煅燒骨粉的制備方法在骨缺損修復中的用途的制作方法

專利名稱：煅燒骨粉的制備方法在骨缺損修復中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種引導骨再生的支架材料的制備方法，尤其涉及一種煅燒骨粉的制備方法及其在骨缺損修復中的用途，屬于醫用衛生材料制備領域。
背景技術：
由于自體骨移植和同種異體骨移植在應用上的限制，使骨缺損的修復成為多年來臨床治療的難題。用人工材料取代二者應用于臨床是當前在骨移植領域研究的主要方向，也是頜面外科、修復外科、骨外科的主要研究內容。
目前骨組織工程中采用的支架材料種類繁多，雖各有優點，但均有無法克服的不足，因而限制了材料的發展。煅燒骨是唯一擁有天然骨小梁結構和骨無機物晶體結構的生物材料，其作為引導骨組織再生術的支架材料，越來越引起人們的重視。其結構式同羥基磷灰石，有一定的硬度和強度、易于塑形且來源豐富，解決了人工合成材料在孔隙率、孔隙交通、孔隙大小等方面的制作難題。而且煅燒骨粉在制備的過程中經過了一定的物理化學方法處理，并經過高溫煅燒，消除了抗原性，解決了生物相容性的問題。

發明內容
本發明的目的在于提供一種煅燒骨粉的制備方法，解決了其它骨組織支架材料的抗原性和生物相容性的問題。
本發明還提供了該煅燒骨粉在骨缺損中的用途。
本發明的煅燒骨粉是通過以下方法制備的A、取哺乳動物骨的松質骨部分切成小塊；B、將切成小塊的骨進行水煮、干燥；C、將水煮、干燥后的骨進行酸、堿處理，并用二次蒸餾水清洗數次，至PH值為7后干燥；D、將上述制備好的骨，放入高溫爐中在600-1000℃煅燒。
本發明的最佳技術方案是高溫爐煅燒過程中充入氧氣，溫度控制為700-900℃，煅燒2-3次，每次3-5小時。
本發明所制備的牛骨粉經能譜分析、X線衍射及掃描電鏡觀察顯示其為無有機質，具有完整三維交通的松質骨結構。在結構上符合理想骨缺損修復材料要求。
通過兔骨髓基質干細胞與異種煅燒骨粉體外復合試驗，證明本發明制備的骨粉生物相容性好，對細胞無不良刺激，材料沒有細胞毒性。因此本發明研制的異種煅燒骨粉可作為優良的骨替代材料，構建組織化人工骨。動物實驗結果顯示本發明的骨粉組織相容性好，在植入體內早期亦未見有明顯的淋巴細胞浸潤，且成骨速度較快，骨缺損是以膜內化骨的方式愈合，未見軟骨化骨。
本方法所制備的骨粉具有良好的抗壓能力，且骨粉是經過高溫煅燒的純無機物質，不存在任何抗原物質。掃描電鏡照片結果顯示，骨粉保留了天然骨的多孔結構及骨小梁，與人體骨結構相似、內表面積大、孔隙間相互交通，有利于成骨細胞的粘附與生長，有利于纖維及血管長入。另外骨粉塑形能力強，可根據原來骨的形態塑形，可操作性好。將從兔的骨髓間充質干細胞定向分化來的成骨細胞與煅燒骨粉共同培養后，掃描電鏡下觀察可見骨粉表面有大量的成骨細胞吸附，生長狀態良好，形態正常，數量較多，且與骨結合的緊密。這說明本實驗研制的骨粉不僅生物相容好，可做為骨缺損修復支架，也可以作為骨組織工程的載體使用。以后可通過對成骨細胞相關基因表達檢測該骨粉的體內成骨效果本發明的優點是提供了一種較為理想的骨缺損修復材料的制備方法，煅燒骨粉主要用于骨缺損的修補，尤其適用于牙槽嵴的擴展和重建治療、填充牙周部位的骨缺損，截根術、囊腫切除術后的缺損充填，填充拔牙窩，以保持牙槽嵴形態等。煅燒塊狀骨不易塑形，很難修復特殊部位的骨缺損。如下頜骨、上頜竇底等部位的骨缺損。
說明書附1A、1本發明骨粉的X-ray衍射譜2A、2B本發明骨粉的紅外譜3本發明煅燒骨的電鏡4DMEM培養7天的骨髓間質干細胞(40×)圖5誘導培養21天后的骨髓間質干細胞(VonKossa染色，40×)圖6煅燒骨粉與兔成骨細胞共同培養5天(40×)
圖7成骨細胞與煅燒牛骨材料復合圖8煅燒骨粉治療家兔顱骨損傷12周時骨組織的X線圖片圖9A煅燒骨粉未見生物膜治療家兔顱骨損傷12周時骨組織的組織學變化圖9B煅燒骨粉治療家兔顱骨損傷12周時骨組織的組織學變化
具體實施例方式通過以下實施例進一步舉例描述本發明，并不以任何方式限制本發明，在不背離本發明的技術解決方案的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實現的任何改動或改變都將落入本發明的權利要求范圍之內。
實施例1煅燒骨的前處理遵循所選取骨的強度和空隙率基本與人骨相類似的原則，選取一歲齡牛脊骨作為處理的對象。
將剛處死的牛脊骨切成10mm3小塊，用清水沖洗數次，后投入鍋中水煮，這一過程的主要目的是去除附著在牛骨上面的有機質，如明膠、骨髓、蛋白質等，此過程需用4～5小時。
將上述處理干凈的牛骨在干燥箱中干燥后，用粉碎機將牛骨粉碎成約為5mm3小塊后放入鍋中再次水煮，將其中的大部分有機質去除，此過程大約需3h期間換水3次，干燥備用。
將上述牛骨置入1MNaOH或碳酸氫鈉溶液中浸泡30分鐘，以去除剩余有機質。
將上述的牛骨塊置入30％H2O2中浸泡30分鐘，氧化和分解殘留在骨內的微量有機質，并用二次蒸餾水清洗數次，至PH值為7，干燥備用。
通過上述的步驟，可以將其中絕大部分的有機質和有害物質去除。
實施例2煅燒骨粉的制備方法制備好的牛骨塊放入高溫爐中(型號Tube Furnace 21100，Germen)不同溫度下在下煅燒。下面僅將不同溫度下的實驗情況列表比較(見表1)表1.牛骨物性與煅燒溫度的關系


本實驗通過對不同煅燒溫度的骨粉進行比較，煅燒溫度為150℃時，孔隙內有軟組織殘留。動物實驗證明，該條件下燒制的骨粉骨引導作用較好。在植入早期(3周)有淋巴細胞及多核巨細胞反應，骨生長情況良好，在骨發生中心，成骨細胞較多，分泌旺盛；6周時淋巴細胞開始減少直至消失。說明煅燒溫度為150℃的骨粉，雖然內部存在著軟組織，但經過前期處理后，其排異反應已明顯消除，且不影響其骨傳導作用(根據灰度測定150℃、800℃骨粉在不同時間的吸收情況將在下面進一步討論)。
煅燒至550℃時孔隙內不存在有機質，但表面色澤呈灰色，證明有碳化物存在，尚未被充分氧化。在煅燒過程中加氧后骨表面顏色變淺，接近正常。
煅燒至800℃時骨粉呈乳白色，電鏡觀察，孔隙內部無軟組織存在，孔隙清晰，孔徑為300-550μm，孔隙交通好，保持骨的天然結構。體外與兔成骨細胞共同培養，成骨細胞生長狀態良好，細胞與骨結合緊密，數量較多，說明該骨粉能作為骨組織工程的支架使用。動物體內實驗證明高溫煅燒的骨粉基本上無排異反應。
結論于600℃以下溫度所得的骨塊，由于煅燒不充分，樣品均為黑、灰色；600℃以上煅燒充分，致有機成分完全氧化，樣品為白色的，其強度有少許下降，但足以滿足需要。
實驗例1煅燒骨粉的X-射線(粉末)衍射分析儀器型號理學D/max 2500V PC X-ray衍射儀。
工作條件Cu耙、40kv、200mA，標準樣品臺連續式掃描。
掃描速度4.000deg/min。
送樣寬度0.020deg。
掃描軸2Theta/thetan。
掃描范圍5.000≥60.000deg。
將本發明的煅燒骨粉進行X線衍射分析，結果其成份如

圖1所示。
實驗例2煅燒骨粉的透射式紅外表征儀器型號BIO-RAD FT135型傅立葉變換紅外光譜儀。
實驗方法用紅外光譜法可以鑒定有機分子中存在的官能團及其化學環境，紅外光譜法是非破壞性的。而且它需要的樣品量少，獲得圖譜快。樣品的制備主要為KBr(溴化鉀)壓片法，首先將固體樣品研細，使其顆粒直徑小于通過樣品的光的波長，取約為15到20mg樣品在瑪瑙研缽中研磨3到10min，直到它擴散到整個研缽內壁并有粘結性和玻璃狀的外觀為止。然后進行測試，結果見圖2。
實驗例3煅燒骨粉的電感耦合等離子體原子光譜分析儀器型號POEMS美國Thermo Jarrell Ash儀器參數功率1150V樣品提升1.48ml/minAr載氣0.56L/min觀察高度13mm實驗方法首先將稱取樣品，然后用硝酸溶解樣品，定容，將樣品送入儀器。
電感耦合等離子體原子光譜法測定本發明煅燒骨粉的元素含量，結果如表2所示。

實驗例4煅燒骨粉的光電子能譜檢測VG ESCALAB MKII型光電子能譜為美國UG公司制造光電子能譜儀由譜儀室、激光源、能量分析器、信號檢測器、真空系統、電子學裝置和計算機組成。
實驗方法將樣品放在載物臺上，將其碾碎，放入儀器內，抽真空，然后開啟儀器對樣品進行檢測，樣品在激光的照射下產生信號，經過信號檢測器轉化成信號由電腦輸出，即可得到我們所需的結果。
實驗例5煅燒骨粉的掃描電鏡檢測電鏡型號AEOL-JSM-5500LV，(日本制造)。
電子顯微鏡的基本結構電子光學系統、真空系統、電器系統。
成像原理處于負高壓的電子槍發射一束電子經兩級磁透鏡組成的照明系統把這些電子聚成直徑僅為幾微米的強電子束照射在要觀察的物體上，電子與物質相互作用，產生彈性和非彈性散射，從而使這些電子所觀察物體的形貌和結構特征等信息，這些電子經物鏡聚焦并在物鏡的像平面形成所觀察物體的放大像，再經兩次或更多級的磁透鏡組成的成像系統進一步放大，最后這些成像電子打在熒光屏上發出熒光。在熒光屏上我們就可以看見放大幾十倍到幾十萬倍的被觀察物體的放大圖像，這些圖像可以用照片的形式記錄下來。
掃描電鏡下觀察結果顯示本發明的煅燒骨粉為無有機質的具有完整三維交通的松質骨結構。在結構上符合理想骨缺損修復材料要求。150℃燒制的骨粉在電鏡下觀察無機結構內尚有有機物存在。而煅燒至800℃的骨粉內完全無軟組織(見圖3)。
實施例6煅燒牛骨粉的生物相容性體外試驗1.兔間質細胞(MSCs)的體外分離及培養選取三周齡的大耳白兔，雌雄不限，體重2.5-3.5公斤。速眠新(1ml/kg)肌肉注射麻醉后無菌抽取骨髓1.5-2.0ml(注射器內含稀釋的肝素鈉3000u約定0.2ml)，放入DMEM培養基中吹打制成單細胞懸液，置于2個25ml培養瓶中，37℃、5％CO2條件下培養，于第五天首次細胞換液，棄去培養液，用Tyrode’s平衡鹽溶液沖洗4次，沖去懸浮生長的造血干細胞，之后每2-3天換液，待骨髓間充質干細胞貼滿培養瓶低壁80％后，倒掉培養液，用D-Hanks液緩慢沖洗2次，然后用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA聯合消化，倒置顯微鏡下觀察，當細胞質偽足回縮約50％時，呈圓形(大約5分鐘)，用含有15％血清的完全培養液終止消化，加入培養液5ml用吸管反復吹打將細胞懸浮，將壁上細胞吹打下來，以1000轉/分離心，棄上清，收取底壁細胞，以1∶2傳代(見圖4)。
2.骨髓間充質干細胞體外誘導髓間充質干細胞體外傳3代后，以5×104/孔接種于預置載玻片的12孔板的6孔，更換入含有地塞米松(DEX)，抗壞血酸和β-磷酸甘油的DMEM培養基誘導液，誘導21天后，見細胞呈集落生長。將細胞10％福爾馬林固定20分鐘，2％硝酸銀孵育10分鐘，去離子水沖去多余的硝酸銀，紫外光照射半小時，光鏡下觀察。結果發現培養的兔MSCs中加入誘導液后，周邊部細胞由單層逐漸轉變為復層生長，部分細胞轉變為平坦多邊角形，在細胞高度密集區又轉變為圓形或橢圓形，并分泌細胞外基質，甲苯胺藍染色呈陽性反應。3天后原來細胞密集的區域細胞質出現收縮，1周左右大部分細胞收縮成細胞團，最后在整個培養環境中形成2-3個細胞結節。VonKossa染色陽性區，呈斑塊狀，多見于細胞密集生長區。證明該細胞具成骨細胞樣特性(見圖5)。
3.成骨細胞與煅燒牛骨材料復合將煅燒骨粉用Co60γ消毒后用培養液預濕備用。取傳第3代骨髓間充質干細胞5×106與小塊狀煅燒牛骨材料共同培養，24小時后見材料周圍有細胞貼壁生長，2-3天換液，5天后見細胞明顯增殖，且細胞形態未見異常變化(見圖6)。證明本材料沒有細胞毒性。
12天后將植有細胞的材料取出，用2.5％的戊二醛固定，1％的鋨酸固定，乙醇系列脫水后噴金給予掃描電鏡觀察。掃描電鏡二次成像法顯示實驗煅燒的牛骨粉在體外培養第五天時已有成骨細胞附著，數量較多，同時在孔洞中也有細胞生長；且生長狀態良好，貼附緊密，形態正常.證明本實驗研制的骨粉生物相容性好，對細胞無不良刺激，材料無細胞毒性，可做骨組織工程的種子細胞載體使用。(見圖7)。
實施例7煅燒骨粉對家兔顱骨損傷的修復作用試驗方法將新西蘭白兔隨機分為六組(動物由吉林大學醫學部動物室提供)，每組四只，雌雄不限，體重2.5-3.5公斤。速眠新(1ml/kg)肌肉注射麻醉，無菌條件下備皮，在兩側顱骨上分別制成1.0×1.5cm的骨穿通缺損，然后在缺損處放入骨粉上復蓋生物可降解膜，左側為實驗骨粉組，右側為對照材料組，按下表分組。
實驗骨粉組(左)1.實驗煅燒骨粉(具有松質骨和密質骨混合型)+可降解生物膜2.實驗煅燒骨粉(純松質骨粉煅燒溫度為150℃)+可降解生物膜3.實驗煅燒骨粉(純松質骨粉煅燒溫度為550℃)+可降解生物膜4.實驗煅燒骨粉(純松質骨粉煅燒溫度為800℃)+可降解生物膜對照組(右)5.骨缺損處不加骨粉只用可降解生物膜6.生物可降解骨替代材料7.骨粉未加膜8.實驗煅燒骨粉(純松質骨粉煅燒溫度為800℃)+生物膜+BMP分別在3、6、8、12周處死家兔，取顱骨拍X線片，然后，固定在10％的中性福爾馬林中，一周后，置20％EDTA中脫鈣，脫鈣完全后，常規石蠟包埋，切片(6μm)HE染色，鏡下觀察。
實驗結果(1)大體觀察兔顱骨愈合良好，上覆纖維組織被膜，均無炎癥反應。實驗組一周處死的兔顱骨表面下陷，呈暗紅色，邊界清楚，上附可降解生物膜。三、六、八、十二周處死的兔顱骨表面纖維組織被膜色澤與正常部位相同，呈乳白色，與正常部位呈移行關系。對光觀察透光度強，說明骨組織密度低。隨時間增長，生物可降解膜逐漸變脆，觸之易碎。多孔PLA/PGA共聚骨替代材料組表面被覆的纖維組織較厚，隨時間延長雖透光度有所減弱，但明顯強于實驗組。
(2)X線觀察實驗組在三周處死的兔顱骨缺損處有明顯的骨粉顆粒存在，六周處死的兔顱骨缺損處仍有骨粉顆粒，但影像不清晰。X線片見骨密度仍低于正常骨組織。八周、十二周處死的兔顱骨內未見骨粉顆粒影像，有骨小梁影像，并透光度下降(見圖8)。多孔PLA/PGA共聚骨替代材料組，未見明顯的骨生成影像。至12周時仍可見明顯的骨缺損影像。
(3)組織學觀察經150℃、500℃、800℃煅燒制成的牛骨粉用于新西蘭白兔顱骨兩側缺損處觀察3、6、8、12周，處死動物，目的是觀察在同一條件下放置不同材料對比其促進骨生長的作用。鏡下見骨粉被逐漸吸收，進而分化成骨細胞通過膜內化骨成骨，而骨粉間充滿富含細胞之結締纖維組織，最后沉積鈣質。這一過程是由外向內進行的即自骨缺損邊緣向骨缺損中心進行。
術后一周(僅一只)處死的白兔顱骨骨缺損處，大體觀察見骨缺損邊界清楚，暗紅色。X線片見骨粉顆粒較清楚。組織學觀察經HE染色見骨缺損部位有大量骨粉顆粒，其間有大量淋巴細胞浸潤，可見多核巨細胞，紅細胞充滿整個視野，未見成骨細胞分化。
術后三周大體觀察見骨缺損表面已覆蓋有較厚的纖維結締組織，創口愈合良好。組織學觀察實驗組骨粉顆粒未被吸收，其周圍包繞富含細胞纖維組織，骨粉周圍該細胞含量更為豐富，靠近骨創邊緣的骨粉部分被骨組織替代，骨陷窩內存在骨細胞，且骨粉間纖維結締組織內有骨基質沉積。煅燒150℃骨粉組有較多的淋巴細胞浸潤及多核巨細胞反應，而煅燒800℃骨粉組，不僅無此類炎癥反應且骨生成較旺盛，成骨細胞數量較多，且活躍。可降解生物骨替代材料組，未見明顯的骨形成，有大量的淋巴細胞浸潤，且見有多核巨細胞。
術后六周骨缺損處表面已恢復正常，觸之較正常骨組織軟。自然光下見骨缺損區透光性好，骨缺損區逐漸縮小，鏡下見靠近骨創邊緣成骨區增寬，有骨小梁生成，但骨髓成分較少。靠近中央部位多數骨粉顆粒被骨組織替代，形成骨組織，周圍包繞富含細胞的纖維組織。未完全吸收的骨粉顆粒的周邊部可見多核破骨細胞。骨粉逐漸被正常骨組織替代，骨粉顆粒內有纖維組織或血管長入，骨粉周邊先形成骨組織，符合爬行替代學說。可降解生物骨替代材料組，骨缺損處長入大量的纖維組織，并有大量的淋巴細胞存在，未見有明顯的骨生成。煅燒至150℃的骨粉組見骨粉部分吸收，殘存的骨粉可見有網狀結構，可能是殘留的有機物質。
術后八周骨缺損區有鈣化不均勻的編織骨形成及骨小梁形成，其中骨髓細胞成分少，成骨細胞位于骨小梁周邊部，數量較多，細胞為長梭形或多角形，核蘭染。靠近缺損中央部位，仍可見有少量未被骨組織替代的骨粉顆粒，其周邊包繞著纖維結締組織，與術后三、六周時比較，骨粉顆粒顏色變淺，這可能是在體內逐漸被降解所致。另外骨粉內可見有血管或纖維結締組織存在，即便是骨缺損中央部位也有骨組織形成。
術后十二周煅燒至800℃實驗組，骨缺損區大部分被骨組織替代，中央區僅見少許分散的骨粉顆粒，板層骨和編織骨的周圍見血管和纖維結締組織(見圖9B)。而煅燒至150℃、500℃仍有骨粉顆粒存在，但均不完整，且不同程度的被骨組織替代，顆粒內有纖維組織和血管組織(內有紅細胞)，骨粉邊緣有破骨細胞，周邊有骨組織生成。而可降解生物骨替代材料刺激骨生長情況很差，第十二周時仍未見有明顯的新骨形成；未加骨粉組雖缺損邊緣有新骨生成，但速度較加骨粉組慢，至12周骨缺損中央部位未見有新骨長入。加骨粉未加可降解生物膜組在第3周可見有少量新骨生成，其骨缺損中央部位被纖維組織充滿，大體可見骨粉顆粒有移動現象，存留在缺損部位的骨粉被纖維組織包繞，體積均縮小、變形，至12周仍未見有明顯的新骨生成，而骨粉均已消失(見圖9A)。
(4)灰度測定利用日產LuzEX-F型號的圖像分析儀，進行骨量測定和灰度檢測，每張樣片分別取10個點，進行成骨面積的測量，取4個視野測量骨粉的面積及灰度測量，以觀測新骨形成量和骨粉在不同時間吸收情況。結果表明，總體結果在新骨形成的量方面皮質骨組、煅燒至150℃、800℃的骨粉組骨形成量無明顯差異，灰度測定同樣沒有差異。骨粉吸收方面經雙因素方差分析皮質骨組、煅燒至800℃組與煅燒至150℃組相比有明顯差異。骨粉吸收方面皮質骨組與800℃組有明顯差異，灰度測定也有明顯差異，P＜0.05。
權利要求
1.一種引導骨組織再生的支架材料-煅燒骨粉。
2.權利要求1中所述的煅燒骨粉由下述方法制得A、取哺乳動物脊骨的松質骨部分切成小塊；B、將切成小塊的骨進行水煮、干燥；C、將水煮、干燥后的骨進行酸、堿處理，并用二次蒸餾水清洗數次，至PH值為7.0后干燥；D、將上述制備好的牛脊骨，放入高溫爐中在600-1000℃煅燒，的本發明。
3.權利要求2所述的煅燒骨粉的制備方法，其特征在于將哺乳動物脊骨進行切塊、水煮、干燥的方法是將脊骨切成10mm3小塊，用清水沖洗數次，后投入鍋中水煮4-5小時置于干燥箱中干燥，干燥后用粉碎機將骨粉碎成約為5mm3小塊后放入鍋中再次水煮2-5小時，期間換水3次，再次干燥。
4.權利要求2所述的煅燒骨粉的制備方法，其特征在于所述的酸、堿處理方法是采用將水煮、干燥后的脊骨置入1M NaOH溶液中浸泡20-50分鐘，置入30％H2O2中浸泡20-50分鐘。
5.權利要求2所述的煅燒骨粉的制備方法，其特征在于高溫爐煅燒過程中溫度控制為600-1000℃，煅燒2-3次，每次3-5小時。
6.權利要求2所述的煅燒骨粉的制備方法，其特征在于高溫爐煅燒過程中充入氧氣。
7.權利要求1中的煅燒骨粉在骨缺損修補中的用途。
8.權利要求7中所述骨缺損為口腔頜面部骨缺損。
9.權利要求7中所述骨缺損為肘關節缺損。
10.權利要求7中所述骨缺損為脊椎骨缺損。
全文摘要
本發明涉及一種引導骨組織再生的支架材料——煅燒骨粉的制備方法及其在骨缺損修復中的用途。煅燒骨粉具有明顯的促進骨愈合的作用及較好的生物相容性，且具有一定的硬度和強度、易于塑形且來源豐富，解決了人工合成材料在孔隙率、孔隙交通、孔隙大小等方面的制作難題。
文檔編號A61L27/38GK1810304SQ20051011907
公開日2006年8月2日 申請日期2005年12月16日 優先權日2005年12月16日
發明者高心, 何鐘勤 申請人:高心