間歇性低氧對(duì)心肌梗塞的治療作用的制作方法

專利名稱：間歇性低氧對(duì)心肌梗塞的治療作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及間歇性低氧在心肌梗塞治療中的用途。
背景技術(shù)：
氧是人類及絕大多數(shù)生物賴以生存的必需條件，也是機(jī)體生理功能調(diào)節(jié)的重要因子。低氧是生命發(fā)育的基本環(huán)境，人類胚胎是在低氧環(huán)境中發(fā)育的，出生后仍有部分組織處于低氧環(huán)境。因此低氧研究涉及生命科學(xué)的基本問(wèn)題，研究低氧與人體組織、器官和細(xì)胞的損傷及其保護(hù)具有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值。
眾所周知，心肌梗塞隨缺血程度的加重和梗塞面積的擴(kuò)大，對(duì)人體造成的損害是呈進(jìn)行性發(fā)展的。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)道，在西方國(guó)家急性冠狀動(dòng)脈阻塞是導(dǎo)致死亡的主要原因，到2020年它將成為全世界的主要死因。Yellow，Downey等指出，現(xiàn)有的治療手段對(duì)于缺血性心臟病的干預(yù)相當(dāng)有限(Yellon DM，Downey JM.Preconditioning the myocardiumfrom cellular physiology to clinicalcardiology.Physiol Rev.2003；831113-1151.)。因此迫切需要一種更為有效的干預(yù)手段，尤其是新的方法，來(lái)限制心肌梗塞病變的進(jìn)展程度。
在過(guò)去的幾十年中，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期生活在高原地區(qū)的人們其心肌梗塞的發(fā)生率和死亡率都很低，這引起了人們對(duì)低氧研究的興趣。這些流行學(xué)上的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室中得到了證實(shí)。1973年Meerson等報(bào)道每天在模擬高原環(huán)境中預(yù)生活5小時(shí)，一周連續(xù)5天，可使大鼠因冠狀動(dòng)脈阻塞引起的死亡率下降84％，心肌梗塞面積減少35％(Meerson FZ，Gomzakov OA，Shimkovich MV.Adaptation to high altitude hypoxia as a factor preventing development ofmyocardial ischemic necrosis.Am J Cardiol.1973；3130-34.)。在低壓氧艙中給予低氧預(yù)適應(yīng)后，可使動(dòng)物在急性心肌缺血后，心臟顫動(dòng)的發(fā)作次數(shù)和死亡率下降2-3倍，并且使心梗后的瘢痕減少1/3，還可促進(jìn)瘢痕附近血管的增生(Meerson FZ，Ustinova EE，Orlova EH.Prevention and elimination of heartarrhythmias by adaptation to intermittent high altitude hypoxia.Clin Cardiol.1987；10783-789.)。在實(shí)驗(yàn)中研究慢性低氧常在高原低氧環(huán)境下進(jìn)行，或是在實(shí)驗(yàn)室模擬高原環(huán)境的低壓氧艙中進(jìn)行。但是，這些文獻(xiàn)說(shuō)明的是低氧預(yù)適應(yīng)后，心肌梗塞的病癥減輕，即低氧處理發(fā)生在心肌梗塞之前，是一種預(yù)防手段而非治療手段。
間歇性低氧(intermittent hypoxia，IH)不同于持續(xù)性低氧，它是在低氧環(huán)境中保持一段時(shí)間，然后恢復(fù)至常氧環(huán)境。近年來(lái)，許多研究表明，間歇性低氧具有與缺血預(yù)適應(yīng)(ischemia preconditioning，IP)相類似的對(duì)心肌的保護(hù)作用。出生后的大鼠經(jīng)間歇性低氧預(yù)適應(yīng)5周后，能明顯改善缺氧再灌注(ischemia-reperfusion)損傷后的心功能。間歇性低氧提高心肌對(duì)缺血再灌注損傷的耐受性，也能顯著提高心肌的抗氧化能力和對(duì)氧的利用能力。雄性S.D大鼠在間歇性低氧環(huán)境中生活28天和42天后，與對(duì)照組相比具有明顯的抗心肌缺血和再灌性心律失常作用，此抗心律失常作用在間歇性低氧14天后逐漸發(fā)生，并可有效維持脫離低氧處理后的二周左右時(shí)間。間歇性低氧可促進(jìn)大鼠心肌組織微血管生成，增加冠脈流量，也可通過(guò)調(diào)控Bcl-2/Bax的表達(dá)抑制缺血再灌后心肌細(xì)胞的凋亡。
目前在心肌缺血損傷的研究方面，都是將間歇性低氧作為一種預(yù)適應(yīng)手段(IH preconditioning)，提高心肌對(duì)缺血缺氧的抵抗力，從而起到心肌保護(hù)作用。然而，臨床上迫切需要解決的卻是在心肌梗塞發(fā)生后如何減少梗死面積和缺血損傷區(qū)域。但是，間歇性低氧是否能有效的改善已經(jīng)發(fā)生的急性或亞急性心肌梗塞，即是否具有緩解或治療作用尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供氧在治療心肌梗塞中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一目的在于提供間歇性低氧在心肌梗塞治療中的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種氧氣艙設(shè)備的用途，用于制備治療心肌缺血、梗塞的設(shè)備，所述的氧氣艙設(shè)備包括一個(gè)封閉的艙體，所述艙體中包括氧氣供給裝置，氧氣排出裝置，以及含氧量檢測(cè)裝置，其中，所述的氧氣供給裝置提供氧氣，使得氧氣艙內(nèi)的氧氣滿足以下條件氧分壓Po2＝84±20mmHg(或11.2±2.8kPa)。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種氧氣的用途，用于制造治療心肌缺血、梗塞的設(shè)備或制劑。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的氧氣在治療心肌缺血、梗塞的設(shè)備中以低氧-常氧相間隔的方式給予，所述低氧-常氧相間隔的時(shí)間為低氧6±2小時(shí)，常氧18±2小時(shí)，并且，所述的低氧為氧分壓Po2＝84±20mmHg(或11.2±2.8kPa)，所述的常氧為氧分壓Po2＝159±20mmHg(或20.7kPa±3kPa)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述低氧-常氧相間隔的時(shí)間為低氧6±1小時(shí)，常氧18±1小時(shí)，并且，所述的低氧為氧分壓Po2＝84±10mmHg(或11.2±1.4kPa)，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±10mmHg(或20.7kPa±1.5kPa)。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種治療哺乳動(dòng)物心肌缺血、梗塞的方法，采用間歇性低氧處理來(lái)實(shí)施治療，包括步驟使所述哺乳動(dòng)物在低氧-常氧相間隔的環(huán)境中進(jìn)行治療，并且，每天將患有心肌梗塞的哺乳動(dòng)物置于低氧環(huán)境中生活6±2小時(shí)，其余18±2小時(shí)生活于常氧環(huán)境；所述的低氧為環(huán)境中的氧分壓Po2＝84±20mmHg(或11.2±2.8kPa)，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±20mmHg或20.7kPa±2.8kPa；連續(xù)治療7-50天。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，每天將患有心肌梗塞的哺乳動(dòng)物置于低氧環(huán)境中生活6±1小時(shí)，其余18±1小時(shí)生活于常氧環(huán)境；所述的低氧為環(huán)境中的氧分壓Po2＝84±10mmHg或11.2±1.4kPa，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±10mmHg或20.7kPa±1.5kPa；連續(xù)治療7-35天。
在另一優(yōu)選例中，每天將患有心肌梗塞的哺乳動(dòng)物置于所述低氧環(huán)境中生活6小時(shí)，其余18小時(shí)生活于常氧環(huán)境；所述的低氧為環(huán)境中氧分壓Po2＝84±20mmHg或11.2±2.8kPa，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±20mmHg或20.7kPa±2.8kPa；連續(xù)治療10-35天。
在本發(fā)明的第四方面，提供一種提高患心肌梗塞的哺乳動(dòng)物心肌組織中內(nèi)新生毛細(xì)血管的方法，將所述哺乳動(dòng)物置于低氧-常氧相間隔的環(huán)境中，每天在低氧環(huán)境中生活6±2小時(shí)，其余18±2小時(shí)生活于常氧環(huán)境；所述的低氧為環(huán)境中的氧分壓Po2＝84±20mmHg或11.2±2.8kPa，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±20mmHg或20.7kPa±2.8kPa；連續(xù)治療7-50天。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，每天在低氧環(huán)境中生活6±1小時(shí)，其余18±1小時(shí)生活于常氧環(huán)境；所述的低氧為環(huán)境中的氧分壓Po2＝84±10mmHg或11.2±1.4kPa，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±10mmHg或20.7kPa±1.4kPa；連續(xù)治療7-35天。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1.實(shí)驗(yàn)安排方案及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組圖。大鼠分成不同的實(shí)驗(yàn)組，各自進(jìn)行不同的結(jié)扎或手術(shù)處理。MI-Nor組行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎手術(shù)+正常給氧；MI-IH組行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎手術(shù)+間歇性低氧處理。另兩組各自進(jìn)行假手術(shù)，分別作為MI-Nor組和MI-IH組的對(duì)照。S-Nor組假手術(shù)+正常給氧；S-IH組假手術(shù)+間歇性低氧處理。
圖2.間歇性低氧治療對(duì)大鼠心臟射血分?jǐn)?shù)(EF)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDD)的影響。射血分?jǐn)?shù)(EF，A)和左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDD，B)的超聲心動(dòng)測(cè)量。假手術(shù)動(dòng)物的EF或LVDD僅呈現(xiàn)微小的變化。在MI后，EF逐漸下降且LVDD逐漸上升，但是在MI 21天、35天(處理14天、28天)后，MI-IH組心臟收縮功能與常氧處理的大鼠(MI-Nor組)的心臟更好(p＜0.05)。
圖3.M型超聲心動(dòng)圖顯示間歇性低氧治療后大鼠心功能的改變。代表性M-性影像。心肌梗塞的間歇性低氧(IH)處理與提高的左心室功能相關(guān)。A在MI 21天(處理14天)后的M型影像，呈現(xiàn)顯著的心腔擴(kuò)大和左室前壁運(yùn)動(dòng)減弱。B在MI后21天(處理后14天)MI-IH組的M型影像，心室擴(kuò)張降低和心臟收縮功能改善。C和DMI后35天(處理28天)，左心室擴(kuò)張且前壁運(yùn)動(dòng)異常在MI-Nor組中持續(xù)，但在MI-IH組中消失了。
圖4.間歇性低氧治療減少心肌梗塞面積。Evan’s藍(lán)和TTC染色。A.由Evan’s藍(lán)確定心肌梗塞面積，而非梗塞的(染成紅色)和梗塞的(未染色)區(qū)域在與1％氯化三苯基四氮唑孵育后確定。B.以冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎手術(shù)后21天和35天(處理后14天和28天)的心肌梗塞面積的百分?jǐn)?shù)表示的心肌梗塞面積。結(jié)果以每組4-5個(gè)心臟的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示。與MI-Nor組相比，*p＜0.05。
圖5.間歇性低氧治療促進(jìn)心肌微血管的增生。免疫組織化學(xué)染色梗塞組織的外周的CD34。A.S-Nor(a)，S-IH(b)，MI-Nor(c)，MI-IH(d)組在MI 21天后(14天IH或正常含氧量處理后)的免疫組化染色。B.S-Nor(a)，S-IH(b)，MI-Nor(c)，MI-IH(d)組在MI35天后(28天IH或含氧量處理后)的免疫組化染色。可觀察到毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞變薄且缺少平滑肌細(xì)胞，刻度標(biāo)記為50μm。C.每mm2梗塞區(qū)域中IH處理對(duì)于毛細(xì)血管的平均數(shù)的影響，與MI-Nor相比，毛細(xì)血管的平均數(shù)明顯增加(*p＜0.05，**p＜0.01，MI-IH)。
圖6.間歇性低氧治療促進(jìn)心肌組織VEGF蛋白的表達(dá)。A.假手術(shù)、冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎手術(shù)21和35天后，用大鼠心肌內(nèi)免疫印跡來(lái)指示間歇性低氧處理對(duì)于VEGF表達(dá)的影響；VEGF蛋白以25kDa表達(dá)。在6個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中獲得相似的結(jié)果(每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)。B.免疫印跡的平均光密度結(jié)果。VEGF蛋白含量以Sham-Nor組的平均值百分比表示。與相應(yīng)的常氧組相比，*p＜0.05，**p＜0.01。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)間歇性低氧作為一種干預(yù)治療手段，對(duì)心肌梗塞具有緩解和治療作用。所述間歇性低氧通過(guò)低氧系統(tǒng)(更特別的為低氧艙)來(lái)實(shí)施?；诖?，完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“間歇性低氧”是一種治療干預(yù)手段，指間隔給予動(dòng)物低氧-常氧-低氧循環(huán)的環(huán)境。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“低氧”是指氧分壓Po2＝84±20mmHg或11.2±2.8kPa；更特別的，氧分壓Po2＝84±10mmHg或11.2±1.4kPa；最佳的，氧分壓Po2＝84±5mmHg或11.2±0.5kPa。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“常氧”是指氧分壓Po2＝159±20mmHg(或20.7kPa±3kPa)；更特別的，氧分壓Po2＝159±10mmHg(或20.7kPa±1.5kPa)；更佳的，氧分壓Po2＝159±5mmHg(或20.7kPa±0.5kPa)。
在本發(fā)明中，“低氧系統(tǒng)”是指一種可制造低氧環(huán)境的設(shè)備，其也可稱為“低氧設(shè)備”、“低氧艙”、“低壓氧艙”等。
本發(fā)明人的研究結(jié)果顯示，在大鼠心肌梗塞后，給予間歇性低氧治療，即每天在相當(dāng)于5000米海拔高度(即Po2＝159±20mmHg或20.7kPa±3kPa)的低壓氧艙中生活4-8小時(shí)，然后恢復(fù)常氧環(huán)境，連續(xù)治療10-30天后，間歇性低氧能明顯促進(jìn)心梗后大鼠心功能的恢復(fù)，減少心梗面積，增加冠脈流量，促進(jìn)微血管的增生，對(duì)大鼠心肌梗塞有明顯的改善作用。由此，提示間歇性低氧對(duì)于人的心肌梗塞的緩解和治療也可產(chǎn)生明顯作用。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1低氧系統(tǒng)一種用于制備治療心肌缺血、梗塞的氧氣艙設(shè)備，所述的氧氣艙設(shè)備包括一個(gè)封閉的艙體，所述艙體中包括氧氣供給裝置，氧氣排出裝置，以及含氧量檢測(cè)裝置，其中，所述的氧氣供給裝置提供氧氣，所述的氧氣排出裝置可排出氧氣。
該氧氣艙可使得其內(nèi)的氧氣滿足以下條件氧分壓Po2＝84±20mmHg或11.2±2.8kPa。
在使用時(shí)，調(diào)節(jié)氧氣供給裝置，使氧氣艙內(nèi)的氧分壓穩(wěn)定在Po2＝84±1mmHg或11.2±0.14kPa，將哺乳動(dòng)物置于其內(nèi)，維持有效長(zhǎng)時(shí)間(如6小時(shí))后，關(guān)閉氧氣供給裝置，使氧氣維持在常氧范圍(Po2＝159mmHg±20mmHg(或20.7kPa±3kPa))小時(shí)。重復(fù)上述步驟10-30天，即可達(dá)到治療或緩解心肌梗塞的效果。
實(shí)施例2動(dòng)物分組和動(dòng)物模型的建立I.動(dòng)物分組雄性Sprague-Dawley大鼠(體重150-180克)均為清潔級(jí)動(dòng)物，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。如圖1所示，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，大鼠被隨機(jī)分組。
分組后，對(duì)其中一部分大鼠行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎手術(shù)(LADocclusion)，造成大鼠急性心肌梗塞。另一部分大鼠則作為假手術(shù)組(Shamsurgery)，不對(duì)其冠狀動(dòng)脈進(jìn)行結(jié)扎。術(shù)后在常溫條件下密切觀察7天。然后大鼠被隨機(jī)分組至常氧環(huán)境繼續(xù)生活，或至低壓氧艙中治療。本發(fā)明人將心梗后的大鼠置于低壓氧艙中治療14天和28天，即大鼠心梗7天后，每天在相當(dāng)于5000米海拔高度的低壓氧艙中生活6小時(shí)，然后恢復(fù)至常氧環(huán)境，連續(xù)治療14天和28天(MI-IH組)。常氧組大鼠在心梗7天后，也在常氧條件下連續(xù)生活14天和28天作為對(duì)照觀察(MI-Nor組)。MI-IH和MI-Nor組分別設(shè)假手術(shù)組Sham-IH，Sham-Nor。所有的大鼠分別在術(shù)前、術(shù)后7天、術(shù)后21天(治療14天)和術(shù)后35天(治療28天)測(cè)量體重及動(dòng)脈血壓。
II.建立大鼠心肌梗塞模型1.實(shí)驗(yàn)器械與試劑包括動(dòng)物人工呼吸機(jī)(DW2000 volume-cycled rodent ventilator，Jiapen Technology，Co，Shanghai)、心電圖儀、頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺針、常規(guī)手術(shù)器械、1％戊巴比妥鈉、70％酒精、醫(yī)用縫合線、6/0的醫(yī)用無(wú)損傷縫合針、醫(yī)用透氣膠布。
2.實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)大鼠心臟的冠狀動(dòng)脈左前降支進(jìn)行結(jié)扎，使大鼠左心室前壁缺血造成心肌梗塞。給予大鼠腹腔內(nèi)注射1％戊巴比妥鈉(50mg/kg)后，將大鼠置于手術(shù)板上。頸部和左胸脫毛后，用70％酒精消毒。沿頸部正中切開然后逐層分離，暴露氣管。將頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺針沿大鼠甲狀軟骨下氣管第2-3軟骨環(huán)縫隙內(nèi)插入，隨后立即接上動(dòng)物呼吸機(jī)，維持通氣量45-50次/分。在左胸第3-4肋骨處，打開胸腔，剪去心外膜，暴露心臟。冠狀動(dòng)脈左前降支一般沿左心房與肺動(dòng)脈圓錐之間的動(dòng)脈溝出發(fā)，基本與室間隔平行前行。由左前降支出發(fā)點(diǎn)向后向下約1-2mm處用6-0醫(yī)用無(wú)損傷縫合針結(jié)扎，注意結(jié)扎時(shí)避免穿破心臟。結(jié)扎成功后肉眼直接可觀察到左心室前壁顏色改變，心臟收縮減弱。冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后逐層縫合，關(guān)閉胸腔。術(shù)后撤去呼吸機(jī)，幾秒鐘后待大鼠恢復(fù)自主呼吸，直接接上心電圖儀記錄大鼠術(shù)后的心電。心電圖監(jiān)護(hù)可見肢導(dǎo)R波振幅升高，I，aVL導(dǎo)聯(lián)ST段明顯抬高，證明結(jié)扎成功。
實(shí)施例3間歇性低氧對(duì)大鼠生理參數(shù)的影響測(cè)量血液參數(shù)指標(biāo)在心梗手術(shù)后21天，35天(也即術(shù)后常氧或間歇性低氧治療14天，28天)，將大鼠麻醉后，從腹股溝動(dòng)脈處采血1ml，分別測(cè)得外周血血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞記數(shù)和白細(xì)胞記數(shù)。
結(jié)果，各組大鼠體重、動(dòng)脈血壓、血紅蛋白及紅細(xì)胞計(jì)數(shù)值見表1。在術(shù)后第7天，四組大鼠動(dòng)脈血壓基本一致。心梗手術(shù)后經(jīng)間歇性低氧治療14天，28天后分別發(fā)現(xiàn)MI-IH組大鼠的血壓值較常氧組(MI-Nor)升高(14天后，間歇性低氧組比常氧組＝142.8±1.4比125.1±1.8，p＜0.01；28天后，間歇性低氧組比常氧組＝153.1±1.5比132.8±1.7，p＜0.01)，但這些大鼠的血壓值均在生理范圍內(nèi)。由此可見，大鼠心肌梗塞后經(jīng)間歇性低氧治療14天和28天，動(dòng)脈血壓值有一定程度的升高，但并未導(dǎo)致高血壓。
大鼠心肌梗塞后經(jīng)間歇性低氧治療14天、28天，其血紅蛋白值和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)與常氧組(MI-Nor)相比，均無(wú)明顯差異(p＞0.05)。心梗后IH治療對(duì)血紅蛋白和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)明顯影響。
表1 各組大鼠體重、動(dòng)脈血壓、血紅蛋白及紅細(xì)胞計(jì)數(shù)值

與相應(yīng)的假手術(shù)值相比，*p＜0.05；與相應(yīng)的正常含氧值相比，**p＜0.01；p＜0.05，p＜0.01。
實(shí)施例4間歇性低氧對(duì)大鼠心功能具有保護(hù)作用1.離體心臟Langendorff灌流1)灌流液Krebs-Henseleit buffe(mM)118 NaCl，4.7 KCl，1.2 KH2PO4，1.2 MgSO4，1.8 CaCl·2H2O，25 NaHCO3，11 Glucose。超純水配置，pH7.4，以95％O2，5％CO2混合氣體充灌30分鐘。
2)恒壓Langendorff灌流裝置此系統(tǒng)主要由管道系統(tǒng)、恒溫系統(tǒng)、氧合器和恒流泵組成。氧合器用于灌流液的供氧；恒流泵用于控制灌流系統(tǒng)的灌注壓，本實(shí)驗(yàn)灌注壓恒定于80mmHg；恒溫系統(tǒng)則使灌流液保持恒定溫度，本實(shí)驗(yàn)所用灌流液溫度為37℃。
3)實(shí)驗(yàn)操作雄性S.D大鼠，1％戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉。仰位固定，打開胸腔，迅速取出心臟置于冰冷的K-H液中(4℃)；剪開心包，分離主動(dòng)脈，將充滿灌流液的套管插入主動(dòng)脈，結(jié)扎固定；注入灌流液排出心臟內(nèi)剩余血液，將主動(dòng)脈套管快速連于Langendorff灌流裝置。在左心房側(cè)壁剪一小口，將小乳膠水囊通過(guò)房室瓣插入左心室。和乳膠水囊相連的導(dǎo)管通過(guò)三通管連接壓力轉(zhuǎn)換器。壓力轉(zhuǎn)換器(model Gould P23 Db，AC Instrument Ltd.Australia)信號(hào)通過(guò)橋式放大器輸入多導(dǎo)記錄系統(tǒng)(PowerLab system，Australia)，通過(guò)計(jì)算機(jī)運(yùn)行chart軟件完成信號(hào)的實(shí)時(shí)采集和處理。流量檢測(cè)裝置直接連于多導(dǎo)記錄系統(tǒng)，記錄冠脈流量(CF)。記錄的心功能參數(shù)包括心率(HR)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室峰壓(LVPSP)、左心室發(fā)展壓(LVDP＝LVPSP-LVEDP)、左心室等容期壓力最大變化速率(±LVdp/dt max)。離體心臟經(jīng)20分鐘平衡灌流后，取下心臟，液氮速凍，用于分子生物學(xué)檢測(cè)；或10％中性福爾馬林固定，用于病理學(xué)檢測(cè)；或進(jìn)行Evan’s染色，測(cè)量心肌梗塞面積。
結(jié)果如表2所示，經(jīng)常氧或間歇性低氧處理14天，28天后，各組大鼠心率值基本一致。離體心臟Langendorff灌流顯示MI-Nor組與MI-IH組之間心臟收縮功能有顯著差異，主要表現(xiàn)在LVDP，±LVdp/dt數(shù)值上。在假手術(shù)組大鼠(sham groups)，除冠脈流量之外，其各項(xiàng)心功能參數(shù)在常氧組與間歇性低氧組之間均無(wú)明顯變化(S-Nor比S-IH，p＞0.05)。心肌梗塞大鼠在間歇性低氧治療14天和28天后，與常氧組相比，LVDP，±LVdp/dt max各項(xiàng)指標(biāo)均有明顯改善。心肌梗塞后經(jīng)間歇性低氧治療一段時(shí)間，可促進(jìn)大鼠心功能的恢復(fù)。
在假手術(shù)組大鼠，經(jīng)IH處理14天和28天后，與常氧組比較，冠脈流量明顯增加(14天，間歇性低氧組比常氧組＝21.2±0.8比15.1±1.5，p＜0.01；28天，間歇性低氧組比常氧組＝18.9±2.4比13.2±0.8，p＜0.01)，CF值分別增加了40.9％和43.9％。同樣，心梗后的大鼠經(jīng)IH治療14天，28天后，與常氧組相比，CF也顯著增加(14天，間歇性低氧組比常氧組＝15.9±0.6比12.5±0.6，p＜0.05；28天，間歇性低氧組比常氧組＝16.6±0.6比12.7±0.8，p＜0.05)，CF值分別增加了26.8％和30.8％。這說(shuō)明間歇性低氧的參與能明顯增加冠脈流量，改善心肌缺血狀態(tài)。
表2.IH治療對(duì)大鼠離體心功能指標(biāo)的影響

與相應(yīng)的假手術(shù)值相比，*p＜0.05，**p＜0.01；與相應(yīng)的常氧組相比，p＜0.05，p＜0.01。
2.超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)所有試驗(yàn)動(dòng)物在心梗前，心梗后第7天，第21天及第35天均進(jìn)行了經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢查。以往的報(bào)道已經(jīng)證實(shí)了大鼠經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖的精確性和可重復(fù)性。超聲心動(dòng)圖使用商業(yè)購(gòu)買的15-MHz線陣探頭(Philips Sonos 5500成像系統(tǒng)，S12)進(jìn)行，檢查期間所有大鼠均用戊巴比妥鈉麻醉，平臥位于左側(cè)胸骨旁切面記錄圖像。采用二維超聲引導(dǎo)下M型超聲心動(dòng)圖，在心室腔最大的短軸切面上測(cè)量室間隔厚度(IVS)，左室后壁厚度(LVPW)，左室舒張末期內(nèi)徑(LVDD)，左室收縮末期內(nèi)徑(LVDS)。儀器將自動(dòng)計(jì)算出左室射血分?jǐn)?shù)(EF)，以及短軸縮短率(FS)。所有的測(cè)量均由一位有經(jīng)驗(yàn)的且不知道分組情況的技術(shù)員進(jìn)行，所有測(cè)值均為3個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期的平均值。心梗后第七天EF≥90％的大鼠視為心梗不顯著而被剔除。
術(shù)前，心梗后第7天，第21天(即治療后第14天)，以及術(shù)后第35天(即治療后第28天)的超聲心動(dòng)圖測(cè)值列于表3。各組在術(shù)前超聲心動(dòng)圖指標(biāo)無(wú)顯著差異。冠脈結(jié)扎后第7天，IH治療的MI組(MI-IH)以及常氧(normoxia)治療的MI組(MI-Nor)的所有心超指標(biāo)較術(shù)前均有顯著變化，室間隔厚度(IVS)變薄，分別下降18.2％和19.4％；左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDD)擴(kuò)張27.8-36.7％，射血分?jǐn)?shù)(EF)和短軸縮短率(FS)分別下降27.9-29％和45.8-46.9％。心梗后第7天，MI-IH組與MI-Nor兩組之間各指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與假手術(shù)組相比，兩個(gè)心梗組的指標(biāo)均有顯著變化。這提示心梗模型的成功建立，而且MI-IH組與MI-Nor組的基礎(chǔ)水平具有可比性。
如圖2A所示，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，sham組大鼠射血分?jǐn)?shù)(EF％)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，其數(shù)值基本保持穩(wěn)定。MI-Nor組大鼠在心梗手術(shù)后7天，EF值明顯下降(92.6％比66.7％)，而且隨時(shí)間的延長(zhǎng)，其EF值始終維持在較低水平。MI-IH組大鼠在心梗術(shù)后7天EF值下降至65.5％，但經(jīng)間歇性低氧治療14天后，其EF值與MI-Nor組相比顯著上升(MI-IH比MI-Nor＝71.5±2.7％比58.2±3.5％，p＜0.05)。在IH治療28天后，MI-IH與MI-Nor二組之間EF值的差異仍然十分顯著(MI-IH比MI-Nor＝72.5±3.6％比60.6±3.5％，p＜0.05)。
如圖2B所示，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，sham組大鼠左室舒張末期內(nèi)徑(LVDD)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化。冠脈結(jié)扎術(shù)后7天，MI-Nor與MI-IH二組大鼠LVDD明顯擴(kuò)大(MI-Nor組由0.5020.008至0.6420.021，p＜0.05；MI-IH組由0.4630.029至0.6330.016，p＜0.05)。心梗后第21天(即治療后14天)，MI-Nor組大鼠LVDD繼續(xù)顯著擴(kuò)大，而MI-IH組大鼠經(jīng)間歇性低氧治療，其LVDD增加程度明顯低于MI-Nor組(0.8220.03比0.7080.03，p＜0.05)。該現(xiàn)象在心梗后第35天(即治療后28天)仍然明顯(0.8740.05比0.7550.03，p＜0.05)。
M型超聲心動(dòng)圖顯示(圖3)，與MI-Nor組左室前壁收縮減弱或收縮消失形成對(duì)比，梗死的心臟在接受間歇性低氧治療14天后(MI-IH)左室前壁運(yùn)動(dòng)改善，IH阻止LVDD的進(jìn)一步擴(kuò)大，心室功能良好。2周后，MI-Nor組仍持續(xù)存在左室擴(kuò)張和前壁運(yùn)動(dòng)異常，而MI-IH組在IH治療28天后上述現(xiàn)象消失，心臟收縮功能明顯改善。
實(shí)施例5間歇性低氧減少心肌梗塞面積1)試劑Evan’s藍(lán)染料(Sigma)氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma)0.05M PBS緩沖液0.2M磷酸緩沖液(pH7.4)2)步驟離體心臟灌流后，從Langendorff灌流裝置上取下心臟，由主動(dòng)脈內(nèi)注入1ml 0.5-1％的Evan’s染料，將正常心肌與缺血區(qū)心肌(area at risk)區(qū)分開。然后用生理鹽水沖洗干凈，將心臟放于液氮中快速冷凍20min。由液氮中取出心臟，順?lè)渴覝蠌男募獠恐列幕科叫袑⒋笫笮氖仪谐?.1-0.2cm厚的心肌片，將心肌片放在1％TTC溶液中37℃溫孵10-15min。染色過(guò)程中不時(shí)搖動(dòng)染色液使之與心肌充分接觸。染色后立即用水沖洗去多余的染料。心肌梗死區(qū)不著色，呈灰白色；缺血但仍存活的心肌被TTC染成紅色。染色結(jié)束后將心肌切片置于10％中性福爾馬林溶液中固定，以增強(qiáng)染色強(qiáng)度。將染色后的心肌切片平鋪于二塊載玻片之間，照相，掃描，用電腦軟件圖像分析法(image-proplus 5.0)確定心肌梗死的面積。心肌梗死范圍以每一心臟總梗死面積(IF)占總?cè)毖獏^(qū)面積(area at risk，AR)的百分比表示。
離體心臟灌流后，取下心臟，用Evan′s藍(lán)和1％TTC染色后，計(jì)算心肌梗塞面積。結(jié)果顯示(圖4)，心梗后21天(即治療后14天)MI-IH組心梗面積為21.7±3.1％，與MI-Nor組35.9±4.3％相比，明顯減少(p＜0.05)。在心梗后35天(即治療后28天)，MI-Nor組心梗面積達(dá)到55.0±6.4％，而MI-IH組經(jīng)間歇性低氧治療，心梗面積縮小至32.6±4.2％，二者存在顯著差異(p＜0.05)。所以，大鼠心肌梗塞后經(jīng)間歇性低氧治療14天、28天，可有效減少心梗面積，提高心肌的存活能力，對(duì)心臟起到保護(hù)作用。
實(shí)施例6間歇性低氧促進(jìn)心肌微血管形成(1)試劑二甲苯 無(wú)水酒精 95％酒精 3％H2O2(甲醇)0.01M PBS緩沖液pH 7.2-7.60.1M枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)DAB顯色劑小鼠抗大鼠CD34單克隆抗體，使用濃度1∶100(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)羊抗鼠二抗(即用型，長(zhǎng)島公司EnVisionTM試劑)(2)免疫組織化學(xué)染色離體心臟灌流后，取下心臟，用生理鹽水沖洗干凈，10％中性福爾馬林固定心臟標(biāo)本。順?lè)渴覝嫌尚募獠恐凉跔顒?dòng)脈左前降支結(jié)扎處平行切取三塊心臟組織，厚約2mm。常規(guī)石蠟包埋后，采用免疫組織化學(xué)EnVision二步法進(jìn)行染色。玻片經(jīng)APES(Sigma公司)、丙酮預(yù)處理，4～5um厚石蠟切片，60℃烘烤2h。二甲苯脫蠟，梯度乙醇入水。3％H2O2(甲醇)溶液孵育20min，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，蒸餾水漂洗。切片置于pH 6.0的枸櫞酸鹽緩沖液內(nèi)，微波抗原修復(fù)98℃15min，室溫冷卻20min后PBS漂洗3次；然后滴加一抗，4℃濕盒孵育過(guò)夜。PBS漂洗3次，EnVisionTM二抗室溫孵育30min，PBS漂洗3次，DAB顯色，蘇木精襯染，常規(guī)梯度乙醇脫水，樹脂封片。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。
(3)CD34免疫組化染色可以顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞心肌細(xì)胞之間微血管呈單個(gè)內(nèi)皮或成簇內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性。每個(gè)標(biāo)本選三張切片，每一張切片選取5個(gè)血管密度最多的區(qū)域，然后在400倍視野下分別記數(shù)毛細(xì)血管數(shù)目，取其平均值。
計(jì)算毛細(xì)血管密度(/mm2)＝平均毛細(xì)血管數(shù)/400倍視野(0.2mm2)，觀察心肌內(nèi)毛細(xì)血管數(shù)量的變化。
結(jié)果本實(shí)施例應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法，用CD34抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，來(lái)反映心肌組織中血管增生的情況。心肌梗死后在梗塞區(qū)周圍的心內(nèi)膜下可見較多新生毛細(xì)血管，每張切片選取五個(gè)不重疊的區(qū)域，在高倍視野下(×400倍)計(jì)數(shù)毛細(xì)血管密度(/mm2)。結(jié)果顯示，心梗后21天(即治療后14天)，MI-IH組經(jīng)間歇性低氧治療，與常氧組MI-Nor相比，毛細(xì)血管密度顯著增加(624±40.7比397.1±42.5/mm2，p＜0.05)。從圖5可見，MI-IH組在心梗周圍毛細(xì)血管增生活躍，排列密集。心梗后35天(即治療后28天)，MI-IH組毛細(xì)血管密度進(jìn)一步增加，與MI-Nor組之間繼續(xù)存在顯著差異(MI-IH比MI-Nor＝919.3±98.4比516.4±50.7，p＜0.05)。
由此可見，間歇性低氧治療可促進(jìn)心肌梗塞后心肌微血管的增生，改善心肌的缺血程度。
實(shí)施例7.
間歇性低氧促進(jìn)VEGF蛋白的表達(dá)(1)試劑和溶液二硫蘇糖醇(DTT)、Tween-20、十二烷基硫酸鈉(SDS)、牛血清白蛋白(BSA)、蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail)一級(jí)抗體小鼠抗大鼠VEGF購(gòu)自Santa Cruz公司(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)二級(jí)抗體HRP酶標(biāo)羊抗鼠IgG、蛋白電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自Sigma公司(St.Louis，MO，USA)；Triton X-100、苯甲基磺酰氟(PMSF)、TEMED購(gòu)自MERCK公司(Merck KGaA，64271 Darmstadt，Germany)；丙烯酰胺(Acrylamide)、雙丙烯酰胺(Bisacrylamide)為Fluka公司產(chǎn)品(Buchs，Switzerland)；硝化纖維素膜購(gòu)自Amersham公司(Buckinghamshire，UK)；化學(xué)熒光顯色劑-Western Blotting Chemiluminescence Reagent，購(gòu)自PE公司(PerkinElmer Life Science.Inc)其它化學(xué)試劑包括Tris-Base、Glycine、EDTA、sodium vanadate、CoomassieBrilliant Blue G-250、Coomassie Brilliant Blue R-250、Bromophenol Blue等均為分析純級(jí)國(guó)產(chǎn)試劑。
勻漿緩沖液A(mM)Tris 50.0，pH 7.4，EDTA 1.0，DTT 0.5，PMSF 0.4，Na3VO4 1.0，Protease Inhibitor Cocktail 0.02％(V/V)，pH 7.4；Bradford蛋白測(cè)定液乙醇95％w/v，磷酸85％w/v和超純水以1∶2∶17的體積混合加入終濃度為0.1mg/ml的Coomassie Brilliant Blue G-250，以濾紙抽氣過(guò)濾；2倍樣本緩沖液(mM)Tris-HCl 125.0，SDS 4.0％(w/v)，Bromophenol Blue0.005％(w/v)，Sucrose 350.0，DTT 150.0，pH 6.8；丙烯酰胺貯備液30g丙烯酰胺和0.8g雙丙烯酰胺溶于超純水，終體積為100ml，以定性濾紙過(guò)濾，4℃避光存放；8倍分離膠緩沖液貯備液Tris-HCl(pH 8.8)3.0M，SDS 1.0％(w/v)，4℃存放備用；4倍濃縮膠緩沖液貯備液Tris-HCl(pH 6.8)0.5M，SDS 0.4％(w/v)，4℃存放備用；濃縮膠貯備液丙烯酰胺貯備液16.7％(v/v)，4倍濃縮膠緩沖液貯備液25％(v/v)，4℃避光存放；10％過(guò)硫酸銨(w/v)使用前新鮮配制，一周內(nèi)使用；電泳槽電極液Tris-Base 25mM，Glycine 0.25M，SDS 0.1％(w/v)，pH8.3；
轉(zhuǎn)移槽電極液Tris-Base 25mM，Glycine 192mM，甲醇20％(v/v)，pH 8.3；TBST緩沖液(Tris-Buffer Saline containing Tween-20)Tris-Base 20mM，NaCl 137mM，Tween-20 0.1％(v/v)，pH 7.6；抗體封閉液含有2％BSA的TBST緩沖液。
(2)蛋白的提取分離和定量蛋白的提取分離(以下所有操作均在冰水浴或低溫下進(jìn)行)心肌組織(約50～100mg)自液氮中取出，加入0.5ml預(yù)冷的勻漿緩沖液，在4℃以高速勻漿機(jī)將心肌組織徹底勻漿，勻漿后置于冰上30min。將勻漿液倒入1.5ml Eppendorff管，在4℃以10,000g/min的速度離心20min，將離心分層后的上清液分裝，置-70℃冰箱內(nèi)保存。
Bradford法蛋白定量以高純度BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白(1mg/ml)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，取10μl的樣本加入1ml的Bradford蛋白測(cè)定液，混合均勻；室溫靜置五分鐘后，以紫外可見光光度計(jì)(Lambda 2S UV/VIS型Perkin Elmer公司Germany)讀取595nm之OD值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本的蛋白濃度。
(3)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)變性蛋白質(zhì)樣本的制備取50μg的蛋白樣本加入4倍蛋白樣本緩沖液，混合均勻，在沸水浴中煮沸10min后，立即放入0℃的冰水浴中冷卻并分裝，置-70℃冰箱冷藏。
SDS-PAGE凝膠(12％)的制備加入3.2ml的30％丙烯酰胺貯備液、1ml的8倍分離膠緩沖貯備液和3.8ml的超純水，混合均勻；再加入10％的過(guò)硫酸銨80μl和TEMED 8μl，迅速攪拌混勻，倒入裝置好的玻璃槽中約4/5高，上面輕輕地覆以超純水隔離膠體與空氣，并使表面平整；待膠體凝結(jié)后，倒掉純水，并以超純水沖洗干凈，以定性濾紙吸干表面水分，取配制好的濃縮膠(5％貯備液)3ml，加入10％的過(guò)硫酸銨30μl和TEMED 3μl，迅速均勻后，倒入玻璃槽內(nèi)，插入樣品梳，待膠體凝結(jié)后取出樣品梳。
電泳在電泳槽內(nèi)加入電泳槽電極液，趕出樣品槽內(nèi)的氣泡。在樣品槽內(nèi)分別加入蛋白電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)品陽(yáng)性對(duì)照和蛋白樣本，樣本上樣量均為50μg；接通電源，先以80V的恒壓電泳40min，再以120V的恒壓繼續(xù)電泳約2-3h，至溴酚蘭染料跑至凝膠底部結(jié)束電泳。
轉(zhuǎn)膜將取下的SDS-PAGE電泳膠體、硝化纖維素膜、定性濾紙以及纖維墊放在電泳槽轉(zhuǎn)移液內(nèi)，以?shī)A三明治方式(中間為膠體和硝化纖維素膜，外面分別夾以濾紙和纖維墊)夾牢，徹底清除內(nèi)部的氣泡；然后放入裝滿電極液的轉(zhuǎn)移槽內(nèi)；正確接通電極和電源，通以150mA的恒流約4h，將膠體上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝化纖維素膜上。
抗體標(biāo)記將轉(zhuǎn)印有蛋白的硝化纖維素膜取出，標(biāo)記方向和蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)印記；然后浸入抗體封閉液，搖床上室溫下孵育2h以封閉非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)；將硝化纖維素膜浸于含有一抗(Primary antibodyanti-VEGF 1∶1000稀釋)的一抗孵育液中，4℃孵育過(guò)夜，以TBST于搖床上洗膜10min×3次。將硝化纖維素膜浸入含有辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二級(jí)抗體(Secondary antibody，Goatanti-mouse horseradish peroxidase 1∶5000)的二抗孵育液中，室溫下?lián)u晃孵育2h，再以TBST洗膜15min×3次。
顯色成像利用辣根過(guò)氧化酶顯色劑的化學(xué)熒光方法，使X感光膠片成像來(lái)檢測(cè)相關(guān)蛋白的位置及其含量；用掃描儀將圖像輸入計(jì)算機(jī)再用蛋白條帶分析軟件Gel-Pro Analyzer 3.0，Media Cybernetics，USA來(lái)對(duì)相關(guān)蛋白進(jìn)行定量。
數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±S.E)表示。不同處理組之間比較通過(guò)單因素方差分析ANOVA或Student’st檢驗(yàn)進(jìn)行。P＜0.05時(shí)差異具有顯著性。
Western Blot免疫印跡法檢測(cè)心肌組織中VEGF蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示(圖6)，大鼠心肌梗塞后21天(即治療后14天)，間歇性低氧組(MI-IH)VEGF表達(dá)值為247±34.1，顯著高于常氧組(MI-Nor)134.6±19.7(p＜0.05)。在心梗后35天(即治療后28天)，這二組VEGF表達(dá)的差異依舊十分顯著(MI-IH 2 44.9±26.7比MI-Nor 123.5±5.3，p＜0.01)。這提示間歇性低氧治療可提高大鼠心肌梗塞后心肌組織中VEGF蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)微血管的增生。
綜上，本發(fā)明證實(shí)了間歇性低氧對(duì)大鼠心肌梗塞具有明顯的治療作用。IH能促進(jìn)梗塞后大鼠心功能的恢復(fù)，減少心肌梗塞面積。IH通過(guò)誘導(dǎo)VEGF表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)心肌組織內(nèi)微血管增生，減少心肌細(xì)胞損傷，對(duì)大鼠心肌梗塞有顯著的改善作用。間歇性低氧作為一種新的干預(yù)治療手段，為心肌梗塞的臨床治療提供了新的途徑。
討論本發(fā)明在大鼠心肌梗塞后，將間歇性低氧作為一種干預(yù)治療手段，研究間歇性低氧治療對(duì)大鼠心肌梗塞是否具有保護(hù)作用。研究結(jié)果第一次表明，在相當(dāng)于海拔高度5000米的低壓氧艙中給予間歇性低氧治療14天和28天，對(duì)于缺血和梗塞的心肌均具有明顯的改善作用。這一新的心肌保護(hù)作用具體表現(xiàn)在通過(guò)IH治療，可改善大鼠心梗后的心功能，有助于心功能的恢復(fù)；有效地減少心肌梗塞面積，提高心肌的存活能力；增加心肌組織內(nèi)VEGF蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)心肌內(nèi)毛細(xì)血管的增生，增加冠狀動(dòng)脈流量，改善心肌缺血程度。同時(shí)，經(jīng)IH治療14天和28天后，與常氧對(duì)照組相比，大鼠外周血中血紅蛋白濃度和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)沒(méi)有明顯增加，表明IH對(duì)心肌梗塞的治療并不影響這二者的水平，從而可減少因血細(xì)胞容積增多導(dǎo)致血栓形成的危險(xiǎn)性。因此，本發(fā)明的研究結(jié)果表明，IH治療對(duì)大鼠慢性心肌缺血損傷具有一定的保護(hù)作用。
以往過(guò)多的研究集中在缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning)對(duì)心肌的保護(hù)方面。心肌缺血預(yù)適應(yīng)(IPC)是指心肌在經(jīng)歷了一次或多次短暫的缺血/再灌注后，對(duì)隨后發(fā)生的長(zhǎng)時(shí)間缺血損傷的耐受性明顯增強(qiáng)。此現(xiàn)象在1986年首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已在不同種屬動(dòng)物、不同臟器得到驗(yàn)證，說(shuō)明IPC是廣泛存在的機(jī)體保護(hù)性防御反應(yīng)。間歇性低氧適應(yīng)能提高心肌對(duì)缺血/再灌注損傷的耐受性)；提高心肌的抗氧化能力和對(duì)氧的利用能力，減少再灌注性心律失常；減輕心肌細(xì)胞壞死和凋亡，促進(jìn)心肌功能的恢復(fù)等。間歇性低氧能提高心肌抗缺血缺氧能力，對(duì)提高人體健康狀況和運(yùn)動(dòng)能力具有積極的意義。目前，許多實(shí)驗(yàn)都是將間歇性低氧作為一種預(yù)適應(yīng)手段(IH preconditioning)，而未見有關(guān)將間歇性低氧用于治療方面的研究報(bào)道。本發(fā)明第一次將間歇性低氧用于大鼠心肌梗塞后的治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IH同樣也具有明顯的治療作用，可改善心肌梗死后的心功能，促進(jìn)心肌組織內(nèi)血管的增生等。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種氧氣艙設(shè)備的用途，其特征在于，用于制備治療心肌缺血、梗塞的設(shè)備，所述的氧氣艙設(shè)備包括一個(gè)封閉的艙體，所述的艙體中包括氧氣供給裝置，氧氣排出裝置，以及含氧量檢測(cè)裝置，其中，所述的氧氣供給裝置提供氧氣，使得氧氣艙內(nèi)的氧氣滿足以下條件氧分壓Po2＝84±20mmHg。
2.一種氧氣的用途，其特征在于，用于制造治療心肌缺血、梗塞的設(shè)備或制劑。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的氧氣在治療心肌缺血、梗塞的設(shè)備中以低氧-常氧相間隔的方式給予，并且，所述低氧-常氧相間隔的時(shí)間為低氧6±2小時(shí)，常氧18±2小時(shí)；所述的低氧為氧分壓Po2＝84±20mmHg，所述的常氧為氧分壓Po2＝159±20mmHg。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述低氧-常氧相間隔的時(shí)間為低氧6±1小時(shí)，常氧18±1小時(shí)；所述的低氧為氧分壓Po2＝84±10mmHg，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±10mmHg。
5.一種治療哺乳動(dòng)物心肌缺血、梗塞的方法，其特征在于，采用間歇性低氧處理來(lái)實(shí)施治療，包括步驟使所述哺乳動(dòng)物在低氧-常氧相間隔的環(huán)境中進(jìn)行治療，并且，每天將患有心肌梗塞的哺乳動(dòng)物置于低氧環(huán)境中生活6±2小時(shí)，其余18±2小時(shí)置于常氧環(huán)境；所述的低氧為氧分壓Po2＝84±20mmHg，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±20mmHg；連續(xù)治療7-50天。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，每天將患有心肌梗塞的哺乳動(dòng)物置于低氧環(huán)境中生活6±1小時(shí)，其余18±1小時(shí)置于常氧環(huán)境；所述的低氧為氧分壓Po2＝84±10mmHg，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±10mmHg；連續(xù)治療7-35天。
7.一種提高患心肌梗塞的哺乳動(dòng)物心肌組織中新生毛細(xì)血管生長(zhǎng)的方法，其特征在于，將所述哺乳動(dòng)物置于低氧-常氧相間隔的環(huán)境中，并且，每天將患有心肌梗塞的哺乳動(dòng)物置于低氧環(huán)境中生活6±2小時(shí)，其余18±2小時(shí)置于常氧環(huán)境；所述的低氧為氧分壓Po2＝84±20mmHg，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±20mmHg；連續(xù)治療7-50天。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述低氧-常氧相間隔的時(shí)間為低氧6±1小時(shí)，常氧18±1小時(shí)；所述的低氧為環(huán)境中的氧分壓Po2＝84±10mmHg，所述的常氧為氧分壓Po2＝159mmHg±10mmHg；連續(xù)治療7-35天。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種低氧系統(tǒng)的新用途，用于心肌缺血、梗塞的治療。本發(fā)明還公開了氧在制造心肌缺血、梗塞治療設(shè)備中的用途。本發(fā)明還公開了一種治療哺乳動(dòng)物心肌缺血、梗塞的方法，采用間歇性低氧處理來(lái)實(shí)施治療。本發(fā)明證實(shí)了間歇性低氧對(duì)大鼠心肌缺血、梗塞具有明顯的治療作用，其作為一種新的干預(yù)治療手段，為心肌缺血、梗塞的臨床治療提供了新的途徑。
文檔編號(hào)A61K9/10GK1989920SQ200510112359
公開日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2005年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月29日
發(fā)明者楊黃恬, 周兆年, 許偉青, 朱儀 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院