專利名稱：一種促進骨再生的微膠囊及其應用的制作方法
技術領域：
本發明關于一種微膠囊，特別關于一種促進骨再生的微膠囊。
背景技術：
目前骨再生的基因治療利用自體干細胞作為基因轉染干細胞，如利用腺病毒載體攜帶的骨形態發生蛋白-2基因，轉染自體骨髓間充質干細胞，再植入骨缺損部位，促進骨再生。目前在大小動物身上均已取得成功。但現在的骨再生基因治療還有以下缺點(1)均利用自體細胞作為基因轉染的靶細胞，由于細胞的分離、培養、擴增需要較長時間，無法用于急診病人；即使對于擇期手術的病人，需要病人首先來院取骨髓，待細胞培養到所需數量(根據我們的經驗，獲得107細胞需要25天左右時間)后再來醫院，難以為病人所接受。再者個體的的干細胞數量和質量存在較大差異，難以保證所培養的每個病人的細胞均有較好的活力。如老年人骨髓中干細胞的數量和質量都較年輕人差，患全身性疾病、代謝性疾病和化療的病人也同樣面臨干細胞數量不足、質量下降的問題。(2)如采用腺病毒作為基因的載體，腺病毒本身會誘導排斥反應，限制了目的基因在體內的表達時間。(3)如利用異體或異種細胞作為轉基因的靶細胞，需使用全身性免疫抑制劑，對人體的免疫功能有一定的損害。
發明內容
本發明的目的在于提供(1)一種促進骨再生的微膠囊；(2)微膠囊在制備治療骨疾病藥物中應用。
本發明的目的是通過以下技術方法來實現的(1)攜帶骨形態發生蛋白基因的重組腺病毒，將BMP-2cDNA片段(由ATCC提供)插入載體PAC-CMV中，構成重組質粒PAC-CMVBMP2，再將PAC-CMVBMP2經Xho I酶切后與5型腺病毒基因經Cla I酶切后的大片段在293細胞中同源重組，形成攜帶骨形態發生蛋白基因-2基因的重組腺病毒。
(2)大鼠骨髓間充質干細胞的培養及腺病毒轉染，取體重120g左右SD大鼠，氯胺酮腹腔麻醉。在嚴格的無菌條件下分離出雙側股骨，用咬骨鉗截除其遠近端。用10ml alpha-MEM完全培養基沖洗出骨髓組織，接種于100mm培養皿，每皿10ml，置于37℃，5％CO2培養箱孵育。3天后半量換液，1周后完全換液，以后每周換液2次。約于14天，貼壁細胞幾乎90％匯合，吸凈培養基，以PBS沖洗2次，加入1ml 0.05胰蛋白酶(含0.02％EDTA)，置于37℃，5％CO2培養箱孵育5分鐘，加入9ml低糖a-MEM完全培養基以中和胰蛋白酶的活性。用吸管輕輕吹打細胞使成為單細胞懸液，按1∶3進行傳代培養，此時的細胞稱第一傳代細胞。同法進行第2傳代細胞培養。第2傳代細胞近90％匯合后，吸干培養基，每皿加入4ml病毒工作液過夜(MOI＝100)，或不加處理，孵化過夜。吸凈病毒工作液，每皿加10ml alpha-MEM完全培養基(FCS經熱滅活)繼續培養。
(3)BMP-2基因轉染的骨髓間充質干細胞的微囊化將BMP-2基因轉染的骨髓間充質干細胞重新懸浮在過濾除菌的1.5％海藻酸鈉溶液中，細胞濃度3×106/ml。海藻酸鈉的細胞懸浮液通過注射器泵的7號鈍頭針滴出，通過大功率高壓脈沖微膠囊制備儀(參見實用新型專利微膠囊成型裝置(專利號00218100.2))，剪切注射器泵滴出的液滴，并控制其粒徑。海藻酸鈉細胞液滴在100mM氯化鈣溶液中凝膠化，約5分鐘后形成海藻酸鈣細胞膠珠；用生理鹽水清洗2次后，將海藻酸鈣細胞膠珠懸浮在過濾除菌的0.05％-0.1％聚賴氨酸溶液中5分鐘，聚賴氨酸與海藻酸鈣發生聚電解質絡合反應成膜，形成包埋骨髓間充質干細胞聚賴氨酸海藻酸鹽微膠囊。再用生理鹽水清洗2次，之后浸入0.15％海藻酸鈉溶液約5分鐘，形成又一層海藻酸鈉外衣，用生理鹽水清洗2次，然后用55mM檸檬酸鈉溶液20ml反應6分鐘，微膠囊的中心部分被液化。經生理鹽水清洗后，加入培養基，37℃培養箱培養。
本發明運用微囊化技術的基本原理利用化學方法包埋移植用細胞，在細胞外形成完整的囊膜，即微膠囊。微膠囊具有選擇通透性，膜上的孔隙允許營養物質等小分子物質自由進出，但抗體等大分子物質和免疫細胞被阻擋在囊外。微膠囊為其內部提供了一個免疫保護的微環境，使微囊內的細胞異體移植后，可以免受宿主排斥反應的攻擊，而在異體存活并分泌治療性重組蛋白(一般分子量小于100kD)。因此，在細胞移植中使用微囊化技術，不僅不需要使用免疫抑制劑，還擴大了移植供體的來源，同時也為治療骨缺損節約了時間。
本發明一種促進骨再生的微膠囊，由以下方法制得(1)腺病毒載體攜帶骨形態發生蛋白基因；(2)骨髓間充質干細胞的培養；(3)攜帶成骨基因的腺病毒載體轉染骨髓間充質干細胞；(4)骨形態發生蛋白基因轉染的骨髓間充質干細胞的微囊化。
步驟(1)和步驟(4)中骨形態發生蛋白基因為骨形態發生蛋白基因2。
步驟(2)骨髓選自大鼠骨髓。
步驟(2)中用alpha-MEM完全培養基沖洗出骨髓組織。
步驟(4)中骨髓間充質干細胞懸浮在海藻酸鈉溶液中，經處理形成海藻酸鈣細胞膠珠。將海藻酸鈣細胞膠珠懸浮聚賴氨酸溶液中，經處理形成包埋骨髓基質干細胞聚賴氨酸海藻酸鹽微膠囊。
本發明所公開一種促進骨再生的微膠囊，其優點表現在允許使用非自體(異體或異種)干細胞作為基因轉染的靶細胞，這樣減少取自體干細胞需擴增培養的時間，用于急診病人，并可以先在體外篩選，能確保細胞的質量，擴大細胞和基因治療的應用范圍。
圖1顯示BMP-2基因轉染的骨髓間充質干細胞的微囊化。
圖2A顯示微囊化第4天，體外X-gal染色確定微囊內轉基因細胞的表達。
圖2B顯示微囊化第28天，體外X-gal染色確定微囊內轉基因細胞的表達。
圖3顯示轉染BMP-2的MSC微囊體外分泌情況。每點5組，取平均值。每組微囊內細胞總量約2.5×106/組，培養于15ml alpha-MEM(含15％小牛血清)。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步描述。
實施例1大鼠骨髓間充質干細胞的培養及腺病毒轉染取體重120g左右SD大鼠，氯胺酮腹腔麻醉。在嚴格的無菌條件下分離出雙側股骨，用咬骨鉗截除其遠近端。用10ml alpha-MEM完全培養基沖洗出骨髓組織，接種于100mm培養皿，每皿10ml，置于37℃，5％CO2培養箱孵育。3天后半量換液，1周后完全換液，以后每周換液2次。約于14天，貼壁細胞幾乎90％匯合，吸凈培養基，以PBS沖洗2次，加入1ml0.05胰蛋白酶(含0.02％EDTA)，置于37℃，5％CO2培養箱孵育5分鐘，加入9ml低糖a-MEM完全培養基以中和胰蛋白酶的活性。用吸管輕輕吹打細胞使成為單細胞懸液，按1∶3進行傳代培養，此時的細胞稱第一傳代細胞。同法進行第2傳代細胞培養。第2傳代細胞近90％匯合后，吸干培養基，每皿加入4ml病毒工作液過夜(MOI＝100)，或不加處理，孵化過夜。吸凈病毒工作液，每皿加10ml alpha-MEM完全培養基(FCS經熱滅活)繼續培養。
實施例2
BMP-2基因轉染的骨髓間充質干細胞的微囊化(見圖1)將BMP-2基因轉染的骨髓間充質干細胞重新懸浮在過濾除菌的1.5％海藻酸鈉溶液中，細胞濃度3×106/ml。海藻酸鈉的細胞懸浮液通過注射器泵的7號鈍頭針滴出，通過大功率高壓脈沖微膠囊制備儀(參見實用新型專利微膠囊成型裝置(專利號00218100.2))，剪切注射器泵滴出的液滴，并控制其粒徑。海藻酸鈉細胞液滴在100mM氯化鈣溶液中凝膠化，約5分鐘后形成海藻酸鈣細胞膠珠；用生理鹽水清洗2次后，將海藻酸鈣細胞膠珠懸浮在過濾除菌的0.05％-0.1％聚賴氨酸溶液中5分鐘，聚賴氨酸與海藻酸鈣發生聚電解質絡合反應成膜，形成包埋骨髓間充質干細胞聚賴氨酸海藻酸鹽微膠囊。再用生理鹽水清洗2次，之后浸入0.15％海藻酸鈉溶液約5分鐘，形成又一層海藻酸鈉外衣，用生理鹽水清洗2次，然后用55mM檸檬酸鈉溶液20ml反應6分鐘，微膠囊的中心部分被液化。經生理鹽水清洗后，加入培養基，37℃培養箱培養。
實施例3體外X-gal染色確定微囊內轉基因細胞的表達(見圖2A、圖2B)為了在體外評估基因治療的有效性，最首要的就是看所轉染的基因是否表達。為此，我們先轉染報告基因β-gal入MSC，再微囊化，觀察微囊內細胞是否能持續分泌β-gal。轉染β-gal的MSC經微囊化后7天，14，21，28天，分別運用X-gal進行組化染色。首先將微囊移入15ml離心管中，用0.5％戊二醛固定10分鐘，PBS洗三遍，再加入X-gal染液37℃5％CO2培養箱過夜。X-gal染液含1mg/ml X-gal，35mM K3Fe(CN)6，35mMK3Fe(CN)6·3H2O，2mM MgCl2。次日放入10cm培養皿顯微鏡下觀察拍照。結果顯示，微囊內的轉β-gal細胞能和未微囊的轉β-gal細胞一樣，分泌β-gal。并且至少能持續分泌28天。
實施例4ELI SA測定分泌至囊外的基因重組產物BMP2的含量(見圖3)轉染BMP-2基因的骨髓間充質干細胞微囊化后每隔2天在換液時留取上清液，，用ELISA法測量BMP2的含量。取出ELISA專用孔板，每孔先加入100ul Assay Diluent RD-19，再加入標準品或樣品，用封膠封住，室溫下搖床2小時。用400ul Wash Buffer洗孔，洗完后用力拍板，重復洗板4次，再每孔痂200ulBMP-2Conjugate室溫搖床2小時，再重復洗孔4次，再加200ul Substrate Solution，避光室溫下30分鐘后，加入50ul StopSolution，混勻后酶標儀下測OD450nm。同時以未轉染BMP-2基因的MSC培養上清做空白對照。結果顯示，在近一個月的時間內連續測BMP-2的含量。與空白組比較，差異明顯。表明微囊內同樣能持續分泌BMP-2。
實施例5微囊內轉基因細胞分泌的BMP2活性測定(見表1)為了驗證微囊內分泌的BMP-2的活性，我們把微囊(每孔微囊內細胞1×106)與骨髓間充質干細胞共培養，觀察囊外MSC的轉化情況。分組(1)未轉染BMP-2的MSC微囊+MSC共培養(2)轉rhBMP-2的MSC微囊+MSC共培養，8天后行堿性磷酸酶(ALP，為成骨細胞的標志蛋白)定量測定，培養基中加入VitC(50μg/ml)，每2天更換1/3培養基，于8天后吸凈培養基，用Tris緩沖鹽溶液沖洗三次，每皿加入0.5ml 50mmol/L的Tris，用細胞刮收集，放置于-20℃凍存備測。檢測時，室溫下解凍，細胞經超聲裂解，用ALP定量檢測試劑盒(Sigma)測定裂解液中ALP的濃度。各組的樣本數均為5。結果顯示，Adv-hBMP-2轉染細胞微囊組內骨髓間充質干細胞的ALP活性明顯高于未轉染細胞微囊組，p＜0.05。
表1各組ALP活性(sigma unit/ml裂解液)(均數±標準差，IU)
p＜0.05兩組差別有顯著性
權利要求
1.一種促進骨再生的微膠囊，由以下方法制得(1)攜帶骨形態發生蛋白基因的腺病毒載體；(2)骨髓間充質干細胞的培養；(3)攜帶成骨基因的腺病毒載體轉染骨髓間充質干細胞；(4)骨形態發生蛋白基因轉染的骨髓間充質干細胞的微囊化。
2.根據權利要求1所述的微膠囊，其特征在于步驟(1)和步驟(4)中骨形態發生蛋白基因為骨形態發生蛋白-2基因。
3.根據權利要求1或2所述的微膠囊，其特征在于步驟(2)骨髓選自大鼠骨髓。
4.根據權利要求1或2所述的微膠囊，其特征在于步驟(2)中用alpha-MEM完全培養基沖洗出骨髓組織。
5.根據權利要求1或2所述的微膠囊，其特征在于步驟(4)中骨髓間充質干細胞懸浮在海藻酸鈉溶液中，經處理形成海藻酸鈣細胞膠珠。
6.根據權利要求5所述的微膠囊，其特征在于將海藻酸鈣細胞膠珠懸浮聚賴氨酸溶液中，經處理形成包埋骨髓間充質干細胞聚賴氨酸海藻酸鹽微膠囊。
7.權利要求1所述的微膠囊在制備治療骨疾病藥物中應用。
全文摘要
本發明涉及一種促進骨再生的微膠囊，該微膠囊由以下方法制得(1)攜帶骨形態發生蛋白基因的重組腺病毒；(2)骨髓間充質干細胞的培養；(3)攜帶成骨基因的腺病毒載體轉染骨髓間充質干細胞；(4)骨形態發生蛋白基因轉染的骨髓間充質干細胞的微囊化。其優點表現在允許使用非自體干細胞作為基因轉染的靶細胞，這樣減少取自體干細胞需擴增培養的時間，用于急診病人，并可以先在體外篩選，能確保細胞的質量，擴大細胞和基因治療的應用范圍。
文檔編號A61K9/50GK1814303SQ200510110750
公開日2006年8月9日 申請日期2005年11月25日 優先權日2005年11月25日
發明者湯亭亭, 丁惠峰, 戴尅戎, 樓覺人 申請人:上海第二醫科大學附屬第九人民醫院