專利名稱：一類萘醌類化合物及藥物組合物的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一類萘醌類衍生物的新用途，具體涉及該類化合物的抗幽門螺旋桿菌作用，以及含有該化合物的藥物組合物在治療和預防幽門螺旋桿菌感染疾病上的應用。
背景技術：
慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃MALT淋巴瘤和胃癌是嚴重危害人類健康及生命的疾病，病理學研究證實以上均與幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori，簡稱Hp)感染有關。據報道全世界約50％以上的人口感染幽門螺旋桿菌，以發展中國家最為嚴重，成年人幽門螺旋桿菌感染率達60-80％。目前臨床上大多采用抗內分泌藥及抗生素聯合療法來治療Hp的感染，但由于副作用大，病人耐受性差，又易產生耐藥性，療效及應用受到了影響。因此，尋找抗Hp感染和治療與其相關的疾病的新藥成了人們關注的研究課題。
梧桐Firmiana plantanifolia(L.f.)Masili[F.simplex(L.)W.F.Weight]屬梧桐科，其種子、花、葉、樹皮和根均入藥。
文獻考證梧桐具有順氣和胃，健脾消食的作用。主治胃脘疼痛，傷食腹瀉。《食物考》和《本草求原》記載其有“舒脾開胃醒脾”的作用，《四川中藥志》記載其可“順氣和胃”，廣州部隊《常用中草藥手冊》說其可以“健胃消滯”。
本發明在對中藥進行抗幽門螺旋桿菌抑制活性的篩選中，發現梧桐(F.plantanifolia)根的提取物具有良好的抗幽門螺旋桿菌作用，經過活性跟蹤分離得到萘醌類活性化合物成分。目前該萘醌類化合物的抗幽門螺旋桿菌活性尚無文獻報道。
發明內容
本發明的目的是提供一類從天然植物梧桐中提取，經分離純化獲得的萘醌化合物及其藥物組合物作為幽門螺旋桿菌抑制劑，在制備治療和預防各種與幽門螺旋桿菌感染相關疾病藥物中的應用。
本發明所述的萘醌類化合物是通過對天然植物梧桐根進行分離提取，具體步驟采用乙醇提取、濃縮，提取物直接上大孔樹脂柱，先用水洗、棄去，再用乙醇—水(30％，50％，95％)梯度洗脫，得到三個流分。經篩選發現95％洗脫餾分活性最強，經進一步的活性跟蹤分離，得到結構如下的活性萘醌化合物 其中R1為H、羥基或烷氧基或酯基；R2為H、羥基或烷氧基或酯基；該類通式化合物來源廣泛，既可以從植物中提取分離，也可利用工業原料有機合成。例如取梧桐根干燥根莖，粉碎后用乙醇提取、濃縮、浸膏上大孔樹脂，乙醇—水梯度洗脫，經200-300目硅膠柱層析，石油醚—乙酸乙酯梯度洗脫；再經Shephadex LH-20柱色譜分離純化得到化合物A1，A2和A3。
Weinberg，M.L.；Gottlieb，O.R.；Oliveira，G.G.Phytochemistry 1976，15，570.Inouye，H.；Okuda，T.；Hayashi，T.Chem.Pharm.Bull.1975，23，384-391.Manners，G.D.；Jurd，L.；Wong，R.；Palmer，K.Tetrahedron 1975，31，3019-3024.
本發明進一步提供一種抗幽門螺旋桿菌感染或治療及預防腸、胃潰瘍相關性疾病方面的藥物組合物，所述藥物組合物包含治療安全有效量的通式化合物和藥學上可接受的載體。藥物組合物包含0.1wt％-99.9wt％(重量百分比)的通式化合物。藥學上可接受的載體指適用人體使用、具有足夠純度和低毒性的一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠。相容性指組合物中的各組份和通式化合物及其它們之間相互摻和而不明顯降低化合物的藥效。藥學上可接受的載體可以包括糖、淀粉、纖維素及衍生物、明膠、滑石、固體潤滑劑、硫酸鈣、植物油、多元醇、乳化劑、著色劑、抗氧化劑、防腐劑等。本發明組合物對載體的選擇取決于化合物的給藥方式，可以制成一般的藥用片劑、顆粒劑、膠囊、口服制劑或注射劑。
抗幽門螺旋桿菌抑制活性體外藥理實驗抗幽門螺旋桿菌抑制活性測試采用瓊脂稀釋法，按照文獻方法進行。(胡伏蓮、周殿元，“幽門螺桿菌感染的基礎與臨床”，中國科學技術出版社，2002年)測試原理檢測化合物抑菌效果采用瓊脂稀釋法首先將不同劑量的化合物分別加入高溫滅菌并冷卻至45℃的定量瓊脂培養基中，混勻后傾注成無菌平板，即含有化合物梯度減少的培養基。接種一定量的幽門螺旋桿菌于該培養基上，經培養后觀察其生長情況，抑制細菌生長的最低化合物濃度即為最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，一般采用的單位為μg/ml。
觀察指標實驗中采用培養三天的幽門螺旋桿菌(標準菌株ATCC 43504和悉尼株SS1)，以適量生理鹽水配成濃度約為108CFU/ml的菌懸液，分別取2.5μl菌液按照所含化合物濃度由低到高的順序，接種到哥倫比亞瓊脂培養基上，待接種點干燥后放入微需氧環境(85％N2、10％CO2、5％O2)37℃培養72h，不出現菌落的瓊脂平板中所含的最低化合物濃度即為最低抑菌濃度(MIC)。
針對幽門螺旋桿菌靶標體外酶學實驗檢測到化合物NPLC518和NPLC519有抑制幽門螺桿菌SS1菌株CGS酶的作用，檢測采用吸光光度法，按照Luong TN，Kirsch JF.Analytical Biochemistry1997，253，46-49Aitken SM，Kim DH，Kirsch JF.Biochemistry 2003，42，11297-11306提供的方法進行。
測試原理CGS酶能催化L-OSHS產生α-ketobutyrate，α-ketobutyrate在NADH存在下被HO-HxoDH催化，使得NADH脫氫生成NAD+。本實驗利用BIO-RAD酶標儀測量NADH在340nm光吸收值得到反應的各項參數。
觀察指標在不同的抑制劑濃度下，CGS酶的催化活性不同。實驗中測得抑制劑濃度梯度對應的催化反應初速度，同時測得沒有抑制劑存在下酶反應初速度，得到抑制劑濃度對應的抑制率(即Vi/V0)，從而利用抑制率對對應抑制劑濃度的-log值作圖得到抑制劑的IC50。
小鼠體內藥理學實驗體內抗菌活性實驗采用幽門螺旋桿菌悉尼株(SS1)感染的SPF級C57BL/6小鼠模型。參考文獻如下1.Lee A，O’Rourke J，De Ungria MC，Robertson B，Daskalopoulos G，DixonMF.Gastroenterology 1997，112，1386-13972.史彤，蕭樹東。胃腸病學2002，8，265-268動物實驗方法實驗分為治療實驗和預防實驗兩部分。治療實驗中將幽門螺旋桿菌感染后的小鼠隨機分為三組第一組喂予通式化合物；第二組喂予陽性藥物；第三組不予治療。治療實驗結束后24小時和4周后分別處死各組小鼠，提取其胃組織檢測幽門螺旋桿菌感染情況。預防實驗中首先將小鼠隨機分為兩組第一組以化合物喂食小鼠一段時間；第二組不喂予化合物。然后以幽門螺旋桿菌感染小鼠，2周后處死小鼠檢測其感染情況。
檢查指標將實驗鼠胃沿大彎縱向切成同樣大小的三份一份直接進行快速尿素酶實驗；一份放于無菌生理鹽水中，用于細菌培養(培養條件同上)；另一份置于10％中性緩沖液福爾馬林中固定，石蠟包埋、切片，用于組織病理學(革蘭氏染色和蘇木素染色)檢查。三項檢測全部呈現陰性的判定為幽門螺旋桿菌感染陰性。
本發明所述的萘醌類化合物及其藥物組合物，在體內、外實驗中均顯示了良好的抗幽門螺旋桿菌作用，并對由于幽門螺旋桿菌感染引起的胃粘膜損傷具有修復作用和抑制幽門螺旋桿菌活性。
圖1為NPLC518和NPLC519抑制CGS酶的IC50
具體實施例方式
下面結合具體實施實例對本發明作進一步闡述，但不限制本發明。
1H-NMR用Varian MercuryAMX300型儀測定；所使用的硅膠，包括200-300目和GF254為青島海洋化工廠或煙臺緣博硅膠公司生產；所使用的ShephadexLH-20為E.Merck公司生產。
實施例一取梧桐根干燥根莖2Kg，粉碎后用95％的乙醇加熱回流提取(5L×3)，回收乙醇得到浸膏。浸膏直接上大孔樹脂柱，乙醇—水梯度洗脫，分為30％，50％，95％三個流分。95％部分經200-300目硅膠柱層析，石油醚—乙酸乙酯梯度洗脫；再經Shephadex LH-20(CHCl3/CH3OH 1∶1洗脫)柱色譜分離純化得到化合物A1，A2和A3。
化合物A1黃色粉末，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.58(1H，d，J＝7.2Hz)，8.20(1H，d，J＝7.2Hz)，7.60(2H，t，J＝7.2Hz)，2.10(2H，m)，1.64(2H，m)，1.30(6H，s)。以上光譜數據與已知化合物α-lapachone[1]相比較，兩者完全一致。故化合物A1鑒定為α-拉帕醌(α-lapachone)。
化合物A2黃色粉末，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.58(1H，d，J＝7.2Hz)，8.20(1H，d，J＝7.2Hz)，7.60(2H，t，J＝7.2Hz)，2.10(2H，m)，1.64(2H，m)，1.30(6H，s)。以上光譜數據與已知化合物9-hydroxy-α-lapachone[2]相比較，兩者完全一致。故化合物A2鑒定為9-羥基—拉帕醌(9-hydroxy-α-lapachone)。
化合物A3黃色粉末，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.22(2H，m)，8.17(2H，m)，7.52(2H，m)，7.49(2H，m)，5.91(2H，d，J＝9.9Hz)，5.61(2H，d，J＝9.9Hz)，1.52(6H，s，2×OMe)，1.47(6H，s，2×OMe)；13C NMR(75MHz，CDCl3)，δ145.6，142.5，131.1，126.9，1236.7，126.3，126.2，123.6，122.4，121.7，76.4。以上光譜數據與已知化合物tectol[3]相比較，兩者完全一致。故化合物A3鑒定為太可酚(tectol)。
實施例二片劑的制備取A1化合物18克、羥丙纖維素120克、微粉硅膠30克、淀粉20克、硬脂酸鎂適量混和均勻，用10％預膠化淀粉作為粘合劑，濕發制粒，烘干，加入硬脂酸鎂混和，壓制成1000片9.7％片劑。
實施例三顆粒劑的制備取A2化合物400克、蔗糖250克、羥丙纖維素120克、微粉硅膠30克、枸櫞酸、碳酸氫鈉適量混和均勻，以適量70％乙醇作濕潤劑，濕法制粒，過篩，烘干，分裝制成2000袋顆粒劑。
實施例四體外抗幽門螺旋桿菌實驗將不同劑量的化合物分別加入高溫滅菌并冷卻至45℃的定量瓊脂培養基中，混勻后傾注成無菌平板，接種2.5μl濃度為108CFU/ml處于對數生長的幽門螺旋桿菌于該培養基上，培養3天后觀察其生長情況，抑制細菌生長的最低化合物濃度即為最低抑菌濃度(MIC)。
表1.萘醌類化合物的體外抗幽門螺旋桿菌作用
實施例五抑制靶標CGS酶實驗在底物L-OSHS濃度為1.625mM時，通過測量反應產物α-ketobutyrate變化所對應的NADH在340nm光吸收值隨反應時間變化得到0.4μM CGS酶在催化反應中的初速度以及不同抑制劑濃度對應的酶催化初速度，從而得到抑制劑IC50。NPLC518的IC50為10.53μM，NPLC519的IC50為8.86μM。
實施例六體內藥效實驗治療實驗以108CFU幽門螺旋桿菌經口灌胃感染60只C57BL/6小鼠，隔日1次，共3次。最后1次灌胃后2周，將小鼠隨機分為3組，每組20只。A組經口灌胃喂予化合物(2000mg/kg)，B組喂予三聯藥物(阿莫西林50mg/kg、枸櫞酸鉍6.15mg/kg和甲硝唑22.5mg/kg)，每天1次，共15天。C組作為對照組不給予任何治療。實驗結束后24h分別處死各組小鼠檢測幽門螺旋桿菌感染情況，計算清除率；實驗結束后4周檢測感染情況計算根除率。
表2.萘醌類化合物的體內治療實驗結果
預防實驗取20只小鼠隨機分成2組A組經口灌胃予化合物(1000mg/kg)，每天1次，共20天；B組不予化合物作為對照組。然后以108CFU幽門螺旋桿菌經口灌胃感染兩組小鼠，隔日1次，共3次。預防實驗結束后2周處死小鼠，提取其胃組織檢測幽門螺旋桿菌感染情況，計算清除率。
表3.萘醌類化合物的體內預防實驗結果
權利要求
1.含有一類如下結構通式的萘醌類化合物及藥學上可接受的載體 其中R1為H、羥基或烷氧基或酯基；R2為H、羥基或烷氧基或酯基；組成的藥物組合物。
2.根據權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于含有萘醌類化合物的有效量為0.1wt％-99.9wt％。
3.根據權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于藥學上可接受的載體選自糖、淀粉、纖維素及衍生物、明膠、滑石、固體潤滑劑、硫酸鈣、植物油、多元醇、乳化劑、著色劑、抗氧化及、防腐劑。
4.如權利要求1所述的藥物組合物的用途，在制備治療、預防抗幽門螺旋桿菌與幽門螺旋桿菌感染相關性疾病藥物中的應用。
5.根據權利要求4所述的藥物組合物的用途，其特征在于與幽門螺旋桿菌感染相關性疾病指所述胃炎、胃糜爛、胃潰瘍。
6.根據權利要求4所述的藥物組合物的用途，其特征在于所述與幽門螺旋桿菌感染相關性疾病指腸、十二指腸潰瘍。
7.根據權利要求4所述的藥物組合物的用途，其特征在于所述與幽門螺旋桿菌感染相關性疾病是為淋巴組織淋巴瘤。
8.如權利要求4所述的藥物組合物的用途，其特征在于所述與幽門螺旋桿菌感染相關性疾病指中度腸腺化增生或不典型增生。
全文摘要
本發明涉及從植物梧桐根中提取、分離獲得結構如通式(1)(2)所示的一類萘醌類化合物，具體涉及該類化合物的抗幽門螺旋桿菌作用，以及含有該化合物的藥物組合物在治療和預防幽門螺旋桿菌感染疾病上的應用。
文檔編號A61P1/04GK1989959SQ200510112279
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月29日 優先權日2005年12月29日
發明者胡立宏, 沈旭, 蔣華良, 武大雷, 白海云 申請人:中國科學院上海藥物研究所