專利名稱：用于治療癌癥的當歸萃取物的制作方法
技術領域：
本發明是關于當歸(Angelicae sinesis)萃取物，特別是關于當歸的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物，以及由其所純化的活性成份在癌癥治療的新用途。
背景技術：
癌癥是不正常的細胞增生，起因于細胞中基因變化的累積而賦予增生潛能。癌癥治療主要是手術、化學療法、放射療法及近來的免疫療法。然而，對于治療及預防癌癥仍需要進一步的研究。
當歸(Angelicae sinensis；Dangqui)是傳統中國醫藥處方中最常使用的藥物之一。當歸的傳統用途包括促進血液制造、保護肝臟、降低血壓、殺菌、緩解婦女月經不正常的疼痛以及降低血膽固醇(Chinese Herbs，Shanghai Science and Technology Publication，Inc.Shanghai，China，Vol.5，p.893，1999)。
中國專利CN1053747揭示了制備傘科植物當歸(Angelicae sinensis(Oliv)Diels、ASD)及ASDP與ASDE作為佐劑的有效成份，且可使用作為遺傳重組B型肝炎疫苗的免疫佐劑。在CN1109356中報導由當歸(Angelicae sinensis(Oliv)Diels、ASD)萃取的有效成份內酯類(ASDE)，可增強免疫抗原性(immunogenicity)及降低毒性，可作為免疫佐劑。Kumazawa等人提供由當歸的水萃取物分離的免疫刺激性多醣類，由于其抗腫瘤活性而在帶有艾氏腹水細胞的老鼠中，觀察到存活期間的延長，可作為具有潛力的佐劑(Y.Kumazawa等人，Immunology，Vol.47，p.75，1982)。然而，先前技術文獻僅提供由當歸分離的多醣類，經由其免疫刺激活性，在癌癥治療的一般性敘述，關于機制并無充足的證據。
發明內容
本發明提供當歸的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物，以及由其所純化的成分，例如正-亞丁基苯酞(n-butylidenephthalide；BP)，可有效抑制癌細胞的端粒酶(Telomerase)活性，且進一步誘發其細胞凋亡而可使用于治療惡性腫瘤(malignant neoplasms)。因此，當歸的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物，以及由其所純化的成分，例如正-亞丁基苯酞，有潛力于制造癌癥治療的醫藥品，且可經由其于細胞周期調節與端粒酶抑制性的活性，與化療藥物組合使用。
因此，本發明的一目的是提供于腫瘤組織中，抑制癌細胞增生及移轉的方法。
本發明的另一目的是提供抑制癌細胞端粒酶活性的方法。
本發明的又一目的是提供誘發癌細胞凋亡(apoptosis)的方法。
本發明的再一目的是提供當歸的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物，以及由其所純化的成分，例如正-亞丁基苯酞，用于制造癌癥治療醫藥品之用途，以及經由其于細胞周期調節與端粒酶抑制性的活性，與化療藥物組合作為佐劑。
圖1為細胞周期分析的結果圖，顯示以70μg/ml AS-C(當歸的氯仿萃取物)，處理GBM細胞(DBTRG-05M)(*p＜0.05)，增加細胞周期累積于G0/G1時期(＞90％)，而同時減少S時期。在G5T/VGH細胞也顯示相同結果(圖未標)。
圖2是5至800μM的BP(正-亞丁基苯酞)誘發GBM腫瘤細胞(DBTRG-05MG)凋亡的效果圖，是以TUNEL方法計算，使用碘化丙啶(propidium iodide)作為計數染色劑(*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005)。
圖3a至圖3c為AS-C誘發的凋亡途徑的分析結果圖，70μg/ml(其中是使用DBTRG-05MG細胞株)。
圖3d至圖3f為BP誘發的凋亡途徑的分析結果圖，400μM(其中是使用DBTRG-05MG細胞株)。
圖4為AS-C處理(500mg/kg)帶有皮下GBM腫瘤(RG-2)的老鼠的腫瘤尺寸的抑制效果圖(p＜0.05)。
圖5顯示經AS-C處理的老鼠的存活率(劑量-500mg/kg)顯著延長(p＜0.0001)(與對照組相比)，其中是使用DBTRG-05MG細胞株。
圖6顯示AS-C處理(500mg/kg)老鼠原位GBM腫瘤(RG2)體積的生長的抑制效果(*p＜0.05，**p＜0.001)。
圖7顯示AS-C處理(500mg/kg由腹腔或皮下投藥)老鼠移植腫瘤生長的抑制效果(p＜0.005)，其中是使用DBTRG-05MG細胞株。
圖8顯示BP處理(300mg/kg)老鼠原位GBM腫瘤(RG2)體積的抑制效果，使用回波平面造影功能，以MRI成像計算(*p＜0.05，**p＜0.001)。
圖9顯示不同劑量BP處理(70至800mg/kg)老鼠移植腫瘤生長的抑制效果(p＜0.005)，其中是使用DBTRG-05MG細胞株。
圖10顯示BP處理(70至800mg/kg)帶有移植腫瘤(皮下DBTRG-05MG)的裸鼠存活期間的延長效果(p＜0.001)。
具體實施例方式
本發明提供當歸的有機溶劑萃取物，由其所純化的成分，例如正-亞丁基苯酞(BP)，可抑制癌細胞端粒酶活性且進一步誘發癌細胞凋亡。因此，它可抑制癌細胞增生且可用于癌癥治療。
當歸萃取物的制備當歸(Angelicae sinensis；Dangqui)長時間以來用于血液疾病與女性疾病。一般是使用屬于傘科(family of Umbelliferae)當歸(Angelicaesinensis(Oliv)Diels)的干燥根部。Angelicae sinensis(后文簡稱為AS)是此項技術領域中通常知識。已知有多種技術用以萃取、單離、及/或純化Angelicae sinensis的個別活性成分。Angelicae sinensis的有機溶劑萃取物可由此項技術領域中慣用的任何標準程序獲得。根據本發明，Angelicae sinensis是用丙酮、氯仿或己烷類萃取。本發明的具體例中，Angelicae sinensis的經干燥及粉末化的根莖部分(rhizomes)，使用丙酮作為溶劑萃取，制得萃取物為AS-A。再者，AS-A進一步使用氯仿萃取，制得萃取物為AS-C；且AS-A進一步使用己烷類萃取，制得萃取物AS-H。
活性成分的純化Angelicae sinensis的活性成分可使用任何現有技術，由Angelicaesinensis的有機溶劑萃取物中單離及/或純化。該活性成分可由任何形式的Angelicae sinensis中純化，特別是根莖部分。可用于進一步純化的技術包括過濾、選擇性沉淀、使用有機溶劑萃取、使用水性溶劑萃取、管柱層析、高效液相層析(HPLC)等。根據本發明，由Angelicae sinensis的有機溶劑萃取物中純化某些活性成分，例如蒿本內酯(ligustilide)及正-亞丁基苯酞(n-butylidenephthalide)，該活性成分可誘發腫瘤細胞凋亡(apoptosis)。本發明的一具體例中，正-亞丁基苯酞(BP)的E-及Z-幾何異構物使用管柱層析加以單離且使用HPLC及NMR加以特征化。
癌癥治療機制端粒(telomeres)，為真核染色體的末端，是維持基因體完整性所必需且在細胞成熟(aging)及不死亡(immortality)扮演重要角色(N.W.Kim，M.A.Piatyszek，K.R.Prowse，C.B.Harley，M.D.West，P.L.C.Ho，G.M.Coviello，W.E.Wright，S.L.Weinrich，J.W.Shay，Science，266，2011-2015(1994))。端粒長度及其減少速率在器官與個體中多有變化。人類與老鼠的端粒長度有大的染色體內變化(large interchromosomalvariation)且單一染色體端粒的短少可導致異常的染色體分離(chromosomal segregation)(L.L.Sandell，V.A.Zakian，Cell，75，729-739(1993))。因此，結論為端粒長度變化的調控與維持在癌癥發展中扮演重要角色。顯然地，細胞具有對抗端粒重要的減短及異常延伸兩者的保護系統。已確定端粒酶為端粒長度的調控者之一(G.B.Morin，Cell，59，521-529(1989))。因此，具有選擇性抑制端粒酶活性的任何化合物或物質，可抑制腫瘤生長且因此進一步誘發腫瘤細胞的細胞凋亡。
細胞凋亡是癌癥治療的另一機制，已成為細胞生物學研究的最新領域。
細胞凋亡進程的活化是由來自細胞內及細胞外刺激的多種信號調控。事實上，近年來的證據開始累積，多個(或全部)癌癥化療劑借由推進細胞凋亡的機制殺死腫瘤細胞。期望與細胞凋亡相關的新藥能更有效對抗具有高增生速率的腫瘤。已篩選許多該候選者用于癌癥治療(Ricardo Pe’rez-Toma’s*，Beatriz Montaner，Esther Llagostera，VanessaSoto-Cerrato.Biochemical Pharmacology，66，1447-1452(2003))。
細胞凋亡由兩個通常使用的終點分析檢測細胞的形態改變(核染色質的濃縮、細胞凋亡體的形成)以及DNA片段化為大片段(300至50kbp)且而后成為寡核體長度的片段(oligonucleosomesizedfragment)(多個200bp)，其在瓊脂膠電泳呈現DNA帶的「階梯」(ladder)。雖然該終點的觀測為細胞凋亡的指示，但無法由該分析去定量族群中凋亡細胞的百分比。為此，本發明在固定細胞中添加熒光-生物素化核苷至DNA片段的終點過程期間，也采用TUNEL分析(Jacques Piettea，*，Ce’dric Volantia，Annelies Vantieghemb，Jean-Yves Yvette Habrakena，Patrizia Agostinis.Biochemical Pharmacology，66，1651-1659(2003))。
對于藥物誘發的細胞凋亡的受體及粒線體途徑的相關分部已成為爭論的主題。取決于毒性藥物本身的種類、劑量及動力學或介于特定細胞種類間的差異，其影響依賴于Fas/FasL途徑中信號的細胞種類。
細胞凋亡途徑可由不同點起始，例如細胞膜，經由死亡受體條節信號(受體途徑；Fas/FasL/caspase-8/caspase-3途徑)，粒線體(粒線體途徑；Bax/AIF/caspase-9/caspase-3途徑)及細胞周期調控(包括p53、Rb腫瘤抑制劑、p16及p21周期素(cyclin)激酶抑制劑及周期素/cdk細胞周期確認點)(Simone Fulda，Matroulea，Klaus-Micheal Debatin.CancerLetter，197，131-135(2003))。
已有文獻報導，Angelicae sinensis的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物及其活性成分具有抗心絞痛(angina)、抗凝集及在心血管系統的特定其它活性。
本發明人驚訝地在本發明中發現Angelicae sinensis的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物，由其純化的活性物質例如正-亞丁基苯酞，具有抗癌癥活性。
根據本發明，多種癌細胞株的生長是用以測試Angelicae sinensis的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物，由其純化的活性物質例如正-亞丁基苯酞。發現其等對癌細胞為毒性；其等抑制癌細胞的端粒酶活性(如圖7所示)；其等壓抑癌細胞增生(如圖2所示)及其等也可誘發癌細胞凋亡(圖3及圖4所示)。再者，動物研究也顯示其等有效于壓抑癌細胞生長(如圖5及圖6所示)。因此其等有潛力用以治療癌癥，特別是人類惡性神經膠母細胞瘤(malignant glioblastoma)、結腸直腸癌、血癌、神經母細胞瘤、肝癌、乳癌、卵巢癌及肺癌。
醫藥組成物本發明的Angelicae sinensis的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物、由其純化的活性成分及衍生物，可依照任何現有的投藥途徑予以投藥，該投藥途徑包括但不限于經口腔、非經腸的、腹腔的(ip)、靜脈內的(iv)、肌肉內的(im)、皮下的(sc)、經肺的、穿皮的、經頰的、經鼻的、舌下的、經眼的、經直腸的、經陰道的或其它途徑。熟習此項技術者應可輕易辨明提供所要治療效果的投藥的任何劑量及頻率皆適用于本發明。在一具體例中，其等可使用現有藥物或食品遞送所使用的方法而經口遞送。
在治療投藥目的，Angelicae sinensis的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物、由其純化的活性成分及衍生物，取決于投藥途徑，其形式可以是錠劑、丸劑、膠囊、粒劑、凝膠、粉劑、無菌非經腸式溶液或懸浮液、定量噴霧或液體噴霧、栓劑。為制備本發明的醫藥組成物，Angelicae sinensis的有機萃取物、由其純化的活性成分或衍生物，可根據現有醫藥組合技術與醫藥可接受載劑混合，其中該載劑取決于所要投藥的制劑形式而可有寬廣范圍的形式。合適的醫藥可接受載劑為此項技術領域中所熟知。某些醫藥可接受載劑的處方可見于由美國醫藥協會及英國醫藥協會(American Pharmaceutical Association and thePharmaceutical Society of Great Britain)出版的醫藥賦形劑手冊(TheHand Book of Pharmaceutical Excipients)中。舉例而言，錠劑、膠囊、凝膠、溶液或懸浮液也可包括下述成分醫藥可接受賦形劑或載劑，其為無毒性、惰性固體或半固體、稀釋劑、封裝物質(encapsulatingmaterial)、凝膠基劑或任何形式的配方佐劑。溶液及懸浮液可含有佐劑，例如注射水、生理鹽水、聚乙二醇、甘油、聚丙二醇或其它合成溶劑；蛋白質例如血清白蛋白以增加溶解度；抗菌劑例如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯(methyl parabens)；抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；緩沖液例如醋酸鹽類、檸檬酸鹽類或磷酸鹽類及用以調整等張性的試劑例如氯化鈉或右旋糖。溶液或懸浮液制劑可密封于安瓿、拋棄式注射器或玻璃或塑料制的多劑量小瓶。
本發明的Angelicae sinensis的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物、由其純化的活性成分及衍生物，也可作為佐劑與化療藥物例如放線菌素(actinomycin)、阿霉素(adriamycin)、Ara-C、平陽霉素(bleomycin)、卡姆斯丁(carmustin)、順鉑(cisplatin)、環磷酰胺(cyclophosphamide)、柔紅霉素(daunomycin)、絲裂霉素(mitomycin)、紫杉醇(taxol)、長春堿(vinblastine)等并用。
本發明的Angelicae sinensis的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物、由其純化的活性成分及衍生物，也可使用熟習此項技術者已知的任何技術調配為任何膳食組成物。
下列實施例僅用以詳細說明本發明但不意味限制本發明的范疇。
方法與材料Angelicae sinensis萃取物及化合物的制備Angelicae sinensis(Oliv.)的根莖部由Chung-Yuan公司(中國臺灣)提供且經Han-Ching Lin教授鑒定。植物切片的證據樣本存放于國防醫學院藥學系。Angelicae sinensis的經干燥及粉末化的根莖部(12kg)使用丙酮(24L/次)萃取3次制得丙酮萃取物，名為AS-A。AS-A接著進行氯仿(24L/次)萃取3次。后者萃取物在減壓下濃縮產生31.67g氯仿萃取物(來自100g丙酮萃取物)，名為AS-C。使用己烷萃取AS-A獲得己烷萃取物(AS-H)。正-亞丁基苯酞(BP)由Lancaster Synthesis公司(Newgate，Morecambe，UK)購得且使用時未進一步純化。BP的E-及Z-型使用管柱層析單離且使用HPLC及NMR特征化。將其等溶解于DMSO，于25℃震蕩培養1小時，在各體外試驗前儲存于4℃。
體外細胞增生分析人類臍帶血管內皮細胞(human umbilical vascular endothelial cells；HUVECs)由Cascade Biologics公司(USA)購得。HUVECs維持于補充有10％胎牛血清(FBSGibco BRL)及低血生長補充物(LSGSCascadeBiologics公司，USA)的Medium 200(Cascade Biologics公司，USA)。人類皮膚纖維母細胞(human dermal fibroblasts；HDFs)由CascadeBiologics公司(USA)購得。HDFs維持于補充有10％FBS及低血生長補充物(LSGSCascade Biologics公司，USA)的Medium 106(CascadeBiologics公司，USA)。人類結腸腺癌細胞株HT-29由ATCC(Manassas，VA，USA)購得。HT-29維持于補充有10％FBS及100ng/ml青霉素及100ng/ml鏈霉素(Life Technologies公司，Grand Island，NY，USA)的Dubecco’s Modified Eagle Medium(DMEM；Gibco)。將細胞在60至80％密集度時回收，進行于對數生長(G1)細胞的增生分析。將100μl細胞懸浮液分注到Falcon 96孔盤。密度為6×103細胞/孔于Medium200(對HUVECs)、9×103細胞/孔于Medium106(對HDFs)以及5×103細胞/孔于DMEM(對HT-29)補充10％FBS。在培養箱(潮濕大氣，例如37℃，5％CO2)預培養細胞24小時。添加各種濃度的毒性物10μl至盤的培養基中。細胞培養48小時。添加10μl的細胞計數套組-8(CellCounting Kit-8；CCK-8；DOJNDO)溶液且在培養箱中培養細胞1至4小時。使用微孔盤測定儀，在600nm或更長的參考波長，測定450nm的吸收度。
由HUVECs抽取RNA使用改良的異氰酸胍(guanidium isothiocyanate)(Trizol；Invitrogen)方法，由培養的基質細胞抽取總RNA。
均質化借由添加1ml trizol試劑至3.5cm直徑孔中，將細胞直接于6孔培養盤中溶解，且將細胞溶解物通過吸管(pipette)數次。
相分離均質化的樣品在15至30℃培養5分鐘，使核蛋白復合體(nucleoprotein complexes)完全解離。而后，每1ml trizol試劑添加0.2ml氯仿(Riedel-de-han)。將樣品瓶嚴密封套。樣品瓶用手劇烈震蕩15秒且在15至30℃培養2至3分鐘。樣品在不超過12,000×g下，在2至8℃離心15分鐘。離心后，混合物酚為下層紅色的酚-氯仿相、中間相(interphase)以及無色的上層水相。RNA獨有地保留在水相。
RNA沉淀將水相移到干凈瓶中。水相與異丙醇(Fluka)混合沉淀RNA。在起始均質化所添加的Trizol試劑每1ml添加0.5ml異丙醇。樣品在15至30℃培養10分鐘后在不超過12,000×g下，在2至8℃離心10分鐘。
RNA清洗移除上清液。使用75％酒精清洗RNA沉淀一次，在起始均質化所添加的Trizol試劑每1ml使用至少1ml的75％酒精。震蕩混合樣品且在不超過7,500×g下，在2至8℃離心5分鐘。
再溶解RNA移除上清液后，干燥RNA小粒。溶解RNA在無RNase的水中，且在55至60℃培養10分鐘。RNA儲存于-70℃。
細胞株測試人類腫瘤細胞株(MCF-7、CL1-5、HT-29、Caco-2)、人類臍帶血管內皮細胞(human umbilical vascular endothelial cells；HUVECs)及人類皮膚纖維母細胞(human dermal fibroblasts；HDFs)對Angelicaesinensis萃取物、蒿本內酯(ligustilide)、正-亞丁基苯酞(n-butylidenephthalide)及其衍生物的敏感度。將DBTRG-05MG，BCM，HL-60及J5細胞，在37℃供給5％CO2的潮濕大氣下，生長在含有10％胎牛血清及100ng/ml氫霉素及100ng/ml鏈霉素的RPMI-1640培養基。將G5T/VGH、RG2、N18、SVEC及Balb/3T3細胞，在37℃供給5％CO2的潮濕大氣下，生長在含有10％胎牛血清及100ng/ml氫霉素及100ng/ml鏈霉素的DMEM培養基。在各試驗前，使用PCR篩檢法排除受霉漿菌(mycoplasma)感染的培養細胞。
實施例1-細胞毒性的分析以不同濃度的Angelicae sinensis萃取物或由其純化的活性成分處理對細胞存活的效果，以三重復的MTT分析進行評估。簡言之，將細胞(5×103)培養至含有100μl生長培養基的96-孔盤。使細胞附著24小時后，使用100μl的溶解于培養基的植物萃取物或活性成分進行處理。對照組含有≤0.02％(v/v)的DMSO。培養24、48及72小時后，含有藥物的培養基以50μl新鮮培養基置換，且在各孔的細胞在50μl的400μg/ml MTT培養6至8小時。而后移除培養基及MTT且在各孔及對照組中添加100μl的DMSO以溶解可溶解成分。以MRX微量滴定盤冷光儀(DYNEX，USA)測定溶液在550nm的吸收度。未進行處理的細胞的吸收度視為100％。評估萃取物或活性成分對于GBM細胞生長速率的影響，5×103個指數生長細胞以不同濃度處理24、48及72小時。各測試物質的細胞毒性以IC50質測定，其代表引起50％抑制性所需的藥物濃度。本研究的所有試驗均為三重復。
表1.不同Angelicae sinensis有機溶劑萃取物、BP及其衍生物在不同細胞株的細胞毒性(IC50)
HUVEC人類臍帶血管內皮細胞HDF人類皮膚纖維母細胞Caco-2人類結腸腺癌細胞MCF-7人類乳癌細胞RG2老鼠惡性神經膠質瘤(rat malignant glioma)表2.Angelicae sinensis的有機溶劑萃取物及BP在不同細胞株的細胞株之細胞毒性(IC50)
A549、AT12人類肺腺癌細胞株(AT12及AT549為抗-紫杉醇次選殖株)J5人類肝癌細胞株HCT15人類結腸腺癌細胞株HT-29人類結腸腺癌細胞株CL1-5人類肺腺癌
DBTRG-05MG人類多形性神經膠質母細胞瘤細胞株G5T/VGH人類多形性神經膠質母細胞瘤細胞株N18神經母細胞瘤BCM人類乳癌HL-60人類前骨髓性血癌細胞RG2老鼠惡性神經膠質瘤SVECSV40轉移老鼠淋巴結內皮細胞Balb/3T3老鼠纖維母細胞表3.HUVEC的ETS-1、MMP-2、細胞移轉(migration)及管形成(tubeformation)的測試結果
與正常細胞(HUVEC及HDF)相比，正-亞丁基苯酞(BP)及當歸萃取物(AS-A、AS-C、AS-H)對人類腫瘤細胞株(表1及表2)一般皆顯示較低的IC50值。尤其是BP對人類腦腫瘤細胞顯示強的細胞毒性效果。BP也對兩個抗紫杉醇的人類肺腺癌細胞、人類肝癌細胞及人類結腸腺癌細胞具有毒性。
AS-C及BP對腦腫瘤細胞株的IC50分別為35至60μg/ml及1.4至10μg/ml，對正常細胞株(HDF)為85至300μg/ml(p＜0.0001)。
在正常細胞中，血管內皮細胞(IC50＝44.2±0.1μg/ml)比纖維母細胞(IC50＝85.1μg/ml)對AS-C較敏感(p＜0.05)。
也測試卡姆斯丁(carmustin)(BCNU)及紫杉醇的抑制效果。結果顯示GBM腫瘤對卡姆斯丁并不敏感(IC50＞100μg/ml)，但DBTRG-05MG及G5T/VGH GBM細胞對紫杉醇敏感(分別為IC50＝61.0±3.3μg/ml及IC50＜0.1μg/ml)。然而，紫杉醇在血管內皮細胞引發非常高的細胞毒性(IC50＜0.1μg/ml)，大大高于由AS-C及BP所引發的。用AS-C或BP處理后，可在72小時期間內于不同時間點，觀察到GBM細胞(DBTRG-05MG)脫離且漂浮于培養基。GBM細胞脫離及漂浮的細胞量隨時間增加，且隨著劑量增加(在BP的情況中，于3小時觀察到)。
在進行AS-C或BP處理后的GBM細胞脫離及漂浮可歸因于腫瘤細胞的型態改變。在上述試驗中，使用BCUN(卡姆斯丁)作為系統對照。
實施例2在GBM細胞中，AS-C與BP增加細胞周期停止于G0/G1時期腦腫瘤細胞株DBTRG-05MG及G5T/VGH與稀釋劑培養在生長培養基。在各測試組及對照組，添加DMSO且含量低于0.02％(v/v)。在AS-C及BP的處理中，分別添加70μg/ml的AS-C及400μM的BP。將所有樣品培養48小時。細胞周期分布的分析是使用碘化丙啶(propidium iodide；PI)將DNA染色進行。簡言之，用胰蛋白？使2×106個細胞脫離(detachment)。離心脫離的細胞及漂浮死亡的細胞且以10ml的冷1×PBS(Life Technologies公司)清洗二次。吸取上清液，將細胞還懸浮于0.8ml的1×PBS后，添加200μl的PI溶液(50μg/mlPI+0.05mg/ml RNase A；Sigma Chemical公司)，將細胞于4℃冷藏隔夜。在DNA分析前，細胞至少避光于室溫2小時。染色后，使用FACScan(Becton Dicklinson Immunocytometry System，San Jose，California，USA)及CellQuest分析軟件在20,000總細胞數中檢測及定量DNA。G0/G1時期設閘于M1(×2)；G2/M時期設閘于M2(×2)；總細胞設閘于M3；S時期為M3-(M1(×2)+M2(×2))；次G1時期(凋亡細胞)設閘于M4。
細胞周期分析顯示，在GBM細胞中，70μg/ml的AS-C及400μM的BP增加細胞周期累積于G0/G1時期(＞90％)。圖1顯示在AS-C處理12小時至48小時后，顯著增加細胞周期累積在G0/G1時期同時減少S時期(p＜0.05，p＜0.005)。
實施例3AS-C及BP誘發GBM細胞凋亡凋亡細胞的死亡是使用原位細胞死亡檢測套組(In Situ Cell DeathDetection Kit，POD(Roche，Germany))分析。DNA染色質的型態特征的變化是使用于定量。操作步驟是根據制造商的指示進行。簡言之，將細胞培養在培養皿且分別以AS-C(70μg/ml)及BP(5至800μg/ml)處理72小時后分析。在AS-C及BP處理組中，收集懸浮細胞。在對照組中，收集脫離及漂浮細胞。爾后，在室溫下，在生理鹽水包復的載玻片上，使用3.7％甲醛固定細胞15分鐘，以1×PBS清洗一次后，且以3％H2O2降低內生性過氧化？的活性后培養于冷滲透溶液(permeabilization solution；0.1％Triton X-100+0.1％檸檬酸鈉)。細胞以1×PBS再清洗一次后，于37℃下，與原位末端標記法(terminaldeoxynucleiotidyl transferase(TdT)-介導的dUTP缺口標示(nickslabeling)(TUNEL)反應混合物培養60分鐘。之后，細胞以1×PBS清洗一次，使用碘化丙啶(PI)復染(counterstain)以進行細胞計數。在凋亡的定量中，結果以熒光顯微鏡(Nikon，Kawasaki，Japan)審視。
當與未處理的細胞相比時，幾乎所有在AS-C及BP處理組的GBM細胞都發現有進行中的凋亡。以AS-C處理的細胞凋亡由熒光顯微鏡檢測(400x)，使用原位TUNEL染色及點化丙啶細胞復染，且明在視野下觀察。同樣地，在GBM細胞中，BP誘發的細胞凋亡是使用TUNEL方法及使用碘化丙啶作為復染劑而估算。在估算前，GBM細胞暴露至BP(5至800μM)48小時。結果示于圖2。可發現，與未處理的細胞相比(對照組)，在BP處理組的GBM細胞的凋亡率較高。
實施例4AS-C及BP經由多個代謝途徑誘發細胞凋亡細胞凋亡分子的西方墨點分析DBTRG-05MG細胞(人類GBM細胞)使用AS-C(70μg/ml)處理0、6、12、24及48小時。在另一測試中，DBTRG-05MG細胞使用BP(400μM)處理0、1.5、3、6、12、24及48小時。細胞小粒(cell pellets)還懸浮在溶解緩沖液(10nM Tris-HCl，pH7.5，1mM EGTA，0.5％CHAPS，10％(v/v)甘油，5mM β-2-巰乙醇及0.1mM苯基甲基磺酰基氟化物)且在冰上培養30分鐘后，在4℃下，13000×rpm離心20分鐘。使用BCA蛋白質分析套組(Pierce，Rockford，IL)，根據制造商的指示測定全細胞溶解物的蛋白質濃度。細胞溶解物(20μg/lane)在10至12％的SDS-PAGE(Bio-Rad，Hercules，CA)進行電泳。轉移蛋白質至聚伸乙烯基氟化物(PVDF)膜(Amersham Lifesciences，Piscataway，NJ)。在室溫下，使用5％脫脂牛奶作為封阻劑(blocking agent)遮蔽該膜1小時后，在室溫下，分別與下述抗體培養2小時Fas(FL-335)、Fas-L(C-178)、caspase3(H-277)、caspase 8(H-134)、caspase 9(H-170)、Bax(B-9)、p16(F-12)、p21(F-5)、p53(DO-1；1/100稀釋)(Santa Cruz Biotechnology公司，CA，USA)、phospho-p53(Ser15；1/2000稀釋)及phospho-Rb(Ser795；1/2000稀釋)(Cell signaling Technology，MA，USA)。檢測抗體識別，是將膜分別與結合有(conjugated)辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)的抗-老鼠、抗-兔子、抗-山羊的IgG二級抗體(1/1000稀釋；Santa CruzBiotechnology公司，CA，USA)，在室溫培養1小時，且使用ECL Plus化學冷光系統(Amersham，Arlington Heights，IL)識別。對于每一測試樣品，作為系統對照組的SDS-PAGE膠體皆為二重復制備，含有同量蛋白質；并使用科麻西藍(comassie blue)染色該對照組電泳膠。另一電泳膠則用于西方墨點分析法。帶(band)的強度是使用GS-800 CalibratedImaging Densitometer(Quantity One 4.0.3軟件；Bio-Rad)以密度測定法分析。結果顯示，AS-C顯著增加GBM細胞的Fas表現(1至159倍)，對Fas-L則無影響。此外，檢測死亡受體誘發的凋亡相關的caspase-8的活化。結果顯示procaspase-8的量，在AS-C處理6小時后，僅些微增加，活化的caspase-8的量，在AS-C處理6小時后，大幅增加(參見圖3A)。
測定p53及Rb蛋白質的磷酸化作用且結果顯示AS-C在處理6小時后增加磷酸化的p53蛋白質。再者，總p53蛋白質量在6小時增加之后逐漸減低。然而，磷酸化的Rb蛋白質在6小時減低，且在AS-C處理12小時后成為無法檢測。該結果顯示，AS-C可啟動蹤細胞周期確認點機制。依序測定在AS-C處理的GBM細胞中，p16、p21及Bax的量，且發現所有該三種蛋白質在AS-C處理后皆增加(參照圖3B)。
最后，也測定procaspase-9及procaspase-3的活化。在AS-C處理6小時后，procaspase-9及procaspase-3二者皆大幅活化。
在BP的情況中，結果顯示BP 400μM大幅增加Fas的表現(由1.5小時5.2倍至48小時27.9倍)，壓抑Fas配位體于GBM細胞的表現(參照圖3d)。
也發現BP增加caspase-8的活化，在48小時增加至137.9，但procaspase-8減低(參照圖3d)。
在BP-誘發細胞凋亡的粒線體途徑的角色研究中，顯示BP誘發Bax及AIF的表現，其分別在48小時增加16倍及2.4倍，且活化的caspase-9在48小時增加25.8倍而procaspase-9減低(參照圖3e)。也發現caspase-3增加而procaspase-3減低(參照圖3d)。
在BP-誘發細胞凋亡的細胞周期途徑的角色研究中，顯示BP增加p53、p21及p16的表現，其在48小時分別為1.4倍、2.3倍及3.1倍。增加的p53磷酸化作用在1.5小時為5.2倍且4在8小時為9.2倍，但降低的Rb磷酸化作用在48小時為0.2倍(參照圖3f)。在此研究中，使用β-actin作為內對照(internal control)。
總結言之，可推論由BP壓力誘發的細胞凋亡信號傳導途徑的略圖模式，其由死亡受體、粒線體及細胞周期途徑所組成。
實施例5動物研究使用RG2細胞(大鼠GBM)及DBTRG-05MG細胞(人類GBM)在動物試驗以檢測AS-C及BP的抗腫瘤活性。由實驗室動物中心(中國臺灣)獲得雄性F344大鼠(230至260g)及雄性Foxnl nu/nu老鼠(10至12周齡)。所有步驟皆符合慈濟大學實驗動物中心的標準操作程序(中國臺灣)。動物維持在無病原物條件下且使用標準實驗室動物膳食加以喂食。分別制備DBTRG-05MG細胞(人類GBM)及RG2細胞(大鼠GBM)，在裸鼠進行異種移植(xenograft)及大鼠同種異體性(allogenics)。
于AS-C處理組試驗1-AS-C以皮下注射投藥對于帶有皮下GBM腫瘤大鼠的存活率及腫瘤尺寸的影響將同樣的F344大鼠分為兩組(6/組)，在后背皮下植入1×106RG2細胞。動物由植入腫瘤細胞點的遠距離處(＞2cm)，在腫瘤細胞植入第3、6及9日后，以皮下注射投藥AS-C(500mg/kg/day)(處理組)，或載劑(50mg/ml聚乙二醇及100mg/ml Twenn-80在蒸餾水中；Standard Chem.& Pharm.，Tainan，)(對照組)。腫瘤尺寸以雙角規形夾(caliper)測定且體積計算為L×H×W×0.52。在腫瘤體積超過25cm3時犧牲動物且以犧牲的天數作為動物的最后存活天數。
結果顯示，與未處理組(對照組)相比，AS-C處理組對于腫瘤生長具有顯著抑制作用(p＜0.05)(圖4)。在第26天分別的腫瘤平均尺寸為對照組20.7±1.5cm3且處理組11.5±0.7cm3。與對照組相比，AS-C處理組的存活率顯著延長(40±2.7天相對于30±2.1天；p＜0.0001)(圖5)。
AS-C以劑量500mg/kg皮下注射，在大鼠未發現藥物相關毒性，可由體重及存活器官的組織學分析加以左證。
試驗2-AS-C由皮下注射投藥與腹腔內注射投藥對于帶有皮下人類GBM腫瘤大鼠的腫瘤尺寸的比較影響將裸鼠分為兩組(6/組)，植入s.c.5×106DBTRG-05MG細胞，且在腫瘤細胞植入5天后投藥AS-C(i.p.500mg/kg/day)、AS-C(s.c.500mg/kg/day)或載劑(s.c.)。腫瘤尺寸以雙角規形夾(caliper)測定且體積計算為L×H×W×0.52。在老鼠體內腫瘤體積超過1000mm3時犧牲動物且以犧牲的天數作為動物的最后存活天數。
結果顯示，與未處理組相比，以AS-C i.p.(500mg/kg)及AS-Cs.c.(500mg/kg)處理組顯著壓抑腫瘤生長(p＜0.005)。腫瘤尺寸的平均值在第38天的對照組為849.9±150.1mm3，在AS-C i.p.(500mg/kg)處理組為295.5±25.3mm3，在AS-C s.c.(500mg/kg)處理組為155.1±56.4mm3。結果示于圖7。
試驗3-AS-C由皮下注射投藥對于帶有原位GBM腫瘤(顱內同種異體GBM)大鼠的腫瘤尺寸的影響AS-C對于原位腫瘤的毒性效果，是以RG2細胞測定。同種大鼠分為二組(6/組)，植入i.c.(紋狀體)5×104RG2細胞，且在腫瘤細胞植入后第4、5、6、7及8天后，用AS-C(500mg/kg/day)或載劑s.c.處理。使用于慈濟醫院的具有回波平面造影功能(echo-planar imagingcapability)(Signa LX 3.8，General Electric，Wisconsin，USA)的3-T單位MRI(General Electric，Wisconsin，USA)測定及計算腫瘤體積。簡言之，使用水合氯醛(400mg/ml，1ml/100g)將大鼠麻醉。使用快速旋轉回波平面(fast spin echo)進行功能性MRI掃描，回波平面擷取序列的重復時間為6000msec，回波時間為102msec，基質影像為256×256，視域為5×5cm，且平面內分辨率為80μm。每只大鼠每19.5秒持續6.5分鐘獲得20片，每片為1.5mm厚。
在MRI影像數據中發現，與未處理組相比，處理組的腫瘤體積顯著減少(p＜0.05)(圖6)。平均腫瘤體積在第14及16天的對照組70.8±4.8mm3及126.4±11.1mm3，在AS-C處理組為46.2±3.6mm3及99.5±9.5mm3。
試驗4-AS-C皮下注射投藥對于帶有異種移植人類GBM腫瘤的老鼠的腫瘤尺寸的細胞毒性在此試驗中，使腫瘤生長至大尺寸以促進臨床條件的腫瘤的手術移除為不可接受的選擇。
如上所述，在裸鼠后背植入s.c.DBTRG-05MG細胞(5×106)。僅當腫瘤體積≥250mm3時，將帶有腫瘤的老鼠以單一劑量的AS-C(500mg/kg)或載劑投藥(s.c.)。在AS-C處理10天后，使用H&E組織染色測定在腫瘤的細胞毒性后，犧牲動物。觀察組織切片且在光學顯微鏡50×及400×放大下照相。
組織學分析的照片顯示，AS-C誘發核降解、空孔細胞質及腫瘤細胞塊的腫瘤細胞死亡。相對地，對照組的腫瘤細胞生長良好且可見于AS-C處理組的細胞毒性作用，未在腫瘤塊中發現。
BP處理組試驗1-BP對于F344雄性大鼠中顱內(i.c.)大鼠同種異體GBM腫瘤的影響大鼠分為二組(6/組)，植入i.c.(紋狀體)5×104RG2細胞，且在腫瘤細胞植入后第4、5、6、7及8天后5個劑量，隨機以BP(300mg/kg/day)或載劑s.c.于后翼側區域處理。用MRI測定及計算腫瘤體積。MRI是借由使用具有回波平面造影功能(echo-planar imaging capability)(SignaLX 3.8，General Electric，Wisconsin，USA)的3-T單位(General Electric，Wisconsin，USA)執行。簡言之，使用水合氯醛(400mg/ml，1ml/100g)將大鼠麻醉。使用快速旋轉回波(fast spin echo)進行功能性MRI掃描，回波平面擷取序列的重復時間為6000msec，回波時間為102msec，基質影像為256×256，視域為5×5cm，且平面內分辨率為80μm。每只大鼠每19.5秒持續6.5分鐘獲得20片＝(每片為1.5mm厚)。最后，測定及計算各組的全腫瘤尺寸(mm3)。
如上述使用MRI掃描及回波平面造影計算，結果顯示，與未處理組相比，BP處理組的腫瘤體積顯著減少(p＜0.05)(圖8)。在圖8的各欄表示平均值±SE(*p＜0.05；**p＜0.001)。平均腫瘤體積在第14及16天的對照組分別為69.9±4.81mm3及126.43±11.07mm3；在BP處理組分別為46.6±1.8mm3及91.68±8.3mm3。MRI造影數據顯示，與對照組相比，BP處理組的原位腫瘤體積具有較小區域。
試驗2-BP對于壓抑裸鼠體內s.c.異種移植人類GBM腫瘤的生長及老鼠存活率的影響動物(Foxnl裸鼠)分為六組(6/組)，皮下植入(s.c.)1×106DBTRG-05MG細胞，且在腫瘤細胞植入后第4、5、6、7及8天后5個劑量，隨機以BPs.c.(70、150、300、500、800mg/kg/day)或載劑s.c.在遠離腫瘤植入點處(＞2cm)處理。每2天測定腫瘤尺寸及計算腫瘤體積。腫瘤超過1000mm3時犧牲動物。未犧牲的動物檢測腫瘤3個月。存活率達200天。
結果顯示，與未處理組相比，BP-處理組具有顯著的腫瘤生長壓抑(圖9；300mg/kg/day組的p＜0.005，且腫瘤生長抑制性的程度為劑量依附性。
圖10的存活圖的對數范圍(Log-rank)(Mantel-Cox)比較顯示，用BP處理的帶有異種移植皮下人類GBM的裸鼠的存活期，延長至200天。
實施例7-AS-C對人類惡性腫瘤細胞的端粒酶活性的影響使用TRAP分析端粒酶活性端粒酶活性是使用揭示于文獻改良的端粒酶重復擴增方法(telomere repeat amplification protocol；TRAP)進行分析。使成小粒(pelleted)的細胞溶解于200μl的冰冷溶解緩沖液(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EGTA，0.5％CHAPS，10％[v/v]甘油，5mM β-2-巰乙醇及0.1mM苯基甲基磺酰基氟化物)且在冰上培養30分鐘后，在4℃下，以13,000×g離心20分鐘。上清液萃取物使用BCA蛋白質分析套組(Pierce，IL，USA)定量蛋白質。TRAP分析法是使用TRAPeze端粒酶檢測套組(Intergen公司，Purchase，NY，USA)進行且步驟根據制造商的標準程序進行。簡言之，將含有0.5μg蛋白質的萃取物的體積添加至50μl的含有0.1μg受質寡核？(TS)引子(5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’)、0.1μg的TSK1模板(內標準)、0.1μg的反義寡核？引子(RP)、2U TakaraTaq DNA聚合？(Takara Shuzo公司，Japan)、20mM Tris-HCl，pH8.3，1.5mM MgCl2，63mM KCl，0.005％(v/v)Tween 20，1mM EGTA，50μM的各脫氧核苷三磷酸鹽(dNTPs)及1.25μCi的(γ32P)ATP、3000Ci/mmol(PerkinElmer Life Science，Boston，MA，USA)的反應混合物中。該反應混合物在94℃培養2.5分鐘再在DNA熱循環機(GeneAmpPCR System 2400，PerkinElmer公司，Norwalk，CT，USA)擴增30個循環的聚合？鏈鎖反應于94℃30秒、59℃30秒及72℃90秒。TRAP產物解析于12.5％(v/v)非變性聚酰胺瓊脂膠電泳(PAGE)于含有54mMTris-HCl，pH8.0，54mM硼酸及1.2mM EDTA的緩沖液中。電泳膠在濾紙上干燥1小時后，在-80℃使用增強板(intensifying screen)曝光于X-底片(Bio-Max MR，Kodak Rochester，NY，USA)。TRAP分析DNA階梯產物的信號強度，是使用Bio-Profil Biolight造影分析軟件V2000.01(Vulber Lourmat，France)定量及比較。
統計數據以平均值±SD或SE表示。統計顯著性使用Student’s t-test分析。將p值＜0.05認為顯著。存活使用對數范圍(Mantel-Cox)測試比較。中間值存活時間由Kaplan-Meier分析計算。
權利要求
1.當歸萃取物在制備治療癌證藥物中的應用。細胞增生及移轉的方法，其特征在于，是包括使用有效量的當歸的丙酮萃取物、氯仿萃取物、或己烷萃取物，或由該萃取物所純化的活性成分，以抑制腫瘤組織中癌細胞的增生及移轉。
2.一種抑制癌細胞端粒酶活性的方法，其特征在于，是包括使用有效量的當歸的丙酮萃取物、氯仿萃取物、或己烷萃取物，或由該萃取物所純化的活性成分，以抑制腫瘤組織中癌細胞的端粒酶活性。
3.一種誘發癌細胞的細胞凋亡的方法，其特征在于，是包括使用有效量的當歸的丙酮萃取物、氯仿萃取物、或己烷萃取物，或由該萃取物所純化的活性成分，以誘發腫瘤組織中癌細胞的細胞凋亡。
4.如權利要求1至3項中任一所述的方法，其特征在于，該由當歸萃取物純化的活性成分包括正-亞丁基苯酞。
5.如權利要求1至3項中任一所述的方法，其特征在于，該癌細胞是選自人類惡性神經膠母細胞瘤、結腸直腸癌、血癌、神經母細胞瘤、肝癌、乳癌、卵巢癌及肺癌所成組群者。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，該癌細胞是選自人類惡性神經膠母細胞瘤、結腸直腸癌、血癌、神經母細胞瘤、肝癌、乳癌、卵巢癌及肺癌所成組群者。
7.一種抑制癌細胞增生及移轉的方法，其特征在于，是包括使用有效量的當歸的丙酮萃取物、氯仿萃取物、或己烷萃取物，或由該萃取物所純化的活性成分作為佐劑，與一種或以上的其它藥劑合并使用，以抑制腫瘤組織中癌細胞的增生及移轉。
8.一種抑制癌細胞端粒酶活性的方法，其特征在于，是包括使用有效量的當歸的丙酮萃取物、氯仿萃取物、或己烷萃取物，或由該萃取物所純化的活性成分作為佐劑，與一種或以上的其它藥劑合并使用，以抑制腫瘤組織中癌細胞的端粒酶活性。
9.一種誘發癌細胞的細胞凋亡的方法，其特征在于，是包括使用有效量的當歸的丙酮萃取物、氯仿萃取物、或己烷萃取物，或由該萃取物所純化的活性成分作為佐劑，與一種或以上的其它藥劑合并使用，以誘發腫瘤組織中癌細胞的細胞凋亡。
10.如權利要求7至9項中任一所述的方法，其特征在于，該由當歸萃取物純化的活性成分包括正-亞丁基苯酞。
11.如權利要求7至9項中任一所述的方法，其特征在于，該癌細胞是選自人類惡性神經膠母細胞瘤、結腸直腸癌、血癌、神經母細胞瘤、肝癌、乳癌、卵巢癌及肺癌所成組群者。
12.如權利要求10所述的方法，其特征在于，該癌細胞是選自人類惡性神經膠母細胞瘤、結腸直腸癌、血癌、神經母細胞瘤、肝癌、乳癌、卵巢癌及肺癌所成組群者。
全文摘要
本發明提供當歸的丙酮萃取物、氯仿萃取物、或己烷萃取物，以及由其純化所得的活性成份，例如正－亞丁基苯酞，可有效治療癌癥。
文檔編號A61P35/00GK1943606SQ20051011354
公開日2007年4月11日 申請日期2005年10月8日 優先權日2005年10月8日
發明者羅箭寬, 韓鴻志, 張溫良, 林欣榮, 程永榮, 蔡女滿 申請人:財團法人佛教慈濟綜合醫院