一種中藥組合物在心腦血管方面的應用的制作方法

專利名稱：一種中藥組合物在心腦血管方面的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥組合物的用途，具體地，涉及一種中藥組合物在心腦血管方面的應用，尤其涉及該中藥組合物在制備防治中風、腦缺血、記憶障礙、血栓及微循環障礙的藥物中的應用。

背景技術：
2005年11月2日公告的發明專利說明書CN1225250C公開了一種防治老年癡呆的中藥組合物，其主要由茯苓、白術和當歸組成的原料藥中的多糖、正丁醇提取物和/或揮發油有效部位組成，或者主要由選自茯苓、白術和當歸中的一種或兩種原料藥中的多糖、正丁醇提取物和/或揮發油有效部位組成。該中藥組合物可采用超臨界萃取和水提取的方法制得。
上述中藥組合物具有防治老年癡呆的用途。本發明發掘了該中藥組合物新的醫藥用途。對于已知的藥物，發現其還具有治療另一種疾病的性能，從而可以治療另一種疾病，這種第二次醫藥用途發明對于滿足醫療臨床需求與市場需求，具有重要意義。
鑒于第二次醫藥用途的重要作用，研究和開發上述中藥組合物的新用途具有重要意義。


發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種中藥組合物的新用途，即在制備防治中風、腦缺血、記憶障礙、血栓及微循環障礙的藥物中的應用。
本發明提供了一種中藥組合物在制備防治中風的藥物中的應用，該中藥組合物主要由選自茯苓、白術和當歸中的一種、兩種或三種原料藥的超臨界萃取物和/或水提取物，或者超臨界萃取物和/或水提取物有效部位組成。
本發明還提供一種中藥組合物在制備防治腦缺血的藥物中的應用。
本發明還提供一種中藥組合物在制備防治記憶障礙，改善記憶的藥物中的應用。
本發明還提供一種中藥組合物在制備防治血栓的藥物中的應用。
本發明還提供一種中藥組合物在制備防治微循環障礙的藥物中的應用。
為敘述方便，將本發明茯苓、白術、當歸組成的中藥組合物簡稱為FBD。茯苓簡稱F、白術簡稱B、當歸簡稱D。
本發明FBD可以采用以下方法制得將原料藥粉碎成粗粉，經二氧化碳超臨界萃取得到超臨界萃取物，之后藥渣用水提取后得到水提取物；或者原料藥經超臨界萃取得到超臨界萃取物后，藥渣用水提取后，加乙醇至含醇濃度為45-95％時沉淀，得到多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得到正丁醇提取物；或者，所述原料藥用水煎煮，水提取液濃縮后，加乙醇至含醇濃度為45-95％時沉淀，得到多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得到正丁醇提取物；多糖和正丁醇提取物是水提取物有效部位。
在所述的超臨界萃取物和水提取物有效部位中可加入藥用載體或敷料，制成中藥制劑。常用制劑輔料可選用，崩解劑如羥丙基淀粉、羥丙纖維素、羧甲基淀粉鈉、羧甲基纖維素鈣、交聯聚維酮、交聯羧甲基纖維素鈉等；填充劑如乳糖、蔗糖、甘露醇、微晶纖維素、糊精、淀粉、磷酸鈣、磷酸氫鈣、硫酸鈣、碳酸鈣、環糊精、微粉纖維素等；潤濕劑和粘合劑如乙醇、預膠化淀粉、聚維酮、羧甲基纖維素鈉、羥丙甲纖維素；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、微粉硅膠、氫化植物油、聚乙二醇4000和6000；潤濕劑如十二烷基硫酸鈉、吐溫80。
本發明FBD的用量和療程可根據劑型、患者的年齡、疾病的輕重程度作適當調整，但一般為每日口服3次，每次2片，以1個月為一個療程，可連續使用1個療程或更長時間。
為了更好地理解本發明的實質，下面將用本發明FBD的藥理試驗及結果來說明其在制藥領域中的新用途 在藥效學研究中發現 1、在線栓法引起大鼠局灶性腦缺血后再灌注損傷實驗中，FBD組及陽性藥尼莫地平(2mg/kg)對線栓法造成的局灶性腦缺血-再灌注損傷均有明顯的治療作用。結果表明FBD能有效防治中風，腦缺血。
2、在小鼠斷頭全腦缺血模型中，尼莫地平(5mg/kg)可使小鼠斷頭全腦缺血模型張口呼吸時間明顯的增加(p＜0.05)。FBD對呼吸時間有一定的延長作用，但與陰性組比較沒有顯著性差異。尼莫地平和FBD都可以顯著提高SOD活力，對MDA含量無明顯影響。結果表明FBD能有效防治中風，腦缺血。
3、在四動脈阻斷大鼠全腦缺血再灌注損傷實驗中，FBD能延長模型大鼠缺血后腦電圖消失時間、縮短再灌注后腦電圖恢復時間和翻正反射恢復時間，效果與劑量呈正相關。結果表明FBD能有效防治中風，腦缺血。
4、在FBD對麻醉犬外周及腦血流量影響的研究中，FBD對麻醉犬具有一定的降低腦部血管阻力，增加腦部血流量的作用，并且對動物的外周血壓也有類似尼莫地平的作用降低外周血壓，特別是舒張壓；減慢心率。但作用強度和作用時間均小于尼莫地平。FBD十二指腸給藥對腦部血流的改善作用在給藥后30min最明顯。結果表明FBD能有效防治中風，腦缺血。
5、FBD對亞硝酸鈉所致小鼠記憶鞏固不良的影響研究中，FBD對由亞硝酸鈉所致記憶鞏固不良有良好的改善作用，其作用強度似比石杉堿甲強。結果表明FBD能有效防治記憶障礙，并改善記憶，提高正常人記憶能力。
6、陽性藥丹參注射液和FBD組可明顯增加軟腦膜微循環血管的網點計數(與給藥前相比p＜0.05)。結果表明FBD能有效改善微循環。
7、FBD可以抑制大鼠動靜脈旁路血栓形成，降低血栓濕重；FBD與陽性藥丹參注射液(3000mg/kg)對大鼠腦微循環障礙的血液流態有不同程度的改善，表現為血細胞聚集程度有所減輕，如血液流態由淤滯狀變為粒狀，或由粒狀變為帶狀或線狀，或由虛線狀變為線狀，使腦膜毛細血管網點計數明顯增加。FBD對AA和ADP誘導的血小板聚集亦有明顯的抑制作用，對膠原誘導的血小板聚集則無明顯的抑制作用。結果表明FBD能有效改善血栓形成，降低血栓濕重。
在作用機制的研究中發現 1、在大鼠動靜脈旁路血栓形成實驗中，FBD對血栓形成有抑制作用，與陰性組比較有顯著性差異(P＜0.05)。但其抑制率小于陽性藥阿司匹林(25mg/kg)。
2、在FBD對大鼠腦膜微循環障礙影響的研究中，丹參組(3000mg/kg)和FBD于給藥后，可明顯增加軟腦膜微循環血管的網點計數(與給藥前相比p＜0.05)；血液流態有不同程度的改善。
3、FBD對血小板聚集功能影響的研究中，FBD可有顯著性地抑制ADP和AA誘導的血小板聚集，而對膠原誘導的血小板聚集無明顯作用，其作用強度均低于阿司匹林(25mg/kg)。
經過上述研究顯示FBD對局部性和全腦缺血-再灌注損傷具有明顯的治療作用。其抗缺血性腦損傷的機制可能與抑制血栓形成、抗血小板聚集和改善微循環，增加腦部血流量有關。
本發明的優點在于本發明對已知的中藥組合物FBD發掘了新的醫療用途，開拓了一個新的應用領域。本發明FBD安全無毒，藥理作用強，預示著很好的藥用前景。本發明FBD制備工藝簡單，并可制成各種口服劑型，如片劑、膠囊等。本發明FBD對局部性和全腦缺血-再灌注損傷具有明顯的治療作用，其抗缺血性腦損傷的機制可能與抑制血栓形成、抗血小板聚集和改善微循環，增加腦部血流量有關，且其對記憶鞏固不良有良好的改善作用。這些作用有利于防治中風、腦缺血、記憶障礙、血栓及微循環障礙。



圖1是FBD十二指腸給藥對麻醉犬腦血管阻力影響的示意圖； 圖2是FBD十二指腸給藥對麻醉犬頸內動脈流量影響的示意圖； 圖3是FBD十二指腸給藥對麻醉犬外周平均動脈壓影響的示意圖； 圖4是FBD十二指腸給藥對麻醉犬心率影響的示意圖。

具體實施例方式 以下通過試驗例對本發明的有益效果作進一步的闡述 試驗例1 FBD對動靜脈旁路血栓形成的影響 1.1實驗目的觀察受試樣品對大鼠動靜脈旁路血栓形成的影響。
1.2動物 品系SD大鼠 來源上海斯萊克實驗動物責任有限公司 性別雌雄各半體重200-240g 動物合格證號SCXK(滬)2003-0003 飼養動物飼養于正壓凈化通風動物房內，室溫25±2℃，自由進食與飲水。
1.3藥品 1.3.1受試樣品 名稱歸苓片(FBD)來源上海中藥制藥技術有限公司 性狀深紅色片劑 批號040904 規格0.48g/片 1.3.2陽性對照樣品 名稱阿司匹林 來源上海信誼百路達藥業有限公司 規格25mg/片性狀白色腸溶片批號030503 1.4動物分組 30只雌性、30只雄性大鼠按隨機數字法各分為6組，每組10只(5只雌鼠，5只雄鼠)動物。
1.5藥液配制 I.阿司匹林
II.FBD藥液的配制 FBD量
1.6實驗方法 第1組動物給予0.5％西黃蓍膠，其余5組動物按應給予的藥液口服灌胃給藥，給藥體積均為0.5ml/100g，每天給藥1次，連續5天。在末次給藥后1小時，大鼠腹腔注射3％戊巴比妥鈉35mg/kg麻醉，將大鼠仰臥固定，切開頸部皮膚，分離左側頸動脈和右側頸外靜脈，以一旁路管連接，管中置一7cm長的4號手術絲線。手術結束后開放血流15分鐘，取出絲線稱重，減去絲線重量，即為血栓濕重。
1.7結果 從表1可見，與陰性組相比FBD不同劑量組能劑量依賴性地抑制大鼠動-靜脈旁路血栓的形成(P＜0.05或0.01)；4.60、2.30、1.15和0.56 g/kg給藥組對血栓形成的抑制率分別為19.95、16.77、11.62和8.17％。陽性藥阿司匹林能非常顯著地抑制大鼠動靜脈旁路血栓的形成(P＜0.01)，抑制率達36.58％(表1)。
數據以平均值±標準差(

)表示，數據差異統計采用t檢驗，組間差異以P＜0.05判斷。
表1.FBD對大鼠動靜脈旁路血栓形成的影響 *P＜0.05，**P＜0.01，aP＝0.05034與陰性對照組相比 試驗例2 FBD對大鼠線栓法局灶性腦缺血-再灌注損傷的治療作用 2.1實驗目的觀察FBD對線栓法引起大鼠局灶性腦缺血后再灌注損傷的治療作用。
2.2動物 品系Wistar大鼠性別雄性體重250～350克 來源上海斯萊克實驗動物責任有限公司 動物合格證號SCXK(滬)2003-0003 飼養恒溫凈化通風動物房，自由進食與飲水，25±2℃。
2.3藥品 2.3.1試驗樣品 同1.3.1 2.3.2陽性對照樣品 名稱尼莫地平 來源鄭州瑞康制藥廠 批號20030106 含量101.29％ 性狀淡黃色結晶性粉末 2.4動物分組 按隨機數字法分組，每組10只。
2.5藥液配制 I.尼莫地平用95％乙醇配制成20mg/ml的注射液 II.FBD受試樣品的的配制同1.5 2.6實驗方法 取健康雄性Wistar大鼠，體重250-350g，共50只，隨機分成3組，FBD樣品于缺血2小時后灌胃給藥，給藥體積為0.5ml/100g；陽性對照組尼莫地平給藥體積為0.01ml/100g，于缺血后2小時從大鼠尾靜脈注射給藥。陰性對照組給同等體積的0.5％西黃蓍膠。
將大鼠以12％的水合氯醛腹腔麻醉(350～400mg/kg)后，仰臥固定于手術臺上。室溫維持在25℃左右。切開右側頸部皮膚，分離、結扎右側頸總動脈、頸外動脈及其分支動脈。分離右側頸內動脈(ICA)，至鼓泡處可見其顱外分支翼腭動脈，根部結扎該分支。在ICA近端備線、遠端放置動脈夾，頸總動脈分叉處切口，插入直徑為0.26mm的尼龍線17～20mm，栓線進入ICA、穿過大腦中動脈(MCA)起始端至大腦前動脈近端，阻斷MCA的所有血流來源。扎緊備線，4小時后，拔出尼龍線，使其血流再通，結扎備線并縫合皮膚，于缺血后2小時給藥，將手術大鼠分籠放回動物房。
缺血24小時后，進行神經缺陷評分，評分方法為(1)提鼠尾離開地面約1尺，觀察前肢情況。正常大鼠兩前肢對稱地伸向地面。如果有左肩內旋，左前肢內收現象發生者，評分為4分，否則為0分。(2)將動物置平滑地板上分別推左(或右)肩向對側移動，檢查抵抗推動的阻力。正常大鼠雙側阻力明顯且對稱。如果推右肩向左側移動時，發現阻力下降者，根據下降程度的不同，評分為1-3分。(3)將動物兩前肢置一金屬網上，觀察兩前肢的肌張力。正常大鼠兩前肢張力明顯且對稱。而發生左前肢張力下降者，根據下降程度的輕重評為0-3分。根據以上標準打分，滿分10分。評分完畢，斷頭取腦。將大腦平均冠狀分為5片，放于TTC溶液中，37℃溫育10～15min染色。梗死區不著色，正常腦組織染成紅色。用生理鹽水沖洗后數碼照相，數碼照片利用計算機測量每片梗死區截面積和全腦截面積，計算梗死面積百分比。
2.7結果 FBD組以及陽性對照藥尼莫地平對大鼠線栓法大腦中動脈造成的局灶性腦缺血-再灌注損傷均有明顯的治療作用，與陰性對照組相比，使腦壞死百分比明顯降低，動物神經學缺陷顯著改善。FBD組抗局部性缺血-再灌注損傷的作用與劑量呈明顯的正相關(表2)。
表2.FBD對大鼠線栓法腦局部性缺血再灌注模型的影響 *P＜0.05，**P＜0.01與陰性組比較 試驗例3 FBD抗小鼠全腦缺血作用的藥效學研究 3.1實驗目的通過小鼠斷頭全腦缺血模型研究FBD對全腦缺血的預防作用，以及對缺血腦耐缺氧能力的改善作用。
3.2動物 品系昆明種小鼠性別雌雄各半體重20-22g 來源上海醫藥工業研究院動物房提供 動物合格證號SYXK(滬)2004-0015 飼養動物飼養于正壓凈化通風動物房內，溫度25±2℃，自由進食與飲水。
3.3藥品 3.3.1試驗樣品 同1.3.1 3.3.2對照樣品 同2.3.2 3.3.3其它試劑 3.3.3.1名稱總蛋白測定試劑盒 來源上海申索試劑有限公司上海生物制品研究所批號20040702 3.3.3.2名稱丙二醛(MDA)測定試劑盒 來源南京建成生物工程研究所批號20041013 3.3.3.3名稱超氧化物歧化酶(SOD)測試盒 來源南京南京建成生物工程研究所批號20041015 3.4實驗儀器 3.4.1名稱3K30高速低溫冷凍離心機來源德國Sigma公司 3.4.2名稱JY92-II超聲細胞粉碎機 來源寧波新芝科器研究所 3.4.3名稱80-2型離心機 來源上海手術器械廠 3.4.4名稱722光柵分光光度計 來源上海第三分析儀器廠 3.5動物分組 將小鼠按隨機數字法分組，做SOD和MDA測定的共3組，每組10只動物；測斷頭呼吸次數的，共3組，每組16只動物，均雌雄各半。
3.6藥液配制 I.FBD藥液的配制 FBD
II.尼莫地平
3.7實驗方法 各組均提前2天灌胃給藥，給藥體積0.2ml/10g體重。給藥開始后第3天給予第3次實驗樣品，并于給藥后1小時，用鋒利的剪刀將小鼠的頭連同小腦腦干一并剪下，并于剪下即刻開始計時，記錄斷頭張口呼吸的時間。將斷頭冰浴，剝下大腦及小腦，稱重，放入已預先冰浴好的離心管中。按照1.9ml冰生理鹽水/100mg腦的稀釋比例，用超聲細胞粉碎機140W，兩秒，10次制成5％的腦組織勻漿，并且在超聲的同時也保持冰浴。將組織勻漿在低溫離心機上以4℃，2700g離心30分鐘。小心吸取上清，測定組織勻漿總蛋白、SOD、MDA。總蛋白用總蛋白測定試劑盒測定，722分光光度計550nm測定吸光度，總蛋白計算公式如下
SOD和MDA分別用SOD和MDA試劑盒測定。每毫克組織蛋白在1ml反應液中SOD抑制率達50％時所對應的SOD量為一個SOD活力單位(U)。722分光光度計550nm測定吸光度SOD的計算公式如下

MDA測定按照測定說明書操作，722分光光度計532nm測定吸光度。MDA的計算公式如下

3.8結果 3.8.1對張口呼吸時間的影響 各組小鼠斷頭后，均經歷一個從激烈張口呼吸到相對靜止到再次張口呼吸數次最后死亡的過程。實驗結果見表3。
陰性組張口呼吸時間為20.6±2.7秒；陽性對照組尼莫地平5mg/kg張口呼吸時間為23.1±3.4秒，與陰性組比較有顯著性增加(p＜0.05)。FBD低劑量組張口呼吸時間為19.8±1.9秒；中劑量組張口呼吸時間為21.3±3.6秒與陰性組比較稍有延長。高劑量組張口呼吸時間為22.9±5.3秒，與陰性組比較延長了2秒左右。
尼莫地平可使小鼠斷頭全腦缺血模型張口呼吸時間明顯的增加。FBD高劑量對小鼠斷頭全腦缺血模型張口呼吸時間有一定的延長作用，但與陰性組比較沒有顯著性差異(表3)。
數據以平均值±標準差(

)表示，數據差異統計采用t檢驗，組間差異以P＜0.05判斷。
表3.FBD對小鼠斷頭全腦缺血模型張口呼吸時間的影響 *p＜0.05，**p＜0.01， 與陰性組比較。
3.8.2對SOD和MDA的影響 各組腦組織均按照實驗方法處理，并測定吸光度，分別測定總蛋白含量以及MDA含量和SOD活力。測定結果見表4。
陰性組MDA含量為3.11±0.43nmol/mgprot，與陰性組比較各組的MDA值均沒有明顯的升高和降低(與陰性組比較沒有顯著性差異)。陰性組SOD含量為59.48±27.00U/mgprot，尼莫地平組為83.72±17.08U/mgprot(P＜0.05)，顯著性升高了近23U/mgprot。FBD組SOD含量為83.98±21.25U/mgprot(P＜0.05)，也顯著性升高了近24U/mgprot；尼莫地平對斷頭MDA含量沒有明顯影響，但可以使腦組織中的SOD活力顯著性升高。(表4)。
表4.FBD對小鼠斷頭全腦缺血模型MDA含量以及SOD活力的影響。
*p＜0.05，**p＜0.01，與陰性組比較 試驗例4 FBD抗四動脈阻斷全腦缺血再灌損傷藥效學研究 4.1實驗目的觀察FBD對四動脈阻斷大鼠全腦缺血再灌注損傷的預防作用。
4.2動物 品系Wistar大鼠性別雄性體重250～270g 來源上海斯萊克實驗動物責任有限公司 動物合格證號SCXK(滬)2003-0003 飼養恒溫凈化通風動物房，自由進食與飲水，25±2℃。
4.3藥品 4.3.1試驗樣品 同1.3.1 4.3.2陽性對照樣品 同2.3.1 4.4實驗儀器 4.4.1名稱SW-30射頻雙極凝固器來源上海市檢測技術所檢測儀器廠 4.4.2名稱SJ-42四道生理記錄儀來源上海醫用電子儀器廠 4.5動物分組 50只雄性大鼠按隨機數字法各分為5組，每組10只。
4.6藥液配制 I.尼莫地平用0.5％西黃蓍膠配制成10mg/ml的注射液 II.FBD受試樣品的的配制同1.5 4.7實驗方法 取健康雄性Wistar大鼠，體重250-350g，分陰性對照組、FBD組及陽性尼莫地平組。于缺血前1小時灌胃給藥，體積為0.5ml/100g。將動物用12％的水合三氯乙醛腹腔麻醉(350mg/kg)，在枕后暴露第一頸椎橫突孔，用雙極電凝對準橫突孔電灼凝固雙側椎動脈。然后在頸部作一切口暴露雙側頸動脈，分離后，用1號絲線穿好備用，縫合傷口。于術后24小時，大鼠清醒時，用帶硅膠管的動脈夾將雙側頸動脈夾閉，即造成4根動脈閉塞全腦缺血，取出動脈夾可使血流再通，為再灌流期。該實驗缺血與再灌時間均為1小時。凡缺血1小時內腦電圖未消失或出現嚴重抑制一律剔除。觀察指標為缺血后腦電圖消失時間、再灌后腦電圖恢復時間及翻正反射恢復時間。所有數據均用

表示，統計學分析用t檢驗。
4.8實驗結果 從表5可以看出，與陰性組相比，FBD組能延長模型大鼠缺血后腦電圖消失時間、縮短再灌注后腦電圖恢復時間和翻正反射恢復時間，效果與劑量呈正相關。與陰性組相比，陽性藥尼莫地平亦能使灌注后腦電圖恢復時間和翻正反射恢復時間明顯縮短(P＜0.05或P＜0.01)(表5)。
表5.FBD對全腦缺血再灌注大鼠的腦電圖和行為學影響(

) *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001與陰性對照組比較； △P＜0.05，△△P＜0.01與尼莫地平組比較； 試驗例5 FBD對麻醉犬外周及腦血流量影響的研究 5.1實驗目的觀察FBD十二指腸給藥對麻醉犬心率、外周動脈血壓、外周動脈和腦動脈流量以及腦血管阻力的影響。
5.2動物 品系雜種犬 性別雌雄兼用 體重10.1±0.7kg來源上海醫藥工業研究院動物房 5.3藥品 5.3.1試驗樣品同1.3.1 5.3.2對照樣品同2.3.2 5.3.3其它藥品 肝素鈉140U/mg，中國醫藥(集團)上海化學試劑總廠批號F20020930 5.4主要儀器 5.4.1名稱Elama Minogograf-82型八導生理記錄儀 來源西門子公司 5.4.2名稱MFV-2100電磁流量計來源日本光電公司 5.4.3名稱GPS-2型高頻手術器 來源江蘇武進無線電廠 5.5動物分組 每組6只。根據大鼠有效劑量折算出犬的給藥劑量。
5.6藥液配制 I.FBD藥液的配制 FBD
II.尼莫地平
5.7實驗方法 將犬用3％戊巴比妥鈉30mg/kg靜脈注射麻醉。將動物仰臥位固定于手術臺上，于右側腹股溝處分離股靜脈，插入導管作輸液用，分離右側股動脈插管，連接壓力換能器，測定外周血壓。分離左側股動脈，以備測定外周動脈血流量。分離右側頸動脈直到頸外動脈和頸內動脈的分叉處，結扎頸外動脈，頸內動脈留用，將電磁流量計鉤在同側的頸總動脈上以備測定頸內動脈的血流量。從腹中線剪開動物腹部約5cm，找到十二指腸，并縫制荷包，插管以備給藥。待動物手術后穩定30min，藥物從十二指腸給予，給藥時間為1min。給藥后觀察3小時，分別在給藥前和給藥后5、10、15、30和60、90、120、180分鐘記錄動物心電圖以及外周動脈血流量和頸內動脈血流量和血壓。陰性對照組以同樣方法給予0.5％西黃蓍膠，1ml/kg。給藥后180分鐘處死犬，取大腦稱重。以右頸總動脈血流量乘以2代表全腦血流量(CBF)。腦血管阻力(R)可用以下公式計算 R＝MAP(kPa)/[CBF(ml/min)·100g腦]。試驗數據從記錄上測量得到。MAP計算公式為1mmHg＝0.1333KPa 實驗數據用平均值±標準差(

)表示。實驗結果統計用給藥后同給藥前的 變化值和陰性對照組同時間點的變化值進行t檢驗 5.8實驗結果 FBD十二指腸給藥對麻醉犬心率、血壓、外周及腦血流量以及腦血管阻力的影響見表6-12，圖1-4。
陰性組，外周血壓穩定變化不大，心率隨著時間的推移有所降低，外周血流量和腦部血流量均逐漸降低，因此腦部血管阻力逐漸增加。
尼莫地平組外周血流量在給藥后12min和120min顯著性增加，在給藥后的30、60、90、180min均非常顯著性增加。而給予尼莫地平后的頸動脈流量在第10、15分鐘非常顯著性增加，而在30-180分鐘顯著性增加。同時外周血壓在給藥后的15-180分鐘均顯著性降低，特別是外周動脈舒張壓，在給予尼莫地平后的15min顯著性降低，在后來的30-180min均非常顯著性降低(與陰性組同一時間點的變化率比較)。心率在給藥后的5、60、90min即顯著性降低，在15min非常顯著性降低。腦部血管阻力在給藥后的5min顯著性降低，在10-180min均非常顯著性降低。
FBD十二指腸給予麻醉犬后對外周動脈流量和血壓以及腦部血管阻力均沒有明顯的影響，僅在給藥后的30min，其腦部血流量有一定的增加，在給藥后30min，血管阻力有非常顯著性降低，但降低的絕對值并不多。
因此FBD對麻醉犬具有一定的降低腦部血管阻力，增加腦部血流量的作用，并且對動物的外周血壓也有類似尼莫地平的作用降低外周血壓，特別是舒張壓；減慢心率。但作用強度和作用時間均小于尼莫地平。FBD十二指腸給藥對腦部血流的改善作用在給藥后30min最明顯。
表6.FBD十二指腸給藥對麻醉犬外周動脈血流量的影響(n＝6，

) *P＜0.05，**P＜0.01與陰性組比較 表7.FBD十二指腸給藥對麻醉犬腦動脈血流量的影響(n＝6，

) *P＜0.05，**P＜0.01與陰性組比較 表8.FBD十二指腸給藥對麻醉犬動脈平均壓的影響(n＝6，

) *P＜0.05，**P＜0.01與陰性組比較 表9.FBD十二指腸給藥對麻醉犬動脈收縮壓的影響(n＝6，

) *P＜0.05，**P＜0.01與陰性組比較 表10FBD十二指腸給藥對麻醉犬動脈舒張壓的影響(n＝6，

) *P＜0.05，**P＜0.01與陰性組比較 表11.FBD十二指腸給藥對麻醉犬心率的影響(n＝6，

) *P＜0.05，**P＜0.01與陰性組比較 表12.FBD十二指腸給藥對麻醉犬腦血管阻力的影響(n＝6，

) *P＜0.05，**P＜0.01與陰性組比較 試驗例6 FBD對腦微循環障礙的影響 6.1實驗目的觀察FBD對大鼠腦膜微循環障礙的影響，探討其抗腦缺血作用機制。
6.2動物 品系SD大鼠性別雄性體重240～260g 來源上海斯萊克實驗動物責任有限公司 動物合格證號SCXK(滬)2003-0003 飼養恒溫凈化通風動物房，自由進食與飲水，25±2℃。
6.3藥品 6.3.1試驗樣品同1.3.1 6.3.2陽性對照樣品 名稱丹參注射液 來源上海中西藥業股份有限公司 批號030305 含量3g/2ml 性狀淡黃色液體 6.4實驗儀器 6.4.1名稱307-6臺式牙鉆車來源上海齒科醫械廠 6.4.2名稱SXP-1B手術顯微鏡 來源上海醫用光學儀器廠 6.4.3名稱SQF-E解剖顯微鏡 來源上海萬科儀器有限公司 6.4動物分組 48只雄性大鼠按隨機數字法各分為6組，每組8只。
6.6藥液配制 I.丹參原液使用 II.FBD受試樣品的的配制同1.5 6.7實驗方法 FBD于高分子右旋糖苷注射后20分鐘灌胃給藥，給藥體積為0.5ml/kg。丹參注射液于高分子右旋糖苷注射后20分鐘尾靜脈注射給藥，給藥體積為2ml/kg。
將大鼠用3％的戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔麻醉，作顱骨開窗術，剪開硬腦膜暴露一側大腦半球的額頂區，以解剖顯微鏡觀察軟腦膜微循環，在觀察軟腦膜微循環后，自股靜脈注射10％的高分子右旋糖苷(分子量50萬)生理鹽水溶液，劑量15ml/kg，假手術組給15ml/kg的生理鹽水，在注射后20分鐘觀察軟腦膜微循環變化。當證實已造成微循環障礙(血流緩慢，血細胞聚集)，再根據分組給藥治療，于給藥后60min，觀察微循環情況。觀察指標如下 ①流態紅細胞的流態可分為4級0級，直線(帶)狀；I級，虛線狀；II級，粒狀；III級，淤滯狀。
②毛細血管網點計數取面積約為1平方毫米左右的固定區域(此區域由血管圍成邊界)，計算此區域中毛細血管與邊界(血管)的交點數。未與邊界相交的毛細血管不計算在內。
③血色觀察血色，分鮮紅、暗紅、淡紅等。
④毛細血管周圍的變化主要觀察毛細血管周圍有無滲出、和出血現象。網點計數數據用

表示，統計學分析用t檢驗。其它質反應資料不作統計學分析。
6.8實驗結果 腦膜微循環流態變化對照組和實驗各組動物在注射高分子右旋糖苷后，血液流態有異常改變。血液流態由正常的帶狀、線狀變為虛線狀、粒狀，甚至變為淤滯狀，陰性對照組動物在注射生理鹽水后，血液流態未見改善。而丹參組和FBD不同劑量組于給藥后，血液流態有不同程度的改善，表現為血細胞聚集程度有所減輕，如血液流態由淤滯狀變為粒狀，或由粒狀變為帶狀或線狀，或由虛線狀變為線狀(表14)。
血色變化對照組和實驗各組動物在注射高分子右旋糖苷后，血色與原來相比無明顯改變。
毛細血管周圍的變化實驗各組動物在注射高分子右旋糖苷及樣品后，與原來相比毛細血管周圍未見滲出和出血。
給藥前后毛細血管網變化表13顯示，陽性藥丹參注射液和FBD組可明顯增加軟腦膜微循環血管的網點計數(與給藥前相比p＜0.05)。
表13.FBD不同劑量組對腦膜毛細血管網點計數的影響(

，n＝10) *p＜0.05，**p＜0.01與血淤前相比；△p＜0.05，△△p＜0.01與治療前相比 表14.FBD不同劑量組對腦微循環流態的影響 試驗例7 FBD對血小板聚集功能的影響 7.1實驗目的觀察FBD對血小板聚集功能的影響。
7.2動物 品系SD大鼠性別雄性體重250～270克 來源上海斯萊克實驗動物責任有限公司 動物合格證號SCXK(滬)2003-0003 飼養恒溫凈化通風動物房，自由進食與飲水，25±2℃。
7.3藥品 7.3.1試驗樣品同1.3.1 7.3.2陽性對照樣品 名稱阿司匹林腸溶片來源Bayer HealthCare AG 規格100mg/片 批號BTA4E31 性狀白色藥片 7.3.3其它試劑 7.3.3.1名稱ADP 來源Sigma公司批號129F0496 7.3.3.2名稱AA(花生四烯酸) 來源Fluka公司批號318175/1 193 7.3.3.3名稱膠原 來源Trinity Biotech Plc，Bray，Co.Wicklow，Treland.公司 批號20050114 7.4實驗儀器 7.4.1名稱80-2型離心機來源上海手術器械廠生產 7.4.2名稱MK4/HC血小板計數儀 來源美國Baker Instruments公司 7.4.3名稱Labor aggregometer-153型雙道血小板聚集儀 來源德國Labor GmbH Hanburg公司 7.5動物分組 每組10-12只。
7.6藥液配制 I.阿司匹林
II.FBD受試樣品的的配制同1.5 III.ADPpH7.4磷酸緩沖液配成200μM濃度溶液，-20℃冰箱保存備用。
AA0.1M Na2CO3緩沖液配成0.5mmol/L濃度溶液，-18℃冰箱保存備用。
膠原制劑標識量2.0mg/ml，2～8℃冰箱保存，白色粉針劑，臨用前以雙蒸水溶解，0.5ml/支，現配現用。
7.7實驗方法 試驗藥物單次口服灌胃，體積為5ml/kg，陰性對照組給予同體積西黃蓍膠。口服灌胃給藥后1小時腹腔注射戊巴比妥鈉45mg/kg麻醉，仰臥固定，腹主動脈采血，用3.8％枸櫞酸鈉按1∶9比例抗凝，以500rpm離心5分鐘，取上部血漿即為富血小板血漿(PRP)，余下部分再次以3000rpm離心15分鐘，上清液為貧血小板血漿(PPP)，用血小板計數儀計數PRP血小板數，用PPP調整PRP的血小板數至6×105個/mm3左右。在測試管中加入PRP200μl，調節記錄儀至零點，另用一PPP管放入測試孔，調節增益至記錄儀行程為60格，以此為100％。樣品管37℃保溫2分鐘后開始攪拌1分鐘，攪拌子轉速500rpm，再加入ADP 5μl或AA 4μl或膠原8μl，使ADP終濃度為5μM；AA濃度為4μM；膠原濃度為8μM；，記錄加入ADP或AA或膠原后的記錄筆移動的行程，按下式計算聚集率
計算出各試驗組的平均聚集率及標準差，用t-檢驗同西黃蓍膠組進行比較。并按下式計算各試驗組的聚集抑制率
7.8實驗結果 實驗結果表明，陽性藥阿司匹林(25mg/kg)對ADP、膠原、AA誘導的血小板聚集均有非常顯著的抑制作用(P＜0.001)。
FBD對ADP誘導的大鼠血小板聚集均有抑制作用，且抑制作用與劑量正相關。
FBD對AA誘導的大鼠血小板聚集均有抑制作用，且抑制作用與劑量呈正相關。實驗結果見表15～17。
表15.FBD對ADP誘導的大鼠血小板聚集的影響 *P＜0.05，**P＜0.01、***P＜0.001與西黃蓍膠組比較 表16.FBD對膠原誘導的大鼠血小板聚集的影響 *P＜0.05，#P＜0.01，***P＜0.001與西黃蓍膠組比較 表17.FBD對AA誘導的大鼠血小板聚集的影響 *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001與西黃蓍膠組比較 結論 通過以上試驗結果可以看到FBD對大鼠線栓法局灶性腦缺血及四動脈阻斷全腦缺血模型均有治療或預防作用，表現為改善大鼠行為學評分，減小大腦壞死面積；延長模型大鼠缺血后腦電圖消失時間、縮短再灌注后腦電圖恢復時間和翻正反射恢復時間，其效果優于尼莫地平(2～5mg/kg)。在9.2g/kg的劑量時，對小鼠斷頭全腦缺血模型也能延長其張口呼吸時間，提高SOD的活力，但效果低于尼莫地平(5mg/kg)。此外，在FBD對麻醉犬外周及腦血流量影響的研究中，FBD組對麻醉犬具有一定的降低腦部血管阻力，增加腦部血流量的作用，并且對動物的外周血壓也有類似尼莫地平的作用降低外周血壓，特別是舒張壓；減慢心率。但作用強度和作用時間均小于尼莫地平(5mg/kg)。其對腦部血流的改善作用在給藥后30min最明顯。
在作用機制方面的研究中發現FBD可以抑制大鼠動靜脈旁路血栓形成，降低血栓濕重；FBD與陽性藥丹參注射液(3000mg/kg)對大鼠腦微循環障礙的血液流態有不同程度的改善，表現為血細胞聚集程度有所減輕，如血液流態由淤滯狀變為粒狀，或由粒狀變為帶狀或線狀，或由虛線狀變為線狀，使腦膜毛細血管網點計數明顯增加。FBD對AA和ADP誘導的血小板聚集亦有明顯的抑制作用，對膠原誘導的血小板聚集則無明顯的抑制作用。
試驗例8 FBD對亞硝酸鈉所致小鼠記憶鞏固不良的影響 原理有改善學習記憶的藥物可減少亞硝酸鈉所致小鼠記憶鞏固不良小鼠24小時后受電擊的動物數，3min內的錯誤數降低，以及第一次跳下平臺的潛伏期縮短。
8.1實驗目的觀察FBD對由亞硝酸鈉所致小鼠記憶鞏固不良有否改善作用。
8.2動物品系、性別、體重及來源均同1.2 8.3藥品 8.3.1受試樣品 同1.3.1 8.3.2對照樣品 同1.3.2 8.3.3其它試劑 名稱亞硝酸鈉(NaNO2) 性狀白色固體結晶 規格分析純 來源國藥集團化學試劑有限公司批號20040722 8.4動物分組 按隨機數字法分組，每組10只動物。
8.5藥液配制 FBD
石杉堿甲
亞硝酸鈉
8.6儀器 名稱小鼠跳臺記錄儀 型號YLS-2T型 來源山東省醫學科學院設備站 8.7實驗方法 第1、2組小鼠口服給予N.S，第3組(陽性藥物組)口服給予石杉堿甲66.7μg/kg，fbd組口服給藥。1次/天，0.2ml/10g體重，連續給藥一周。最后一次給藥后1小時，腹腔注射東莨菪堿2mg/kg，30min后將小鼠放入跳臺儀內適應5min。然后通電，動物受到電擊后的正常反應是跳回平臺以躲避傷害性刺激，多數動物可能再次或多次跳至銅柵上，受到電擊后又迅速跳回平臺，如此訓練5min，記錄每鼠受電擊的次數。24小時后重測，記錄受電擊的動物數，第一次跳下平臺的潛伏期和3min內的錯誤總數。
8.8結果 亞硝酸鈉引起缺氧性的記憶障礙，因此模型組小鼠明顯縮短了第一次跳下平臺的潛伏期；石杉堿甲延長了小鼠第一次跳下平臺的潛伏期，與模型組相比，P＜0.05。受電擊的動物數和3min內的錯誤次數也顯著減少(與模型組相比，P值均＜0.01)；FBD的4.6、2.3g/kg均明顯的延長了第一次跳下平臺的潛伏期、受電擊的動物數和3min內的錯誤次數(與模型組相比，P值均＜0.01)，且作用似比石杉堿甲要強，表明FBD可改善由腦缺氧所致的記憶障礙。1.15g/kg的FBD改善上述兩項指標的作用不明顯(表18)。
數據以平均值±標準差(

)表示，數據差異統計采用單因素方差分析(ANOVA)或X2檢驗，組間差異以P＜0.05或P＜0.025判斷。
表18.6組小鼠對記憶鞏固不良的試驗結果(n＝10，

) #P＜0.025##P＜0.01與陰性對照組相比； *P＜0.05**P＜0.01與模型組相比 8.9結論 同上述兩項記憶障礙的試驗結果，FBD對由亞硝酸鈉所致記憶鞏固不良有良好的改善作用，其作用強度似比石杉堿甲強。結果表明FBD能有效防治記憶障礙。
綜上所述，FBD對局部性和全腦缺血-再灌注損傷具有明顯的治療作用。其抗缺血性腦損傷的機制可能與抑制血栓形成、抗血小板聚集和改善微循環，增加腦部血流量有關。且其對記憶鞏固不良有良好的改善作用。
以下通過實施例對本發明作進一步的闡述 實施例1 取茯苓25g，白術12g，當歸7g，混合后，用水煎煮，水提取液濃縮后，加入乙醇沉淀，得多糖(2.3g)，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位(0.71g)，合并水提取物有效部位(多糖與正丁醇提取物)，加入適量輔料后，壓成片劑。
實施例2 取茯苓25g，白術12g，混合后，用水煎煮，水提取液濃縮后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并水提取物有效部位(多糖與正丁醇提取物)，加入適量輔料后，壓成片劑。
實施例3 取白術20g，當歸10g，混合后，用水煎煮，水提取液濃縮后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并水提取物有效部位(多糖與正丁醇提取物)，加入適量輔料后，灌制膠囊。
實施例4 取白術25g，用水煎煮，水提取液濃縮后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并水提取物有效部位(多糖與正丁醇提取物)，加入適量輔料后，制成片劑。
實施例5 取茯苓50g，白術40g，當歸20g，混合后，CO2超臨界萃取提取揮發油(2.5ml)，控制提取萃取罐壓力為10.0MP，溫度為35℃，提取時間為2小時。藥渣用水提取后，加乙醇至含醇量為90％，沉淀，得到總多糖(4.2g)，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，合并揮發油，總多糖及正丁醇提取物(7.5g)，加適量輔料，制粒，灌制膠囊。
實施例6 取茯苓50g，當歸20g，混合后，夾帶劑用己烷，進行CO2超臨界萃取，控制萃取罐壓力為9.0MP，溫度為32℃，提取時間為3小時，得到超臨界萃取物。藥渣用水提取后，加乙醇至含醇量為95％，沉淀，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得到總多糖及正丁醇提取物，合并超臨界萃取物和總多糖及正丁醇提取物，加適量輔料，制粒，灌制膠囊。
實施例7 取白術40g，當歸20g，混合后，CO2超臨界萃取提取揮發油，控制萃取罐壓力為14.0MP，溫度為32℃，提取時間為1小時。藥渣用水提取后，加乙醇至含醇量為75％，沉淀，得到總多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，合并揮發油，總多糖及正丁醇提取物，加適量輔料，制粒，灌制膠囊。
實施例8 取茯苓50g，白術40g混合后，CO2超臨界萃取，控制萃取罐壓力為12.0MP，溫度為35℃，提取時間為2小時，得到超臨界萃取物。藥渣用水提取后，加乙醇至含醇量為85％，沉淀，得到總多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，合并超臨界萃取物，總多糖及正丁醇提取物，加適量輔料，制粒，灌制膠囊。
實施例9 取當歸20g，用乙酸乙酯作為夾帶劑，進行CO2超臨界萃取，控制萃取罐壓力為8.0MP，溫度為40℃，提取時間為3小時，得到超臨界萃取物。藥渣用水提取后，加乙醇至含醇量為90％，沉淀，得到總多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，合并超臨界萃取物，總多糖及正丁醇提取物，加適量輔料，制粒，灌制膠囊。
實施例10 取茯苓40g，白術20g，當歸10g，混合后，CO2超臨界萃取，控制萃取罐壓力為12.0MP，溫度為35℃，提取時間為2小時，得到超臨界萃取物。藥渣用水提取后，加乙醇至含醇量為85％，沉淀，得到總多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，合并超臨界萃取物，總多糖及正丁醇提取物，加適量輔料，制粒，灌制膠囊。
實施例11 取茯苓40g，夾帶劑用己烷，進行CO2超臨界萃取，控制萃取罐壓力為9.0MP，溫度為32℃，提取時間為3小時，得到超臨界萃取物。藥渣用水提取后，加乙醇至含醇量為95％，沉淀，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得到總多糖及正丁醇提取物，合并超臨界萃取物和總多糖及正丁醇提取物，加適量輔料，制粒，灌制膠囊。
實施例12 取茯苓40g，白術20g，當歸12g，混合后，用乙醇用夾帶劑，進行CO2超臨界萃取提取揮發油(1.64ml)，藥渣用水提取后，加乙醇沉淀，得到總多糖(2.74g)，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取(4.9g)，合并揮發油，總多糖及正丁醇提取物，加適量淀粉，制粒，灌制膠囊16粒。服用劑量一日服用2次，每次2粒。
實施例13 取茯苓50g，白術25g，當歸15g，混合后，用水煎煮，水提取液濃縮后，加入乙醇沉淀，得多糖(4.77g)，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位(1.46g)，合并多糖與正丁醇提取物，加入適量輔料后，制成片劑18片。服用劑量一日服用2次，每次2片。
實施例14 取茯苓50g，白術40g，當歸20g，混合后，CO2超臨界萃取提取揮發油(2.5ml)，控制提取萃取罐壓力為10.0MP，溫度為35℃，提取時間為2小時。藥渣用水提取后，得到水提取物，合并揮發油及水提取物，加適量輔料，壓制成片。
實施例15 取茯苓50g，白術40g混合后，CO2超臨界萃取，控制萃取罐壓力為12.0MP，溫度為35℃，提取時間為2小時，得到超臨界萃取物。藥渣用水提取后，得到水提取物，合并超臨界萃取物和水提取物，加適量輔料，制粒，灌制膠囊。
實施例16 取茯苓50g，當歸20g，混合后，夾帶劑用乙醇，進行CO2超臨界萃取，控制萃取罐壓力為9.0MP，溫度為32℃，提取時間為3小時，得到超臨界萃取物。藥渣用水提取后，得到水提取物，合并超臨界萃取物和水提取物，加適量輔料，制粒，灌制膠囊。
實施例17 取白術40g，當歸20g混合后，CO2超臨界萃取，控制萃取罐壓力為12.0MP，溫度為35℃，提取時間為2小時，得到超臨界萃取物。藥渣用水提取后，得到水提取物，合并超臨界萃取物和水提取物，加適量輔料，制粒，灌制膠囊。
實施例18 取白術40g，CO2超臨界萃取，控制萃取罐壓力為12.0MP，溫度為35℃，提取時間為2小時，得到超臨界萃取物。藥渣用水提取后，得到水提取物，合并超臨界萃取物和水提取物，加適量輔料，制粒，灌制膠囊。
實施例19 取茯苓50g，夾帶劑用乙醇，進行CO2超臨界萃取，控制萃取罐壓力為9.0MP，溫度為32℃，提取時間為3小時，得到超臨界萃取物。藥渣用水提取后，得到水提取物，合并超臨界萃取物和水提取物，加適量輔料，制粒，灌制膠囊。
實施例20 取當歸20g，夾帶劑用己烷，進行CO2超臨界萃取，控制萃取罐壓力為9.0MP，溫度為32℃，提取時間為3小時，得到超臨界萃取物。藥渣用水提取后，得到水提取物，合并超臨界萃取物和水提取物，加適量輔料，制粒，灌制膠囊。
權利要求
1、一種中藥組合物在制備防治中風的藥物中的應用，所述的中藥組合物主要由選自茯苓、白術和當歸中的一種、兩種或三種原料藥的超臨界萃取物和/或水提取物，或者超臨界萃取物和/或水提取物有效部位組成。
2、權利要求1所述的中藥組合物在制備防治腦缺血的藥物中的應用。
3、權利要求1所述的中藥組合物在制備防治記憶障礙，改善記憶的藥物中的應用。
4、權利要求1所述的中藥組合物在制備防治血栓的藥物中的應用。
5、權利要求1所述的中藥組合物在制備防治微循環障礙的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種中藥組合物在制備防治中風，防治腦缺血及其引起的眩暈、頭痛，防治記憶障礙、改善記憶，防治血栓，防治微循環障礙的藥物中的應用，該中藥組合物主要由選自茯苓、白術和當歸中的一種、兩種或三種原料藥的超臨界萃取物和/或水提取物，或者超臨界萃取物和/或水提取物有效部位組成。
文檔編號A61P7/00GK1985866SQ20051011169
公開日2007年6月27日 申請日期2005年12月20日 優先權日2005年12月20日
發明者阮克鋒, 沈平孃, 朱丹妮, 嚴永清, 林志宏, 虞偉, 周迎新 申請人:上海中藥制藥技術有限公司, 中國藥科大學