專利名稱：楊梅花青素提取物的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物有效成分的提取工藝領域，具體說，是楊梅花青素提取物的提取和制備。本發明還涉及楊梅花青素提取物的組合物及其質量標準。
背景技術：
花青素類已是國際公認的安全無毒的天然食品著色劑，歐共體色素標準中對來源于果蔬的花青素的使用不作量的限制。但是由于各種果蔬中的各類成分相差徑庭，花青素類成分組成也不同，加之性質不穩定，因此，制備工藝相差很大。我國僅有蘿卜紅、葡萄皮紅、黑豆紅三種花青素類天然食品著色劑，質量標準中主要評價指標色價均小于20(按我國定義)，純度較低。歐共體花青素主要評價指標色價為30(按我國定義)，純度較高。但無論國內外，都未對主要色素成分進行含量測定，僅使用吸光值來評價色價，這對花青素類天然食品著色劑的內在質量控制是一種欠缺。
本領域中已經有很多對楊梅色素進行的研究。馬銀海等(食品科學，2004，Vol.25，No.7，p.112-113)公開了一種提取楊梅紅色素的方法，主要是通過酸浸泡然后過大孔樹脂純化。該方法是一種實驗室方法，其中的樹脂、淋洗液、洗脫所用的條件都跟本發明的方法不同。林璇等(漳州師范學院化學系，2002年8月，15卷，3期，pp.98-101)公開了一種實驗室使用的矢車菊苷分離方法，以及對楊梅紅色素進行了研究。然而，該方法是一種非常復雜的實驗室級別的方法，因此沒有工業上應用的意義。該文獻還描述了楊梅紅色素中含有矢車菊苷，以及楊梅紅色素的理化性質等。然而，該文獻中描述的色素隨著pH的增加而顏色呈紅→綠→藍變化，而在葉日英，農牧產品開發，2000第1期中，認為色素是呈紅色到綠色變化。此外，在高居易，天然產品研究與開發，Vol.13，No.2，pp.59-62中，認為該紅色色素在水溶液中34％下就達到飽和。
如上所述，這些研究的結果差異很大，原因是由于提取方法粗，成分差異大。因此，需要一種標準的提取方法，來獲得有效的楊梅花青素，以及與其配套的工業生產的檢測標準。
此外，食品藥品著色劑在工業應用中有相當大的重要性，并且也是常用的工業產品。近年來，對于這些著色劑發生了很多的爭端，有許多以前常用的食品著色劑被發現是對人體有害的，例如可能導致癌癥等。因此，對于天然無害的食品著色劑有很大的市場需求。
發明內容
因此，本發明的一個目的是提供一種制備楊梅花青素提取物的方法，該方法包括步驟 (a)用1-10倍鮮果重量的50-95％重量的乙醇水溶液浸泡楊梅果肉4小時以上，優選12小時； (b)過濾，除去乙醇，得到藥液； (c)將所得藥液調至pH至1-4，優選pH1-2，過大孔樹脂吸附柱； (d)用水洗滌柱，至流出液為無色； (e)用20％-95％重量的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液； (f)過濾，回收乙醇，40-80℃真空干燥得到的洗脫液。
在該方面的一個實施例中，步驟(a)中的乙醇水溶液是藥材重量的5倍。
在該方面的另一個實施例中，步驟(a)中的乙醇水溶液濃度是90％重量。
在該方面的另一個優選例中，步驟(e)中的乙醇優選是30-85％重量，更優選是50％重量的水溶液。
在該方面的另一個優選例中，步驟(e)中還包括用高效液相層析法在515nm波長下，流速1.0ml/分鐘，25℃下，用乙腈∶甲酸∶水＝10∶10∶100檢測楊梅花青素成分矢車菊素-3-葡萄糖的含量。
本發明的另一個方面，提供了上述方法獲得的楊梅花青素提取物。其中楊梅花青素提取物色價(按中國定義)在40以上，矢車菊素-3-葡萄糖在總提取物中的含量為5-30％重量。
本發明的另一個方面提供了上述楊梅花青素提取物的用途，其特征在于，用作食品或藥物的著色劑。
具體實施例方式 楊梅(Mynica rubra Sied.et Zucc)是一種常見的水果。本發明中所用的楊梅為集市購得。
本發明的楊梅花青素提取方法采用乙醇作為提取試劑，然后使用大孔樹脂純化，與常規的乙醇粗浸取或酸水提取然后大孔樹脂純化的條件不同，洗脫條件也不相同，因此理化參數等有很大的差異。
本發明中步驟(b)中的回收乙醇步驟，使得獲得的藥液濃縮，從而能吸附在大孔樹脂上有效分離所需的組分。回收是通過常規方法進行的，例如減壓蒸餾等。
本發明的柱層析使用各種常規的大孔樹脂吸附柱，可采用各種醫藥級大孔吸附樹脂，常用的樹脂是極性苯乙烯骨架。優選樹脂購自西安藍曉科技有限公司的LSA-33、LSA-20和XDA-1。在使用前可先用水平衡。上樣，洗滌，洗脫速度不受限制，但優選在30-300ml/分鐘之間，最優選是60ml/min。
本發明的洗滌液可使用極性溶劑，例如去離子水等對柱進行洗滌。
該方面的另一個實施例中包括了檢測步驟，該檢測步驟是在步驟(e)洗脫過程中使用常規的HPLC(高效液相層析)，例如硅膠柱等，對洗脫液中的矢車菊素-3-葡萄糖成分進行檢測，檢測波長為515nm，流速為1.0ml/分鐘，25℃下，乙腈∶甲酸∶水＝10∶10∶100。如在該洗脫液中沒有矢車菊素-3-葡萄糖峰出現則證明其洗脫完全。
本發明(f)中所使用的過濾裝置可以是各種常規過濾裝置。例如濾紙真空吸濾，多孔樹脂，分子篩，填充柱等。
本發明提取物色價(中國定義)在40以上，是常規乙醇浸出法的5倍以上，提取效率達到60％以上，有效成分得率為0.2％以上，同時，由于操作步驟簡單，沒有TLC，電泳等昂貴步驟，可用于大批量工業生產。
本發明獲得的楊梅花青素提取物的主要成分是矢車菊素-3-葡萄糖，作為著色劑，它完全沒有毒性和副作用，因此，非常適合工業和商業用作食品和藥品的著色劑。
實施例 實施例1楊梅花青素的提取 1.材料和儀器 材料蘇州集市市售的楊梅50kg。
樹脂LSA-33、LSA-20和XDA-1，購自西安藍曉科技有限公司 儀器多功能提取罐(500L)，常州武進孟河制藥機械廠 2.提取方法 三批楊梅(集市購得)分別去核取肉，分別用2、5、9倍鮮果量的90、85、65％乙醇浸泡提取12、8、4小時，過濾得乙醇提取液，回收乙醇，殘液加水稀釋，過濾，濾液以鹽酸分別調pH酸性至1、3、5，分別過大孔樹脂LSA-33、LSA-20和XDA-1吸附柱，樹脂用量為藥材量的1/3、1、2，藥液過完柱床后用水洗柱床(流速300ml/min、不限)至流出液為無色，再分別用30％、50％、85％乙醇洗脫至流出液為無色(流速200ml/min、100ml/min、50ml/min)，至用高效液相層析柱(反相硅膠柱，中科院大連化學物理研究所)在515nm波長下，流速1.0ml/分鐘，25℃下，用乙腈∶甲酸∶水＝10∶10∶100檢測矢車菊素-3-葡萄糖的含量，至不出現其峰； 收集乙醇洗脫液，過濾，回收乙醇，80℃水浴蒸干，40-80℃真空烘干，得楊梅花青素提取物。
三批約50公斤的楊梅鮮果經提取，楊梅花青素的最終提取率在60％以上，得率在0.2％以上。用中華人民共和國國家標準GB9992-88的檢測矢車菊素-3-半乳糖苷(雖然該方法用于黑豆提取物，但是其同樣是用于檢測矢車菊素的方法，并且也是用于經植物提取后的固體)，發現檢測楊梅花青素提取物的E值大于40(相當于歐共體和國際糧農組織色價定義400，歐共體花青素標準中花青素提取物色價為300)，結果見下表1。
表1三批楊梅花青素提取中試結果 注
其中A是吸光度，W是樣品質量(g)，E表示色價，C-楊梅紅溶液濃度；L-比色杯溶液厚度，cm。
三批提取物的色價都大于40(我國標準)。花青素提取物得率都在60％以上。
實施例2產品的質量檢測標準 根據三批中試樣品制定了楊梅花青素提取物的質量標準，如下 本標準適用于以楊梅(Mynica rubra Sied.et Zucc)成熟果實為原料，用乙醇溶液提取經大孔樹脂純化的提取物，經濃干燥制得的紫紅色粉末，在食品藥品工業中作為著色劑。化學名稱矢車菊素-3-葡萄糖苷分子式C21H21O11分子量449.39(按1983年國際原子量) 1技術要求 1.1外觀本品為紫紅色粉末。
1.2理化要求 表2 2實驗方法 2.1 pH將樣品配成1％水溶液用酸度計測定。
2.2吸光度精密稱定樣品約0.1g，加50％乙醇定容到100ml。從中取10ml，再以0.02M鹽酸溶液(PH3.0)定容至100ml。取出稀釋液潿于1cm比色杯中，用分光光度計在波長515±5nm處，以鹽酸溶液(PH3.0)為參比液，測定其吸光度(E)。
式中A-吸光度；C-楊梅紅溶液濃度；L-比色杯溶液厚度，cm。
注
A-吸光度，稱定樣品定容到100ml溶液測定，比色杯厚度1cm；W-稱樣量，g。
2.3矢車菊素-3-葡萄糖苷含量測定 用HPLC法進行測定，流動相為乙腈∶甲酸∶水10∶10∶100，流速為1.0ml/min，柱溫為25℃，檢測波長為515nm。
2.4水分精確稱取樣品1g(準確至0.002g)，置于恒重的稱量瓶中，于105±1℃烘箱灼約4h，冷卻、稱重，至恒重。
式中X-樣品中水分含量，％；G1-稱量瓶加樣品質量，g；G2-干燥后稱量瓶加樣品質量，g％；G-樣品質量，g。
2.5灰分精確稱取樣品3g(準確至0.01g)置于已恒重的坩堝中，先炭化(約300℃)，再移入800±25℃馬福爐中灼燒至恒重。
式中X2-樣品中灰分含量，％；G-灰分質量，g；W-樣品質量，g。本品在包裝完整，未經啟封情況下，保質期為一年。
2.6大孔樹脂殘留物的檢測方法精密稱取供試品0.5g，置頂空瓶中，精密加入5ml1％甲醇溶液溶解，作為供試品溶液。另精密稱取1，4-二乙烯基苯適量，分別加入甲醇溶液溶解并稀釋制成每1ml中含1mg的對照品儲備液。精密量取上述儲備液適量，加入二甲亞砜溶解并稀釋制成1ml中含2ug的混合溶液。精密量取混合液5ml置頂空瓶中作為對照品溶液，照氣相色譜頂空進樣法測定，頂空恒溫箱溫度85℃，傳輸管溫度110℃，進樣環溫度100℃，色譜柱HP-INNOWAX(30m×0.25mm×0.25mm)，檢測器FID，檢測器溫度240℃，進樣口溫度150℃，柱溫60℃(5min)→94℃，升溫速度每分鐘8℃，再以8℃/10min升至190℃。含1，4-二乙烯基苯不得超過50ug/kg。
3.三批中試產品的質量報告 實驗檢驗了三批中試產品，同時也對比了三批楊梅鮮果汁干燥物的品質，下文表3顯示了三批中試產品的質檢結果和原料檢驗結果，以及和乙醇粗提取物的對比。
表3三批中試產品質檢結果及原料檢驗結果 結果表明楊梅紅提取物色價遠高于楊梅鮮果汁干燥物(即表中原汁1、2、3)。工藝中除去了大量果糖和果酸及大分子成分，使楊梅紅提取物色價高、性質穩定、不易吸潮、易于存放。
實施例3楊梅花青素作為著色劑的用途 (1)在食品著色劑中的用途 該產品主要用于酸性的食品，實驗考察了楊梅紅在飲料、冰淇淋、雪糕、棒冰、糖果、果凍、配制果酒、蛋糕上彩裝等食品中的使用情況，結果表明其在水和乙醇中溶解度很大，著色性能良好，儲藏期內各食品的色素吸光值穩定，并且除鐵離子和強氧化劑外可與各類食品常用添加劑混用。常用量為10-100mg每公斤食品。
I.飲料配方碳酸水、白砂糖、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、維生素C、香精，分別加入楊梅紅提取物0.01％、0.02％、0.05％，按飲料常規方法配制，滅菌灌裝后，置37℃避光處按藥品的加速穩定性法進行該飲料的穩定性考察。每個月取樣進行檢測，連續檢測三個月，結果顯示飲料的吸光值穩定，即色澤無明顯變化，說明該飲料保質期在一年以上。
檢測方法取樣品2ml加8ml0.02M鹽酸溶液稀釋，過濾，取出稀釋液潿于1cm比色杯中，用分光光度計在波長515±5nm處，以鹽酸溶液(PH3.0)為參比液，測定其吸光度(E)。結果見表4。
表4飲料的三個月加速穩定性(n＝3) 由此可見，三個月后飲料中楊梅紅提取物并沒有明顯的損失，飲料外觀沒有明顯變化。
II.冰淇淋配方蛋黃、白砂糖、代可可脂、奶粉、水、香精，分別加入楊梅紅提取物0.05％、0.1％、0.2％，按冰淇淋常規方法配制，滅菌灌裝后，置37℃避光處按藥品的加速穩定性法進行該冰淇淋的穩定性考察。每個月取樣進行檢測，連續檢測三個月，結果顯示冰淇淋的吸光值穩定，即色澤無明顯變化，說明該冰淇淋保質期在三個月以上。
檢測方法取樣品2g加8ml0.02M鹽酸溶液稀釋，過濾，取出稀釋液潿于1cm比色杯中，用分光光度計在波長515±5nm處，以鹽酸溶液(PH3.0)為參比液，測定其吸光度(E)。結果見表5。
表5冰淇淋的三個月加速穩定性(n＝3) III.糖果配方白砂糖、葡萄糖、煉乳、檸檬酸、植物油、香精，分別加入楊梅紅提取物0.01％、0.02％、0.05％，按糖果常規方法配制，滅菌灌裝后，置37℃避光處按藥品的加速穩定性法進行該糖果的穩定性考察。每個月取樣進行檢測，連續檢測三個月，結果顯示糖果的吸光值穩定，即色澤無明顯變化，說明該糖果保質期在一年以上。
檢測方法取樣品2g加8ml0.02M鹽酸溶液稀釋，過濾，取出稀釋液潿于1cm比色杯中，用分光光度計在波長515±5nm處，以鹽酸溶液(PH3.0)為參比液，測定其吸光度(E)。結果見表6。
表6糖果的三個月加速穩定性(n＝3) 實施例4該產品的安全性 (1)急性毒性 為了提供試驗安全使用的劑量范圍，對楊梅紅進行了急性毒性試驗。
在預備試驗中，小鼠灌服大劑量楊梅紅提取物亦不致死，不能測出半數致死量，故采用最大給藥量試驗。
受試藥物 楊梅花青素，由蘇州思源醫藥科技開發公司提供。
配制加蒸餾水，配制成每ml含100mg楊梅紅提取物的混懸液，供灌胃用。
實驗動物 ICR小鼠40只，18～21g，雌雄各半，由中國藥科大學實驗動物中心提供。
試驗方法與結果 取健康小鼠20只，雌雄各半，1ml/10g灌胃給藥，一日內灌胃3次，連續觀察7日。
小鼠給藥當日，行動緩慢，進食減少。次日恢復食量，活動、大便均正常。觀察7日未見死亡，第8日空腹12h稱重，尸解未見主要臟器有異常。體重變化見表7。
表7A-2小鼠急性毒性試驗體重變化(
) 與給藥前比，***P＜0.01 由表7可見，小鼠灌服楊梅紅提取物，體重正常增長。
在小鼠急性毒性試驗中，采用最大給藥量法，楊梅紅提取物小鼠量大1000mg/kg，再次對人進行試驗。人最大用量為100mg/kg，成人以60kg計，每人每天最大用量為6000mg。給藥后觀察7日，均未出現死亡及明顯中毒反應，體重正常增長。
以上結果說明該色素安全、無毒。
權利要求
1.一種制備楊梅花青素提取物的方法，其特征在于，該方法包括步驟
(a)用1-10倍鮮果重量的50-95％重量的乙醇水溶液浸泡楊梅果肉4小時以上；
(b)過濾，除去乙醇，得到藥液；
(c)將所得藥液調至pH至1-4，過大孔樹脂吸附柱；
(d)用水洗滌柱，至流出液為無色；
(e)用20％-95％重量的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液；
(f)過濾，回收乙醇，40-80℃真空干燥得到的洗脫液。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)中的乙醇水溶液是藥材重量的5倍。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)中的乙醇水溶液濃度是90％重量。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述浸泡時間為12小時。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述pH為1-2。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(e)中的乙醇是40-90％重量的水溶液。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(e)中的乙醇是60％重量的水溶液。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(e)中還包括用高效液相層析法在515nm波長下，流速1.0m1/分鐘，25℃下，用乙腈∶甲酸∶水＝10∶10∶100檢測楊梅花青素成分矢車菊素-3-葡萄糖的含量。
9.一種楊梅花青素提取物，其特征在于該提取物是用權利要求1所述的方法制備的，其中楊梅花青素提取物色價(按我國定義)大于40，其中矢車菊素-3-葡萄糖濃度為5-30％重量。
10.權利要求8所述的楊梅花青素提取物的用途，其特征在于，用作食品或藥物的著色劑。
全文摘要
公開了一種制備楊梅花青素提取物的方法，包括步驟(a)用1－10倍鮮果重量的50－95％重量的乙醇水溶液浸泡楊梅果肉4小時以上；(b)過濾，除去乙醇，得到藥液；(c)將所得藥液調至pH至1－4，過大孔樹脂吸附柱；(d)用水洗滌柱，至流出液為無色；(e)用20％－95％重量的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液；(f)過濾，回收乙醇，40－80℃真空干燥得到的洗脫液。還公開了用該方法制備的楊梅花青素提取物，及其質量標準和用作食品或藥物的著色劑的用途。
文檔編號A61K36/185GK1986539SQ20051011168
公開日2007年6月27日 申請日期2005年12月20日 優先權日2005年12月20日
發明者徐麗華, 黃芳 申請人:蘇州市思源醫藥科技有限公司