日本血吸蟲表皮抗原及候選疫苗基因、蛋白及其應用的制作方法

            文檔序號:1098240閱讀:475來源:國知局
            專利名稱:日本血吸蟲表皮抗原及候選疫苗基因、蛋白及其應用的制作方法
            技術領域
            本發明涉及基因工程技術領域,具體地說涉及一類表達于日本血吸蟲表皮的蛋白質、其編碼核苷酸和編碼氨基酸序列以及其作為藥物靶點和疫苗的作用。
            背景技術
            目前研究表明,血吸蟲病由血吸蟲的感染引起,在世界上有76個國家,受感染者約1.5億。致病的血吸蟲有3種,既日本血吸蟲(Schistosoma japonicum),曼氏血吸蟲(S.mansoni)和埃及血吸蟲(S.haematobium)。在我國流行的是日本血吸蟲。
            研制新的治療血吸蟲病和抗血吸蟲的藥物,首先必須找到合適的藥物作用靶點。血吸蟲的表皮是宿主和血吸蟲相互作用的界面。而組成血吸蟲表皮的蛋白質暴露在這個界面上,對小分子的化學藥物和大分子的抗體藥物而言都是最理想的藥物作用靶點。已經有研究表明治療血吸蟲的化學藥物——比喹酮的作用靶點就是存在于血吸蟲的表皮。另外一些已知的血吸蟲表皮蛋白,例如GST28,paramyosin,已經用于疫苗研究和應用。

            發明內容
            本發明要解決的技術問題是提供一類表達于日本血吸蟲表皮的蛋白質、其編碼核苷酸、及編碼氨基酸序列日本血吸蟲表皮蛋白,作為可能的藥物作用靶點和候選疫苗方面的作用。
            為解決上述技術問題,本發明提供一種DNA序列,它具有序列表中SEQ IDNO.1~SEQ ID NO.23所述序列中任一序列的堿基序列;或者它是在中度嚴緊條件下與序列表中SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.23所示的序列中任一條序列雜交的序列;或者它是與序列表中SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.23所示的序列中任一條序列有至少70%同源性的序列。
            為解決上述技術問題,本發明還提供一種氨基酸序列,它具有序列表中SEQID NO.24~SEQ ID NO.46所述序列中任一序列的氨基酸序列;或者它是與序列表中SEQID NO.24~SEQID NO.46所示的序列中任一條序列有至少70%同源性的序列;或者它是包含有序列表中SEQ ID NO.24~SEQ ID NO.46所示的序列中任一條序列的氨基酸序列。
            本發明由于通過大規模的蛋白質組學研究,發現了23個日本血吸蟲表皮蛋白質,這些蛋白質,都是可能的藥物作用靶點和候選疫苗。血吸蟲病的流行給人民身體健康和經濟發展都造成巨大的損失,因此,防治血吸蟲病、開發研制治療血吸蟲病和抗血吸蟲的藥物具有巨大的社會和經濟效益。


            圖1是免疫熒光抗體原位雜交實驗結果。
            具體實施例方式
            下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步詳細的說明。
            實施例1日本血吸蟲表皮蛋白的分離和鑒定實驗1.日本血吸蟲表皮的分離純化血吸蟲表皮的純化按照文獻報道的Triton-x-100提取方法進行(參見Oaks,J.A.等人,寄生蟲學雜志,69(3)519-533(1983)。)。表皮蛋白從血吸蟲雄蟲、雌蟲、雌雄混合成蟲和童蟲分離。蟲體用Krebs’-Ringer’s,Tris-馬來酸鹽-緩沖鹽液(KRTM)洗3次,再用KRTM/0.2%Triton X-100溶液懸浮。這個液體和蟲體的混和物置于冰水浴中,在搖床上搖動10分鐘。然后,裝有液體和蟲體的混和物的試管在渦旋混合器上混旋幾次,然后再放回冰水浴中,靜置使蟲體下沉。用吸管吸出上部液體,放置到另一個新管中。這個試管在離心機上用2500×g的離心力,離心15分鐘。得到的沉淀就是血吸蟲的表皮。Krebs’-Ringer’s溶液的配方是0.15M NaCl,6.2mM KCl,1.2mM Na2HPO4,1.2mM MgSO4,10mM Glucose and 20mM Tris-Hepes,pH7.4。Tris maleate緩沖溶液的配方是0.2M Tris and 0.2MMaleicanhyclride,pH7.4。
            2.日本血吸蟲表皮蛋白的電泳分離日本血吸蟲表皮用裂解劑裂解,蛋白溶液用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,條帶切割后再做第二維的在線毛細液相色譜分離以及質譜鑒定。軟件分析得到鑒定蛋白。分離好的血吸蟲表皮,用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)緩沖液懸浮,用超聲波促進組織細胞裂解和蛋白溶解,超聲波裂解方法為超聲1秒,暫停3秒,總時間2分鐘。并用100℃加熱5分鐘以使蛋白質變性。然后這些表皮蛋白混合物用SDS-PAGE分離,分離方法按照普通的SDS凝膠電泳方法進行。膠上電泳泳道用刀切割下來,再用刀均等分割成8-12份。接下來做蛋白的膠內酶解。
            3.日本血吸蟲表皮蛋白的膠內酶解過程膠內酶解參照文獻(Shevchenko,A.等人,化學年報,68850-858(1996)。)的方法進行。蛋白膠塊用刀切碎,每個小塊大小約為1立方毫米。加入100mMNH4HCO3,洗2次;轉入到試管中;加入10mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)/100mM NH4HCO3,56度放置反應1小時;冷卻到室溫,離心吸去DTT;加入等體積的55mM碘乙酰胺iodoacetamide/100mM NH4HCO3,室溫/黑暗反應45分鐘;吸去iodoacetamide,加入100mM NH4HCO3,洗2次;b去掉NH4HCO3,加入乙腈縮膠;去掉乙腈,真空抽干;加入100mM NH4HCO3,膠膨脹,去掉NH4HCO3,加入乙腈縮膠;去掉乙腈,抽干;加入含Trypsin的消化緩沖液(50mM NH4HCO3/12.5ng/ul trypsin)冰上放置45min;去掉多余酶液,加入50mM NH4HCO3,以剛覆蓋膠為準;37度,過夜酶切;酶切結束后,從試管中吸出上清液到新管子中,膠中加入60%ACN/0.5%HAC,在水浴中超聲處理15min,再重復一次;吸出上清液到新管子中,在原管子中再加入60%ACN/0.5%HAC,37度40min,吸出上清液,與前面的上清液合并,真空抽氣去ACN。
            4.日本血吸蟲表皮蛋白酶解肽段的在線色譜分離和質譜鑒定酶解產生的肽混合物,用真空將溶液體積抽減到30μl。之后,每個組分的肽混合物上樣到一個反相捕獲柱(C18,5μm,300,300μm i.d×5mm,LC Packings),在20μl/min的流速下脫鹽。然后這個捕獲柱和一個分析用的75μm×150mm C18柱(LC Packings)相連接,肽混合物就在200nl/min的流速下,從這個柱子上洗脫進入裝有Protana NanoES的電噴霧離子源的QSTAR pulser i中。Agilent1100毛細液相系統(Agilent Technologies)用來提供流動相A(0.5%乙酸/水)和流動相B(0.5%乙酸/乙腈),線性梯度是60分鐘內5%B到50%B,30分鐘內50%B到90%B,然后是在90%B停留15分鐘。在分析柱后通過一個不銹鋼的兩通(Valco Instrument)連接一個10-μm直徑的PicoTip納噴霧頭(New Objective),加上2500-3000伏的噴霧電壓,以獲得穩定的噴霧。MS/MS串聯質譜譜圖通過信息依賴的采集(IDA)和任務-循環增強來記錄。在每個測定掃描中,選取3-6個信號最強、帶2到3個電荷的離子,用滾動碰撞能量打碎,以獲得串聯質譜的信息。
            5.日本血吸蟲表皮蛋白的軟件搜索鑒定用牛胰酶的自裂解片段如([M+H]+)1153.5741,2163.0569和2274.1600作為內標,或者以預先數據庫搜索得到的得分高的肽段的分子量,來校正所有的質譜譜圖。質譜搜索用的數據庫,包括從8420個從EST cluster預測得到的血吸蟲蛋白質序列,以及可能的污染蛋白質序列如牛胰酶的序列、宿主蛋白污染如人蛋白質序列、小鼠蛋白質序列、大鼠蛋白質序列、兔子蛋白質序列和角蛋白序列等。搜索軟件是MASCOT(http://www.matrixscience.com/,MatrixScience)。搜索參數為最大漏切點,3個;monoisotopic;肽電荷數,+1/+2/+3;修飾,半胱氨酸carbamoylmethylation和methionine氧化。搜索結果合并后,用下列標準進行過濾篩選1.對每一個串聯質譜譜圖的搜索結果列表,只提取排位在第一個的結果,其他的則丟棄;2.搜索得到的肽段中如果有KR,KK,RK,RR等序列,則這個肽段丟棄;3.搜索得到的肽段,長度在8個氨基酸以上的保留,小于8個氨基酸的丟棄;4.重復打到的肽段,只計算其中分值最高的,把這些肽段分值加起來,做為蛋白的得分;5.蛋白的得分超過60,就認為是可信的結果。低分的蛋白,手工檢查后保留或者丟棄。匹配到宿主或者牛胰酶、角蛋白的肽段,則丟棄。
            實施例2日本血吸蟲表皮蛋白的生物信息學分析和功能注釋
            1.同源性和相似性分析日本血吸蟲表皮蛋白序列對GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的非冗余數據庫(Non-redundant,NR)做BLASTP比對;日本血吸蟲表皮蛋白序列對Swissprot數據庫做BLASTP同源性比對。根據比對結果得到的與已知其他物種或已知的血吸蟲蛋白的序列相似性,做出日本血吸蟲表皮蛋白的功能注釋。
            2.文獻查檢根據已經發表的文獻報道,發現鑒定得到的23個表皮蛋白在蟲體上的位置,有一些的確在血吸蟲表皮上。而其他則是新發現的表皮蛋白。
            舉例說明,比如以下表皮分離和質譜鑒定得到的蛋白,根據文獻報道,就是已知的表皮蛋白,而且有些蛋白已經有進行了疫苗和抗原研究。
            paramyos intropomyosinmyosindynein light chain 122.6 kDa tegument membrane-associated antigentegumental antigen Sm20nitric oxide synthase 1(NOS1)leucine aminopeptidase14-3-3 proteinsSnaKcathepsin B-like cysteine protease precursor
            21.7kDa antigenFK506-binding protein 50(immunophilin)實施例3日本血吸蟲表皮蛋白的實驗驗證為了進一步用實驗的方法驗證用蛋白質組學手段鑒定得到的血吸蟲表皮蛋白,選取了一個Immunophilin(SjFKBP50,GenBank登錄號為AY815389)做免疫熒光抗體原位雜交做蛋白定位分析。
            實驗方法血吸蟲成蟲用冷凍包埋劑(OCT)完全包埋,切成5μm厚的切片。用抗Immunophilin的抗體覆蓋切片,在37℃反應60分鐘。該抗體是用重組表達的Immunophilin免疫小鼠制備的單克隆抗體。隨后切片用PBS洗滌,再加入FITC-偶聯的兔抗鼠免疫球蛋白的抗體(1∶40稀釋,用含有0.5mg/ml的Evans藍的PBS稀釋),置濕盒中37℃反應60分鐘。染色結果用Leica DM-RB型熒光顯微鏡觀察并拍照。
            圖-所示為免疫熒光抗體原位雜交實驗結果,表皮T;腸道G;下表皮ST。綠色熒光部分是Immunophilin的信號。
            該結果證明了Immunophilin確實分布在血吸蟲成蟲的表皮上。這說明前面表皮分離和質譜鑒定的結果是可信的。
            序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>日本血吸蟲表皮抗原及侯選疫苗基因、蛋白及其應用<130>NP-10261<160>46<170>PatentIn version3.1<210>1<211>1462<212>DNA<213>Schistosoma japonicum<400>1aagttttcgc ttcactggat tatgataggt cgtcttcctg ccattgtgat tgataatggg60acagggtact ctaagatagg ttatgctgga aatacagaac ctcaatcaat catcccttcc 120tgcatagccg taaaagaata tagcaaggtt ggtgcaagag aagtcagacg acttgggact 180ggtttagatg acttaaattt ctatatagga gatgaagcta tagctttaga cggaaagaat 240gatttttctg taaagtggcc tattcgtcat ggtataattg aagattggga tttaatgcaa 300cgttacatgg aacagcttat cttcaaactt cttcgagcag agcctgaaga tcattatttt 360ctcctgacag aaccgccact gaatacaccg gaaaatcgtg aatacttggc tgaaatcatg 420tttgaaacat ttaatattcc tggtctctat attgctgtac aagctgtatt agcattatca 480gcatcatggt gttcaaatcg aactggtggt cgttcactta ctggaactgt tattgattcg 540ggtgatggtg tcacgcatgt gattcctgta gtcgatggtt atgttattgg atcatgtatt 600aaacatatac caatagctgg ccgggatatt acttcattca ttcaacatct gcttagagat 660cgcgagacaa atatcccacc ggaattaagt atggaggttg ctaagcaaat taaagaacgt 720tactcttatg tttgtcctga tttgcctaaa gatttgctaa atatgatagt gaaccagata 780aatggattaa accacatgtc gtttcaaaat ctgcgaaata tccagcattt tctgttgatg 840tcggttatga acgtttcttg ggtccggaaa tattttttca gcctgaattc gtcaatccag 900actttacaac ctcattgagt gatgttgtcg atgaagttat tcaaaagtct ccaattgatt 960ctcgccgtgg tctttatggt aatattgttt tatcaggagg cagttcaatg ttcaagcatc 1020ttgatcgtcg tttacaaaga gatattaaac gaaatgttga taatcgctta aaactaacag 1080aagaacttac tggcggacaa atgaagccta aatctataga cgtcaaggtg gtttcacatc 1140ctatgcaacg ttatgctgtt tggtttggtg gatcagtact tgctaatgag agtgaatttt 1200acaacgtatg tcataccaaa gcacaatatg aagaaattgg cccagctatc tgccgtcata 1260atccagtatt cggtacaatg acataattgt gatggagaaa ctttattatg gtttcctttt 1320tatattttct acatgatttc gcttcgttat tttatgatta atataatgtt ttcttactaa 1380actgttgaat tgcactaact caatctgctt actagcaatc ttatcgtttt gtttaatttt 1440taactaataa taagaatgtg aa 1462
            <210>2<211>2000<212>DNA<213>Schistosoma japonicum<400>2tttaatcata gacttttaca catatttcga ttgccttagg tgctagtatt gttttgtctt 60atctcactag ctagaatgcc gagcagcaat gttgctaatg aagttatgtt gtcaggaaag 120ccagagaaat ttatagataa aatcgatcct gaggatccag attatcaaaa aatcctaatg 180cgtcctgctg ctataaaaga agatgttaat ttaatgattc agcgacagcg tgtttctgga 240atattgaagt cagatgcatt tcgtcgggaa ctggaagaag ttgttcgttc tcaatgtcag 300tctggtgact atcctggtat gagtacgagc cttctatctc tgcagcatat atcggacttg 360ttcacttccg ctccttctgg acagcctgcc agtgggggtg gattttcaag aggacatcga 420agtggtgtta tccctataaa tgacctgcgt ggtggtgacg ctactgttta ttctcgccgt 480gaacgttctt tgcgttgtaa gctggcttca gtatatcgcc taatagatct ctttggatgg 540aattctagta tatacaatca tgttactgta tgtgttagtc gcaatcatga gcattatctg 600gtgaatcctt tcggattgct ttatcatgaa attaccgctt cttctcttat caaagtcgat 660tctaaaggcc aaatacttga tccaggatct actattttgg gtgtaaacca agtgacctgg 720gctttacact ctgcagtaca ttcagccagg gctgatattc gttgcattat acatttggat 780accccttcaa ctgttgcaat atcttgcatg aaatcgggtt tattgcctct ttgtaatgaa 840gcaatgattt taggcgaagt ggcttattat acacctagta gtggattgag gtgcaaaact 900aatttcaata caaatggaga tttcagtgat gctaaagatt gggcagctga atgtgcaacg 960gtcagtgaag ctttaggtcc aactgctcgt atattgtttc tacgaagttt tgggctactc1020gctctgggtg aaactatcga ggaggcatgg cactatgcga ctaatgcaat agttgcatgt1080gatactcagc tcttattagc ctcagttggt gctgaaaatc tcatccttcc tacagacaaa1140ttaaagcaaa aaacgtatga aacatggcgt actgctgggt taggcggtct tagtggtcca1200gaagctgctc tggctatgag actatcttcg cctaataaat ctggcactag tgaaacagga1260caacatggag caacgaatgg atttcttaca gatggaggta caaatgtgga aactactttg1320tccagaccgt ggcggctggg tgagctcgag tttgaagcta tgatgcgtca cttagataat1380gctggatgtc gtacaggtca tctttatcga caggaggcta tggcaagccc acacagacct1440cgaaaaagta ggcccgttaa tggacacagt ggagctggta gtcaagatga agaaatacta1500gtcccaccat ctgcctcatc tgtaactgct acaatggctt actattatga cgatggagtt1560ctttcgggtg atgaaacaga aacacctagg ccgtcaactc ttaggcgaga gttttcagat1620aagcaatggt ttaatactcc aaacaaatat actaaagaag taattgaacc tgctccaggt1680catcaaccag tttcccattg ggtttgtgaa cgtgaggcgg ctgtttataa tgctgtttgc1740aatggtgccc tacctcctcc agcaccgttt catcctctta ctcatggggc agtaccacta1800ggttcaactg ggggacctgc tacagggact tcgtcaatta catcaccgta caatgtgttc1860gctccgcaag gttctaaccc caaggaatat cgtgaccaac agaaaaaagt caaggcaaaa1920tattaccatg atacaaatac tgccggacct caatctcgac tgttggacgg ccttacatgg1980gatgaagctc gacgagttcg2000<210>3<211>1129
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            <210>24<211>305<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>24KFSLHW IMIGRL PAIVID NGTGYS KIGYAG NTEPQS IIPSCI AVKEYS KVGARE VRRLGT 60GLDDLN FYIGDE AIALDG KNDFSV KWPIRH GIIEDW DLMQRY MEQLIF KLLRAE PEDHYF 120LLTEPP LNTPEN REYLAE IMFETF NIPGLY IAVQAV LALSAS WCSNRT GGRSLT GTVIDS 180GDGVTH VIPVVD GYVIGS CIKHIP IAGRDI TSFIQH LLRDRE TNIPPE LSMEVA KQIKER 240YSYVCP DLPKDL LNMIVN QINGLN HMSFQN LRNIQH FLLMSV MNVSWV RKYFFS LNSSIQ 300TLQPH 305<210>25<211>641<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>25MPSSNV ANEVML SGKPEK FIDKID PEDPDY QKILMR PAAIKE DVNLMI QRQRVS GILKSD 60AFRREL EEVVRS QCQSGD YPGMST SLLSLQ HISDLF TSAPSG QPASGG GFSRGH RSGVIP 120INDLRG GDATVY SRRERS LRCKLA SVYRLI DLFGWN SSIYNH VTVCVS RNHEHY LVNPFG 180LLYHEI TASSLI KVDSKG QILDPG STILGV NQVTWA LHSAVH SARADI RCIIHL DTPSTV 240AISCMK SGLLPL CNEAMI LGEVAY YTPSSG LRCKTN FNTNGD FSDAKD WAAECA TVSEAL 300GPTARI LFLRSF GLLALG ETIEEA WHYATN AIVACD TQLLLA SVGAEN LILPTD KLKQKT 360YETWRT AGLGGL SGPEAA LAMRLS SPNKSG TSETGQ HGATNG FLTDGG TNVETT LSRPWR 420LGELEF EAMMRH LDNAGC RTGHLY RQEAMA SPHRPR KSRPVN GHSGAG SQDEEI LVPPSA 480SSVTAT MAYYYD DGVLSG DETETP RPSTLR REFSDK QWFNTP NKYTKE VIEPAP GHQPVS 540HWVCER EAAVYN AVCNGA LPPPAP FHPLTH GAVPLG STGGPA TGTSSI TSPYNV FAPQGS 600NPKEYR DQQKKV KAKYYH DTNTAG PQSRLL DGLTWD EARRV641<210>26<211>326<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>26MPIQCR YYEDLF PEVGDV VVVTVK VIQPMG SYVELL EYKNIG GMILHS ELSRRR IRSISK 60LVRIGS NTEVTV VRVDSA KGYIDL SKRRAS AEEIAK CKERFA KAKAVN QILRNV AEKLEY 120ETDEQL EELCRK TAWYFD KKTGRK AGSYDI FKKVVN SPEILD ECDIDQ PTKEML LTDIRH 180RLTPKA VKIRAD FEVSCF TYDGID AVRSAL RSGLKL NSDALP IRINLI APPLYV LTTQTM 240
            DRAAGL EQLNEV LNVIQT SIESQG GSFKIR QAPRVV SDTDDA ELQRQM DELEKA NREVSG 300DEDDED DDEDED DDEESN DGDQNE HK 326<210>27<211>103<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>27MSGRGK GGKGLG KGGAKR HRKVLR DNIQGI TKPAIR RLARRG GVKRIS GLIYEE TRGVLK60VFLENV IRDAVT YTEHAK RKTVTA MDVVYA LKRQGR TLYGFG G 103<210>28<211>417<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>28MSLTSL YTCRVI VNYHPW SVVYSC SMRCRH YSKGFI QSLIEK VKEESS KDTELK ENIRRF 60REETAK LEQTKE LRSVRE FYKKIE KEMPAD TVDKVR GTFQSV KNKIRN DAQNLA QNETLR 120KGVESL SKAGEH VRDATK SLGETD FVKAAI KSVEVL EKELES DRSKMY QAPSIL KTRSEI 180SGKSED RIMQPD SESSGV VVHKDS KWFTAW QDFKEN NPYVQR FFDLKA NYEESD HLIVRS 240LRFVTD KVSSLF GGFKIN NELQEV LDEVTK MDPSFN LESFIR YCRFVV IPNVLE AIVRVD 300LPILQD WCHEAP FNVLAT PLRQIK ELGYVS ESRILD IHNVDV QMGKIM EQGPVL IITFQA 360QQIHCI RDKNGT VHEGDP NKVLRV THVWAL CRDQSE MHPLAA WRLLDI AMIPSE QWV 417<210>29<211>470<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>29MAFINL LLRNTG RNNFVR FSPINR SVALSR FEENTL DYDKLE HSLSTV KKRLGH PLTLAE 60KVLYSH LDNPKT ANIERG KSYLML RPDRVA MQDATA QMALLQ FISSGL PRVAVP STVHCD 120HLIEAK DGSETD LNRAND VNKEVY DFLASA SAKYGI GFWKPG SGIIHQ IVLENY AFPGAL 180IIGTDS HTPNGG GLGGLC IGVGGA DAVDVM ANLPWE LKAPLV IGVHLT GKLSGW TSPKDI 240ILKVAE ILTVKG GTGAII EYYGPG VESISC TGMATI CNMGAE IGATTS IFPFND RMLDYL 300RATNRA DIGDLA SKHKAS LLTPDV NCKYDR IIEINL DTLEPH VNGPFT PDLAHP ISKLSS 360HSSKEG WPQYIS AGLIGS CTNSSY EDMSRA ASLARQ ALDKGV KIKSQF FITPGS EQIRAT 420IERDGI TKVFQS VGGIVL ANACGP CIGQWF RKDTKK GDKNTI VSSYNR NF 470
            <210>30<211>184<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>30MSASAL VILSEG AEEMEA VTVADI LARAGV NVTMGG LQGDAI IKGSHG VLIKPN VALSSV 60SSKLFD MVVMPG GMGGSN AMAESK LVGQIL REHEKH GKYIAA ICAAPI ALESHK IAVGKK 120LTSYPG FEDRLR SYTYCE DIVVVD DKLVTS RGPGTA IAFAMK LVELLC SKSKAQ TLAKGM 180LVSL 184<210>31<211>155<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>31MDVDKA LMEKLE KLKGMS DQVRIG GKGTAR RKKKVV HKNAAA DDKKLQ SSLKKL NLNTIP 60TIEEVN MYKPDG TIIHFK NPKVQA SPQANV FAVSGQ AECKAI NDLLPG VLNQLE SAKLRL 120SKMNEN SKTSDS KIDDGD DDVPDL VEDFDE KSRLE 155<210>32<211>194<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>32MDFEQE IKLFGK WSVDDL NVNDLS LTDYIN IKRKGN PIVPHT AGRYQV KRFRKA LCPLVE 60RVCCSL MMHGRN NGKKVK AMNILK HTFEII HLLSGE NPIHVL VNAVLN SGARED STRIGR 120GGTVRR QAVDVS PLRRVN QAIYLL CTGARE AAFRNV KTISEC LADELL NAAKGS SNSYAI 180KKKDEL ERVAKS NR 194<210>33<211>223<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>33MVFRSS MSLVHI LRSSVL RNYGVR FKHTLP PLPYDP SALEPV ISKEIM QLHHSK HHAAYV 60NNLNIA EEQFAD AMSKSD VTKMIS LQPALR FNGGGH INHSIF WHNLSS KGGGVP TGSLAN 120AINDEF GSFDNF KSRLSA TTIAIQ GSGWGW LGYNPN TKRLQI ATCANQ DPLEGT TGLKPL 180LGIDVW EHAYYL QYKNAR PDYVKA IWDIVN WSDVAK RFDLCR N 223
            <210>34<211>326<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>34MAESDK LNIDSL ISRLLE VRGSRP GKNVQL SEGEIR GLALKS REIFLR QPILLE LEAPLK 60ICGDIH GQYYDL LRLFEY GGFPPD ANYLFL GDYVDR GKQSLE TICLLL AYKIKY PENFFL 120LRGNHE CASINR IYGFYD ECKRRY NIKLWK TFTDCF NCLPIV AIVDEK IFCCHG GLSPDL 180HSMEQI RRIMRP TDVPEQ GLLCDL LWSDPD KDITGW GENDRG VSYTFG ADIVTK FLHSHE 240LDLICR AHQVVE DGYEFF AKRQLV TLFSAP NYCGEF DNAGAM MSVDET LTCSFQ ILKPAD 300KKKFNF RSLNSG WPTTPP RNSKLE DK 326<210>35<211>279<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>35MSGGYP ALELSA EDLRLM LAAHVH VGETNM NFQMST YVHGRT KDNFHI IKLDKT WEKILL 60SARAIA AIDTAS DVFAIG SRPFSQ RAVLKF ANYTGA TAMAGR FTPGAF TNQKQS CFREPR 120LLVVSD PLSDHQ AVMEAS SVNVPL IALCNT DSPLTR VDIVIP CNNKST HSIAVV WWFLAR 180EVRRIR GEDTRL QQWSVL PDLFLY RDPNEE EQNVED PEDARL EPVIPG ADAEAA ETWGVE 240PSMPVG SLGDMG IAAPGY GPVGGT AGGWSN LDADPT ETW 279<210>36<211>302<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>36MNATIE RMWKEG VSNLSV ISACEL FQRFIT LTTLDT VSFDEC KRYLSE RAQIFI RKVGSC 60RRKIAE NFLNYI PNGSVI FLHSYS RVVLAA LAYAAS AHKRLH CYVTTC SPNGLG AKMTKA 120LAKLKI SCTLVP DNSLAY LMPQVD FVVLGA EAVVES GGILNI LGSSLI AMTASS LGKPVY 180VLAESF KFMRCY PLDQRH IPDEFK WSSDHE YKSLSS PSPLFN LRDKSN CYYFPN DDDDDE 240NKCVFP EMKTVW AAVEAQ RVSVIE QKMPRV DYTSPC YINYLI TDLGVL TPSAVS DELIKL 300YL 302<210>37<211>333
            <212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>37MDTVRQ AVTRTA LGLAEY VTPVLK ATKFRE TGVITP EEFVAA GDFLVY HCPTWQ WSIGDK 60PARPYL PKEKQY LVTRSV PCYKRV KQMADH HEEFEK VLEEED GDGGWV DTHHYA TKYGDL 120NPEVEK TNEMSV PSVSHS LKKSNL EETIIS DCEDEE DEDMEA FLQSGM LDECDP AAVKAR 180TKVAND GNTSQA MADFGI DQNIDR ENN6IL QTRTYD LYITYD KYYQTP RLWLFG YDEQHQ 240PLTETQ MYEDFS QDHAKK TVTTEA HPHLSG HMMPSI HPCRQA DVMRKL IEAVAD NGAELA 300VHQYLM VFLKFV QAVIPT IEYDYT RNFNLS SYA 333<210>38<211>281<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>38MSSLVV DRGPGG FSFDNC YRNKVI EQKGFK VPKAVK TGTTIC GVVFKN GIVLGA DTRATE 60GNIVAE KNCSKI HRIADN IYCCGA GTAADT QMVTLM ISSQVE LHRLNT GRTPRV IAPLRL 120LKRYLY QYQGYV GAALVL GGVDST GPHLFS IAPHGS TDKLPY ITMGSG SLACMS VLESRF 180KFNMEQ DEAVKL VRDGIA AGIFND MGSGSN VDICII TKDGTK YIRSYD EANVKG KRAEKY 240NPPEGT TSVLNK SVHRVE FDVVTT RVVRDM PVHDVE TMDLS281<210>39<211>341<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>39MFSRGV NVFKFG ITFRSF VTSPKH SLKVAV LGASGG IGQPLS LLLKQS PLIYQL ALYDIA 60HVKGVA ADLSHI ETQAHV TPHLGP GELGEC LSGANL VMIPAG MPRKPG MTRDDL FNTNAS 120IVAELI NACAKN CPKAMI CIITNP VNSTVP IAAEIL KRHNVY DPKRLF GVTTLD VVRSNT 180FIAQAK DLAVRK VSCPVI GGHSGI TILPVI SQCSPH VSFPQD EREKIT KRIQEA GTEVVE 240AKAGAG SATLSM AYAGAR FAISLL EAMNGR AGVVEC AFVQSD VTECEF FSTPLA LGTEGV 300EKNMGI GKLNEY EIELLK KLIPEL QANIKK GKEFAA KFTPK341<210>40<211>216<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>40
            MAGSKW PASVAP TSRVGN TPRAKQ VIFEPT FAKMEK ENYSLT QRLKEA FYKVEK RYPGFS 60KDFMVG LLQRMG VDSEID VTETCL RIAALQ ECDNPR TSRNPR VLELEL TAKTLK TILSSI 120PDEITD RRAFIE VIKGIA DAIKML LAAVGA FYDALP PGTQKK CLEDQK RKFITY CRKFSD 180TLKQYF RNNDQT VYFSSA NLLYNQ TNLILF VVHDVD 216<210>41<211>514<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>41EVRRLH SIELIG GSSRIP MLKDAV VSIFKQ EGITTL NADEAV ARGCAF QAAICS PAFKVR 60DFNVVE ACLYPI EIKFDR EEGSEQ CMQTEE IGGAIT TQGKAM HIEVFP FLHPIP SSRQIF 120LTRRGA LTLEAR YANTEG LPNGNV VIGTFR IGEASQ MFTEPR KIRLKL RMNTHG IFNISQ 180AQLVEE YEKEVE VSVSED NPVVDG PANSTK EMTTAA NEGNEN PNPSAD NGQVNT QDSTSP 240KKKTVL RKKKFT KYHDLS IEVNNM QFSTKQ LNEFCE ICANLI FKDKLE RERVNA KNAVEE 300YVYEMR SKLQGS LNPFAS PTESES LLQLLD ATEEWL YGDGEC SKRQVY VEKLAE LKNKGD 360PIVHRA NEHLNR PLAVEN FNRSLV RIRKVI DSIAAG EPTYDH LTQEQV NQLENM IVQYET 420WLNQQM MHQNPR PQHADP VVKVTD IISQQQ AMESVC HPIINI PKPTPT SQTNTA DPNSHS 480SEQCNN VNNANT DCNTKS NHSKKC GDNAEN MDLD 514<210>42<211>197<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>42MAPKAQ PKKQEK STNDPA KKTQDS KKGSKK SQKTSK SLKALK SVKGGK VVKASS KKSAAL 60KALKAQ RAITLG SHTKGK KRVMYT TRFRRP KTYKPA RCPKDR RFLIPK RTKLDA FRIIQH 120PVTTEA AMKKIE DNDTLV FIVDRR ANKPAI KAAVQE LYNIKV AKVNTL NCPNNV KKAYVK 180LPPDFD ALDVAN RIGII 197<210>43<211>355<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>43YPVQNG ETPKLL YPHVNF LGIPVN KGQPKL GTYQGP DFIRKS NFFQLV AEDGIQ ITDCGD 60VIPVEL SESEDP ERCGMK WSRSFT QTTLKI ADRVEQ LVKGSN KHSIES SNSKPS PLVIVG 120GDHSMA TGTILG HARAKP DVCIIW VDAHGD INTPPN STTGNI HGMPLS FLVKEL QDQIPW 180LDDFHS IKPCLD ASNLVY IGLRDL DVYETR DIRKHG IAYFTM LDVDRM GMEAVI KEALQA 240
            VNPRLE KPIHLS FDIDAL DPSIAP STGTAV PGGLTL REGLRI CEEISA TGKLSI VELAEL 300NPLLGS KEDVEK TQSSAV HILRAS LGHCRS GQLPMK VNNSTT NSIVRQ AERIQI K 355<210>44<211>417<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>44MPTKSP VFTYVI KRLSSH WNHVKL GPPDAI LGITEA YNRDTN PQKINL GAGAYR DDNGKP 60FVLPSV KEAESL LLAKNL NKEYAP ISGIPQ FCDLSI KLALTE QSPRIK DRCNAT VQTISG 120TGALRI GGAFIN EFAEQK HIWMPS PTWGNH IPIFVH SGLNVH QYRYYD SNTCGF DIDGCL 180SDLSKI PKGHFV LLHACA HNPTGV DPSFDQ WRKIGE IMKSRD LIPFFD CAYQGF ASGDIN 240NDAKAI RYFTDE LNFPTL FLTQSF AKNMGL YGERVG AFSLLC SSSDEA ERCLSQ IKILIR 300PMYSNP PIHGAR IAAELM SNVDLR RKWLID LKSMAD RIITMR QSLKNG LIEAGS QHDWSH 360ITNQIG MFCFSG LNPSQV EKLTNE YSIYLT KDGRIS IAGLSS KNVKYL AHAIHQ VTK 417<210>45<211>337<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>45RLTEEL RSIRDQ TASELE EYKIQM EETFEN KLGQLK SSANFS AEDACR QRSELL MARKRA 60DDLSHD LSKKIA ELELLQ RRVTDL EGQLSD ERRDFE AQLLFQ RQEVER LKEELE ESFREF 120TDLMNT KIALDQ EILMYR KMLEGE ESRLNL TPASRD SPFNIH TVKRRR IDGDYD GDDSTV 180NLTGSS YSSSRS RFAYRV SSTAR6 PVEFFK EQDIHG KWIKIY NSSTEE VNLGSW ELVHEA 240DGHETR FKFSRT FSLKPG TTCTIW SQDAEG NSHNPP SDITMK NKSFHP GTEVTI LLLDAD 300GEEQTK CTVKRE KVRPSV VNFDRK SGVRGH DEKCHL M337<210>46<211>313<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>46MGRRNS ENNDRR TEQFRK LFIGGL TPLTTE AKLKDF YSQWGE IVDVVV MKDGRT NRSRGF 60GFITYK EPEMVD AAQANR PHEIDG KTVEAK RAMPRE DSNSPE SHMTVT KLFVGG LKKDVT 120HEELRE YFSKYG NITECE VVAWKE SGESRG FGFVTF DDYDPV DKAILY KPHHIG SSRADV 180KKALSK EQINTM KKKQES RIDYNN NYGGGG YGPMGG GYGGYE GGYGGS YGGGPY GGYGSN 240GGGSGG AYGGGN YGGGWG PNHMNG DGPGWG QGGMGD GFGHYG NQQNYA GGPMRG GPPGGY 300QRNAPY GGGYGR R31權利要求
            1.一種DNA序列,其編碼表達于日本血吸蟲表皮的蛋白質,其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.23所述序列中任一序列的堿基序列;或者它是在中度嚴緊條件下與序列表中SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.23所示的序列中任一條序列雜交的序列;或者它是與序列表中SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.23所示的序列中任一條序列有至少70%同源性的序列。
            2.一種氨基酸序列,其編碼表達于日本血吸蟲表皮的蛋白質,其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.24~SEQ ID NO.46所述序列中任一序列的氨基酸序列;或者它是與序列表中SEQ ID NO.24~SEQ ID NO.46所示的序列中任一條序列有至少70%同源性的序列;或者它是包含有序列表中SEQ IDNO.24~SEQ ID NO.46所示的序列中任一條序列的氨基酸序列。
            3.一種從日本血吸蟲中分離獲得日本血吸蟲表皮蛋白質的制備方法。
            4.根據權利要求2所述的氨基酸序列在制備血吸蟲免疫蛋白的免疫原方面的應用。
            5.根據權利要求2所述的氨基酸序列在篩選化學和其他種類藥物的潛在的藥物的作用靶點方面的應用。
            6.根據權利要求2所述的氨基酸序列在制備抗血吸蟲抗體的特異性血吸蟲抗原方面的應用。
            7.根據權利要求2所述的氨基酸序列在制備血清學診斷方面需要的蛋白質方面的應用。
            8.根據權利要求2所述的核苷酸序列在制備用于基因治療的核苷酸序列方面的應用。
            全文摘要
            本發明公開了一類在日本血吸蟲表皮上表達的表皮蛋白,尤其公開了所述表皮蛋白的編碼核苷酸和編碼氨基酸。本發明通過大規模的蛋白質組學研究,發現了一類日本血吸蟲表皮蛋白質,這些蛋白質,都是可能的藥物作用靶點和候選疫苗。血吸蟲病的流行給人民身體健康和經濟發展都造成巨大的損失,因此,防治血吸蟲病、開發研制治療血吸蟲病和抗血吸蟲的藥物具有巨大的社會和經濟效益。
            文檔編號A61P33/00GK1986810SQ20051011173
            公開日2007年6月27日 申請日期2005年12月20日 優先權日2005年12月20日
            發明者韓澤廣, 劉鋒, 王志勤, 胡薇, 馮正 申請人:上海人類基因組研究中心, 中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所
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