專利名稱：一種治療b細胞淋巴瘤的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療癌癥的藥物組合物，尤其涉及一種治療B細胞淋巴瘤的藥物組合物。
背景技術：
淋巴瘤是一種起源于淋巴組織的惡性腫瘤，近年來在世界范圍內的發病率幾乎增長了一倍，嚴重危害人類的健康。B細胞淋巴瘤是最常見的淋巴瘤種類，約占淋巴瘤的50-60％。除早期、局限性、低度惡性的B細胞淋巴瘤可單純使用放射治療外，目前主要的治療方式仍為聯合化療。采用聯合化療可使約50-60％的患者獲得疾病緩解，20-30％的患者獲得長期生存，但大部分患者對治療無效或治療后迅速復發，疾病進展快，預后差。更重要的是，化療的毒副反應大，患者尤其是老年或合并其它疾病患者不能耐受。
CD20廣泛表達于B細胞淋巴瘤細胞表面，是開展免疫治療的理想靶點。近年來，人-鼠嵌合性抗CD20單克隆抗體利妥昔(Rituximab，Rituxan，美羅華)已成功應用于臨床，通過抗體介導的針對細胞特異表面標記的免疫治療，具有低毒，低骨髓抑制和較高特異性的特點，為B細胞淋巴瘤的治療開辟了新途徑。然而患者的治療費用昂貴，部分患者在治療早期或疾病復發時發生耐藥。因此，研究利妥昔和其他藥物聯合應用的可行性對于提高療效、降低費用具有重要意義。
組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制劑可通過抑制HDAC，阻斷由于HDAC募集功能紊亂而導致的基因表達受抑，有顯著的抗腫瘤效應。其中SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid，辛二酰苯胺氧肟酸)已進入II期臨床，治療復發的B細胞淋巴瘤患者有一定的療效，是一種極具潛力的靶向治療藥物。
發明內容
本發明的目的在于提供一種治療B細胞淋巴瘤的藥物組合物。
本發明的目的是通過以下技術方法來實現的本發明一種治療B細胞淋巴瘤的藥物組合物，該藥物由利妥昔和SAHA組成。利妥昔用量為1-100μg/ml，SAHA用量為1-10μM。利妥昔用量可為1-50μg/ml，SAHA用量可為1-5μM。利妥昔用量優選為20μg/ml，SAHA用量優選為2.5μM。
本發明應用了以下兩種人的細胞株對利妥昔敏感的濾泡型淋巴瘤SU-DHL-4細胞株，和對利妥昔耐藥的Burkitt’s淋巴瘤Daudi細胞株。該兩種人的細胞株分別經不同濃度的利妥昔(0、1、20、50、100μg/ml)和SAHA(0、1、2.5、5、10μM)聯合處理，進行了MTT實驗、流式細胞儀檢測annexin-V和線粒體跨膜電位實驗、免疫印跡分析實驗及核蛋白膠電泳轉移檢測實驗。
本發明所公開的一種治療B細胞淋巴瘤的藥物組合物，其優點表現在通過使用本發明的藥物組合物，發揮兩種藥的協同作用，可以協同抑制B淋巴瘤細胞生長增殖，協同誘導B淋巴瘤細胞凋亡，協同抑制NF-κB活性和下調BCL-XL表達。兩藥組合在提高療效的同時下可大幅降低費用。
圖1A顯示單用利妥昔抑制B淋巴瘤細胞生長的效果圖。
圖1B顯示單用SAHA抑制B淋巴瘤細胞生長的效果圖。
圖1C顯示合用利妥昔、SAHA抑制B淋巴瘤細胞生長的效果圖。
圖2A顯示流式細胞儀檢測濾泡型淋巴瘤SU-DHL-4細胞株凋亡對照組的效果圖。
圖2B顯示單用利妥昔誘導濾泡型淋巴瘤SU-DHL-4細胞株凋亡的效果圖。
圖2C顯示單用SAHA誘導濾泡型淋巴瘤SU-DHL-4細胞株凋亡的效果圖。
圖2D顯示合用利妥昔、SAHA誘導濾泡型淋巴瘤SU-DHL-4細胞株凋亡的效果圖。
圖2E顯示合用利妥昔、SAHA誘導濾泡型淋巴瘤SU-DHL-4細胞株凋亡的協同指數效果圖。
圖2F顯示用流式細胞儀檢測Burkitt’s淋巴瘤Daudi細胞株凋亡對照組的效果圖。
圖2G顯示單用利妥昔誘導Burkitt’s淋巴瘤Daudi細胞株凋亡的效果圖。
圖2H顯示單用SAHA誘導Burkitt’s淋巴瘤Daudi細胞株凋亡的效果圖。
圖2I顯示合用利妥昔、SAHA誘導Burkitt’s淋巴瘤Daudi細胞株凋亡的效果圖。
圖2J顯示合用利妥昔、SAHA誘導Burkitt’s淋巴瘤Daudi細胞株凋亡的協同指數效果圖。
圖3顯示單用及合用利妥昔或SAHA作用24小時線粒體跨膜電位的結果圖。
圖4A顯示單用及合用利妥昔或SAHA對濾泡型淋巴瘤SU-DHL-4細胞株Caspase-3、PARP和BCL-XL影響的結果圖。
圖4B顯示顯示單用及合用利妥昔或SAHA對Burkitt’s淋巴瘤Daudi細胞株Caspase-3、PARP和BCL-XL影響的結果圖。
圖5顯示單用及合用利妥昔或SAHA對B淋巴瘤細胞NF-κB活性影響的結果圖具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步描述。
實施例1一種治療B細胞淋巴瘤的藥物組合物制備本發明一種治療B細胞淋巴瘤的藥物組合物，該藥物由利妥昔和SAHA按照一定的濃度比例混合制得。其中利妥昔用量為20μg/ml，SAHA用量為2.5μM。
實施例2一種治療B細胞淋巴瘤的藥物組合物制備本發明一種治療B細胞淋巴瘤的藥物組合物，該藥物由利妥昔和SAHA按照一定的濃度比例混合制得。其中利妥昔用量為1μg/ml，SAHA用量為10μM。
實施例3一種治療B細胞淋巴瘤的藥物組合物制備本發明一種治療B細胞淋巴瘤的藥物組合物，該藥物由利妥昔和SAHA按照一定的濃度比例混合制得。其中利妥昔用量為100μg/ml，SAHA用量為1μM。
實施例4一種治療B細胞淋巴瘤的藥物組合物藥效評價(一)試劑利妥昔購自上海羅氏公司，-4℃保存。SAHA由上海默沙東贈送，溶解于DMSO中，儲存液濃度為100mM，-20℃保存。MTT、碘化丙啶(PI)、rhodamine 123(Rh123)、二硫蘇糖醇購自Sigma公司。抗PARP、caspase-3、BCL-XL、NF-κB(P65)、過氧化物酶偶聯的羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗均購自Santa Cruz公司。抗β-actin購自Abcam公司。
(二)細胞培養，細胞存活和細胞形態學本研究應用了以下兩種人的細胞株濾泡型淋巴瘤SU-DHL-4細胞株，對利妥昔敏感，Burkitt’s淋巴瘤Daudi細胞株，對利妥昔耐藥。淋巴瘤細胞在5％CO2-95％空氣，飽和濕度以及37℃的條件下，培養于RPMI-1640培養液中(Gibco/BRL)，并加入10％胎牛血清。在每次實驗中，細胞接種密度為2×105/ml。細胞的存活率采用臺盼蘭拒染實驗檢測。細胞形態學觀察采用瑞氏染色法。
(三)MTT實驗
在96孔板中，用不同濃度利妥昔或SAHA處理細胞。72小時后，向每孔中加入0.1mg MTT，在37℃下孵育4小時后，在分光光度計570nm處測量標本吸光度值。
(四)流式細胞儀檢測annexin-V和線粒體跨膜電位細胞凋亡用ApoAlert Annexin V-FITC Apoptosis kit(BD)進行分析。在檢測線粒體跨膜電位中，細胞用PBS洗后，在37℃下與10μg/mlRh123孵育30分鐘，然后再用50μg/ml PI染色。熒光強度用流式細胞儀進行測量。
(五)免疫印跡分析用200ml Laemmli裂解緩沖液(0.5M Tris-HCl，pH6.8，2mM EDTA，10％glycerol，2％SDS and 5％β-mercaptoethanol)裂解5×106細胞。蛋白裂解物(20μg)用于10％聚丙烯酰胺凝膠電泳，再轉移至硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜在溶于TBS/0.05％Tween 20的5％脫脂牛奶中封閉，之后與一抗在室溫孵育2小時，與辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1小時。免疫復合物用辣根過氧化物酶化學發光檢測試劑盒檢測。
(六)核蛋白分離1×107細胞與不含NP-40的裂解緩沖液(10mM HEPES，10mM KCl，1.5mM MgCl2，0.5mM DTT，pH7.9)洗后，重懸于提取緩沖液(20mM HEPES，pH7.9，420mM NaCl，0.5mM DTT，0.2mM EDTA and 25％甘油)中，冰上孵育20分鐘。12000×g離心10分鐘后，上清即為核蛋白。
(七)膠電泳轉移檢測實驗Daudi細胞核蛋白提取物用考馬斯亮藍試劑(Pierce)定量。核蛋白(10μg)與32P標記的雙鏈NF-κB(5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’)共有序列孵育，然后用4％非變性PAGE凝膠分離，用放射自顯影檢測被標記的條帶。
(八)統計分析實驗結果用三次獨立實驗的平均值和標準差表示，用t檢驗來比較差異。P值小于0.05則認為具有統計學差異。所有的統計采用SAS8.2軟件。
(九)結果采用CD20陽性B淋巴瘤細胞系SU-DHL-4和Daudi細胞進行培養，通過分析生長曲線觀察利妥昔、SAHA單獨及聯合應用對細胞生長增殖的影響。B淋巴瘤細胞分別經不同濃度的利妥昔(0、1、20、50、100μg/ml)和SAHA(0、1、2.5、5、10μM)聯合處理。單用和合用不同劑量利妥昔或SAHA對B淋巴瘤細胞的抑制作用見圖1A、圖1B、圖1C，利妥昔(20μg/ml)聯合SAHA(2.5μM)應用48小時可顯著抑制SU-DHL-4和Daudi細胞的增殖。
用流式細胞儀檢測單用及合用藥后B淋巴瘤細胞的凋亡(Annexin V和PI雙染法)。SU-DHL-4經利妥昔20μg/mL、SAHA 2.5μM及利妥昔20μg/mL與SAHA 2.5μM聯合處理的48小時后，Annexin V陽性細胞分別為對照組3.4％(見圖2A)；利妥昔組17.3％(見圖2B)；SAHA組26.3％(見圖2C)；利妥昔與SAHA合用組56.7％(見圖2D)。在Daudi細胞中對照組3.0％(見圖2F)；利妥昔組4.2％(見圖2G)；SAHA組24.4％(見圖2H)；利妥昔與SAHA合用組61.7％(見圖2I)。同時我們應用Berenbaum建立的等效應線圖法分析利妥昔與SAHA的聯合應用是協同、相加或拮抗。將利妥昔與SAHA單用與合用Annexin V陽性率取30％±5％，計算兩者合用的協同指數(combined index，CI)CI＝d1/D1+d2/D2。D1、D2代表單用藥物1和2時產生30％±5％效應時所需的藥物劑量，d1、d2代表聯合應用藥物1和2時產生同等效應時的藥物劑量。CI＞1，圖形為凸形，兩者聯合應用為拮抗作用，CI＝1，圖形為一直線，兩者聯合應用為相加作用，CI＜1，圖形為凹形，兩者聯合應用為協同作用。利妥昔與SAHA作用于SU-DHL-4和Daudi細胞，圖形均為凹型(見圖2E、圖2J)，證明兩者為協同作用。
用親脂陰離子染料Rh123和PI雙染色檢測單個細胞可獲得線粒體跨膜電位(Δψm)和細胞膜的完整性，前者由于線粒體攝取量與線粒體Δψm成正比，攝取量減少表示Δψm下降；PI不能通過完整的細胞膜，細胞發生凋亡早期細胞膜仍保持完整，PI不能進入細胞，反之，壞死細胞膜破壞早期即發生PI染色增加。請參閱見圖3，經利妥昔(20μg/ml)聯合SAHA(2.5μM)合用24小時后出現了Δψm的下降。
利妥昔與SAHA單用或合用SU-DHL-4細胞和Daudi細胞蛋白表達變化見圖4A、圖4B示。利妥昔單用Caspase-3活化不明顯，SAHA單用可以誘導Caspase-3表達增加，相應的其底物PARP剪切成89KD的片段，不能發揮正常功能，導致細胞凋亡，利妥昔和SAHA合用時這種效應更明顯。因此，利妥昔誘導B淋巴瘤細胞系凋亡無需激活的Caspases參與，而SAHA誘導B淋巴瘤細胞系凋亡通過激活的Caspases進行，這也可以部分解釋兩者協同作用的機制。BCL-XL是BCL-2家族的重要的凋亡抑制因子，可通過穩定線粒體膜通透性，減少凋亡因子的釋放，抑制細胞凋亡。利妥昔和SAHA可以下調BCL-XL蛋白表達，合用組BCL-XL的下調更明顯，從而促進淋巴瘤細胞凋亡(圖4A和圖4B)。
NF-κB是一個信號傳導家族，多以異源性二聚體形式發揮作用，在細胞核內調節與細胞惡性轉化、免疫以及炎癥反應有關的許多基因的表達。BCL-XL是NF-κB的靶基因，NF-κB激活可上調BCL-XL的表達。在利妥昔(20μg/ml)聯合SAHA(2.5μM)應用48小時可抑制NF-κB的表達(圖5A)。在Daudi細胞中，核蛋白膠電泳轉移檢測進一步證實兩者合用可導致NF-κB轉錄活性的減低(圖5B)。
綜上所述，抗CD20單克隆抗體利妥昔與組蛋白去乙酰化酶抑制劑合用能夠抑制NF-κB活性，下調BCL-XL表達，協同抑制淋巴瘤細胞凋亡，可能成為B細胞淋巴瘤的又一種有效治療方法。
權利要求
1.一種治療B細胞淋巴瘤的藥物組合物，其特征在于該藥物由利妥昔和SAHA組成。
2.如權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于利妥昔用量為1-100μg/ml，SAHA用量為1-10μM。
3.如權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于利妥昔用量為1-50μg/ml，SAHA用量為1-5μM。
4.如權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于利妥昔用量為20μg/ml，SAHA用量為2.5μM。
全文摘要
本發明涉及一種治療B細胞淋巴瘤的藥物組合物，該藥物由利妥昔(Rituximab，Rituxan，美羅華)和SAHA(suberoylanilide hydroxamicacid，辛二酰苯胺氧肟酸)組成，該藥物有明顯協同作用，較單用可顯著抑制B淋巴瘤細胞生長增殖，協同誘導凋亡，協同抑制NF－κB活性和下調BCL－XL表達。兩藥組合在提高療效的同時可大幅降低治療費用。
文檔編號A61K31/15GK1824307SQ20051011214
公開日2006年8月30日 申請日期2005年12月28日 優先權日2005年12月28日
發明者陳竺, 陳賽娟, 趙維蒞, 王蘭, 劉元華, 閻金松 申請人:上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院