專利名稱：月季花總黃酮及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及月季花提取物及其提取方法，以及在制備治療糖尿病藥物中的應用。
背景技術：
糖尿病是一種常見的代謝性疾病，是由胰島素絕對或相對分泌不足所造成的糖代謝失調，進而導致脂肪、蛋白質代謝紊亂，因此隨著世界人口的老齡化、生活水平提高帶來的飲食結構不合理以及遺傳基因等因素，糖尿病已經成為一種常見病、多發病，由于它涉及全身系統，以至發生許多致命性的并發癥，嚴重威脅著人類的生命健康。
一般可將糖尿病分為以下幾種類型A、胰島素依賴型(簡稱I型糖尿病)；B、非胰島素依賴型(簡稱II型糖尿病)；C、營養不良型糖尿病；D、其他類型的糖尿病，其中II型糖尿病占糖尿病患者總人數的85％以上，且發病率急劇增加。
目前，國內外常用的口服降糖藥種類繁多，主要是磺酰脲類、雙胍類藥物、生物制劑α-葡萄糖苷酶抑制劑以及一些中西藥復方制劑，盡管上述藥物對各類糖尿病有一定的治療作用，但他們的共同特點是用藥周期長，對癥狀的改善缺乏明顯效果，停藥后均有不同程度的“反跳”現象。
月季花性味甘、溫，具有活血調經、散毒消腫作用，主要用于治療月經不調等婦科疾病，在中國專利98100371.0和99103552.6中，將月季花與其他藥物配伍，用于治療糖尿病，但遺憾的是這種中藥組方復雜，各組分藥效不明確，質量不易控制，不利于制備成藥物制劑。
在徐文昭發表于南京中醫藥大學學報(自然科學版)2000年7月第16卷第4期上的“月季花花瓣的黃酮類成分的研究”一文中，作者通過對月季花進行乙醇提取、Sephadex LH20柱層析分離，經波譜解析確定結構并用HPLC測定總黃酮含量，得到四個化合物經過鑒定分別為槲皮甙、山萘素-3-O-鼠李糖甙、槲皮素和山萘黃素，各黃酮成分含量為73.61％、22.5％、0.45％、1.56％，盡管本文對月季花花瓣的黃酮成分進行了分析，但對其藥用價值并未提出任何建議，也未做深入的研究。
本申請人于2002年12月28日申請了“月季花提取物及其制備方法和用途”，明確了月季花提取物的藥理作用，但是對其提取物的定性和更深入的藥效研究還有待于進行。
發明內容
本發明所要解決的問題是通過對月季花提取物的制備，對提取物進行定性研究，在進行大量的藥效實驗基礎上，尋找該提取物的臨床用途，并將這種提取物用于藥物制劑，得到適合于臨床應用的劑型。
本發明通過以下方法得到月季花提取物水提法取月季花藥材，稍加搗碎，加水提取，合并提取液，濃縮至每1ml含1g生藥的浸膏，即得月季花的水提物，提取溫度從0～100℃。
水提過柱法取上述水提法得到的水提物，過分離柱，用水和醇或水和酸水依次洗脫，得月季花總酚酸。
水提物通過大孔吸附樹脂時，使用水、醇依次洗脫，收集乙醇洗脫物；水提物通過離子交換樹脂柱時，用水、稀酸依次洗脫，收集稀酸洗脫液；水提物通過聚酰胺柱，用水、甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液。
水提醇沉法月季花用石油醚脫脂，藥渣揮干石油醚，用上述水提法提取，過濾，濾液濃縮成稠膏狀，用乙醇進行沉淀，靜置過夜，離心過濾，取沉淀，干燥即得月季花的總多糖。
醇提法取月季花藥材，搗碎，用30％～98％的低級醇進行提取，溫度從0～90℃，提取液過濾，濾液合并，濃縮至浸膏，即得月季花的醇提物。
所述的低級醇包括甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇中的一種，或者兩種以上的混合醇。
醇提萃取法取上述醇提法得到的醇提物，浸膏用水混懸后，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，濃縮至稠膏，即得月季花總黃酮。
月季花提取物可作為活性成分與可接受的藥物載體制成口服或注射單方以及復方制劑的應用。
用上述方法得到的月季花提取物分別是月季花水提物、月季花總酚酸、月季花總多糖、月季花醇提物或月季花總黃酮，通過藥效實驗顯示具有顯著的降糖作用。
本發明通過對月季花提取物在降糖方面的研究，為臨床提供了一種安全有效的降糖藥物，本產品來源于天然藥物，與現有的合成藥相比，具有安全性高的優點，與現有的中成藥相比，具有用藥量小，降糖作用明確，可制成口服或注射制劑使用等優點。
具體實施例方式
本發明用上述方法制備月季花提取物的優選方式是優選水提法取月季花藥材，稍加搗碎，加水提取，提取溫度為10～100℃合并提取液，濃縮至每1ml含1g生藥的浸膏，即得月季花的水提物。
優選水提過柱法取按優選水提法制得的月季花水提物，通過717型強堿型離子交換樹脂后，依次用水、稀鹽酸洗脫，收集稀酸洗脫液，濃縮成稠膏，干燥即得.取上述干粉少許用水溶解，采用化學試劑顯色法進行定性，結果如下
因此將此提取物定義為總酚酸。
優選水提醇沉法月季花用石油醚脫脂，藥渣揮干石油醚，加水提取，過濾，濾液濃縮成稠膏狀，加95％乙醇使含醇量達80％，靜置過夜，收集沉淀，干燥，即得月季花總多糖，取上述干粉少許用水溶解，與下述化學檢驗試劑有如下反應
優選醇提法取月季花藥材，稍加搗碎，直接用60～95％濃度的乙醇進行提取，溫度控制在10～90℃，提取液過濾，濾液合并，濃縮成1ml含1g生藥的浸膏，即得月季花的醇提物。
優選醇提萃取法取月季花95％乙醇醇提物，用水混懸后，用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，濃縮至稠膏狀，干燥，取干粉少許用甲醇溶解，采用化學試劑顯色法進行定性，結果如下
因此將此種方法制備的月季花提取物萃取液定義為總黃酮。
為詳細說明本發明中月季花提取物的制備及其降糖作用，分別通過以下實施例說明。
實施例一月季花水提物(I)的制備取月季花藥材1kg，稍加搗碎，加入10倍量水回流提取，共提取3次，每次1小時，合并提取液，過濾，濾液濃縮至每1ml含1g生藥的浸膏，共得浸膏約330g。
實施例二月季花乙醇提取物(II)的制備取月季花藥材1kg，稍加搗碎，加入8倍量45％乙醇進行室溫浸提，共浸提3次，每次8小時，合并浸提液，過濾，濾液濃縮至每1ml含1g生藥的浸膏，共得浸膏約150g。
實施例三月季花乙醇提取物(II*)的制備取月季花藥材1kg，稍加搗碎，加入8倍量60％乙醇進行回流提取，共提取3次，每次1小時，合并提取液，過濾，濾液濃縮至每1ml含1g生藥的浸膏，共得浸膏約200g。
實施例四月季花提取物(I)、(II)、(II*)對實驗性高血糖模型小鼠血糖的影響1實驗目的觀察月季花提取物對實驗性高血糖模型小鼠血糖的影響，為篩選有效藥物提供依據。
2實驗用試劑四氧嘧啶(Alloxan)SIGMA公司，批號2244-11-3；血糖測定藥盒，北京中生生物工程高技術公司，批號0002013實驗動物昆明種小鼠23-28g，雌雄兼用，河北省實驗動物中心提供，合格證號冀動字040354實驗方法取體重23-28g的昆明種小鼠，雌雄兼用，禁食不禁水24小時后，腹腔注射四氧嘧啶200mg/kg，第二天重復注射一次，造成實驗性高血糖模型。末次注射四氧嘧啶72小時后，小鼠眼眶取血測血糖(取血前小鼠禁食不禁水14小時)。選取血糖≥10.0mmol/L的小鼠，分為模型組和月季花提取物(I)、(II)、(II*)高、低劑量組，每組14-18只，按0.2ml/10g體重灌胃4g/kg、8g/kg，模型組給等量蒸餾水。每日一次，連續14天。第15天小鼠眼眶取血測血糖(取血前小鼠禁食不禁水14小時)。計算小鼠血糖均值，用t檢驗進行統計學分析，比較給藥前后及組間差異。
5實驗結果月季花提取物(I)、(II)、(II*)在4g/kg、8g/kg劑量下，與模型組比較，可明顯降低實驗性高血糖模型小鼠的血糖值；與給藥前比較可明顯降低實驗性高血糖模型小鼠的血糖值。
表1月季花提取物(I)、(II)、(II*)對實驗性高血糖模型小鼠血糖的影響(X＝SD)
與模型組比較△P＜0.01，△△P＜0.001與給藥前比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0016實驗結論月季花水提物(I)、醇提物(II、II*)可明顯降低實驗性高血糖模型小鼠的血糖值。
實施例五月季花水提物過陰離子交換樹脂柱洗脫物的制備(III)取月季花藥材1kg，稍加搗碎，加入10倍量水室溫浸提，共提取3次，每次1小時，合并提取液，過濾，濾液濃縮至每1ml含1g生藥的浸膏，共得浸膏約330g。將浸膏上陰離子交換樹脂柱，分別用水、稀酸水洗脫，得酸水洗脫部分約100g。
實施例六月季花提取物(III)對KK II型糖尿病小鼠血糖的影響1實驗目的觀察月季花提取物(III)口服給藥后對KKII型糖尿病小鼠血糖的影響。
2實驗材料2.1受試物及藥品月季花提取物(III)為棕色浸膏，用少量吐溫-80研磨后，加蒸餾水配制成0.4g/ml，供KK小鼠灌胃用。
馬來酸羅格列酮片，史克必成(天津)有限公司生產，每片含羅格列酮4mg，用前將片劑研碎，用蒸餾水配制成0.025mg/ml的混懸液供KK小鼠灌胃用。
2.2動物KK/Upj-Ay/J II型糖尿病小鼠，中國醫學科學院實驗動物所提供，二級動物，動物合格證號SGKK II-00-0006。動物飼養在有空調調控的觀察室，室溫為24±2℃，飼以高脂肪的誘發飼料(中國醫學科學院實驗動物所飼料營養部門提供)，自由飲水(含0.16％鹽酸的自來水，PH9.3)。
2.3儀器GT-1640京都血糖儀，日本ARKRAY，Inc.產品。
3試驗方法KK II型糖尿病小鼠32只，體重41.4±7.4g，雌雄兼用，動物禁食不禁水2h后，尾靜脈取血約10ml，用GT-1640京都血糖儀測定其血糖值，選取血糖值≥8.0nmol/L的小鼠，按血糖值和體重分層隨機分成4組，每組8只，溶劑對照組給予含1％吐溫-80的蒸餾水，月季花提取物(III)給予相應的藥液，劑量為8g生藥/kg，陽性藥物組給予羅格列酮，劑量為0.5mg/kg，給藥體積均為0.2ml/10g，每天1次，連續15天，分別于第5、10、15天給藥后1h測定血糖值(禁食不禁水2小時)，計算各組小鼠血糖值的均值，采用配對t檢驗進行統計學處理，比較給藥前、后均數的差異性。
4試驗結果KK II型糖尿病小鼠口服給予月季花提取物(III)、羅格列酮后，其血糖均有顯著的降低。
表2月季花提取物(III)對糖尿病小鼠的血糖影響
與給藥前比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0015結論上述結果表明，月季花提取物(III)有顯著的降糖作用。
實施例七醇提法月季花總黃酮C的制備月季花藥材1kg，稍加搗碎，用10倍量95％乙醇于室溫下浸漬，共浸提三次，每次24小時，過濾，濾液合并，回收乙醇至無醇味得浸膏，浸膏用水混懸后乙酸乙酯進行多次萃取，直到萃取液色淡或幾盡無色為止。合并乙酸乙酯萃取液，濃縮至稠膏狀，干燥。共得干粉約70g.
取上述干粉少許用甲醇溶解，用化學試劑顯色法對此干粉進行定性，結果如下
上述反應為黃酮類物質定性反應，故所得干粉為月季花總黃酮。
實施例八水提過柱法月季花總酚酸D的制備取月季花藥材1kg，加8倍量水于室溫下浸提三次，每次24小時，過濾，濾液通過717型堿離子交換樹脂柱，依次用水、0.2N鹽酸洗脫，收集酸水洗脫液濃縮至稠膏狀，干燥得干粉約40g.
取上述干粉少許用水溶解，采用化學試劑顯色法對此干粉進行定性，結果如下
上述反應為酚羥基或羧基物質定性反應，故所得干粉為月季花總酚酸。
實施例九水提醇沉法月季花總多糖E的制備月季花藥材1kg用8倍量石油醚(60-90℃)回流提取三次，每次1小時，藥渣揮干石油醚.加10倍量水回流提取兩次，每次1小時，過濾，合并濾液，濃縮至相對密度為1.10(50℃)的清膏，加95％乙醇使含醇量達80％，靜置過夜，離心過濾，收集沉淀，干燥得干粉約120g.
取上述干粉少許用水溶解，采用化學試劑顯色法對此干粉進行定性，結果如下
水提醇沉法是多數植物類多糖的提取方法，上述反應為多糖類物質定性反應，故所得干粉為月季花總多糖。
實施例十月季花總黃酮C、總酚酸D、總多糖E藥理實驗1.實驗材料與方法1.1主要的試劑和設備鏈脲佐菌素(STZ)SIGMA公司提供，批號112K1006；
檸檬酸鈉由沈陽化學試劑廠提供，批號2000040；胰島素試劑盒由美國Market公司提供，批號50920601。
血糖試劑盒保定長城臨床試劑有限公司Nikon ALPHAPHOT-2 YS2s型生物顯微鏡1.2實驗用藥品月季花各提取部分中奇制藥技術(石家莊)有限公司提供。
糖適平德國格林格翰、北京萬輝制藥公司提供。
1.3實驗動物體重為170+15g的Wistar大鼠236只，雌雄各半，由中國醫科大學實驗動物中心提供。
1.4實驗方法取體重為170±15g的Wistar大鼠236只，其中10只作為正常試驗組。其余大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，劑量為65mg/kg(鏈脲佐菌素臨用前用無菌檸檬酸鈉緩沖液配制成1％濃度的溶液，PH＝4.3)。腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)后前二天大鼠應給予10％濃度的糖水，以防止出現大鼠低血糖性死亡。一周后測定大鼠血糖，取血糖值大于16.7mmol/L者作為糖尿病模型動物，記錄血糖值。
采用區組法隨機分成11組，每組7只(其中模型組8只)，分別為模型組、陽性藥組(糖適平)、C、D、E組分高、中、低劑量組(高劑量組為20g生藥/kg，中劑量組10g生藥/kg，低劑量組5g生藥/kg)。陽性藥和實驗用藥分別用0.1％的CMC鈉溶液配制成混懸液，灌胃給藥。模型組給予CMC鈉溶液。正常組給予等量的自來水。分別于給藥后7天、14天眼眶取血，測量大鼠血糖值和胰島素水平。實驗結束后根據所測血糖、胰島素值，取療效最為明顯的試驗組大鼠的胰腺組織，用10％福爾馬林溶液固定，常規HE染色，觀察胰島病理改變情況。
2.實驗結果2.1.各藥物對糖尿病大鼠血糖的影響見表I中藥ND-YJH的C組中、低劑量組與模型組相比有顯著性差異(P＜0.05)，D組分的高低劑量組與模型組相比有非常顯著性差異(P＜0.01)，中劑量組與與模型組相比有顯著性差異(P＜0.05)，E組分中、低劑量組與模型組相比有顯著性差異(P＜0.05)，表明月季花各提取物有明顯的降低鏈脲佐菌素(STZ)所造成的高血糖大鼠的血糖水平的作用。
表I各藥物對糖尿病大鼠血糖的影響
與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
2.2.各藥物對糖尿病大鼠胰島素水平的影響，見表II中藥ND-YJH的C組分中、低劑量組與模型組相比有非常顯著性差異(P＜0.01)，其高劑量組與模型組有顯著性差異(P＜0.05)，D組分的高、低劑量組與模型組相比有非常顯著性差異(P＜0.01)，其中劑量組與模型組有顯著性差異(P＜0.05)。說明中藥ND-YJH具有促糖尿病大鼠分泌胰島素的作用。同時E組分沒有促胰島素分泌的作用，但能夠降低大鼠血糖，說明其降低糖尿病大鼠血糖是通過其他途徑來實現的。
表II各藥物對糖尿病大鼠胰島素水平的影響
與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
2.3.各實驗藥物對糖尿病大鼠胰腺病理改變的影響。
由血糖和胰島素測定結果可見實驗藥的C、D提取部位的療效明確，所以對C、D兩組、陽性藥物組和正常組進行病理檢測。由病理切片顯示，正常組大鼠胰腺內的胰島數量眾多，胰島內胰島細胞豐富，排列規則。模型組大鼠胰腺內胰島數量減少，胰島細胞數目也明顯減少，這是由于鏈脲佐菌素(STZ0能夠破壞大鼠胰腺內胰島細胞。陽性藥物組大鼠胰腺內的胰島數目與正常組大鼠相比也明顯減少，胰島內胰島細胞數量也顯著減少，排列不規則。實驗藥物組的C、D提取部位組的胰腺中的胰島數目和胰島細胞情況與正常組相比也明顯減少，與陽性藥物組相比沒有明顯的差別。
3.總結中藥ND-YJH的C、D、E組分具有明顯的降血糖作用，并且具有促胰島素分泌的作用。該中藥對鏈脲佐菌素(STZ)造成的大鼠胰島和胰島細胞的損傷未見有明顯的改善作用。
實施例十一月季花水提物的制備取月季花藥材1kg，稍加搗碎，加入10倍量水60℃溫浸，共浸提3次，每次4小時，合并提取液，過濾，濾液濃縮至每1ml含1g生藥的浸膏，共得浸膏約295g。
實施例十二月季花水提物的制備取月季花藥材1kg，稍加搗碎，加入10倍量水于室溫下進行冷浸，共浸提3次，每次12小時，合并提取液，過濾，濾液濃縮至每1ml含1g生藥的浸膏，共得浸膏約254g。
實施例十三醇提法制備月季花總黃酮月季花藥材1kg，稍加搗碎，用10倍量95％乙醇于60℃溫浸，共浸提三次，每次8小時，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，得浸膏，浸膏用水混懸后用乙酸乙酯進行多次萃取，直到萃取液無色。合并乙酸乙酯萃取液，濃縮至稠膏狀，干燥。共得干粉85g。
取上述干粉少許用甲醇溶解，用化學試劑顯色法對此干粉進行定性，顯色結果同實施例七。
實施例十四醇提法制備月季花總黃酮月季花藥材1kg，稍加搗碎，用10倍量95％乙醇回流提取，共提取三次，每次2小時，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，得浸膏，浸膏用水混懸后用乙酸乙酯進行多次萃取，直到萃取液無色。合并乙酸乙酯萃取液，濃縮至稠膏狀，干燥。共得干粉102g。
取上述干粉少許用甲醇溶解，用化學試劑顯色法對此干粉進行定性，顯色結果同實施例七。
實施例十五水提過柱法制備月季花總酚酸取月季花藥材1kg，用8倍量水于60℃溫浸，共浸提三次，每次8小時，過濾，合并濾液通過717型強堿離子交換樹脂柱，分別用水、0.2N鹽酸洗脫，收集鹽酸洗脫液，濃縮成稠膏，干燥。共得干粉51g。
取上述干粉少許用水溶解，用化學試劑顯色法對此干粉進行定性，顯色結果同實施例八。
實施例十六水提過柱法制備月季花總酚酸取月季花藥材1kg，用8倍量水回流提取，共提取三次，每次1小時，過濾，合并濾液通過717型強堿離子交換樹脂柱，分別用水、0.2N鹽酸洗脫，收集鹽酸洗脫液，濃縮成稠膏，干燥。共得干粉57g。
取上述干粉少許用水溶解，用化學試劑顯色法對此干粉進行定性，顯色結果同實施例八。
實施例十七水提過柱法制備月季花總酚酸取月季花藥材1kg，用8倍量水于室溫下浸提三次，每次24小時，過濾，合并濾液通過大孔吸附樹脂S-8，分別用水、50％乙醇和95％乙醇洗脫，收集50％乙醇洗脫液，濃縮成稠膏狀，干燥。共得干粉30g.。
取上述干粉少許用水溶解，用化學試劑顯色法對此干粉進行定性，顯色結果同實施例八。
實施例十八水提過柱法制備月季花總酚酸取月季花藥材1kg，用8倍量水于室溫下浸提三次，每次24小時，過濾，合并濾液通過聚酰胺柱，分別用水、30％甲醇、50％甲醇和甲醇洗脫，收集30％甲醇洗脫液，濃縮成稠膏狀，干燥。共得干粉27g。
取上述干粉少許用水溶解，用化學試劑顯色法對此干粉進行定性，顯色結果同實施例八。
實施例十九水提醇沉法制備月季花總多糖月季花藥材1kg用8倍量石油醚(60-90℃)回流提取三次，每次1小時，藥渣揮干石油醚，加10倍量水于室溫下浸泡，共浸提三次，每次24小時，過濾，濾液濃縮成相對密度為1.10(50℃)的清膏，加95％乙醇使含醇量達80％，靜置過夜，收集沉淀，干燥得干粉105g。
取上述干粉少許用水溶解，用化學試劑顯色法對此干粉進行定性，顯色結果同實施例九。
實施例二十水提醇沉法制備月季花總多糖月季花藥材1kg用8倍量石油醚(60-90℃)回流提取三次，每次1小時，藥渣揮干石油醚，加10倍量水于60℃進行溫浸，共浸提三次，每次8小時，過濾，濾液濃縮成相對密度為1.10(50℃)的清膏，加95％乙醇使含醇量達80％，靜置過夜，收集沉淀，干燥得干粉117g。
取上述干粉少許用水溶解，用化學試劑顯色法對此干粉進行定性，顯色結果同實施例九。
權利要求
1.一種月季花總黃酮在制備降糖藥物及降糖保健品中的應用。
2.一種月季花總黃酮，其特征在于制備方法如下(1)取月季花藥材，搗碎，用30～98％的低級醇提取，溫度0～90℃，提取液過濾，濾液合并，濃縮至浸膏，得月季花醇提物；(2)取上述醇提法得到的醇提物，浸膏用水混懸后，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，濃縮至稠膏，即得月季花總黃酮。
3.根據權利要求2所述的月季花總黃酮，其特征在于所述的低級醇包括甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇中的一種，或者兩種以上的混合醇。
4.一種藥物組合物，其特征在于含有月季花總黃酮與可接受的藥物載體制成口服液或注射單方以及復方制劑。
全文摘要
本發明涉及月季花提取物及其提取方法，以及在制備治療糖尿病藥物中的應用。通過用不同的提取方法得到的月季花提取物，進行動物藥效實驗后，發現具有顯著的降糖作用，因此可以應用于制備治療糖尿病的藥物中。
文檔編號A61P3/10GK1772065SQ200510113988
公開日2006年5月17日 申請日期2003年12月25日 優先權日2003年12月25日
發明者劉振濤, 李清娟, 劉亞英, 陳衛平, 徐峰, 梁敏 申請人:石藥集團中奇制藥技術(石家莊)有限公司