專利名稱：一種抗腫瘤的中藥制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥制劑，尤其涉及一種抗腫瘤的中藥制劑。
背景技術：
鴉膽子系苦木科鴉膽子屬植物(Brucea Jaranica L Merr)的干燥成熟果實。秋季果實成熟時采收，除去雜質，曬干。分布于臺灣、福建、廣東、海南、廣西、云南。具有清熱解毒。截瘧，止痢，腐蝕贅疣之功效，用于痢疾、瘧疾，外治贅疣，抗腫瘤治療。有文獻報道，鴉膽子醇提取物對人鼻咽癌細胞KB、Walker-256肉瘤和P388淋巴細胞性白血病有明顯抑制作用；鴉膽子油對艾氏腹水癌、腹水型肝癌、S37、S180、u14等均有顯著的抗癌活性。臨床可用于胃腸道癌癥、肺癌、肝癌、乳腺癌的治療。
納米技術突飛猛進，已經開始應用于生物醫藥領域如納米微膠囊等藥物給藥系統。納米微膠囊(nanocapsules)簡稱納囊/毫微囊，是指粒徑在10～1000nm間的膠囊。納囊兼具有微囊和納米粒子的優點，一方面可作為藥物釋放體系，控制內部包裹藥物的釋放。另一方面，小尺寸導致其明顯的表面效應，具體表現為生物相容性好，在生物體內易吸收，易游走等特點。目前有半數以上的新藥存在溶解和吸收的問題。采用納囊技術，可以在很大程度上增加藥物與胃腸道液體的有效接觸面積，提高藥物的吸收利用率。此外，特殊的納米藥囊還可以使藥物在病灶處合理地釋放，提高藥物靶向性，避免了藥物對人體其他部位的不良作用。因此，近年來納囊技術受到國內外學者的廣泛關注，大量的創新研究正圍繞其展開，初步預示中藥納囊制劑技術在中藥現代化中具有良好的應用前景。
由于鴉膽子臨床制劑僅有口服乳液和靜脈注射油乳兩種劑型，且原油多為鴉膽子的粗提物，有效成分含量低，雜質類成分多，使制劑難度增加，制劑服用量大，儲存期間穩定性差，這給鴉膽子的臨床推廣使用效果的評判帶來很多不確定因素。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種抗腫瘤的中藥制劑，該藥物抗腫瘤效果顯著，毒性較小，且工藝穩定，可以進行大規模工業化生產。
為解決上述技術問題，本發明一種抗腫瘤的中藥制劑，主要包含鴉膽子超臨界提取物。
本發明選用符合中國2005版藥典標準的鴉膽子藥材，粉碎成粗粉，經二步二氧化碳超臨界萃取得到萃取物，其中第一步萃取，萃取壓力為15～20MPa，萃取溫度35～50℃，萃取流速為0.6～4.8kg/m2·s，萃取時間為1～3小時；第二步萃取，加1～5倍量乙醇做夾帶劑，萃取壓力為20～25MPa，萃取溫度35～50℃，萃取流速為1.2～4.8kg/m2·s，萃取時間為1～3小時，回收乙醇，兩部分合并即得鴉膽子超臨界提取物。
本發明一種抗腫瘤的中藥制劑可以由鴉膽子超臨界提取物直接與常規的輔料制成，或者由所述鴉膽子超臨界提取物經過微囊化包裹后，形成毫微囊，再與常規的輔料一起制成。優選方案為將鴉膽子超臨界提取物經過微囊化包裹后，形成毫微囊，再與常規的輔料一起制成。
本發明一種抗腫瘤的中藥制劑可以是粉針劑、注射劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、滴丸劑、外用貼劑、凝膠劑或軟膏劑。
將上述鴉膽子超臨界提取物作為原料，采用改進的高效微囊的制備方法，制成以鴉膽子超臨界提取物為囊心組分，以藥用高分子材料為囊材的粒徑在500nm以下范圍可控的尺度均一的毫微囊，如制備成粒徑100nm左右，尺寸均一的毫微囊，在一定的乳化均質成囊條件下，獲得尺寸均一的毫微囊。所說的乳化均質條件是指借助乳化劑等附加劑或與高壓均質機聯合作用下，可分散得到尺寸均一，粒子穩定性好，不團聚的乳液體系，經自聚或交聯聚合后，得到本發明要求的毫微囊。
所述的藥用高分子材料，包括天然高分子材料、半合成高分子材料和人工合成的高分子材料。其中天然高分子材料包括明膠、阿拉伯膠、海藻酸鹽、蛋白類、淀粉類，但常用的是明膠和淀粉類，因為這兩類材料降解好、且生產成本較低；其中半合成高分子材料常用的是纖維素類、聚乙烯吡咯烷酮，因為它們的成囊工藝較為簡單，操作方便；人工合成的高分子材料常用的是聚乳酸類和聚氰基丙烯酸烷基酯類材料，其中聚乳酸類材料包括聚乳酸、聚乳酸共聚乙醇酸及聚己內酯，以聚乳酸為最佳，這些材料具有良好的組織相溶性、毒性低等優點；其中聚氰基丙烯酸烷基酯類高分子材料，包括甲酯、乙酯、丁酯、異丁酯和己酯，其中丁酯為最佳，因為聚氰基丙烯酸丁酯具有生物降解性、毒性小、以及在體內耐受性好等多方面的優點，受到廣泛運用。
由于毫微囊包囊材料的不同，其具體制法是有區別的，它可以采用乳化聚合法、天然高分子法或噴霧(液中)干燥法中的一種。其制備方法如下先將鴉膽子超臨界提取物溶解在溶劑中，然后與聚氰基丙烯酸烷基酯類藥用高分子材料的溶液混合成均一的“油相”，繼將油相在攪拌下，用注射器緩慢射入含有附加劑的水相中，控制攪拌速度、溶液溫度和pH值、囊材和囊心物比例、攪拌時間，使微粒尺寸在500nm以下范圍調控，由高分子材料單體聚合，包裹藥物，直接形成毫微囊。或者先將鴉膽子超臨界提取物溶解在溶劑中，然后與非水溶性藥用高分子材料的溶液混合成均一的“油相”，繼將油相在攪拌下，緩慢加入至含有附加劑的水相中，形成一種乳狀液，另外也可將上述溶解在溶劑中的鴉膽子超臨界提取物加入到含有水溶性藥用高分子材料與附加劑的水相中，在攪拌下形成乳狀液，再通過高壓均質機進行均質處理，在高壓均質過程中調控物料在均質機中的壓力和溫度，及內循環次數，使通過均質處理的乳液中的微粒尺寸在500nm以下范圍調控，形成穩定的均一的超細乳液，最后完成包埋、聚合或交聯成毫微囊。
本發明中藥制劑的用量和療程可根據劑型、患者的年齡、疾病的輕重程度作適當調整，但一般為每日口服3次，每次2克，以1個月為一個療程，可連續使用3個療程或更長時間。
本發明具有以下有益效果本發明中藥制劑與傳統鴉膽子油及其制劑相比，由于其中有效部位完整，含量較高，因此鴉膽子超臨界提取物及其毫微囊的抗腫瘤功效相應有較大提高，便于臨床給藥與科學判斷藥物的功效，從而有利于鴉膽子制劑走向國際市場。此外，由鴉膽子超臨界提取物的毫微囊制成的制劑具有高效、低毒、吸收快、利用率高的優點，在治療腫瘤時療效確切，使用方便，無毒副作用，更有利于推廣應用。
圖1是YDZ含藥血清對HepG2細胞活力的影響示意圖，其中，YDZ是鴉膽子超臨界萃取物，HepG2是肝癌細胞株。
具體實施例方式 以下通過實施例對本發明作進一步的闡述 實施例1鴉膽子超臨界提取物的制備 稱取鴉膽子粗粉5kg，置萃取器中，啟動二氧化碳高壓泵，通過背壓閥和高壓泵轉速聯合調節使萃取器的壓力和二氧化碳的流量維持在設定參數，其中第一步萃取，萃取壓力為20MPa，萃取溫度35℃，萃取流速為4.8kg/m2·s，萃取時間為1小時；第二步萃取，加4倍量乙醇做夾帶劑，萃取壓力為25MPa，萃取溫度35℃，萃取流速為4.8kg/m2·s，萃取時間為1小時，回收乙醇，兩部分合并即得流動性好，顏色較深的鴉膽子超臨界提取物。
實施例2鴉膽子超臨界提取物的制備 稱取鴉膽子粗粉5kg，置萃取器中，啟動二氧化碳高壓泵，通過背壓閥和高壓泵轉速聯合調節使萃取器的壓力和二氧化碳的流量維持在設定參數，其中第一步萃取，萃取壓力為15MPa，萃取溫度50℃，萃取流速為0.6kg/m2·s，萃取時間為3小時；第二步萃取，加5倍量乙醇做夾帶劑，萃取壓力為20MPa，萃取溫度50℃，萃取流速為1.2kg/m2·s，萃取時間為3小時，回收乙醇，兩部分合并即得流動性好，顏色較深的鴉膽子超臨界提取物。
實施例3鴉膽子超臨界提取物的制備 稱取鴉膽子粗粉5kg，置萃取器中，啟動二氧化碳高壓泵，通過背壓閥和高壓泵轉速聯合調節使萃取器的壓力和二氧化碳的流量維持在設定參數，其中第一步萃取，萃取壓力為18MPa，萃取溫度40℃，萃取流速為1.8kg/m2.s，萃取時間為1.5小時；第二步萃取，加1倍量乙醇做夾帶劑，萃取壓力為23MPa，萃取溫度45℃，萃取流速為2.4kg/m2·s，萃取時間為2小時，回收乙醇，兩部分合并即得流動性好，顏色較深的鴉膽子超臨界提取物。
實施例4乳化聚合法制備鴉膽子超臨界提取物毫微囊 ①處方 油相無水乙醇 50ml 聚氰基丙烯酸丁酯 0.5g 鴉膽子超臨界提取物(實施例1) 3.0g 水相水 200ml 葡聚糖 2.0g 吐溫20 1.0g ②制備工藝取聚氰基丙烯酸丁酯加入乙醇中分散均勻成白色乳濁液，加入鴉膽子超臨界提取物，分散均勻。冰箱中冷卻至20℃。另取吐溫20及葡聚糖加入水中溶解后，冰箱中冷卻至20℃。取出后用稀鹽酸調節pH值為3，攪拌水相，使轉速為600rpm，將油相注射入水相中。完畢后繼續攪拌2小時后砂芯漏斗過濾，濾液呈乳狀，測定粒徑在100納米左右，加甘露醇噴霧干燥固化即得。
實施例5天然高分子法制備鴉膽子超臨界提取物毫微囊 ①處方 油相芝麻油 100ml明膠溶液 100ml(1000g/L) 鴉膽子超臨界提取物(實施例2) 3.0g 水相水 200ml 硫酸鈉 2.0g 吐溫80 1.0g ②制備工藝取明膠溶液，加入鴉膽子超臨界提取物，在芝麻油中乳化均勻。將形成的乳狀液在冰水浴中冷卻，使明膠完全膠凝，用丙酮稀釋并洗去芝麻油。另取吐溫80及硫酸鈉加入水中溶解后，在冰箱中冷卻至10℃。取出后兩相混勻，進高壓均質機均質，控制壓力為400bar，溫度25℃，內循環3次，回收丙酮，過0.45μm的微孔濾膜，測定粒徑在200納米左右，加甘露醇通過冷凍干燥或噴霧干燥固化即得。
實施例6半合成高分子噴霧干燥法制備鴉膽子超臨界提取物毫微囊 ①處方 油相無水乙醇 100ml磷脂170 2g 鴉膽子超臨界提取物(實施例3) 80g 水相水 300ml 聚乙烯吡咯烷酮K30 10g 吐溫80 5g甘露醇 80g ②制備工藝取磷脂170與鴉膽子超臨界提取物，用無水乙醇溶解，作為油相。另取吐溫80、聚乙烯吡咯烷酮、甘露醇加入水中溶解，作為水相。將兩相混勻，進高壓均質機均質，控制壓力為300bar，溫度25℃，內循環4次，測定粒徑為50nm左右，冷凍干燥或噴霧干燥固化即得。
實施例7合成高分子液中干燥法制備鴉膽子超臨界提取物毫微囊 ①處方 油相丙酮 15ml 聚乳酸 0.1g卵磷脂 0.2g 鴉膽子超臨界提取物(實施例3) 1g 水相水 500ml泊洛沙姆 1g ②制備工藝取聚乳酸和卵磷脂用丙酮溶解，加入鴉膽子超臨界提取物，混合均勻，作為油相。另取泊洛沙姆加入水中溶解，作為水相。將兩相緩慢混勻，進高壓均質機均質，控制壓力為800bar，溫度20℃，內循環3次，回收丙酮，離心，去除上清液，冷凍干燥固化即得，測定粒徑為150nm左右。
實施例8粉針劑的制備 ①處方 鴉膽子超臨界提取物毫微囊(實240g 施例6) 葡萄糖 120g 甘露醇 240g 維生素C100g 雙蒸水加至 1000ml ②制備工藝將鴉膽子超臨界提取物毫微囊與葡萄糖、甘露醇、維生素C加入雙蒸水中溶解均勻，封裝冷凍干燥即得。
實施例9注射劑的制備 ①處方 鴉膽子超臨界提取物毫微囊(實 100g 施例5) 甘油22.5g 1，2-丙二醇 100g 維生素E 2.5g 膽酸30g 精制豆油25g 磷脂33.3g 雙蒸水加至 1000ml ②制備工藝將鴉膽子超臨界提取物毫微囊與甘油、1，2-丙二醇、維生素E、膽酸加入雙蒸水中溶解均勻，將磷脂溶解于精制豆油，兩相高壓乳化均勻，封裝即得。
實施例10片劑的制備 ①處方 鴉膽子超臨界提取物毫微囊(實500g 施例4) 微晶纖維素 100g 乳糖 400g 羧甲基淀粉鈉 50g 滑石粉 25g 硬脂酸鎂 25g ②制備工藝將鴉膽子超臨界提取物毫微囊與微晶纖維素、乳糖、羧甲基淀粉鈉混合均勻，流化床一步制粒，加入滑石粉和硬脂酸鎂，混合均勻，壓片包裝即得。
實施例11膠囊劑的制備 ①處方 鴉膽子超臨界提取物毫微囊(實700g 施例7) 改良淀粉 200g 糊精 50g 硬脂酸鎂 50g ②制備工藝將鴉膽子超臨界提取物毫微囊與改良淀粉、糊精混合均勻，流化床一步制粒，加入硬脂酸鎂，混合均勻，灌裝膠囊包裝即得。
實施例12顆粒劑的制備 ①處方 鴉膽子超臨界提取物毫微囊(實500g 施例4) 微晶纖維素 200g 乳糖 200g 羧甲基淀粉鈉 50g 硬脂酸鎂 50g ②制備工藝將鴉膽子超臨界提取物毫微囊與微晶纖維素、乳糖、羧甲基淀粉鈉混合均勻，流化床一步制粒，加入硬脂酸鎂，混合均勻，顆粒包裝即得。
實施例13滴丸劑的制備 ①處方 鴉膽子超臨界提取物(實施例2)400g PEG6000500g 甘油 100g ②制備工藝將鴉膽子超臨界提取物、甘油與PEG6000加熱熔融，并攪拌均勻，保溫60℃，滴入10℃的液體石蠟中，收集滴丸，擦去表面的石蠟油，包裝即得。
實施例14外用貼劑的制備 ①處方 組成 藥庫層 粘貼層 鴉膽子超臨界提取物(實施 200g 50g 例1) 聚異丁烯MML-100 300g 200g 聚異丁烯LM-MS350g 400g 蓖麻油 500g 400g 汽油 5000g3000g ②制備工藝按藥庫層處方和粘附層處方量稱取各成分，分別溶解，將藥庫層溶液涂布在70微米厚的鋁塑膜上，烘干或自然干燥，形成約60微米厚的藥庫層；將粘附層溶液涂布在200微米厚的硅紙上，干燥，制成約50微米厚的粘附層。將粘附層復合到藥庫層，切成合適大小的小片即得。
實施例15凝膠劑的制備 ①處方 鴉膽子超臨界提取物毫微囊300g (實施例4) 卡波普 100g 乙醇100g 甘油50g 聚山梨酯-80 2g 尼泊金乙酯 1g 氫氧化鈉4g 蒸餾水加至 1000g ②制備工藝將卡波普與聚山梨酯-80、鴉膽子超臨界提取物毫微囊及600ml水混合；氫氧化鈉用水適量溶解后加入上液，攪勻；再將尼泊金乙酯溶于乙醇后逐漸加入攪勻，即得淡黃色透明凝膠。
實施例16軟膏劑的制備 ①處方 鴉膽子超臨界提取物(實施例200g 3) 單硬脂酸甘油酯 250g 凡士林 100g 十二烷基硫酸鈉 20g 氮酮 10g 蒸餾水加至 1000g ②制備工藝將油相單硬脂酸甘油酯、凡士林加熱至80℃，鴉膽子CO2超臨界提取物、氮酮、十二烷基硫酸鈉、水加熱略高于80℃，將水相緩緩加到油相，邊加邊攪拌，漸漸成軟膏。
以下通過試驗例對本發明的有益效果作進一步的闡述 試驗例1鴉膽子超臨界提取物及其毫微囊體外抗腫瘤作用研究及血清藥理學研究 1.1材料 1.1.1試劑與藥品 鴉膽子超臨界萃取物(YDZ)、YDZ納米乳顆粒(粒徑500nm)(Nanocap-YDZ-500nm)均由國家中藥制藥工程技術研究中心/上海中藥制藥技術有限公司提供。YDZ生藥得率4.0％，批號040709。載藥量Nanocap-YDZ-500為25％，YDZ納米乳顆粒溶解于生理鹽水得YDZ納米乳；YDZ溶解于含有2％土溫80生理鹽水得YDZ乳液。YDZ乳液與YDZ納米乳實驗劑量均以YDZ計算。
DMEM培養基(Dulbecco’s modified eagle medium)購自Gibco公司，含2.2mg/mLNaHCO3、2.385mg/mL Hepes、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、100U/mL卡那霉素、5mg/L酚紅，pH7.2；MTT[溴化-(4，5-二甲基-2-塞唑基)-2，5-二苯基四氮唑]購自Amresco公司，臨用PBS液溶解；胰蛋白酶(trypsin)購自Serva公司，臨用D-Hanks液溶解，含0.04％EDTA-2Na pH7.2；Hepes購自Sigma公司；新生牛血清(newborn calfserum，NCS)購自杭州四季青生物工程公司；二甲亞砜(dimethylsulphoxide，DMSO)，購自永華特種化學試劑廠；PBS液8.00mg/mL NaCl、0.20mg/mL KCl、1.56mg/mL Na2HPO4·H2O、0.20mg/mL KH2PO4；D-Hanks液8.00mg/mL NaCl、0.40mg/mL KCl、0.06mg/mL Na2HPO4·H2O、0.06mg/mLKH2PO4、0.35mg/mLNaHCO3、Glucose 1.00mg/mL、20mg/L酚紅。
1.1.2動物與細胞雄性昆明小鼠，體重20±2g，由江蘇省青龍山實驗動物場提供，合格證號SCXK蘇-2002-0018。肝癌細胞株HepG2由中國藥科大學新藥篩選中心提供。
1.1.3儀器HERA細胞培養箱，美國Therma Elemental公司；XSZ-D倒置生物顯微鏡，重慶光學儀器廠；潔凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；Z323K冷凍高速離心機，德國Hermle labor tecknik公司；Sunrise遙控酶標儀，奧地利Tecan GmbH公司。
1.1.4統計分析應用EXCEL與NDST4.4統計軟件進行統計，數據用
表示，比較組間差異行t或t’檢驗。
1.2方法與結果 1.2.1YDZ與Nanocap-YDZ-500nm含藥血清制備 雄性ICR小鼠，體重22±2g，隨機分為3組YDZ30，60mg/kg組與空白對照組。小鼠ig給予YDZ乳液，給藥量為20mL/kg體重，bid×3.5d，d4最后一次給藥后1h，摘眼球取血，4℃下靜置1-2h，4000rpm×10min離心二次，收集血清，0.22μm微孔濾膜正壓過濾除菌，-20℃下冷凍備用。另同法制備YDZ 30mg/kg含藥血清、Nanocap-YDZ-500nm 30mg/kg含藥血清與空白血清。
1.2.2YDZ對HepG2細胞活力的影響 取對數生長期的HepG2細胞接種于96孔板中，用10％NCS DMEM培養液置37℃、5％CO2培養箱中培養24h。細胞用D-Hanks液洗1次后，換無血清DMEM培養液，設空白對照組6孔，實驗組設0.1，1.0，10，100，1000μg/mL5個YDZ濃度，每濃度6孔。
培養48h后，在含100μl/孔培養液的96孔細胞培養板中，加入終濃度0.5mg/mLMTT溶液10μl/孔，繼續培養4h后，小心吸取上清90μl，再加入DMSO 50μl/孔，微型振蕩器上振蕩5min，Sunrise遙控酶標儀測定光吸收值，波長570nm。抑制率(％)＝(1-A實/A對)×100％。
表1 YDZ對HepG2細胞活力的影響
ap＜0.05 b p＜0.01 cp＜0.001相對于對照組 表1顯示，0.1-1000μg/mL YDZ對HepG2細胞活力有不同程度的抑制作用，抑制率為3.1-80.8％，其中10-1000μg/mL YDZ作用有極顯著性(p＜0.001-0.01)，IC50為31.8μg/mL。
1.2.3YDZ含藥血清對HepG2細胞活力的影響 取對數生長期的HepG2細胞接種于96孔板中，用10％NCS DMEM培養液置37℃、5％CO2培養箱中培養24h。細胞用D-Hanks液洗1次后，換無血清DMEM培養液，設0.1％，0.5％，1.0％，5％，10％，20％空白血清對照組，實驗組設0.1％，0.5％，1.0％，5％，10％，20％ 30，60mg/kg YDZ含藥血清組。
培養48h后，在含100μl/孔培養液的96孔細胞培養板中，加入終濃度0.5mg/mLMTT溶液10μl/孔，繼續培養4h后，小心吸取上清90μl，再加入DMSO50μl/孔，微型振蕩器上振蕩5min，Sunrise遙控酶標儀測定光吸收值，波長570nm。
圖1是YDZ含藥血清對HepG2細胞活力的影響示意圖，其中(
n＝4)，cp＜0.001相對于對照組。如圖1所示，與空白血清對照組比較，在0.1％-1.0％實驗濃度下，YDZ含藥血清對HepG2細胞活力無顯著影響；在5.0％-10.0％實驗濃度下，YDZ含藥血清對HepG2細胞活力有一定促進作用；在20％實驗濃度下，YDZ含藥血清對HepG2細胞活力有極顯著抑制作用(p＜0.001)。
1.2.4YDZ與YDZ納米乳含藥血清對HepG2細胞活力的影響 取對數生長期的HepG2細胞接種于96孔板中，用10％NCS DMEM培養液置37℃、5％CO2培養箱中培養24h。細胞用D-Hanks液洗1次后，換無血清DMEM培養液，設5％與10％空白血清對照組，實驗組設5％與10％YDZ含藥血清組與Nanocap-YDZ-500nm含藥血清組。
培養48h后，在含100μl/孔培養液的96孔細胞培養板中，加入終濃度0.5mg/mLMTT溶液10μl/孔，繼續培養4h后，小心吸取上清90μl，再加入DMSO50μl/孔，微型振蕩器上振蕩5min，Sunrise遙控酶標儀測定光吸收值，波長570nm。
表2 YDZ與YDZ納米乳含藥血清對HepG2細胞活力的影響(
n＝6) bp＜0.01相對于對照組；#p＜0.05相對于YDZ 表2顯示，與空白血清對照組比較，在5％與10％實濃度下，YDZ含藥血清對HepG2細胞活力無抑制作用；而等載藥劑量下，5％與10％Nanocap-YDZ-500nm可不同程度抑制HepG2細胞活力，其中以5％Nanocap-YDZ-500nm作用顯著(p＜0.01)；與YDZ含藥血清組比較，5％Nanocap-YDZ-500nm可顯著提高YDZ細胞毒性(p＜0.05)。
1.3結論 體外實驗顯示，YDZ對肝癌HepG2細胞具有抗腫瘤效應。血清藥理學研究發現，不同實驗濃度的YDZ含藥血清對HepG2細胞影響不同。在YDZ含藥血清不顯示抗腫瘤作用實驗濃度下，等YDZ劑量下的YDZ納米乳卻顯示出顯著的抗腫瘤效應。
試驗例2YDZ毫微囊抗肝癌尺寸效應血清藥理學研究 2.1材料 2.1.1試劑與藥品 鴉膽子超臨界萃取物(YDZ)、YDZ毫微囊(Nanocap-YDZ-1-4)均由國家中藥制藥工程技術研究中心/上海中藥制藥技術有限公司提供。YDZ生藥得率4.0％，批號040709。載藥量Nanocap-YDZ為0.8g/100mL；YDZ溶解于含有2％土溫80生理鹽水得YDZ乳液。YDZ乳液與YDZ納囊乳液劑量均以YDZ計算。
DMEM培養基(Dulbecco’s modified eagle medium)購自Gibco公司，含2.2mg/mL NaHCO3、2.385mg/mL Hepes、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、100U/mL卡那霉素、5mg/L酚紅，pH7.2；MTT[溴化-(4，5-二甲基-2-塞唑基)-2，5-二苯基四氮唑]購自Amresco公司，臨用PBS液溶解；胰蛋白酶(trypsin)購自Serva公司，臨用D-Hanks液溶解，含0.04％EDTA-2Na pH7.2；Hepes購自Sigma公司；新生牛血清(newborn calfserum，NCS)購自杭州四季青生物工程公司；二甲亞砜(dimethylsulphoxide，DMSO)，購自永華特種化學試劑廠；PBS液8.00mg/mL NaCl、0.20mg/mL KCl、1.56mg/mL Na2HPO4·H2O、0.20mg/mL KH2PO4；D-Hanks液8.00mg/mL NaCl、0.40mg/mL KCl、0.06mg/mL Na2HPO4·H2O、0.06mg/mLKH2PO4、0.35mg/mL NaHCO3、Glucose 1.00mg/mL、20mg/L酚紅。
2.1.2動物與細胞雄性昆明小鼠，體重20±2g，由江蘇省青龍山實驗動物場提供，合格證號SCXK蘇-2002-0018。肝癌細胞株HepG2由中國藥科大學新藥篩選中心提供。
2.1.3儀器HERA細胞培養箱，美國Therma Elemental公司；XSZ-D倒置生物顯微鏡，重慶光學儀器廠；潔凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；Z323K冷凍高速離心機，德國Hermle labor tecknik公司；Sunrise遙控酶標儀，奧地利Tecan GmbH公司。
2.1.4統計分析應用EXCEL與NDST4.4統計軟件進行統計，數據用
表示，比較組間差異行t或t’檢驗。
2.2方法與結果 2.2.1YDZ與Nanocap-YDZ含藥血清制備 雄性ICR小鼠，體重22±2g，隨機分為6組YDZ 30mg/kg組、Nanocap-YDZ-1-430mg/kg組與空白對照組。小鼠ig給予YDZ乳液，給藥量為20mL/kg體重，bid×3.5d，d4最后一次給藥后1h，摘眼球取血，4℃下靜置1-2h，4000rpm×10min離心二次，收集血清，0.22μm微孔濾膜正壓過濾除菌，-20℃下冷凍備用。
2.2.2Nanocap-YDZ對HepG2細胞活力的影響 取對數生長期的HepG2細胞接種于96孔板中，用10％NCS DMEM培養液置37℃、5％CO2培養箱中培養24h。細胞用D-Hanks液洗1次后，換無血清DMEM培養液，設空白對照組6孔，實驗組設8，80，800μg/mL 3個Nanocap-YDZ-1-4濃度，每濃度6孔。
培養48h后，在含100μl/孔培養液的96孔細胞培養板中，加入終濃度0.5mg/mLMTT溶液10μl/孔，繼續培養4h后，小心吸取上清90μl，再加入DMSO 50μl/孔，微型振蕩器上振蕩5min，Sunrise遙控酶標儀測定光吸收值，波長570nm。抑制率(％)＝(1-A實/A對)×100％。
表3 Nanocap-YDZ對HepG2細胞活力的影響
n＝4) ap＜0.05 b p＜0.01 cp＜0.001相對于對照組 表3顯示，8-800μg/mL Nanocap-YDZ-1-4對HepG2細胞活力有不同程度抑制作用，IC50分別為Nanocap-YDZ-1 33.9μg/mL、Nanocap-YDZ-292.7μg/mL、Nanocap-YDZ-3 216.4μg/mL與Nanocap-YDZ-4 86.5μg/mL。
2.2.3YDZ與Nanocap-YDZ含藥血清對HepG2細胞活力的影響 取對數生長期的HepG2細胞接種于96孔板中，用10％NCS DMEM培養液置37℃、5％CO2培養箱中培養24h。細胞用D-Hanks液洗1次后，換無血清DMEM培養液，設5％與10％空白血清對照組，實驗組設5％與10％YDZ含藥血清組與Nanocap-YDZ-1-4含藥血清組。
培養48h后，在含100μl/孔培養液的96孔細胞培養板中，加入終濃度0.5mg/mLMTT溶液10μl/孔，繼續培養4h后，小心吸取上清90μl，再加入DMSO50μl/孔，微型振蕩器上振蕩5min，Sunrise遙控酶標儀測定光吸收值，波長570nm。
表4 YDZ與Nanocap-YDZ含藥血清對HepG2細胞活力的影響
n＝6) ap＜0.05 b p＜0.01相對于對照組；#p＜0.05 ## p＜0.01 ###p＜0.001相對于YDZ 表4顯示，與空白血清對照組比較，在5％與10％實濃度下，YDZ含藥血清對HepG2細胞活力無抑制作用；而等載藥劑量下，5％與10％Nanocap-YDZ-1-3可不同程度抑制HepG2細胞活力，其中以Nanocap-YDZ-2作用顯著(p＜0.05-0.01)；與YDZ含藥血清組比較，5％與10％Nanocap-YDZ-1-3可顯著提高YDZ細胞毒性，其中以Nanocap-YDZ-2差異顯著(p＜0.05-0.001)。
2.3結論 體外實驗顯示，YDZ毫微囊對肝癌HepG2細胞具有抗腫瘤效應。血清藥理學研究發現，在YDZ含藥血清不顯示抗腫瘤作用實驗濃度下，等YDZ劑量下的YDZ毫微囊卻顯示出顯著的抗腫瘤效應，其作用強度與毫微囊尺寸可能有關。
權利要求
1.一種抗腫瘤的中藥制劑，其特征在于，主要包含鴉膽子超臨界提取物。
2.如權利要求1所述的抗腫瘤的中藥制劑，其特征在于，所述的鴉膽子超臨界提取物由以下方法制得將鴉膽子藥材粉碎成粗粉，先經二氧化碳超臨界萃取，其中萃取壓力為15～20MPa，萃取溫度35～50℃，萃取流速為0.6～4.8kg/m2·s，萃取時間為1～3小時；再加1～5倍量乙醇做夾帶劑，經二氧化碳超臨界萃取，其中萃取壓力為20～25MPa，萃取溫度35～50℃，萃取流速為1.2～4.8kg/m2·s，萃取時間為1～3小時，回收乙醇，兩部分合并即得鴉膽子超臨界提取物。
3.如權利要求1所述的抗腫瘤的中藥制劑，其特征在于，所述的抗腫瘤的中藥制劑由所述的鴉膽子超臨界提取物直接與常規的輔料制成，或者由所述的鴉膽子超臨界提取物經過微囊化包裹后，形成毫微囊，再與常規的輔料一起制成。
4.如權利要求3所述的抗腫瘤的中藥制劑，其特征在于，所述的抗腫瘤的中藥制劑由所述的鴉膽子超臨界提取物經過微囊化包裹后，形成毫微囊，再與常規的輔料一起制成。
5.如權利要求1所述的抗腫瘤的中藥制劑，其特征在于，所述的抗腫瘤的中藥制劑為粉針劑、注射劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、滴丸劑、外用貼劑、凝膠劑或軟膏劑。
6.如權利要求3或4所述的抗腫瘤的中藥制劑，其特征在于，所述的毫微囊是以鴉膽子超臨界提取物為囊心物，藥用高分子材料為囊材，配有附加劑構成，所述的附加劑為穩定劑、稀釋劑或乳化劑。
7.如權利要求6所述的抗腫瘤的中藥制劑，其特征在于，所述的穩定劑為葡聚糖、葡萄糖、甘露醇、右旋糖酐中的一種或其組合；所述的乳化劑為磷脂、吐溫、司盤、泊洛沙姆中的一種或其組合。
8.如權利要求6所述的抗腫瘤的中藥制劑，其特征在于，所述的藥用高分子材料是天然高分子材料、半合成高分子材料或人工合成的高分子材料；所述的天然高分子材料是明膠、阿拉伯膠、海藻酸鹽、蛋白類或淀粉類；所述的半合成高分子材料是纖維素類或聚乙烯吡咯烷酮；所述的人工合成的高分子材料是聚乳酸類或聚氰基丙烯酸烷基酯類材料，其中，所述的聚乳酸類材料是聚乳酸、聚乳酸共聚乙醇酸或聚己內酯，所述的聚氰基丙烯酸烷基酯類材料是甲酯、乙酯、丁酯、異丁酯或己酯。
9.如權利要求8所述的抗腫瘤的中藥制劑，其特征在于，所述的聚乳酸類材料為聚乳酸；所述的聚氰基丙烯酸烷基酯類材料為聚氰基丙烯酸丁酯。
全文摘要
本發明公開了一種以鴉膽子超臨界提取物為主要成分的具有抗腫瘤功效的中藥制劑。該中藥制劑抗腫瘤效果顯著，毒性較小，具有穩定性好、吸收迅速、生物利用度高的特點，并且工藝簡單，可以進行大規模工業化生產，更易普及推廣。
文檔編號A61K9/00GK1981785SQ20051011154
公開日2007年6月20日 申請日期2005年12月15日 優先權日2005年12月15日
發明者劉志遠, 阮克鋒, 沈平孃, 張繼全, 劉峻, 虞偉, 趙明 申請人:國家中藥制藥工程技術研究中心, 上海中藥制藥技術有限公司