一種丹皮有效組分、制劑及其制備方法與用途的制作方法

專利名稱：一種丹皮有效組分、制劑及其制備方法與用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療心血管疾病的中藥提取物，具體地說涉及從丹皮中提取的有效組分，制劑及其制備方法與用途，該有效組分主要含有氧化苯甲酰芍藥苷(Benzoyloxypaeoniflorin)。
背景技術：
冠心病和心絞痛是危害人類健康的“第一殺手”，近年來，隨著我國人口老年化以及人們工作、生活、飲食結構及環境等的變化，冠心病等心腦血管疾病的發生率也逐年增多，嚴重威脅著人民的身心健康。天然產物中許多活性物質具有抗心肌缺血、缺氧作用，其中一些已開發成治療冠心病和心絞痛的新藥，如治療冠心病的藥物地奧心血康，它是由從中藥中提取的8種甾體皂甙制成的純中藥制劑；心達康是以沙棘為原料提取加工而成的純天然藥物，其有效成分為沙棘總黃酮。因而從天然產物中尋找具有抗心肌缺血、缺氧生理活性的有效物質，是發現、開發新藥的有效途徑之一。我國藥用生物資源十分豐富，其生理活性物質是研究和發現新藥先導化學物，開發新藥的天然寶庫。目前，我國從天然產物中提取活性物質，用于開發成治療冠心病、安全性好、毒性低的新藥還很少，從天然產物中提取活性物質，開發成具有抗心肌缺血，用于治療冠心病和心絞痛的新藥，具有重要應用價值和廣闊發展前景。
丹皮又名牡丹皮，系雙子葉植物藥毛茛科植物牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)的根皮。分布河北、河南、山東、四川、陜西、甘肅等地。全國各地均有栽培，藥材主產安徽、四川、甘肅、陜西、湖北、湖南、山東、貴州等地，此外，云南、浙江亦產。其性微寒，味辛苦，涼，入心、肝、腎經，具有清熱，涼血，和血，消瘀的功效。丹皮炮制最早見于我國梁代陶宏景所撰《集注》中，認為“皆促破，去心。”《本草綱目》等醫書中記載“丹皮木心不入藥，需去之。”研究表明丹皮含丹皮酚(Paeonol)、芍藥甙(Paeoniflorin)、羥基芍藥甙、苯甲酰芍藥甙(Benzoylpaeoniflorin)、苯甲酰羥基芍藥甙、芍藥苷元(Paeoniflorigenone)、6-羥基香豆素(6-hydroxycoumarin)和沒食子酸(GallicAcid)，以及苯甲酸、植物甾醇、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖等。揮發油中含有苯甲酸(Benzoic Acid)、十四烷烴(Tetradecane)、2-羥基-4-甲氧基-苯乙酮(2-hydroxy-4-methoxy acetophenone)、2，6-雙特丁基對苯醌(2.6-ditert-butyl-p-Benzoquinone)、鄰苯二甲酸二乙酯(Diethyl Phthalate)、十四酸異丙酯(Isopropyl Myristate)等化合物(陳悅嬌等，廣州食品工業科技，2002，18(4)36-37)。吳少華等人首次從丹皮中分離得到了以下五種化合物白樺脂酸(Betulinic Acid)、白樺脂醇(Betulin)，齊墩果酸(OleanolicAcid)、3β，23-dihydroxy-30-norolean-12，20(29)-dien-28-oic acid、3-O-methylpaeonisuffral(吳少華等，中草藥，2002，33(8)679-680)。
丹皮對實驗性心肌缺血有減輕損傷程度作用，并能夠降低心肌耗氧量，增加冠脈流量，認為丹皮有調節血行，疏通血脈之作用，因而對心肌缺血有保護作用(馬玉玲等，山西醫藥雜志，1984，13(4)212-214)。

發明內容
本發明的目的在于提供一種丹皮有效組分。
本發明的另一目的在于提供該丹皮有效組分的制備方法及其用途。
本發明還提供了包含丹皮有效組分的制劑。
本發明以如下技術方案予以實施本發明的丹皮有效組分中，主要含有氧化苯甲酰芍藥苷。其中，以重量百分比計，氧化苯甲酰芍藥苷的含量為75～85％。
優選的，本發明的丹皮有效組分中，以重量百分比計，氧化苯甲酰芍藥苷的含量為77～83％。
最佳的，本發明的丹皮有效組分中，以重量百分比計，氧化苯甲酰芍藥苷的含量為79～81％。
本發明的丹皮有效組分的制備方法，包括下列步驟將丹皮藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液I，棄之。藥渣加入乙醇，加熱提取得提取液II，將提取液II濃縮成浸膏，用甲醇溶解浸膏，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用低濃度甲醇作為流動相，得洗脫液I，然后改換高濃度甲醇作為流動相，得洗脫液II，濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為半制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫。
優選的，本發明的丹皮有效組分制備方法，包括下列步驟將丹皮藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶0.8～1.2)，加熱回流0.8～1.2小時，提取1～3次，合并濾液得提取液I，棄之。在藥渣中加入60％～80％乙醇，加熱回流0.8～1.2小時，提取1～3次，濾液合并得提取液II，將提取液II濃縮成浸膏，用40％～60％甲醇溶解浸膏，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用3％～8％甲醇作為流動相，得洗脫液I，然后改換50％～70％甲醇作為流動相，得洗脫液II，濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為半制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為2.8～3.2ml/min，柱溫為室溫。
最佳的，本發明的丹皮有效組分制備方法，包括下列步驟取丹皮藥材，將其粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶1)，加熱回流1小時，提取2次，濾液合并得提取液I。藥渣加入70％乙醇，加熱回流1小時，提取2次，濾液合并得提取液II，將提取液II濃縮成浸膏，用50％甲醇溶解浸膏，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用5％甲醇作為流動相，得洗脫液I，然后改換60％甲醇作為流動相，得洗脫液II，濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到的樣品制備色譜的分離條件色譜柱為半制備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)，流動相為水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相A為90％的水溶液、流動相B為10％的乙腈溶液；8分鐘時，流動相A為81％的水溶液、流動相B為19％的乙腈溶液；60分鐘時，流動相A為65％的水溶液、流動相B為35％的乙腈溶液；流速為3ml/min，柱溫為室溫。樣品用100％乙醇溶解，經制備液相色譜分離，在時間段7.7～10.7min收集溶液，溶液經濃縮干燥后得到有效組分。
本發明的丹皮有效組分可以作為活性成分，加入藥劑學上接受的輔料，按照藥劑學上記載的制劑的制備方法制成制劑。
本發明的丹皮有效組分還可以作為活性成分之一，加入藥劑學上接受的輔料，按照藥劑學上記載的制劑的制備方法制成制劑。
所述的制劑包括注射液、滴注液、粉針劑、顆粒劑、片劑、沖劑、散劑、口服液、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口含劑、顆粒劑、丸劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、崩解劑、口崩片、微丸等。
本發明的丹皮有效組分及其制劑可在制備治療、預防心血管疾病藥物中進行應用。
本發明的有益效果為1.本發明的提取分離工藝中使用了正相硅膠柱，能有效地除去糖、蛋白質、氨基酸等雜質，提高有效成分的含量，同時采用了制備色譜，能快速準確的得到有效成分。
2.本發明提供的丹皮有效組分化學成分簡單明確，在藥理研究上更易于闡明其作用機制，在生產中更易于藥物的質量控制。


圖1為丹皮有效組分的HPLC分析圖。
具體實施例方式
下面將結合本發明的實施例進一步詳細說明本發明的實質內容，該實施例僅用于說明本發明而對本發明并沒有限制。
實施例一 丹皮有效組分的制備將200g丹皮藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液I，棄之。藥渣加入乙醇，加熱提取得提取液II，將提取液II濃縮成浸膏42g，用甲醇溶解浸膏，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用低濃度甲醇作為流動相，得洗脫液I，然后改換高濃度甲醇作為流動相，得洗脫液II，濃縮干燥后得樣品20.16g；用制備液相色譜繼續分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為半制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫。樣品用100％乙醇溶解，經制備液相色譜分離，在時間段48.5-58min收集溶液，溶液經濃縮干燥后得到有效組分1.68g。
實施例二 丹皮有效組分的制備將500g丹皮藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶0.8～1.2)，加熱回流0.8～1.2小時，提取1～3次，合并濾液得提取液I，棄之。在藥渣中加入60％～80％乙醇，加熱回流0.8～1.2小時，提取1～3次，濾液合并得提取液II，將提取液II濃縮成浸膏106g，用40％～60％甲醇溶解浸膏，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用3％～8％甲醇作為流動相，得洗脫液I，然后改換50％～70％甲醇作為流動相，得洗脫液II，濃縮干燥后得樣品50.62g；用制備液相色譜繼續分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為半制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為2.8～3.2ml/min，柱溫為室溫。樣品用100％乙醇溶解，經制備液相色譜分離，在時間段48.5-58min收集溶液，溶液經濃縮干燥后得到有效組分4.85g。
實施例三 丹皮有效組分的制備取丹皮藥材250g，將其粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶1)，加熱回流1小時，提取2次，濾液合并得提取液I。藥渣加入70％乙醇，加熱回流1小時，提取2次，濾液合并得提取液II，將提取液II濃縮成浸膏55g，用50％甲醇溶解浸膏，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用5％甲醇作為流動相，得洗脫液I，然后改換60％甲醇作為流動相，得洗脫液II，濃縮干燥后得樣品26.48g。用制備液相色譜繼續分離得到的樣品。制備色譜的分離條件色譜柱為漢邦半制備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)，流動相為水(A)和乙腈(B)，洗脫梯度見表2，流速為3ml/min，柱溫為室溫。樣品用100％乙醇溶解，經制備液相色譜分離，在時間段48.5-58min收集溶液，溶液經濃縮干燥后得到有效組分2.23g。
實施例四 丹皮有效組分的HPLC分析(1)丹皮提取物中氧化苯甲酰芍藥苷的含量測定(高效液相色譜法)色譜條件色譜柱Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；采用梯度洗脫，流動相A相為0.2％冰醋酸水溶液，流動相B相為含0.2％冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相A為90％的0.2％冰醋酸水溶液、流動相B為10％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；10分鐘時，流動相A為70％的0.2％冰醋酸水溶液、流動相B為30％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；30分鐘時，流動相A為50％的0.2％冰醋酸水溶液、流動相B為50％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；流速0.5mL·min-1；檢測波長全波長；柱溫30℃；ELSD條件漂移管溫度105℃；氮氣流速1.8L/min供試品溶液的制備稱取本品約1.53mg，用甲醇溶液溶解1ml容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。
測定方法精密吸取供試品溶液5ul，注入液相色譜儀，測定，即得。
(2)上述丹皮提取物HPLC-ELSD指紋圖譜測定方法參見(1)上述丹皮提取物中的氧化苯甲酰芍藥苷含量測定(高效液相色譜法)。記錄色譜時間為30分鐘。
分析結果丹皮有效組分的HPLC-ELSD分析譜圖見圖1。圖1中的1號峰為氧化苯甲酰芍藥苷。
氧化苯甲酰芍藥苷結構式 實施例五 滴丸的制備取實施例三的丹皮有效組分1g與10.5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料后移至滴丸滴灌中，藥液滴至6～8℃液體石蠟中，除油，制得滴丸800粒。
實施例六 凍干粉針劑的制備取實施例三的丹皮有效組分1g、葡萄糖5.5g、硫代硫酸鈉0.9g和蒸餾水1ml，上述組分混合均勻后，冷凍干燥，分裝600支，即得。
實施例七 凍干粉針劑的制備取降香油1.5g，加入到13ml飽和的羥丙基β-環糊精中，攪拌溶解，濾過，濾液低溫干燥得降香油和羥丙基β-環糊精的包合物粉末。除上述降香油合羥丙基β-環糊精的包合物粉末外，再取實施例三的丹皮提取物1g、甘露醇5.5g、依地酸鈣鈉0.9g和蒸餾水2ml，上述組分混勻后，冷凍干燥，分裝500支，即得。
實施例八 丹皮有效組分的藥理實驗1藥理模型乳鼠心肌細胞缺血缺氧模型原代心肌細胞培養出生1～3天SD乳鼠處死后，取心臟，經PBS液清洗后減成1mm3左右的碎塊。用0.125％胰蛋白酶(Sigma，USA)+0.05％膠原酶II(Gibco，USA)于37度消化3～4次。差速貼壁法分離成纖維細胞1.5小時后，細胞懸液轉移至48孔板中(每孔約4×105細胞)。經DMEM(Gibco，USA)加10％胎牛血清(Falcon，USA)培養3-6天的細胞供藥效篩選。篩選前1天替換為無血清培養液。培養3～6天的心肌細胞，PBS洗滌后加入含藥培養液。置于95％N2和5％CO2培養箱中缺氧6小時。然后在CO2培養箱中復氧3小時。取細胞上清液測定LDH含量。
給藥方案提取得到的丹皮有效組分用無糖Hanks液配成10-4g/mL供試液，脂溶性成分可加入少量DMSO助溶(DMSO終濃度控制在0.2％以下)。各組分在培養液中的終濃度控制在10-5g/mL。
乳酸脫氫酶含量測定細胞培養液中乳酸脫氫酶含量能夠表示細胞損傷程度。漏入上清液中的乳酸脫氫酶含量越高，表明細胞損傷也顯著。乳酸脫氫酶測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。測定方法為取30微升細胞上清液，加入50微升基質緩沖液及10微升乳酸脫氫酶輔酶，37度振蕩15分鐘，再加入50微升2，4-二硝基苯肼，37度振蕩15分鐘。平行空白。取反應液50微升加入200微升0.4mol/L氫氧化鈉溶液，靜置3～4分鐘后，用酶標儀于450nm測定光度值。
藥效結果所有數據用均值±方差表示。采用單邊方差分析和T檢驗進行統計學分析。與模型組相比，P＜0.05認為顯著有效。藥效結果見表1。根據心肌細胞乳酸脫氫酶(LDH)檢測結果，丹皮有效組分對降低LDH釋放有非常顯著效果。
表1

2藥理模型臍靜脈內皮細胞缺氧復氧模型原代臍靜脈內皮細胞培養取健康新生兒臍帶，用30～50mlHanks液洗凈靜脈血管內的殘留血跡。視臍帶長度加入相應量的0.1％膠原酶I，轉入培養箱消化15～20分鐘。隨后將臍帶內消化液小心收集到燒杯中，并用Hanks液將燒杯潤洗兩次，一并收集到燒杯中分裝于離心管，900rpm離心10分鐘。吸去上清液，用M199培養液(含10％胎牛血清，100U/ml雙抗，0.15mg/ml Heparin，10uM VC)充分溶解沉淀。將所得細胞懸液分裝于5cm2培養瓶，置于培養箱內培養。第二天換成采用含30ug/ml ECGS的M199培養液，之后每三天換一次培養液直至細胞鋪滿底面。所用細胞均為原代內皮細胞。造模前將培養瓶內細胞接種至96孔板并培養一天，所用細胞量為3.5～4萬/孔。造模時，吸棄舊的M199培養液，加入含藥無酚紅M199培養液，每孔總量為100ul。置于95％N2和5％CO2培養箱中缺氧12小時，然后在CO2培養箱中復氧2小時。取細胞上清液測定LDH含量和NO含量。
給藥方案 提取得到的三七有效組分用無糖Hanks液配成10-4g/mL供試液，脂溶性成分可加入少量DMSO助溶(DMSO終濃度控制在0.2％以下)。各組分在無酚紅M199培養液中的終濃度控制在10-5g/mL。
NO含量測定采用Greiss試劑法測定，取90ul細胞上清液，加入等量Greiss試劑，室溫下靜置10分鐘，用酶標儀于550nm測定吸光度值。
藥效結果所有數據用均值±方差表示。采用單邊方差分析和T檢驗進行統計學分析。與模型組相比，P＜0.05認為顯著有效。藥效結果見表2。根據內皮細胞NO含量檢測結果，枳殼有效組分對抑制內皮細胞缺氧-復氧后NO過度表達有非常顯著效果。
表2

權利要求
1.一種丹皮有效組分，其特征在于，以重量百分比計，氧化苯甲酰芍藥苷的含量為75～85％。
2.如權利要求1所述的丹皮有效組分，以重量百分比計，氧化苯甲酰芍藥苷的含量為77～83％。
3.如權利要求1所述的丹皮有效組分，以重量百分比計，氧化苯甲酰芍藥苷的含量為79～81％。
4.權利要求1-3任一權利要求所述的丹皮有效組分的制備方法，包括下列步驟將丹皮藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液I，棄之。藥渣加入乙醇，加熱提取得提取液II，將提取液II濃縮成浸膏，用甲醇溶解浸膏，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用低濃度甲醇作為流動相，得洗脫液I，然后改換高濃度甲醇作為流動相，得洗脫液II，濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為半制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫。
5.如權利要求書4所述的丹皮有效組分的制備方法，包括下列步驟將丹皮藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加熱回流0.8～1.2小時，提取1～3次，合并濾液得提取液I，棄之。在藥渣中加入60％～80％乙醇，加熱回流0.8～1.2小時，提取1～3次，濾液合并得提取液II，將提取液II濃縮成浸膏，用40％～60％甲醇溶解浸膏，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用3％～8％甲醇作為流動相，得洗脫液I，然后改換50％～70％甲醇作為流動相，得洗脫液II，濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為半制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為2.8～3.2ml/min，柱溫為室溫。
6.如權利要求5所述的丹皮有效組分的制備方法，其中所述的乙酸乙酯和乙醇的體積比為1∶0.8～1.2。
7.如權利要求書4所述的丹皮有效組分的制備方法，包括下列步驟取丹皮藥材，將其粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加熱回流1小時，提取2次，濾液合并得提取液I。藥渣加入70％乙醇，加熱回流1小時，提取2次，濾液合并得提取液II，將提取液II濃縮成浸膏，用50％甲醇溶解浸膏，采用ODS-C18柱對其進行分離，首先用5％甲醇作為流動相，得洗脫液I，然后改換60％甲醇作為流動相，得洗脫液II，濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到的樣品制備色譜的分離條件色譜柱為半制備柱(LichrospherC18；10.0mm×250mm，5μm)，流動相為水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相A為90％的水溶液、流動相B為10％的乙腈溶液；8分鐘時，流動相A為81％的水溶液、流動相B為19％的乙腈溶液；60分鐘時，流動相A為65％的水溶液、流動相B為35％的乙腈溶液；流速為3ml/min，柱溫為室溫；樣品用100％乙醇溶解，經制備液相色譜分離，在時間段48.5～58.0min收集溶液，溶液經濃縮干燥后得到有效組分。
8.如權利要求7所述的丹皮有效組分的制備方法，其中所述的乙酸乙酯和乙醇的體積比為1∶1。
9.含有權利要求1-3任一權利要求所述的丹皮有效組分的藥用制劑，其特征是，按照藥劑學允許的制備方法制成藥劑學接受的任一藥用制劑。
10.權利要求1-3任一權利要求所述的丹皮有效組分在制備治療和預防心血管疾病藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種丹皮有效組分，制劑及其制備方法與用途。以重量百分比計，本發明的丹皮有效組分含有75～85％的氧化苯甲酰芍藥苷。本發明的丹皮有效組分的制備方法包括下列步驟將丹皮藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液I，棄之。藥渣加入乙醇，加熱提取得提取液II，將提取液II濃縮成浸膏，用甲醇溶解浸膏，采用ODS－C18柱對其進行分離，首先用低濃度甲醇作為流動相，得洗脫液I，然后改換高濃度甲醇作為流動相，得洗脫液II，濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到的樣品，即得。本發明提供的丹皮有效組分化學成分簡單明確，在藥理研究上更易于闡明其作用機制，在生產中更易于藥物的質量控制。
文檔編號A61P9/10GK1981821SQ20051012235
公開日2007年6月20日 申請日期2005年12月14日 優先權日2005年12月14日
發明者程翼宇, 賀慶, 王毅, 王學偉, 李云飛, 葛志偉, 胡興江 申請人:天津天士力現代中藥研究開發有限公司