步驟1～5中任一步的物質為精氨酸衍生物。
(8)、一種含有精氨酸衍生物作為有效成分的肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑，其中精氨酸的氨基和胍基被取代，精氨酸的羧基可被取代。
(9)、(7)或(8)所示的肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑，其中精氨酸衍生物為(1)～(5)中任一項所述的化合物或其鹽。
(10)、(6)～(9)中任一項所述的肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑，用于預防和/或治療與肽基精氨酸脫亞胺酶相關的疾病。
(11)、(10)所述的肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑，其中與肽基精氨酸脫亞胺酶相關的疾病選自類風濕性關節炎，牛皮癬和多發性硬化癥。
本說明書中，“肽基精氨酸脫亞胺酶4”是指具有序號1的氨基酸序列的野生型肽基精氨酸脫亞胺酶4，也包括具有同等生物活性(即，在鈣離子存在下對蛋白質中的精氨酸殘基脫氨基化而變換為瓜氨酸殘基的反應進行催化的酶活性)，且具有與序號1的氨基酸序列相同的氨基酸序列的肽基精氨酸脫亞胺酶4。
另外，本說明書中，Boc表示叔丁氧基，Arg表示精氨酸，Tos表示對苯磺酰基，Me表示甲基，ADMA表示NG，NG-二甲基-L-精氨酸，SDMA表示NG，N’G-二甲基-L-精氨酸，Bz表示苯甲酰基。
另外，本說明書中，“～”表示將在其前后記載的數值分別作為最小值和最大值包含的范圍的意思。
以下，詳細地說明本發明。
1.通式(I)所示的化合物或其鹽本發明提供通式(I)所示的化合物或其鹽。
通式(I)所示的化合物或其鹽可以是L型、D型或DL型，L型更為有效。
通式(I)中，R1，R2和R3分別獨立地是氫原子或碳原子數l～3烷基，其中，R1，R2和R3中至少1個不為氫原子。作為碳原子數1～3的烷基，可以列舉甲基、乙基、正丙基、異丙基。
R1，R2和R3優選分別獨立地是氫原子或甲基，其中，R1，R2和R3中至少1個為甲基。
通式(I)中，R4為被取代的氨基。關于R4的氨基上付加的取代基，只要具有該取代基的化合物能夠被PAD4識別(即和PAD4相互作用)，則可以是任何的基團，與R4氨基的氮直接結合的原子優選與氧基(＝O)結合。作為R4的一個例子，可以列舉下式所示的基。
式中，R41為R401CO-〔式中，R401為氫原子、可被取代的烴基或可被取代的雜環基〕所示的基團、R402S(O)m-〔式中，R402為氫原子，可被取代的烴基或可被取代的雜環基，m為1或2的整數〕所示的基團、R405N(R406)-CHR404-CO-[NH-CHR403-CO]n-〔式中，R403、R404、R405和R406分別獨立地表示氫原子、可被取代的烴基或可被取代的雜環基，n為1～50的任一整數〕所示的基團或可被取代的肽基，R42為氫原子或碳原子數1～3的烷基。作為R405N(R406)-CHR404-CO-所示的基團和-NH-CHR403-CO-所示的基團，可以列舉天然蛋白質和肽中存在的氨基酸殘基。作為R41的肽基的取代基，可以列舉苯甲酰基、丹磺酰基等，該苯甲酰基、丹磺酰基等還可被進一步取代。作為苯甲酰基、丹磺酰基等的取代基，可以列舉鹵原子(例如氟、氯、溴、碘等)、羥基、碳原子數1～6的烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基等)、氨基、氨基甲酰基、碳原子數1～6的烷氧基羰基(例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基等)、雜環基(作為雜環基的雜環，可以列舉含1個硫原子、氮原子或氧原子的5～7元環、含2～4個氮原子的5～6元環、含1～2個氮原子和1個硫原子或氧原子的5～6元環等，這些雜環可以和含1～2個氮原子的6元環、苯環或含1個硫原子的5元環縮合，作為雜環基具體的例子，可以列舉，2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、異噻唑基、噁唑基、異噁唑基、吡啶并[2、3-d]嘧啶基、苯并吡喃基、1，8-萘啶基、1，5-萘啶基、1，6-萘啶基、1，7-萘啶基、喹啉基、噻吩并[2、3-b]吡啶基、四唑基、噻二唑基、噁二唑基、三嗪基、三唑基、噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、呋喃基、吡咯烷基、苯并噻吩基、吲哚基、咪唑啉基、哌啶基、哌啶子基、哌嗪基、嗎啉基、嗎啉代等)等。氨基可被碳原子數1～6的烷基或碳原子數1～10的酰基取代。此外，氨基甲酰基可被碳原子數1～6的烷基取代。
作為R401、R402、R403、R404、R405和R406的烴基可以列舉，飽和鏈烴基(例如，碳原子數1～6直鏈狀和支鏈狀烷基等)、不飽和鏈烴基(例如，碳原子數1～6的直鏈狀和支鏈狀烯基、碳原子數1～6的直鏈狀和支鏈狀炔基等)、脂環式烴基(例如，碳原子數1～6的環烷基、碳原子數1～6的環烯基、碳原子數1～6的環炔基等)、芳烴基(例如，苯基、萘基、蒽基、菲基等)。
作為當R401、R402、R403、R404、R405和R406為可被取代的烴基時的取代基，可以列舉鹵原子(例如氟、氯、溴、碘等)、羥基、碳原子數1～6的烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基等)、氨基、氨基甲酰基、碳原子數1～6的烷氧基羰基(例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基等)、雜環基(作為雜環基的雜環，可以列舉含1個硫原子、氮原子或氧原子的5～7元環、含2～4個氮原子的5～6元環、含1～2個氮原子和1個硫原子或氧原子的5～6元環等，這些雜環可以和含1～2個氮原子的6元環、苯環或含1個硫原子的5元環縮合，作為雜環基具體的例子，可以列舉，2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、異噻唑基、噁唑基、異噁唑基、吡啶并[2、3-d]嘧啶基、苯并吡喃基、1，8-萘啶基、1，5-萘啶基、1，6-萘啶基、1，7-萘啶基、喹啉基、噻吩并[2、3-b]吡啶基、四唑基、噻二唑基、噁二唑基、三嗪基、三唑基、噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、呋喃基、吡咯烷基、苯并噻吩基、吲哚基、咪唑啉基、哌啶基、哌啶子基、哌嗪基、嗎啉基、嗎啉代等)等。氨基可被碳原子數1～6的烷基或碳原子數1～10的酰基取代。此外，氨基甲酰基可被碳原子數1～6的烷基取代。
R401、R402、R403、R404、R405和R406的雜環基中的雜環，可以列舉含1個硫原子、氮原子或氧原子的5～7元環、含2～4個氮原子的5～6元環、含1～2個氮原子和1個硫原子或氧原子的5～6元環等，這些雜環可以和含1～2個氮原子的6元環、苯環或含1個硫原子的5元環縮合。作為雜環基具體的例子，可以列舉，2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、異噻唑基、噁唑基、異噁唑基、吡啶并[2、3-d]嘧啶基、苯并吡喃基、1，8-萘啶基、1，5-萘啶基、1，6-萘啶基、1，7-萘啶基、喹啉基、噻吩并[2、3-b]吡啶基、四唑基、噻二唑基、噁二唑基、三嗪基、三唑基、噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、呋喃基、吡咯烷基、苯并噻吩基、吲哚基、咪唑啉基、哌啶基、哌啶子基、哌嗪基、嗎啉基、嗎啉代等。
作為當R401、R402、R403、R404、R405和R406為可被取代的雜環基時的取代基，可以列舉鹵原子(例如氟、氯、溴、碘等)、羥基、碳原子數1～6的烷基(例如甲基、乙基、正丙基、異丙基等)、碳原子數1～6的烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基等)、氨基、氨基甲酰基、碳原子數1～6的烷氧基羰基(例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基等)、上述雜環基等。氨基可被碳原子數1～6的烷基或碳原子數1～10的酰基取代。此外，氨基甲酰基可被碳原子數1～6的烷基取代。
作為R42的碳原子數1～3的烷基，可以列舉甲基、乙基、正丙基、異丙基。
R41為可被取代的苯甲酰基、可被取代的苯甲酰基肽基、可被取代的丹磺酰基或可被取代的丹磺酰基肽基，R42優選為氫原子。
通式(I)中，R5為可被取代的羧基。R5為被取代的羧基時，取代基可以是任意的基團。例如，為了提高對PAD4的抑制活性，R5為-COOR51(式中，R51為碳原子數1～20的烷基)所示的基團、-COO-{R54N(R55)-CHR53-CO-[NH-CHR52-CO]p-}〔式中，R52、R53、R54和R55分別獨立地表示氫原子、可被取代的烴基或可被取代的雜環基，p為1～50的任一整數〕所示的基團等。作為R54N(R55)-CHR53-CO-所示的基團和-NH-CHR52-CO-所示的基團，可以列舉天然蛋白質和肽中存在的氨基酸殘基。
R51的烷基可以是任一種碳原子數1～20的直鏈狀和支鏈狀烷基，具體可以列舉，甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。
作為R52、R53、R54和R55的烴基，可以列舉飽和鏈烴基(例如，碳原子數1～6直鏈狀和支鏈狀烷基等)、不飽和鏈烴基(例如，碳原子數1～6的直鏈狀和支鏈狀烯基、碳原子數1～6的直鏈狀和支鏈狀炔基等)、脂環式烴基(例如，碳原子數1～6的環烷基、碳原子數1～6的環烯基、碳原子數1～6的環炔基等)、芳烴基(例如，苯基、萘基、蒽基、菲基等)。
作為當R52、R53、R54和R55為可被取代的烴基時的取代基，可以列舉鹵原子(例如氟、氯、溴、碘等)、羥基、碳原子數1～6的烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基等)、氨基、氨基甲酰基、碳原子數1～6的烷氧基羰基(例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基等)、雜環基(作為雜環基的雜環，可以列舉含1個硫原子、氮原子或氧原子的5～7元環、含2～4個氮原子的5～6元環、含1～2個氮原子和1個硫原子或氧原子的5～6元環等，這些雜環可以和含1～2個氮原子的6元環、苯環或含1個硫原子的5元環縮合，作為雜環基具體的例子，可以列舉，2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、異噻唑基、噁唑基、異噁唑基、吡啶并[2、3-d]嘧啶基、苯并吡喃基、1，8-萘啶基、1，5-萘啶基、1，6-萘啶基、1，7-萘啶基、喹啉基、噻吩并[2、3-b]吡啶基、四唑基、噻二唑基、噁二唑基、三嗪基、三唑基、噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、呋喃基、吡咯烷基、苯并噻吩基、吲哚基、咪唑啉基、哌啶基、哌啶子基、哌嗪基、嗎啉基、嗎啉代等)等。氨基可被碳原子數1～6的烷基和碳原子數1～10的酰基取代。此外，氨基甲酰基可被碳原子數1～6的烷基取代。
作為R52、R53、R54和R55的雜環基中的雜環，可以列舉含1個硫原子、氮原子或氧原子的5～7元環、含2～4個氮原子的5～6元環、含1～2個氮原子和1個硫原子或氧原子的5～6元環等，這些雜環可以和含1～2個氮原子的6元環、苯環或含1個硫原子的5元環縮合。作為雜環基具體的例子，可以列舉，2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、異噻唑基、噁唑基、異噁唑基、吡啶并[2、3-d]嘧啶基、苯并吡喃基、1，8-萘啶基、1，5-萘啶基、1，6-萘啶基、1，7-萘啶基、喹啉基、噻吩并[2、3-b]吡啶基、四唑基、噻二唑基、噁二唑基、三嗪基、三唑基、噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、呋喃基、吡咯烷基、苯并噻吩基、吲哚基、咪唑啉基、哌啶基、哌啶子基、哌嗪基、嗎啉基、嗎啉代等。
作為當R52、R53、R54和R55為可被取代的雜環基時的取代基，可以列舉鹵原子(例如氟、氯、溴、碘等)、羥基、碳原子數1～6的烷基(例如甲基、乙基、正丙基、異丙基等)、碳原子數1～6的烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基等)、氨基、氨基甲酰基、碳原子數1～6的烷氧基羰基(例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基等)、上述雜環基等。氨基可被碳原子數1～6的烷基或碳原子數1～10的酰基取代。此外，氨基甲酰基可被碳原子數1～6的烷基取代。
作為通式(I)所示化合物的具體例子，可以列舉如下(Ia)、(Ib)或(Ic)所示的化合物。

式(Ia)所示的化合物為Bz-Arg(mono-methyl)。式(Ib)所示的化合物為Bz-ADMA。式(Ic)所示的化合物為Bz-SDMA。
通式(I)所示的化合物可以用市售的精氨酸或如下述結構式所示的精氨酸衍生物作為起始物合成。
(式中，R1，R2和R3分別獨立地表示氫原子或碳原子數1～3的烷基，其中，R1，R2和R3中至少1個不為氫原子)通式(I)中，R4為R401-CO-NH-(式中，R401為氫原子、可被取代的烴基或可被取代的雜環基)所示的基團、R5為羧基的化合物可以用如R401CO-O-COR401所示的對稱酸酐酰基化或用Bz2O(安息香酸酐，benzoic anhydride)苯甲酰基化作為起始物的上述精氨酸或精氨酸衍生物而制備。苯甲酰基化反應可以通過公知的方法進行。例如，可以在惰性溶媒中，在堿的存在下，進行苯甲酰基化反應。作為該反應中使用的惰性溶媒，可以列舉例如，二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、四氫呋喃(THF)等與水的混合物或它們的混合物等。此外，作為堿，使用碳酸氫鈉或碳酸氫鉀，考慮到精氨酸側鏈的胍結構pKa為約12，調整反應溶液的pH為約10以下。反應溫度優選為約0～37℃，反應時間優選約10分鐘～約24小時。Bz2O的用量優選為，相對于1摩爾精氨酸或精氨酸衍生物(起始物)為約1～1.2摩爾。
通式(I)中，R4為R402-S(O)m-NH-(式中，R402為氫原子、可被取代的烴基或可被取代的雜環基，m為1或2的整數)所示的基團、R5為羧基的化合物(例如當m＝2時)可以通過用DNS-Cl(丹磺酰基氯)丹磺酰基化作為起始物的上述精氨酸或精氨酸衍生物而制備。丹磺酰基化反應可以通過公知的方法進行(B.S.Hartley，V.Massey，Biochim.Biophys.Acta，21，58(1956))。例如，可以在惰性溶劑中，在堿存在下，進行丹磺酰基化反應。作為該反應中使用的惰性溶媒，可以列舉例如，丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、四氫呋喃(THF)等與水的混合物或它們的混合物等。此外，作為堿，使用碳酸氫鈉或碳酸氫鉀，考慮到精氨酸側鏈的胍結構pKa為約12，調整反應溶液的pH為約10以下。反應溫度優選為約0～37℃，反應時間優選約10分鐘～約24小時。DNS-Cl的用量優選為，相對于1摩爾精氨酸或精氨酸衍生物(起始物)為約1～1.2摩爾，濃度優選5mM左右。
通式(I)中，R4為R405N(R406)-CHR404-CO-[NH-CHR403-CO]n-NH-〔式中，R403、R404、R405和R406分別獨立地表示氫原子、可被取代的烴基或可被取代的雜環基，n為1～50的任一整數〕所示的基團、R5為羧基的化合物例如可通過以下的方法合成。首先，與苯甲酰基化同樣地，對作為起始物的上述精氨酸或精氨酸衍生物，用Boc2O(叔丁氧基羰基對稱酸酐)Boc化。可以采用公知的方法(J.Ramachandran，C.H.Li，J.Org.Chem.，27，4006(1962))，通過用對甲苯磺酰氯使得到的Boc-Arg或其衍生物側鏈的胍基甲苯磺酰化。使用該衍生物，通過作為公知方法(獲得諾貝爾化學獎)的肽固相合成法(R.B.Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85，2149(1963))，可制得上述的肽。
通式(I)中，R4為R41-NH-〔式中，R41為可被取代的苯甲酰基肽基〕，R5為羧基的化合物例如可以通過下述方法合成。
首先，采用作為公知方法的Fmoc固相合成法(Atherton，E.andSheppard，R.C.，989，Solid Phase Peptide Synthesis.A Practical Approach.，IPF Press，Oxford，UK)合成肽鏈。但是，此時使用沒有用TFA切斷側鏈羧基，而是用HF進行切斷的Asp、Glu以及Lys、Arg，即Asp、Glu是Fmoc-Asp(OcHex)、Fmoc-Glu(OcHex)，Lys、Arg是Fmoc-Lys(Cl-Z)、Fmoc-Arg(Tos)。除去最后的N末端氨基酸的Fmoc基后，如前所述，用Bz2O(安息香酸酐)通過公知的方法進行苯甲酰基化。然后，在乙二硫(ethanedithiol)、茴香硫醚(thioanisole)等滅活劑的存在下用TFA處理目標肽樹脂，用HPLC等對游離的目標肽進行精制。然后，用DMF等溶劑溶解該游離肽，在冰冷卻下，加入1當量的1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二酰亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)，生成肽的酐后，加入Arg或Arg衍生物。此外，作為此時加入的堿，使用碳酸氫鈉或碳酸氫鉀，考慮到精氨酸側鏈的胍結構pKa為約12，調整反應溶液的pH為約10以下。反應溫度優選為約0～37℃，反應時間優選約10分鐘～約24小時。最后，用HF(無水氟化氫)處理生成的肽，除去苯甲酰基以外的所有保護基，進行精制。
通式(I)中，R4為R41-NH-〔式中，R41為可被取代的丹磺酰基肽基〕、R5為羧基的化合物，可以通過上述反應，在除去Fmoc基后加入丹磺酰氯進行丹磺酰基化，而后通過與上述同樣的方法合成。
通式(I)中，R4為R401-CO-NR42-(式中，R401為氫原子、可被取代的烴基或可被取代的雜環基)所示的基團、R5為羧基的化合物(例如當R42為甲基(CH3-)時)，可以將上述精氨酸或精氨酸衍生物的Nα-methyl體作為起始物，用R401CO-O-COR401所示的對稱酸酐進行制備。例如，可在惰性溶劑中，在堿的存在下進行反應。作為該反應中使用的惰性溶媒，可以列舉例如，二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、四氫呋喃(THF)等與水的混合物或它們的混合物等。此外，作為堿，使用碳酸氫鈉或碳酸氫鉀，考慮到精氨酸側鏈的胍結構pKa為約12，調整反應溶液的pH為約10以下。反應溫度優選為約0～37℃，反應時間優選約10分鐘～約24小時。對稱酸酐的用量優選為，相對于1摩爾精氨酸或精氨酸衍生物的Nα-methyl體(起始物)為約1～1.2摩爾。
作為R42為甲基(CH3-)的化合物的起始物Boc-N-Me-Arg(Tos)-OH，由BACHEM公司銷售。可以用三氟乙酸對其處理進行脫Boc反應，可得到N-Me-Arg(Tos)-OH(生物化學試驗講座1，蛋白質的化學IV-化學修飾和肽合成一，p234，日本生化學編，東京化學同人)。用對稱酸酐或Bz2O，可以對其methyl體的α-氨基進行各種的修飾。
側鏈胍基被甲基化、進而α-氨基被甲基化的物質可如下制備，首先對市售的Arg(mono-methyl)、ADMA、SDMA進行Boc化(T.Nagasawa，K.Kuroiwa，K.Narita，Y.Isowa，Bull.Chem.Soc.Jpn.，46，1269(1973))，合成Boc-Arg(mono-methyl)、Boc-ADMA、Boc-SDMA。然后，將甲基化的側鏈胍基基進一步甲苯磺酰化(J.Ramachandran，C.H.Li，J.Org.Chem.，27，4006(1962))，制成各自的甲苯磺酰體Boc-Arg(mono-methyl，Tos)、Boc-ADMA(Tos)、Boc-SDMA(Tos)。用三氟乙酸處理進行脫Boc反應，制成Arg(mono-methyl，Tos)、ADMA(Tos)、SDMA(Tos)。將其作為起始物，還原為N-苯亞甲基氨基酸得到N-芐基化物，用福爾馬林和甲酸甲基化后接觸還原除去芐基，得到N-Me-Arg(mono-methyl，Tos)、N-Me-ADMA(Tos)、N-Me-SDMA(Tos)(P.Quitt，J.Hellerbach，K.Volger，Helv.Chim.Acta，46，327(1963))。如前所述，通過用HF處理(S.Sakakibara，Y.Shimonishi，Y.Kishida，M.Okada，H.Sugihara，Bull.Chem.Soc.Jpn，40，2164(1967))，可制得N-Me-Arg(mono-methyl)、N-Me-ADMA、N-Me-SDMA。將其作為起始物質，用對稱酸酐或Bz2O可以對methyl體的α-氨基進行各種修飾。
通式(I)中，R4為R402-S(O)m-NR42-(式中，R402為氫原子、可被取代的烴基或可被取代的雜環基，m為1或2的整數)所示的基團、R5為羧基的化合物(例如當m＝2且R42為甲基(CH3-)時)，可以用DNS-Cl(丹磺酰基氯)對作為起始物質的上述精氨酸或精氨酸衍生物的Na-methyl體進行丹磺酰基化而制備。丹磺酰基化反應可以通過公知的方法進行(B.S.Hartley，V.Massey，Biochim.Biophys.Acta，21，58(1956))。例如，可以在惰性溶劑中，在堿存在下，進行丹磺酰基化反應。作為該反應中使用的惰性溶媒，可以列舉例如，丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、四氫呋喃(THF)等與水的混合物或它們的混合物等。此外，作為堿，使用碳酸氫鈉或碳酸氫鉀，考慮到精氨酸側鏈的胍結構pKa為約12，調整反應溶液的pH為約10以下。反應溫度優選為約0～37℃，反應時間優選約10分鐘～約24小時。DNS-Cl的用量優選為，相對于1摩爾精氨酸或精氨酸衍生物的Na-methyl體(起始物)為約1～1.2摩爾，濃度優選5mM左右。
通式(I)中，R4為R405N(R406)-CHR404-CO-[NH-CHR403-CO]n-NR42-〔式中，R403、R404、R405和R406分別獨立地表示氫原子、可被取代的烴基或可被取代的雜環基，n為1～50的任一整數〕所示的基團、R5為羧基的化合物(例如R42為甲基(CH3-)時)，可與作為起始物的上述精氨酸或精氨酸衍生物的Na-methyl體的苯甲酰基化同樣地，用Boc2O(叔丁氧基羰基對稱酸酐)Boc化。得到的Boc-Arg或其衍生物的Na-methyl體采用公知的方法(J.Ramachandran，C.H.Li，J.Org.Chem.，27，4006(1962))，通過對甲苯磺酰氯使側鏈的胍基甲苯磺酰化。使用該衍生物，通過作為公知方法(獲得諾貝爾化學獎)的肽固相合成法(R.B.Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85，2149(1963))，可制得上述的肽。
通式(I)中，R4為R41-NR42-〔式中，R41為可被取代的苯甲酰基肽基〕，R5為羧基的化合物(例如R42為甲基(CH3-)時)的合成方法的一例如下所述。
首先，采用作為公知方法的Fmoc固相合成法(Atherton，E.andSheppard，R.C.，1989，Solid Phase Peptide Synthesis.A Practical Approach.，IPF Press，Oxford，UK)合成肽鏈。但是，此時使用沒有用TFA切斷側鏈羧基，而是用HF進行切斷的Asp、Glu以及Lys、Arg，即Asp、Glu是Fmoc-Asp(OcHex)、Fmoc-Glu(OcHex)，Lys、Arg是Fmoc-Lys(Cl-Z)、Fmoc-Arg(Tos)。除去最后的N末端氨基酸的Fmoc基后，如前所述，用Bz2O(安息香酸酐)通過公知的方法進行苯甲酰基化。然后，在乙二硫(ethanedithiol)、茴香硫醚(thioanisole)等清除劑(scavenger)的存在下用TFA處理目標肽樹脂，用HPLC等對游離的目標肽進行精制。然后，用DMF等溶劑溶解該游離肽，在冰冷卻下，加入1當量的1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二酰亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)，生成肽的酐后，加入Na-methyl化的Arg或Na-methyl化的Arg衍生物。此外，作為此時加入的堿，使用碳酸氫鈉或碳酸氫鉀，考慮到精氨酸側鏈的胍結構pKa為約12，調整反應溶液的pH為約10以下。反應溫度優選為約0～37℃，反應時間優選約10分鐘～約24小時。最后，用HF(無水氟化氫)處理生成的肽，除去苯甲酰基以外的所有保護基，進行精制。
通式(I)中，R4為R41-NR42-〔式中，R41為可被取代的丹磺酰基肽基〕，R5為羧基的化合物(例如R42為甲基(CH3-)時)，可通過上述反應，在除去Fmoc基后加入丹磺酰氯進行丹磺酰基化，然后通過與上述同樣的方法合成。
下面簡單地說明在R5的羧基上引入取代基的方法。例如，當在R5的羧基上引入烷基(例如甲基、乙基)或芐基時，通過公知的方法(H.Yajima，Y.Kiso，K.Kitagawa，Chem.Pharm.Bull.，22，1079(1974)以及M.Brenner，W.Huber，Helv.Chim.Acta，36，1109(1953))，進行Arg或其衍生物的酯化。將制得的物質作為起始物，與上述Bz化反應等同樣地進行Bz化等反應，可以合成各種化合物。
下面再對R5為-COO-[NR54-CHR53-CO-(NH-CHR52CO-)p]時的化合物合成方法進行簡單的說明。當R54為氫時，首先，通過Gisin法(B.F.Gisin，Helv.Chem.Acta，56，1476(1973))制備在Merrifield樹脂(聚苯乙烯樹脂)中C末端結合氨基酸的保護氨基酸樹脂。將該保護氨基酸樹脂作為起始物，重復p-1次的肽固相合成(R.B.Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85，2149(1963))，再縮合Boc-NR54-CHR53-COOH。然后將用對甲苯磺酰氯使Boc-Arg(Tos)(肽研究所，大阪箕面)或Arg衍生物側鏈的胍基Tos化后的產物(J.Ramachandran，C.H.Li，J.Org.Chem.，27，4006(1962))通過肽固相合成連接。用氟化氫(HF)處理(S.Sakakibara，Y.Shimonishi，Y.Kishida，M.Okada，H.Sugihara，Bull.Chem.Soc.Jpn，40，2164(1967))得到目標產物。
此外，R5為-COO-[NR54-CHR53-CO-(NH-CHR52CO-)p]、R54為甲基的化合物可以通過Boc化前述的N-Me-Arg(mono-methyl，Tos)、N-Me-ADMA(Tos)、N-Me-SDMA(Tos)，制備Boc-N-Me-Arg(mono-methyl，Tos)、Boc-N-Me-ADMA(Tos)、Boc-N-Me-SDMA(Tos)，將其通過上述的肽固相合成引入目標位置，制備目標產物。
當通式(I)所示的化合物具有酸性官能團(例如羧基等)時，可以用通常的方法與堿(例如藥學上允許的堿)形成鹽。作為所述的鹽，可以列舉例如，鈉鹽、鉀鹽、鋁鹽、鈣鹽等。當通式(I)所示的化合物含有堿性官能團(例如氨基、單取代的氨基等)時，可以用通常的方法與酸(例如藥學上允許的酸)形成鹽。作為所述的鹽，可以列舉例如，鹽酸鹽、硫酸鹽、醋酸鹽、富馬酸鹽等。
通式(I)所示的化合物及其鹽可以用作肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑。
2.肽基精氨酸脫亞胺酶4(PAD4)抑制劑本發明提供一種含有下述物質作為有效成分的肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑，所述物質能夠抑制如下圖所示在具有序號1的氨基酸序列的肽基精氨酸脫亞胺酶4與其反應基質的反應機理中步驟1～5中的任一步驟。
(圖中，Asp350、His471、Asp473和Cys645分別表示序號1的氨基酸序列中350位的天冬氨酸殘基、471位的組氨酸殘基、473位的天冬氨酸殘基和645位的半胱氨酸殘基)
作為能夠抑制在具有序號1的氨基酸序列的肽基精氨酸脫亞胺酶4與其反應基質的反應機理中步驟1～5中的任一步驟的物質，可以列舉精氨酸衍生物等。作為精氨酸衍生物，可以列舉精氨酸的氨基和胍基可被取代、精氨酸的羧基可被取代的精氨酸衍生物，更具體地，可以列舉通式(I)所示的化合物及其鹽。
此外，對于在具有序號1的氨基酸序列的肽基精氨酸脫亞胺酶4與其反應基質的反應機理中能夠抑制步驟1～5中的任一步驟的物質，還可以利用肽基精氨酸脫亞胺酶4或其變異體蛋白質的全部或部分3維結構座標進行探索。例如，利用全部或部分的在Protein Data Bank注冊的Ca2+-free PAD4的3維結構座標(accession code 1WD8)或根據其均方平方根偏差(根平均二乗偏差)得出的鍵長為0.019埃、鍵角為1.894°的座標，全部或部分的Ca2+-bound PAD4(C645A)的3維結構座標(accession code1WD9)或根據其均方根偏差得出的鍵長為0.017埃、鍵角為1.662°的座標，或全部或部分的PAD4(C645A)·鈣離子·基質(benzoly-L-arginine-amideBA)的復合體的3次元結構座標(accession code 1WDA)或根據其均方根偏差得出的鍵長為0.014埃、鍵角為1.595°的座標，通過計算機，探索被具有序號1的氨基酸序列的肽基精氨酸脫亞胺酶4識別的物質(例如，鑒定、檢索、評價或設計)，然后，通過在該物質適當的位置上加合或取代適當種類的原子或原子團，可以設計出能夠抑制在具有序號1的氨基酸序列的肽基精氨酸脫亞胺酶4與其反應基質的反應機理中步驟1～5中的任一步驟的物質。用于物質探索的計算機沒有特別的限制，只要能運行用于物質探索的程序即可。作為所述程序，可以列舉DOCK(Science，1992，257，1078)、Gold4、Glide、FlexX(J.Mol.Biol.，1996，261，470)、AutoDock(J.Comput.Chem.，1998，19，1639)，ICM(J.Comput.Chem.，1994，15，488)、Ludi等。
在設計能夠抑制步驟1～5中的任一步驟或所有步驟的物質時，可以用烷基(例如，甲基和乙基等)取代精氨酸的＝NH2(+)基的氫原子和/或-NH2基的氫原子，和/或用-CH2-取代-NH-。
能夠抑制在具有序號1的氨基酸序列的肽基精氨酸脫亞胺酶4與其反應基質的反應機理中步驟1～5中的任一步驟的物質，可以是天然物質或合成產物，也可以是高分子化合物或低分子化合物。
對于能夠抑制在具有序號1的氨基酸序列的肽基精氨酸脫亞胺酶4與其反應基質的反應機理中步驟1～5中的任一步驟的物質，可以根據該物質的種類，用公知的手法制備。
然后，研究能夠抑制在具有序號1的氨基酸序列的肽基精氨酸脫亞胺酶4與其反應基質的反應機理中步驟1～5中的任一步驟的物質與肽基精氨酸脫亞胺酶4的相互作用(例如，對于肽基精氨酸脫亞胺酶4的解離常數)、以及在所述能夠抑制在具有序號1的氨基酸序列的肽基精氨酸脫亞胺酶4與其反應基質的反應機理中步驟1～5中的任一步驟的物質的存在下肽基精氨酸脫亞胺酶4的酶活性即可。肽基精氨酸脫亞胺酶4可以通過公知的方法(例如，The Journal of Biological Chemistry，Vol.277，No.51，pp.49562-49568，2002以及其中所引用的文獻記載的方法)制備。對于肽基精氨酸脫亞胺酶4的解離常數用BIACORE3000(PharamaciaBiosensor AB)通過表面胞質團共振實驗測定。簡單地說，將肽基精氨酸脫亞胺酶4固定在傳感芯片(sensor chip)表面后，將被檢物質注入到傳感芯片上，到達平衡狀態后，通過斯卡查德圖(Scatchard plot)測定解離常數。肽基精氨酸脫亞胺酶4的酶活性可以通過Nakashima，K.，Hagiwara，T.，Ishigami，A.，Nagata，S.，Asaga，H.，Kuramoto，M.，Senshu，T.and Yamada，M.(1999)Molecular characterization of peptidylarginine deiminase in HL-60 cells induced by retinoic acid and 1α，25-dihydroxyvitamin D3.J.Biol.Chem.，274，27786-27792中記載的方法測定。使肽基精氨酸脫亞胺酶4的酶活性降低的物質可以用作肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑。
本發明的肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑可以以藥物或試驗用試藥的形式對人和其它動物進行給藥。本發明的肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑可以單獨使用，或者也可以與其它藥劑(例如，其它類風濕性關節炎預防·治療藥)組合使用。
當本發明的肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑對人給藥時，可以是例如換算為有效成分量，以每天為約0.1～9000mg/kg(體重)，優選每天為約1～900mg/kg(體重)的給藥量，分1次或幾次通過口服給藥，其給藥量和給藥次數可以根據癥狀、年齡和給藥方法等適當地變化。
本發明的肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑可以制成片劑、膠囊劑、顆粒劑、粉劑、糖漿等劑型而通過口服給藥，也可以制成注射劑、栓劑等劑型，通過注射到腹腔內或靜胍內的非口服方式給藥。制劑中的有效成分含量可以在1～90重量％的范圍內變化。例如，當為片劑、膠囊劑、顆粒劑、粉劑等形態時，優選含有5～80重量％的有效成分。當為糖漿等液劑時，優選含有1～30重量％的有效成分。進而，當為通過非口服方式給藥的注射劑時，優選含有1～10重量％的有效成分。
本發明的肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑的制劑化，可以通過使用賦形劑(乳糖、白糖、葡萄糖、甘露醇等糖類，馬鈴薯、小麥、玉米等淀粉，碳酸鈣、硫酸鈣、碳酸氫鈉等無機物，結晶纖維素等)、粘合劑(脫水淀粉、阿拉伯膠、明膠、藻酸鈉、甲基溶纖劑、乙基溶纖劑、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素等)，潤滑劑(硬脂酸鎂、滑石、加氫植物油、聚乙烯醇、硅油)，崩解劑(淀粉、瓊脂、明膠末、結晶纖維素、CMC·Na、CMC·Ca、碳酸鈣、碳酸氫鈉、藻酸鈉等)、調味劑(乳糖、白糖、葡萄糖、甘露醇、芳香性精油類等)，溶劑(注射用水、滅菌純水、芝麻油、豆油、玉米油、橄欖油、棉籽油等)，穩定劑(氮氣、二氧化碳等惰性氣體、EDTA、硫代二醇等螯合劑、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、L-抗壞血酸、雕白粉等還原物質等)，防腐劑(對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、芐醇、苯酚、氯化芐烷銨等)，表面活性劑(氫化蓖麻油、聚山梨酸酯80、20等)，緩沖劑(檸檬酸、醋酸、磷酸的鈉鹽、硼酸等)，稀釋劑等制劑添加物，通過公知的方法進行。
本發明的肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑可用于預防和/或治療肽基精氨酸脫亞胺酶相關疾病。作為肽基精氨酸脫亞胺酶相關疾病，已知的有類風濕性關節炎、牛皮癬、多發性硬化癥等，本發明的肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑可以有效地預防和/或治療類風濕性關節炎、多發性硬化癥等。此外，本發明的肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑可用于肽基精氨酸脫亞胺酶4的研究。
本申請要求基于日本專利申請的特愿2004-28467號的申請的優先權，并將其說明書和/或附圖中記載的內容全文并入本說明書中。
根據本發明，提供了一種肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑。通過使用該抑制劑，可以預防和/或治療與肽基精氨酸脫亞胺酶相關的疾病(例如類風濕性關節炎、多發性硬化癥等)。


圖1是本發明者們提出的PAD4的脫亞氨基化反應機理。
圖2是制備例中最終精制物的HPLC譜圖。
1是Bz-Arg的峰，2是Bz-Arg(mono-methyl)的峰，3是Bz-ADMA的峰，4是Bz-SDMA的峰。
圖3是顯示了制備例中制備的Bz-Arg衍生物在PAD4消化中的抑制反應(反應時間40分鐘)的結果。
圖4是顯示了制備例中制備的Bz-Arg衍生物在PAD4消化中的抑制反應(反應時間60分鐘)的結果。
具體實施例方式
以下，通過實施例更具體地說明本發明。另外，這些實施例僅用于對本發明進行說明，而不是對本發明范圍的限定。
〔制備例〕Bz-Arg衍生物的合成將Arg衍生物(Argナカライテスク(京都)、瓜氨酸Sigma(Stlouis，USA)、NG-Monomethyl-L-arginine和光純藥(大阪)、ADMA(NG，NG-Dimethyl-L-Argnine)ALEXIS Biochemicals(Lausen，Switzerland)、SDMA(NG，N’G-Dimethyl-L-Argnine)ALEXISBiochemicals(Lausen，Switzerland))(10μmol)在0.1M NaHCO3(200μl)中溶解，加入Bz2O(10μmol)/DMF(200μl)攪拌后，在室溫下放置1小時。向反應液中加入水(200μl)稀釋后，用醋酸乙酯(500μl)清洗3次。在得到的水溶液中加入6M HCl(100μl)，用醋酸乙酯(500μl)清洗4次。然后用反相HPLC，從得到的反應溶液中精制目標Bz-Arg衍生物(1.Bz-Arg，2.Bz-Arg(mono-methyl)，3.Bz-ADMA，4.Bz-SDMA)。任一種Bz-Arg衍生物精制后的收率均為40％左右。HPLC條件
Waters M600 multi-solvent delivery systemUV220nm柱Develosil ODS-UG-5(4.6×150mm)溫度30度溶劑0.05％TFA水溶液中，從5％乙腈開始以1％/min的速度提高乙腈濃度。
最終精制物的HPLC譜如圖2所示。圖2中的1是Bz-Arg的峰，2是Bz-Arg(mono-methyl)的峰，3是Bz-ADMA的峰，4是Bz-SDMA的峰。
化合物的鑒定通過MALDI-TOFMS(質量分析)進行。
裝置Applied Biosystems Voyager System 6178[表1]原子 精密質量數原子 精密質量數C12H1.00783N14.0031O15.9949MALDI-TOF Mass精密質量數(M) 計算值M+H 實測值M+HBzBz-Arg 278.1 279.1 279.5Bz-Arg(monoMe) 292.2 293.2 293.6Bz-ADMA 306.2 307.2 307.6Bz-SDMA 306.2 307.2 307.6Bz-citrulline279.1 280.1 280.3〔試驗例〕Bz-Arg衍生物在PAD4消化中的抑制反應在冰冷卻下混合緩沖液B(0.1M Tris/HCl，10mM CaCl2，2mM DTT，pH7.6，125μl)、Bz-Arg(0.1M Tris/HCl，10mM CaCl2，pH7.6，25μl(濃度1nmol/μl))、PAD4(1μl)。PAD4根據The Journal of BiologicalChemistry，Vol.277，No.51，pp.49562-49568，2002及其中所引用的論文記載的方法制備。分別取20μl(濃度1nmol/μl)的Bz-Arg(mono-methyl)、Bz-ADMA、Bz-SDMA、緩沖液A(0.1M Tris/HCl，10mM CaCl2，pH7.6)與上述Bz-Arg溶液(30μl)混合，在37度下反應40或60分鐘。加入1M HCl(50μl)中止反應后，用反相HPLC分離反應混合物。結果發現，Bz-ADMA的抑制作用最強，Bz-Arg(mono-methyl)次之。另外，在本次使用的濃度下Bz-SDMA未發現抑制作用。反應時間40分鐘的結果如圖3所示，反應時間60分鐘的結果如圖4所示。在圖3和4中，1為未使用抑制劑的結果，2為Bz-Arg(mono-methyl)，3為Bz-ADMA，4為Bz-SDMA的結果。此外，縱軸表示樣品序號，橫軸表示脫亞氨基化反應收率(Bz-citrulline的生成收率)。
本說明書中引用的所有出版物、專利和專利申請的內容均引入本說明書作為參考。
通過本發明，提供一種肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑。通過使用所述抑制劑，可以預防和/或治療與肽基精氨酸脫亞胺酶相關的疾病(例如類風濕性關節炎、多發性硬化癥等)。
序號1表示人體肽基精氨酸脫亞胺酶4的氨基酸序列。
序列表<110>橫濱市<120>肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑<130>FP-036PCT<140>
<141>
<150>JP P2004-028467<151>2004-02-04<160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>663<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Met Ala Gln Gly Thr Leu Ile Arg Val Thr Pro Glu Gln Pro Thr His1 5 10 15Ala Val Cys Val Leu Gly Thr Leu Thr Gln Leu Asp Ile Cys Ser Ser20 25 30Ala Pro Glu Asp Cys Thr Ser Phe Ser Ile Asn Ala Ser Pro Gly Val35 40 45Val Val Asp Ile Ala His Ser Pro Pro Ala Lys Lys Lys Ser Thr Gly50 55 60Ser Ser Thr Trp Pro Leu Asp Pro Gly Val Glu Val Thr Leu Thr Met65 70 75 80Lys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Gly Asp Gln Lys Val Gln Ile Ser Tyr85 90 95Tyr Gly Pro Lys Thr Pro Pro Val Lys Ala Leu Leu Tyr Leu Thr Ala100 105 110Val Glu Ile Ser Leu Cys Ala Asp Ile Thr Arg Thr Gly Lys Val Lys115 120 125Pro Thr Arg Ala Val Lys Asp Gln Arg Thr Trp Thr Trp Gly Pro Cys130 135 140Gly Gln Gly Ala Ile Leu Leu Val Asn Cys Asp Arg Asp Asn Leu Glu145 150 155 160Ser Ser Ala Met Asp Cys Glu Asp Asp Glu Val Leu Asp Ser Glu Asp165 170 175Leu Gln Asp Met Ser Leu Met Thr Leu Ser Thr Lys Thr Pro Lys Asp180 185 190Phe Phe Thr Asn His Thr Leu Val Leu His Val Ala Arg Ser Glu Met195 200 205Asp Lys Val Arg Val Phe Gln Ala Thr Arg Gly Lys Leu Ser Ser Lys210 215 220Cys Ser Val Val Leu Gly Pro Lys Trp Pro Ser His Tyr Leu Met Val225 230 235 240Pro Gly Gly Lys His Asn Met Asp Phe Tyr Val Glu Ala Leu Ala Phe245 250 255Pro Asp Thr Asp Phe Pro Gly Leu Ile Thr Leu Thr Ile Ser Leu Leu260 265 270
Asp Thr Ser Asn Leu Glu Leu Pro Glu Ala Val Val Phe Gln Asp Ser275 280 285Val Val Phe Arg Val Ala Pro Trp Ile Met Thr Pro Asn Thr Gln Pro290 295 300Pro Gln Glu Val Tyr Ala Cys Ser Ile Phe Glu Asn Glu Asp Phe Leu305 310 315 320Lys Ser Val Thr Thr Leu Ala Met Lys Ala Lys Cys Lys Leu Thr Ile325 330 335Cys Pro Glu Glu Glu Asn Met Asp Asp Gln Trp Met Gln Asp Glu Met340 345 350Glu Ile Gly Tyr Ile Gln Ala Pro His Lys Thr Leu Pro Val Val Phe355 360 365Asp Ser Pro Arg Asn Arg Gly Leu Lys Glu Phe Pro Ile Lys Arg Val370 375 380Met Gly Pro Asp Phe Gly Tyr Val Thr Arg Gly Pro Gln Thr Gly Gly385 390 395 400Ile Ser Gly Leu Asp Ser Phe Gly Asn Leu Glu Val Ser Pro Pro Val405 410 415Thr Val Arg Gly Lys Glu Tyr Pro Leu Gly Arg Ile Leu Phe Gly Asp420 425 430Ser Cys Tyr Pro Ser Asn Asp Ser Arg Gln Met His Gln Ala Leu Gln435 440 445Asp Phe Leu Ser Ala Gln Gln Val Gln Ala Pro Val Lys Leu Tyr Ser450 455 460Asp Trp Leu Ser Val Gly His Val Asp Glu Phe Leu Ser Phe Val Pro465 470 475 480Ala Pro Asp Arg Lys Gly Phe Arg Leu Leu Leu Ala Ser Pro Arg Ser485 490 495Cys Tyr Lys Leu Phe Gln Glu Gln Gln Asn Glu Gly His Gly Glu Ala500 505 510Leu Leu Phe Glu Gly Ile Lys Lys Lys Lys Gln Gln Lys Ile Lys Asn515 520 525Ile Leu Ser Asn Lys Thr Leu Arg Glu His Asn Ser Phe Val Glu Arg530 535 540Cys Ile Asp Trp Asn Arg Glu Leu Leu Lys Arg Glu Leu Gly Leu Ala545 550 555 560Glu Ser Asp Ile Ile Asp Ile Pro Gln Leu Phe Lys Leu Lys Glu Phe565 570 575Ser Lys Ala Glu Ala Phe Phe Pro Asn Met Val Asn Met Leu Val Leu580 585 590Gly Lys His Leu Gly Ile Pro Lys Pro Phe Gly Pro Val Ile Asn Gly595 600 605Arg Cys Cys Leu Glu Glu Lys Val Cys Ser Leu Leu Glu Pro Leu Gly610 615 620Leu Gln Cys Thr Phe Ile Asn Asp Phe Phe Thr Tyr His Ile Arg His625 630 635 640Gly Glu Val His Cys Gly Thr Asn Val Arg Arg Lys Pro Phe Ser Phe645 650 655Lys Trp Trp Asn Met Val Pro660
權利要求
1.一種下述通式(I)所示的化合物或其鹽， 式中，R1、R2和R3分別獨立地表示氫原子或碳原子數1～3的烷基，其中，R1、R2和R3中的至少1個不是氫原子，R4為取代的氨基，R5為取代或非取代的羧基。
2.如權利要求1所述的化合物或其鹽，其中R4為下式所示的基團， 式中R41為R401CO-所示的基團，其中R401為氫原子、取代或非取代的烴基或取代或非取代的雜環基；R402S(O)m-所示的基團，其中R402為氫原子、取代或非取代的烴基或取代或非取代的雜環基、m為1或2的整數；R405N(R406)-CHR404-CO-[NH-CHR403-CO]n-所示的基團，其中R403、R404、R405和R406分別獨立地表示氫原子、取代或非取代的烴基或取代或非取代的雜環基、n為1～50的任一整數；或者取代或非取代的肽基，R42為氫原子或碳原子數1～3的烷基。
3.如權利要求2所述的化合物或其鹽，其中R41為取代或非取代的苯甲酰基、取代或非取代的苯甲酰基肽基、取代或非取代的丹磺酰基或取代或非取代的丹磺酰基肽基，R42為氫原子。
4.如權利要求1～3中任一項所述的化合物或其鹽，其中R1、R2和R3分別獨立地表示氫原子或甲基，其中，R1、R2和R3中的至少1個為甲基。
5.如權利要求4所述的化合物或其鹽，其為下述(Ia)、(Ib)或(Ic)所示的化合物或其鹽，
6.一種肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑，作為有效成分含有下述物質，，的，所述物質能夠抑制如下圖所示在具有序號1的氨基酸序列的肽基精氨酸脫亞胺酶4與其反應基質的反應機理中步驟1～5中的任一步驟， 圖中，Asp350、His471、Asp473和Cys645分別表示序號1的氨基酸序列中350位的天冬氨酸殘基、471位的組氨酸殘基、473位的天冬氨酸殘基和645位的半胱氨酸殘基。
7.如權利要求6所述的肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑，所述能夠抑制在具有序號1的氨基酸序列的肽基精氨酸脫亞胺酶4與其反應基質的反應機理中步驟1～5中任一步的物質為精氨酸衍生物。
8.一種肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑，作為有效成分含有精氨酸衍生物，其中精氨酸的氨基和胍基被取代或非取代，精氨酸的羧基被取代或非取代。
9.如權利要求7或8所述的肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑，其中精氨酸衍生物為權利要求1～5中任一項所述的化合物或其鹽。
10.如權利要求6～9中任一項所述的肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑，用于預防和/或治療與肽基精氨酸脫亞胺酶相關的疾病。
11.如權利要求10所述的肽基精氨酸脫亞胺酶4抑制劑，其中與肽基精氨酸脫亞胺酶相關的疾病選自類風濕性關節炎，牛皮癬和多發性硬化癥。
全文摘要
本發明提供如下述通式(I)所示的化合物或其鹽。(式中，R
文檔編號A61K31/198GK1914168SQ200580003789
公開日2007年2月14日 申請日期2005年2月3日 優先權日2004年2月4日
發明者佐藤衛, 清水敏之, 橋本博, 山田道之, 日高雄二 申請人:公立大學法人橫浜市立大學