專利名稱：Puma在腫瘤放化療增敏中的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及PUMA基因的新用途，特別是外源PUMA基因或包含有PUMABH3結(jié)構(gòu)域(LRRMADDLN)的cDNA及蛋白的導(dǎo)入在制備增加腫瘤對化療藥物和放射治療的敏感性藥物中的用途。
背景技術(shù)：
腫瘤化療是惡性腫瘤綜合治療中不可缺少的重要手段，已成為某些腫瘤根治的主要方法，手術(shù)后(輔助性化療)和手術(shù)前(新輔助化療)化療能使部分癌癥的治愈率有所提高，可增加局部晚期多種實體瘤的手術(shù)切除機會。但是不同作用機制的各種化療藥物(烷化劑、抗代謝類藥物、抗腫瘤抗生素類、抗腫瘤的植物類藥物、鉑類等)均有不同程度的毒副作用，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、心、肺、肝、腎、膀胱、神經(jīng)毒性等。放射治療是除手術(shù)和化療以外的最主要的治療腫瘤的方法，但它對增殖較慢的或失去增殖能力的組織有較大的毒副作用，如肺放射性纖維化、腦和脊髓的放射性壞死。這些毒副作用嚴重影響了放、化療在臨床中的應(yīng)用，尋找一種可以增強放、化療療效、減低其治療劑量，從而減輕其毒副作用的物質(zhì)是醫(yī)務(wù)工作者孜孜以求的目標。
現(xiàn)在，人們已知放療和大多數(shù)化療藥物主要都是通過誘導(dǎo)細胞凋亡來清除腫瘤細胞的。外源促凋亡相關(guān)基因的導(dǎo)入有可能起到增加放、化療敏感性的作用，這在人們以往的對p53的研究中已得到證實。
PUMA(p53 up-regulated modulator of apoptosis)是2001年報道的新發(fā)現(xiàn)的Bcl-2蛋白家族一員，因其可被p53快速誘導(dǎo)并具有強大促凋亡作用而得名。它通過BH3結(jié)構(gòu)域與其它Bcl-2家族蛋白相互作用，誘導(dǎo)細胞色素c釋放，引起凋亡。PUMA蛋白定位于線粒體膜上，BH3結(jié)構(gòu)域(141-149位氨基酸，LRRMADDLN)是誘導(dǎo)凋亡所必不可少的，而C端43個氨基酸殘基(151-193位)是其在線粒體定位和誘導(dǎo)凋亡所必需的。僅含C端93個氨基酸殘基的PUMA表達結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)凋亡的水平與全長PUMA蛋白的接近。PUMA誘導(dǎo)凋亡的能力是快速強大的，表達p53的人大腸癌DLD1細胞比表達PUMA的DLD1細胞凋亡形態(tài)學改變出現(xiàn)晚9小時(如染色質(zhì)聚集，核片斷化)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種PUMA基因或包含有PUMA BH3結(jié)構(gòu)域的cDNA及蛋白在制備增加放、化療敏感性藥物中的新用途。換言之，本發(fā)明在于提供一種腫瘤放、化療增敏劑。
本發(fā)明所述的化療藥物包括，但不限于鉑類cDDP(cisplatin順鉑)、CBP(carboplatin卡鉑)、L-OHP(Oxaliplatin奧沙利鉑)、NDP(Nedaplatin奈達鉑)等。
微管抑制劑PTX(Taxol紫杉醇)、TXT(Taxotere泰索帝)、VLB(Vinblastine長春堿)、VCR(Vincristione長春新堿)、VNR(Vinorelbine長春瑞賓)等。
抗代謝類5-Fu(5-Fluorouracil五氟尿嘧啶)、6-TG(Thioguanine硫鳥嘌呤)、AG337(Nolatrexed洛拉曲克)、FT-207(Tegafur替加氟)、HCFU(Carmofur卡莫氟)、5`-DFUR(Doxifluridine氟鐵龍)、UFT(優(yōu)福定)、Ara-C(Cytarabine阿糖胞苷)等。
拓撲異構(gòu)酶II抑制劑VP16-213(etoposide鬼臼乙叉甙)、VM-26(teniposide鬼臼噻吩甙)等。
蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素ADR(adriamycin阿霉素)、DAM(daunomycin柔紅霉素)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、表阿霉素(epirubicin)、去甲柔紅霉素(idarubicin)、米托蒽醌(mitoxatrone)等。
優(yōu)選的是順鉑cDDP、紫杉醇taxol、五氟尿嘧啶5-Fu、奧沙利鉑Oxaliplatin、鬼臼乙叉甙etoposide、阿霉素adriamycin。
本發(fā)明所述的放射治療包括但不限于γ射線。
本發(fā)明所述的藥物是PUMA基因?qū)胼d體或包含有PUMA BH3結(jié)構(gòu)域的cDNA及蛋白形成的藥物。
本發(fā)明可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種基因?qū)胼d體，可以采用腺病毒介導(dǎo)將外源PUMA基因(Ad-PUMA)及缺失BH3結(jié)構(gòu)域的PUMA基因(Ad-ΔBH3)導(dǎo)入的系統(tǒng)，經(jīng)過體外細胞系、體內(nèi)人癌裸鼠腫瘤模型，證實Ad-PUMA的協(xié)同化療藥物和放射治療、增強抗腫瘤療效的作用，而由缺失BH3結(jié)構(gòu)域的PUMA基因構(gòu)建的Ad-ΔBH3則不具備上述功能。所述的載體并不局限于復(fù)制缺陷型腺病毒載體，還可以包括其他各種外源基因?qū)氲姆椒?，如基因槍、脂質(zhì)體法、受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)等，以及其它病毒載體系統(tǒng)，所述的其它病毒載體包括，增殖型腺病毒、單純皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒、痘苗病毒等。成功導(dǎo)入包含有PUMA BH3結(jié)構(gòu)域的cDNA及蛋白也可起到增加放、化療敏感性的作用。
PUMA或其BH3結(jié)構(gòu)域能增敏的化療藥物也不局限于下面實驗中所列舉的幾種。
通常Ad-PUMA的使用包括對于小鼠的治療實驗可根據(jù)不同情況(腫瘤大小、治療次數(shù)、間隔時間等)采用不等劑量一般5×108PFU～5×109PFU/次，可每天一次連續(xù)給藥5次，也可每兩天或三天給藥一次共三次。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知Ad-p53對于人體的治療用藥劑量，治療組給藥劑量、間隔時間不等，按其產(chǎn)品說明書描述為每周一次，每次1012VP(相當于3.3×1010PFU)，瘤組織局部多點注射。
本發(fā)明的Ad-PUMA可參考Ad-p53的使用劑量與用藥方式。
本發(fā)明通過一系列體外、體內(nèi)實驗證實導(dǎo)入外源PUMA基因，在多種不同組織類型的包括乳腺癌、宮頸癌、肺癌、肝癌、胰腺癌和食管癌等實體腫瘤中，可增強多種不同作用機制的化療藥物和放射治療的抗腫瘤作用，外源PUMA基因缺失BH3結(jié)構(gòu)域后則不具備該功能，而且PUMA的導(dǎo)入與化療藥物的協(xié)同增效比p53基因的導(dǎo)入更顯著。外源PUMA的導(dǎo)入并不改變各種化療藥物本身對腫瘤細胞的細胞周期的影響，這種協(xié)同作用是由于誘導(dǎo)凋亡的協(xié)同引起的。
圖1A顯示Ad-PUMA聯(lián)合放化療顯著抑制A549細胞生長。
圖1B顯示不同劑量的化療藥單獨或與Ad-PUMA聯(lián)合處理A549細胞后的細胞生長率。
圖2A顯示Ad-PUMA顯著增強阿霉素誘導(dǎo)的A549細胞凋亡。
圖2B顯示Ad-PUMA顯著增強γ射線誘導(dǎo)的A549細胞凋亡。
圖3顯示不同病毒感染食管癌細胞72h后細胞存活率。
圖4顯示KYSE150細胞平板集落形成情況。
圖5顯示不同因素處理48h后KYSE-150細胞周期的變化。
圖6A顯示DAPI染色后的細胞核形態(tài)。
圖6B顯示50MOIAd-PUMA感染KYSE150不同時間點凋亡細胞百分比。
圖6C顯示200MOIAd-p53感染KYSE150不同時間點凋亡細胞百分比。
圖6D顯示Ad-PUMA與化療藥聯(lián)合作用36hr各組凋亡細胞百分比。
圖7表示采用PUMA的特異性引物(上游5’＞GTCCTCAGCCCTCGCTCT＜3’下游5’＞CTGCTGCTCCTCTTGTCTCC＜3’)檢測PUMA在mRNA水平的改變電泳圖。
圖8顯示KYSE150裸鼠移植瘤生長曲線圖。
圖9顯示剝離的KYSE150裸鼠移植瘤組織。
圖10A顯示Ad-PUMA顯著抑制肺癌細胞生長。
圖10B顯示PI染色法檢測Ad-PUMA感染H1299肺癌細胞后細胞的形態(tài)改變。
圖10C顯示流式細胞儀檢測Ad-PUMA感染H1299肺癌細胞后凋亡細胞百分比。
圖11顯示Ad-PUMA比Ad-p53抑制細胞生長更顯著。
圖12A顯示A549裸鼠移植瘤生長曲線圖。
圖12B顯示Ad-PUMA抑制A549裸鼠移植瘤生長。
圖12C顯示H1299裸鼠移植瘤生長曲線圖。
圖12D顯示Ad-PUMA顯著誘導(dǎo)H1299裸鼠移植瘤組織凋亡。
具體實施例方式
實施例一各種腫瘤細胞系中Ad-PUMA與化療藥物聯(lián)合作用的研究方法采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知手段獲得PUMA基因，并將其導(dǎo)入腺病毒，得到Ad-PUMA(腺病毒-PUMA)。然后將對數(shù)生長期的以下各種腫瘤(乳腺癌、宮頸癌、肝癌、肺癌、胰腺癌)細胞系細胞接種于96孔板，根據(jù)不同細胞系間細胞體積的差異調(diào)整接種的細胞數(shù)，培養(yǎng)過夜。所述的Ad-PUMA(腺病毒-PUMA)感染細胞前，棄去原培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗3遍，加入100μl含一定量Ad-PUMA的無血清RPMI1640培養(yǎng)基，使其達到一定感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection)，即平均每個細胞中有一定數(shù)目的有感染能力的Ad-PUMA病毒顆粒。由于每種細胞系對Ad-PUMA的敏感度存在差異，各細胞系間的感染復(fù)數(shù)有所不同。將96孔板放置于37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)90min，期間每隔15min十字型輕輕晃動培養(yǎng)皿一次，使病毒液分布均勻。然后不同孔中分別加入含一定濃度化療藥物的RPMI1640完全培養(yǎng)基(含10％FBS、100U/ml青霉素、0.1mg/ml鏈霉素)。所加入化療藥物的濃度的確定原則是該化療藥物單獨作用時對細胞的生長抑制率＜60％。其中HeLa、SiHa、MGC803、A549、P3細胞系中cDDP、taxol、5-Fu的濃度分別為5μM、5nM、10μM；BEL7402細胞系中5-Fu的濃度為20μM，余同前；MCF-7細胞系中cDDP、taxol、5-Fu的濃度分別為2μM、2nM、10μM.藥物處理72hr后采用MTT法用酶標儀檢測各孔細胞的吸光度，計算各處理組細胞生長的抑制率。每一處理組設(shè)3個平行孔，重復(fù)實驗2-3次。
結(jié)果見表1。
在不同組織類型的腫瘤細胞系中(乳腺癌、宮頸癌、肝癌、肺癌和胰腺癌)，外源導(dǎo)入PUMA基因(Ad-PUMA)可增強多種不同作用機制的化療藥物(如順鉑cDDP、紫杉醇taxol、五氟尿嘧啶5-Fu等)的細胞毒作用。與低劑量的Ad-PUMA聯(lián)用后，化療藥物對細胞的生長抑制率分別增長了10.39％～54.51％，其中宮頸癌細胞系SiHa對Ad-PUMA最為敏感，只要外源導(dǎo)入2MOI的Ad-PUMA，即平均每個SiHa細胞中有2個有感染能力的重組PUMA腺病毒顆粒，便可顯著增強各種化療藥物的細胞毒作用。
表1不同處理組細胞生長抑制率(％)
實施例二肺癌細胞系中Ad-PUMA與化療藥物協(xié)同作用及其機制的研究1.Ad-PUMA顯著降低A549肺癌細胞中不同化療藥的IC50Ad-PUMA10MOI感染A549細胞，24hr后用不同濃度的Taxol、Cisplatin、5-FU、Etoposide和Adriamycin處理細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48hr后采用MTS法檢測各孔細胞的吸光度，同時檢測各化療藥單獨作用的吸光度值，以未處理細胞作為對照，計算各處理組細胞生長率，計算各化療藥單獨及聯(lián)合Ad-PUMA的IC50。每一處理組設(shè)3個平行孔，重復(fù)實驗3次。
結(jié)果在A549肺癌細胞系中Ad-PUMA可顯著降低各種化療藥的IC50，最少可將其降至原來的1/3(Adriamycin0.76μg/ml降至0.22μg/ml)，最高可使IC50低于原來的1/10(Taxol和5-FU)(表2)。這說明Ad-PUMA在各肺癌細胞系中均具有顯著的化療增敏作用。
表2A549細胞中化療藥單獨及與Ad-PUMA聯(lián)合作用的IC50
2.Ad-PUMA增強肺癌細胞系A(chǔ)549對化療敏感性的研究采用與實施例一相同的方法獲得Ad-PUMA，以10MOI的感染強度感染A549細胞，24hr后進行不同處理Taxol5nM；5-FU5-Fluorouracil，25μg/ml；OxaOxaliplatin，25μM；CisCisplatin，25μM；EtpEtoposide，2μM；AdrAdriamycin，0.2μg/ml。繼續(xù)培養(yǎng)48hr后采用MTS法檢測各孔細胞的吸光度，以各化療藥單獨作用時對細胞生長的抑制率為參照，計算Ad-PUMA與各化療藥聯(lián)用后相對的細胞生長抑制倍數(shù)。并將各化療藥單獨及與Ad-PUMA聯(lián)合作用的劑量效應(yīng)趨勢進行顯著性檢驗。每一處理組設(shè)3個平行孔，重復(fù)實驗3次。結(jié)果見附圖1A、B，Ad-PUMA與各化療藥聯(lián)用后細胞生長抑制率是單獨給予化療藥的2-8倍不等。采用GraphPadPrism IV統(tǒng)計軟件對劑量效應(yīng)趨勢圖進行檢驗，可見Ad-PUMA與各化療藥合用對細胞的生長抑制顯著強于各化療藥單獨作用(P＜0.05)。這表明Ad-PUMA具有增強肺癌細胞系A(chǔ)549對化療藥物敏感性的作用。
3.肺癌細胞系中Ad-PUMA增強其化療敏感性的機制的研究A549細胞經(jīng)10MOI Ad-PUMA或Ad-ΔBH3感染24小時后，加Adriamycin 0.2μg/ml后在指定時間點收集懸浮和貼壁細胞，通過PI染色檢測核片段化計數(shù)凋亡細胞百分比。每次計數(shù)至少300個細胞，重復(fù)試驗3次，取均值。如圖2A所示，單獨用Ad-PUMA(10 MOI)或Adriamycin(0.2μg/ml)處理A549細胞72小時未誘導(dǎo)顯著的凋亡，而二者聯(lián)合處理A549細胞72小時則近90％的細胞發(fā)生凋亡。相同劑量的Ad-ΔBH3聯(lián)合化療藥Adriamycin則未對后者誘導(dǎo)凋亡的能力產(chǎn)生影響。由此可見，BH3結(jié)構(gòu)域是PUMA發(fā)揮其化療增敏作用所必需的，細胞中成功表達BH3結(jié)構(gòu)域便可顯著增強化療誘導(dǎo)凋亡的能力。
實施例三食管癌細胞系中Ad-PUMA與化療藥物協(xié)同作用及其機制的研究1.Ad-PUMA抑制不同食管癌細胞系生長增殖作用的研究采用與實施例一相同的方法獲得Ad-PUMA，分別以不同感染強度(500MOI～5MOI)的Ad-PUMA、Ad-p53(商品名“今又生”，為重組人p53腺病毒注射液——深圳市賽百諾基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)，陽性對照)、Ad-GFP(帶綠色熒光蛋白基因GFP的腺病毒，陰性對照)感染各種食管癌細胞，72hr后采用MTT檢測各孔細胞的吸光度，計算各處理組細胞生長率。每一處理組設(shè)3個平行孔，重復(fù)實驗3～4次。
結(jié)果見附圖3?？梢姡谑彻馨┘毎礙YSE150、KYSE410、YES2、KYSE510中感染強度相同，作用時間相同時，Ad-PUMA對細胞的生長抑制率顯著高于Ad-p53，其中KYSE150細胞對Ad-PUMA最為敏感，50MOI的Ad-PUMA感染細胞72小時便可抑制63.73％的細胞生長，而在相同的感染時間200MOI的Ad-p53對細胞的生長抑制率只有51.37％。
2.食管癌細胞系中Ad-PUMA與化療藥物抑制增殖的協(xié)同作用采用如前所述的MTT法檢測各種化療藥單獨作用各食管癌細胞系72hr的50％抑制劑量IC50(inhibitory concentration of 50％)。然后用固定劑量的Ad-PUMA與各化療藥聯(lián)合作用，計算作用72hr后在各食管癌細胞系中達到50％生長抑制時的藥物濃度。固定的Ad-PUMA劑量選取原則為該劑量Ad-PUMA單獨作用72hr細胞生長抑制率＜10％。根據(jù)公式(combination index＝Ac/Ae+Bc/Be，Ae和Be分別為兩因素各自單獨作用達到50％生長抑制時的濃度，Ac和Bc則分別為兩因素合用達到50％生長抑制時的各自濃度)計算合用指數(shù)，該指數(shù)＜1為協(xié)同，＝1為相加，＞1為拮抗。結(jié)果見下表3
表3食管癌細胞系中Ad-PUMA與化療藥抑制增殖的協(xié)同作用(IC50)
由此可見，較低感染復(fù)數(shù)的Ad-PUMA即可顯著增強各種化療藥物的敏感性，在各細胞系中化療藥物與Ad-PUMA合用后，IC50均有不同程度的降低(KYSE-510中的taxol除外)。根據(jù)計算出的合用指數(shù)可以看出，Ad-PUMA與各種化療藥均存在一定的協(xié)同作用，并且其中50％的合用指數(shù)＜0.5，表明協(xié)同作用十分顯著。
3.Ad-PUMA與化療藥物聯(lián)合抑制KYSE-150細胞平板集落形成采用平板集落形成實驗驗證Ad-PUMA與各種化療藥的協(xié)同作用，結(jié)果見附圖4?？梢?MOI Ad-PUMA與小劑量化療藥(1μM cDDP、0.5nM taxol、2μM 5-Fu)聯(lián)合作用便可顯著降低KYSE-150細胞的集落形成。
4.外源導(dǎo)入PUMA對細胞周期的影響收集不同處理因素作用48hr后的KYSE150細胞，應(yīng)用BD公司的FACSCalibur流式機，采用Cell Quest Mod Fit LT for Mac V3.0分析軟件檢測細胞周期，結(jié)果見附圖5，5MOI Ad-PUMA感染細胞48小時細胞周期的分布與對照的相同，2nM taxol和10μM 5-Fu單獨作用48小時細胞周期分別特異性的阻滯在G2/M期和S期，而5MOI的Ad-PUMA與上述化療藥物聯(lián)合應(yīng)用48小時，細胞周期的分布基本與各化療藥單獨作用時一致?？梢?，外源PUMA的導(dǎo)入并不改變各種化療藥本身對腫瘤細胞細胞周期的影響。
5.DAPI染色法檢測Ad-PUMA與化療藥物單獨及聯(lián)合作用的凋亡細胞百分比收集不同處理因素各相應(yīng)時間點的細胞，采用DAPI(4′-6-Diamidino-2-phenylindole)染色法檢測凋亡細胞百分比。如附圖6A所示，熒光顯微鏡下觀測DAPI染色后正常的細胞核核膜光滑，染色質(zhì)分布均勻；而凋亡的細胞染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀、出現(xiàn)凋亡小體。根據(jù)DAPI染色后計數(shù)的凋亡細胞率曲線來看50MOI Ad-PUMA感染KYSE150細胞18小時即有50.44％的細胞出現(xiàn)凋亡的細胞核的改變，而200MOI Ad-p53感染細胞48小時僅有47.98％的細胞呈現(xiàn)明顯的凋亡的細胞核的改變(見附圖6B、C)。5MOIAd-PUMA、4μMcDDP、2nM taxol、10μM 5-Fu單獨作用細胞36小時分別有19.46％、9.62％、9.94％、13.71％的細胞出現(xiàn)凋亡，而當上述三種化療藥仍以相同的濃度與5MOI Ad-PUMA聯(lián)合作用36小時，凋亡的細胞百分比則分別達到32.99％、34.72％、39.30％(見附圖6D)。這表明低感染強度的Ad-PUMA與化療藥聯(lián)合應(yīng)用便可顯著增強化療藥物誘導(dǎo)細胞凋亡的效果。
6.RT-PCR檢測Ad-PUMA與小劑量化療藥物聯(lián)合作用后PUMA的表達水平收集5MOI Ad-PUMA單獨、及與小劑量化療藥(4μM cDDP、2nM taxol、10μM5-Fu)聯(lián)合作用36hr后的KYSE-150細胞，提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后，采用PUMA的特異性引物(上游5’＞GTCCTCAGCCCTCGCTCT＜3’下游5’＞CTGCTGCTCCTCTTGTCTCC＜3’)檢測PUMA在mRNA水平的改變，結(jié)果見附圖7。可以看出，Ad-PUMA和小劑量各種化療藥均能使細胞PUMA mRNA表達，而聯(lián)合作用后PUMA在mRNA水平表達增高得更加明顯。
實施例四KYSE-150裸鼠移植瘤模型證實Ad-PUMA與化療藥物協(xié)同作用1.KYSE-150裸鼠移植瘤模型的建立將對數(shù)生長期的KYSE-150細胞消化后離心去除消化液，用含雙抗的Hank’s液洗2次，離心、計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1×107/ml，取200μl細胞懸液接種于裸鼠右腋下。裸鼠共35只，4～5周鼠齡，體重14g～16g，雌性。
2.移植瘤生長曲線待腫瘤長徑達5mm～7mm時，隨機將裸鼠分為7組。調(diào)整Ad-PUMA、Ad-p53滴度，使其達2×1010PFU/ml，每3天瘤體內(nèi)注射一次，每次50μl，共三次。cDDP采用腹腔注射，按3mg/kg體重給藥，給藥時間同腺病毒。從治療前一天開始，每3天用游標卡尺測量皮下移植瘤的長徑(a)和短徑(b)，按公式計算瘤體積V＝a×b2/2，繪制移植瘤的生長曲線，見附圖8?？梢?，Ad-PUMA單獨給藥即可顯著抑制移植瘤的生長，聯(lián)合cDDP后腫瘤生長更為緩慢，相同劑量的Ad-p53單獨及聯(lián)合cDDP給藥抑瘤效果均不如Ad-PUMA明顯。
3.移植瘤重量的測定在用藥的第18天處死裸鼠，剝?nèi)∧[瘤組織(見附圖9)，稱取瘤重，計算抑瘤率。詳細資料見下表表4不同處理組的瘤重及抑瘤率
從各組移植瘤的重量仍可以看出，Ad-PUMA單獨給藥即可達到48.24％的抑瘤率，聯(lián)合cDDP后抑瘤率可達56.24％，與對照組相比差異十分顯著，P值分別為0.001和＜0.001。盡管相同劑量的Ad-p53與cDDP聯(lián)合給藥抑瘤效果也顯著(P＝0.014)，但其抑瘤率只有32.68％。Ad-PUMA或Ad-p53與cDDP聯(lián)合給藥組與單獨注射腺病毒組相比，瘤重差異均不顯著(P值分別為0.223、0.606)，這可能是本研究采用的cDDP劑量低，導(dǎo)致聯(lián)合作用后的效果不甚明顯。
實施例五肺癌細胞系中Ad-PUMA與放射治療協(xié)同作用及其機制的研究1.肺癌細胞系中Ad-PUMA增強其放療敏感性的研究采用與實施例一相同的方法獲得Ad-PUMA，以10MOI的感染強度感染A549細胞，24hr后接受8Gy的γ射線照射。繼續(xù)培養(yǎng)48hr后采用MTS法檢測各孔細胞的吸光度，以單獨γ射線照射對細胞生長的抑制率為參照，計算Ad-PUMA與放射治療合用后相對的細胞生長抑制倍數(shù)。每一處理組設(shè)3個平行孔，重復(fù)實驗3次。結(jié)果見附圖1A，Ad-PUMA與放療聯(lián)用后細胞生長抑制率是單獨放療處理8倍以上。這表明Ad-PUMA具有增強肺癌細胞系A(chǔ)549對放療敏感性的作用。
2.肺癌細胞系中Ad-PUMA增強其放療敏感性的機制的研究A549細胞經(jīng)10MOI Ad-PUMA或Ad-ΔBH3感染24小時后，經(jīng)8Gyγ射線照射后在指定時間點收集懸浮和貼壁細胞，通過PI染色檢測核片段化計數(shù)凋亡細胞百分比。每次計數(shù)至少300個細胞，重復(fù)試驗3次，取均值。如圖2B所示，單獨用Ad-PUMA(10MOI)或γ射線(8Gy)處理A549細胞48小時未誘導(dǎo)顯著的凋亡，而二者聯(lián)合處理A549細胞48小時則近70％的細胞發(fā)生凋亡。但相同劑量的Ad-ΔBH3聯(lián)合γ射線則未對后者誘導(dǎo)凋亡的能力產(chǎn)生影響。由此可見，BH3結(jié)構(gòu)域是PUMA發(fā)揮其放療增敏作用所必需的，細胞中成功表達BH3結(jié)構(gòu)域便可顯著增強放療誘導(dǎo)凋亡的能力。
實施例六體內(nèi)、外實驗證實BH3結(jié)構(gòu)域是PUMA發(fā)揮其功能所必需的1.Ad-PUMA通過誘導(dǎo)凋亡顯著抑制各種肺癌細胞生長，而Ad-ΔBH3無效采用與實施例一相同的方法獲得Ad-PUMA，Ad-ΔBH3(缺少氨基酸序列為LRRMADDLN的BH3結(jié)構(gòu)域，余與PUMA相同)，分別以100MOI的感染強度感染A549、Calu 1、128.88T、H1299、H1752、DMS53肺癌細胞。感染后48小時，采用MTS方法檢測細胞生長。以未處理的細胞為對照，視其生長率為100％。為闡明Ad-PUMA、Ad-ΔBH3對細胞生長抑制效果的差異的機制，我們在病毒感染H1299細胞后48小時用PI(碘化丙錠)對其進行核染，在相差顯微鏡和熒光顯微鏡下進行觀察。并且于Ad-PUMA、Ad-ΔBH3(100MOI)感染H1299細胞24小時后，進行PI和Annexin V/DAPI染色，利用流式細胞儀檢測亞G1期細胞百分比和早期凋亡細胞百分比(R4，右下區(qū))。
結(jié)果在所檢測的6種肺癌細胞系中，與未處理的細胞相比Ad-PUMA均可引起顯著的生長抑制(60％--100％)，而Ad-ΔBH3對細胞生長均無顯著影響(附圖10A)。Ad-PUMA感染的細胞呈現(xiàn)出明顯的細胞膜發(fā)泡，染色質(zhì)凝集，核片斷化等凋亡特征(附圖10B)，而Ad-ΔBH3感染的細胞則不出現(xiàn)上述特征。細胞周期分析和Annexin V染色均證實Ad-PUMA誘導(dǎo)的凋亡顯著，分別為43％和56％，相同情況下Ad-ΔBH3感染的細胞則分別只有2.4％和8％的細胞出現(xiàn)凋亡(附圖10C)。這說明外源導(dǎo)入PUMA通過誘導(dǎo)凋亡可顯著抑制肺癌細胞的生長，位于PUMA(全長193個氨基酸)氨基酸序列141至149位的BH3結(jié)構(gòu)域具有強大的促凋亡作用，是PUMA發(fā)揮其促凋亡作用所必需的。
2.Ad-PUMA、Ad-p53對H1299和A549細胞生長抑制的比較H1299和A549細胞被指定感染復(fù)數(shù)的Ad-PUMA，Ad-p53或感染(H1299細胞0、2、5、10MOI；A549細胞0、20、50、100MOI)48hrs，以未處理細胞作為對照，采用MTS方法進行檢測，計算Ad-PUMA、Ad-p53、Ad-ΔBH3在不同感染復(fù)數(shù)下的相對生長率。由附圖11可見，10MOI Ad-PUMA感染H1299后48小時，約15％的細胞存活；100MOIAd-PUMA感染A549細胞后48小時，約40％的細胞存活。各相應(yīng)劑量的Ad-p53對細胞生長均無顯著影響，Ad-ΔBH3則對細胞生長基本無影響。這表明相同劑量的Ad-PUMA比Ad-p53的療效更顯著，而缺失BH3結(jié)構(gòu)域則使其功能喪失。
3.體內(nèi)實驗證實BH3結(jié)構(gòu)域是PUMA發(fā)揮其功能所必需的為檢驗外源導(dǎo)入的PUMA(Ad-PUMA)及缺失BH3的PUMA(Ad-ΔBH3)在體內(nèi)是否有抗腫瘤活性，我們將4×106個A549或H1299肺癌細胞注射入5-6周齡胸腺缺失的雌性裸鼠兩側(cè)部皮下，當腫瘤長至50-100mm3時開始治療實驗，每次瘤內(nèi)注射含有5×108pfuAd-PUMA或Ad-ΔBH3的100μl PBS溶液，每隔一天治療一次，共三次。為避免不同動物間潛在的個體差異對病毒療效的影響，Ad-PUMA和Ad-ΔBH3被分別注射至同一只裸鼠不同側(cè)部的腫瘤。將第一次治療時記為0天，每2天用游標卡尺測量皮下移植瘤的長徑(a)和短徑(b)，按公式計算瘤體積V＝a×b2/2，繪制移植瘤的生長曲線，見附圖12A。與單獨注射PBS相比Ad-ΔBH3對腫瘤生長無顯著影響，在治療后的22天腫瘤體積達到初始體積的8倍。給予Ad-PUMA治療的腫瘤生長緩慢，與Ad-ΔBH3相比Ad-PUMA抑制腫瘤生長至少達到80％(P＜0.01)。在用藥的第22天處死裸鼠，剝?nèi)∧[瘤組織(見附圖12B)，圖12B上半部分顯示A549荷瘤小鼠Ad-PUMA及Ad-ΔBH3治療前和治療后22天的狀況。
我們也對H1299細胞建立的裸鼠移植瘤進行治療實驗，每隔2天注射一次含有5×108pfu Ad-PUMA或Ad-ΔBH3的100μl PBS溶液，共三次。每3天測量瘤子大小，繪制移植瘤生長曲線，可見Ad-PUMA抑制腫瘤生長達80％以上(附圖12C)。在第二次注射后的48小時剖取腫瘤，在熒光顯微鏡下觀察腫瘤的冰凍切片以確定腺病毒感染效率(GFP，200×)?？梢娭委熀蟮哪[瘤組織中GFP高表達，提示腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的目的基因高效表達(附圖12D)。但高效表達PUMA的細胞會快速凋亡，致使Ad-PUMA治療后的腫瘤組織經(jīng)H&E染色(400×)顯示有大量的細胞缺失，而在Ad-ΔBH3或PBS處理的組織中則細胞完好(附圖14D)。TUNEL染色(TUNEL，紅色，200×；DAPI復(fù)染，藍色)表明給予Ad-PUMA治療的腫瘤大量細胞發(fā)生凋亡，而用Ad-ΔBH3或PBS處理的腫瘤組織中幾乎不存在凋亡細胞(附圖12D)。這表明PUMA能通過誘導(dǎo)凋亡有效抑制腫瘤的生長，而缺失BH3后PUMA的抑瘤作用不復(fù)存在。
權(quán)利要求
1.含有BH3結(jié)構(gòu)域的cDNA的PUMA基因及其表達的蛋白在制備增加腫瘤細胞對化療藥物和放射治療的敏感性藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的藥物包括鉑類順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、奈達鉑；微管抑制劑紫杉醇、泰索帝、長春堿、長春新堿、長春瑞賓；抗代謝類氟尿嘧啶、硫鳥嘌呤、洛拉曲克、替加氟、卡莫氟、氟鐵龍、優(yōu)福定、阿糖胞苷。拓撲異構(gòu)酶II抑制劑鬼臼乙叉甙、鬼臼噻吩甙。蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素阿霉素、柔紅霉素、阿克拉霉素、表阿霉素、去甲柔紅霉素、米托蒽醌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的藥物包括順鉑、紫杉醇、五氟尿嘧啶、奧沙利鉑、鬼臼乙叉甙、阿霉素及放射治療γ射線。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的腫瘤為實體腫瘤，其包括乳腺癌、宮頸癌、肺癌、肝癌、胰腺癌和食管癌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的藥物是PUMA基因?qū)胼d體形成的藥物或包含有PUMABH3結(jié)構(gòu)域(LRRMADDLN)的cDNA及蛋白形成的藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述的載體包括可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達質(zhì)粒、增殖型及復(fù)制缺陷型腺病毒、單純皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒、痘苗病毒載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的藥物是Ad-PUMA。
全文摘要
本發(fā)明涉及PUMA基因的新用途，特別是外源PUMA基因或包含有PUMA BH3結(jié)構(gòu)域的cDNA及蛋白的導(dǎo)入在制備增加腫瘤細胞對化療藥物和放射治療的敏感性藥物中的用途。
文檔編號A61K31/7068GK1981872SQ20051013027
公開日2007年6月20日 申請日期2005年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月12日
發(fā)明者林晨, 詹啟敏, 王海娟, 張 林, 余健 申請人:中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所