甲鈷胺分散片及其制備方法

專利名稱：甲鈷胺分散片及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種甲鈷胺分散片及其制備方法，屬于藥物制劑領域。
背景技術：
隨著我國人民的生活水平的不斷提高，糖尿病的發病率在逐步上升。據世界衛生組織統計，我國的糖尿病患者自1998年到2000年已經達到2000萬人，而且上升趨勢極為明顯，如果不進行有效的控制，到2010年將達到6000萬人。周圍神經病變是糖尿病的最常見的嚴重的并發癥之一，發病率可達到80％左右。糖尿病周圍神經性病變會使患者產生肢體麻木，嚴重時會出現肢體潰瘍、肌肉萎縮和劇烈的疼痛，甚至引起肢體的壞死導致殘廢。
甲鈷胺為周圍神經病變的治療藥物，屬于維生素B12類，別名為甲基維生素B12。它通過促進神經細胞內核酸和蛋白質以及神經髓鞘的合成，從而修復受損傷的周圍神經。其化學名稱為α-(5，6-二甲基苯并咪唑基)-Co-甲鈷酰胺，英文化學名為α-(5，6-dinethylbenzimidazolyl)-Co-methyl-cobamide，分子式為C63H91CoN13O14P，分子量1344.38，主要成分的化學結構為 從1948年Spies等人把維生素B12作為藥物研究以來，維生素B12的研究取得飛速的發展，到目前為止，作為藥物的維生素B12主要有氰鈷胺、羥鈷胺、腺苷鈷胺和甲鈷胺。前兩種維生素B12在人體內沒有生物活性氰鈷胺(維生素B12)在體內經與鈷胺運載蛋白結合形成Tcs-VB12復合物而攝入細胞，然后由溶酶體蛋白酶釋放出羥鈷胺，羥鈷胺在細胞液中甲基化生成甲鈷胺。后兩種輔酶型維生素B12已經實現人工合成，這為周圍神經病變患者的治療提供了有力武器。在修復受損的神經組織方面，腺苷鈷胺必須先轉化為甲鈷胺才能作為輔酶參與一碳單位循環，從而促進核酸、蛋白質和卵磷脂的合成。
甲鈷胺主要存在于生物的血液、髓液中，與氰鈷胺相比，其對神經組織有良好的傳遞性，通過甲基轉化反應促進核酸、蛋白質、脂質代謝，修復被損傷的神經組織。
甲鈷胺為周圍神經病變的治療藥物，屬于維生素B12類，別名為甲基維生素B12。它通過促進神經細胞內核酸和蛋白質以及神經髓鞘的合成，從而修復受損傷的周圍神經，目前已廣泛應用于臨床。臨床試驗結果表明，甲鈷胺是治療糖尿病神經病變的一種安全、有效的藥物；甲鈷胺和對周圍性面癱均有良好治療作用，且療效優于維生素B12；甲鈷胺對肘管綜合癥手術后功能恢復具有促進作用，其療效優于維生素B12；甲鈷胺還有阻止青光眼性視野惡化和促進其視野改善的作用。
分散片劑型使藥物溶出快，起效快，服用方便，可直接口服，也可分散于溫水中服用，特別適合老人及吞咽有困難的患者，基于分散片這樣的優點，有必要提供甲鈷胺分散片。

發明內容
本發明的目的在于提供一種甲鈷胺分散片。
本發明的另一目的在于提供上述甲鈷胺分散片的制備方法。
本發明所述分散片每1000片含有以下組分甲鈷胺 0.5g羧甲基淀粉鈉 5-10g低取代-羥丙基纖維素 15-30g微晶纖維素 50-65g聚維酮 1-3g微粉硅膠 5g甜菊素 5g硬脂酸鎂 1g滑石粉 1g其中1.羧甲基淀粉鈉是優良的膨脹型崩解劑，崩解效果明顯，對甲鈷胺的測定無干擾。
2.低取代羥丙基纖維素是一種新型輔料，具有崩解作用，能增加藥片崩解后分散的細度，且不影響甲鈷胺的測定。
3.微晶纖維素也作為片劑的崩解劑，有良好的崩解效果不干擾主藥的測定。
4.PVP作為粘合劑。
5.甜菊甙為矯味劑。
本發明所述的制備方法為在避光條件下，將甲鈷胺原料過100目篩，羧甲基淀粉鈉、低取代-羥丙基纖維素、微晶纖維素、聚維酮、微粉硅膠、甜菊素、硬脂酸鎂、滑石粉過80目篩，稱取如下量甲鈷胺 0.5g羧甲基淀粉鈉 5-10g低取代-羥丙基纖維素15-30g微晶纖維素 50-65g聚維酮 1-3g微粉硅膠 5g甜菊素 5g按照等量遞加原則將輔料與甲鈷胺混合均勻，加入適量30％乙醇制成軟材，過20目尼龍篩，制成顆粒，并于50～60℃干燥，過20目篩，整粒，稱取約1g硬脂酸鎂和1g滑石粉，過篩并與顆粒混合均勻，壓片，共1000片，檢驗合格后包裝。
本發明甲鈷胺分散片的規格優選為500μg片，含量限度為含甲鈷胺(C63H91CoN13O14P)應為標示量的90.0～110.0％。
檢查項中制訂了有關物質、溶出度和片劑的其他常規檢查。按照“化學藥品藥學部分指導原則”中對有關物質檢查的規定，對按處方工藝制成的片劑進行有關物質檢測結果按自身對照法計算分別為1.70％、1.62％、1.48％，穩定性研究(加速試驗、長期試驗9個月)結果表明，本發明產品的有關物質限度定為不大于3％。
本發明產品溶出度測定采用小杯法，槳法75轉/分鐘，高效液相色譜法測定，溶出均一性較好，三批樣品溶出度測定結果平均值分別為100.59％、100.56％、100.16％，溶出限度定為不低于標示量的80％。
含量測定采用高效液相色譜法測定。通過方法學試驗，精密度較好，RSD均小于2％；平均回收率為99.61±0.90％(n＝9)，RSD為0.90％，三批樣品的含量測定結果分別為100.24％、101.36％、99.14％，含量限度訂為90.0％～110.0％。
在初步穩定性考察中，因素試驗結果表明，甲鈷胺分散片對光較敏感，有關物質增加，高溫(60℃)條件對甲鈷胺分散片有關物質稍有影響，高濕條件下片重增加較為明顯，但不影響其他質量指標；加速試驗和長期放置試驗9個月后，產品的質量沒有明顯的變化，各項指標仍在質量標準的要求范圍內。因此，本發明產品應避免高溫并嚴格避光、密閉保存，有效期為2年。
甲鈷胺為周圍神經病變的治療藥物，屬于維生素B12類，別名為甲基維生素B12。它通過促進神經細胞內核酸和蛋白質以及神經髓鞘的合成，從而修復受損傷的周圍神經，目前已廣泛應用于臨床。甲鈷胺可治療糖尿病神經系統疾病；緩解麻木和疼痛，迅速緩解神經痛；隨機開放臨床試驗顯示，甲鈷胺能加速面神經功能的恢復；Hanai組織的多中心臨床試驗顯示甲鈷胺改善頸椎病引起的疼痛、感覺異常等神經癥狀有很好的療效；甲鈷胺促進斷指再植后手指感覺的恢復雙盲試驗，表明甲鈷胺對斷指再植患者的神經功能恢復有重要作用；一項雙盲研究表明，對周圍神經病變的治療甲鈷胺比其它維生素更有效。國內臨床研究也表明甲鈷胺組在治療糖尿病神經病變方面療效優于其它維生素B族。
臨床安全性評價陳家倫等人的臨床研究中，甲鈷胺副作用發生率為5.6％，無一例因副作用退出研究。
本發明制備方法工藝簡單、合理，制出的分散片各項指標均符合要求。
甲鈷胺分散片的規格是0.5mg/片。
分散時限的測定是將藥片置于20±1℃的100ml水中振搖至完全分散所需時間。(中國藥典2000年版二部附錄IA)在強光照射(4500±500lx)甲鈷胺極不穩定，照射4小時，甲鈷胺的降解產物增加到4.26％。按2號處方制備甲鈷胺片做如下試驗(每批生產100片)。
4.1全部操作在自然光條件下進行，從配料到壓成片約3小時。
4.2全部操作嚴格在避光條件下進行，必要時用弱紅光照明。
按照前述處方及工藝制備甲鈷胺分散片，抽取一定量作為樣品，置于高溫條件下(60℃)10天，考察其質量變化。結果見表1。
表1 高溫對甲鈷胺分散片質量的影響

結論在高溫(60℃)條件下考察10天，甲鈷胺分散片的有關物質變化不大，在此條件下甲鈷胺分散片是穩定的。
取甲鈷胺分散片置于高濕條件下(RH92.5％)，放置10天，考察其質量變化。結果見表2。
表2 高濕對甲鈷胺分散片質量的影響

結論甲鈷胺片在高濕條件下(RH92.5％)放置10天，有關物質基本沒有變化，片重明顯增加，說明甲鈷胺分散片吸濕性較強，包裝應注意密閉。
取甲鈷胺分散片，置于強光條件下(4500lx)5小時，考察甲鈷胺分散片質量的變化。結果見表3。
表3 強光照射對甲鈷胺分散片質量的影響

結論甲鈷胺分散片在強光條件下(4500lx)放置5小時，有關物質變化較大，說明甲鈷胺分散片在光照條件下質量不穩定，包裝及儲存應注意避光。
由于本發明分散片見光易分解，且具有一定的吸濕性，因此，包裝材料一定要避光性能好，密閉性能好。取甲鈷胺分散片，采用雙鋁包裝，在光照4500lx、濕度92.5％的環境下放置30天，考察甲鈷胺分散片的質量變化。結果見表4。
表4 包裝對甲鈷胺分散片質量的影響

因此，本發明分散片采用雙鋁包裝。
本發明在方便病患的前提下，提供了甲鈷胺分散片這一劑型，相對于普通片劑，分散性好，均一性好，溶出度好，(指前面所述的溶出度測定采用小杯法，槳法75轉/分鐘，高效液相色譜法測定，溶出均一性較好，三批樣品溶出度測定結果平均值分別為100.59％、100.56％、100.16％)使吸收更為迅速，生物利用度更高，服用更方便，尤其適合老、幼和吞服固體困難的病患者。


圖1為本發明流程2為標準曲線圖3同批樣品6次的溶出曲線4三批樣品的溶出均一性曲線圖具體實施方式
實施例1在避光條件下，將甲鈷胺原料過100目篩，羧甲基淀粉鈉、低取代-羥丙基纖維素、微晶纖維素、聚維酮、微粉硅膠、甜菊素、硬脂酸鎂、滑石粉過80目篩，稱取如下量甲鈷胺 0.5g羧甲基淀粉鈉 5g低取代-羥丙基纖維素15g微晶纖維素 65g聚維酮 3g微粉硅膠 5g甜菊素 5g按照等量遞加原則將輔料與甲鈷胺混合均勻，加入適量30％乙醇制成軟材，過20目尼龍篩，制成顆粒，并于50℃干燥，過20目篩，整粒，稱取約1g硬脂酸鎂和1g滑石粉，過篩并與顆粒混合均勻，壓片，共1000片，檢驗合格后包裝。
實施例2在避光條件下，將甲鈷胺原料過100目篩，羧甲基淀粉鈉、低取代-羥丙基纖維素、微晶纖維素、聚維酮、微粉硅膠、甜菊素、硬脂酸鎂、滑石粉過80目篩，稱取如下量甲鈷胺 0.5g羧甲基淀粉鈉7g低取代-羥丙基纖維素 20g微晶纖維素 60g聚維酮 2g微粉硅膠5g甜菊素 5g按照等量遞加原則將輔料與甲鈷胺混合均勻，加入適量30％乙醇制成軟材，過20目尼龍篩，制成顆粒，并于55℃干燥，過20目篩，整粒，稱取約1g硬脂酸鎂和1g滑石粉，過篩并與顆粒混合均勻，壓片，共1000片，檢驗合格后包裝。
實施例3在避光條件下，將甲鈷胺原料過100目篩，羧甲基淀粉鈉、低取代-羥丙基纖維素、微晶纖維素、聚維酮、微粉硅膠、甜菊素、硬脂酸鎂、滑石粉過80目篩，稱取如下量甲鈷胺 0.5g羧甲基淀粉鈉9g低取代-羥丙基纖維素 25g微晶纖維素 55g聚維酮 2g微粉硅膠5g甜菊素 5g按照等量遞加原則將輔料與甲鈷胺混合均勻，加入適量30％乙醇制成軟材，過20目尼龍篩，制成顆粒，并于55℃干燥，過20目篩，整粒，稱取約1g硬脂酸鎂和1g滑石粉，過篩并與顆粒混合均勻，壓片，共1000片，檢驗合格后包裝。
實施例4在避光條件下，將甲鈷胺原料過100目篩，羧甲基淀粉鈉、低取代-羥丙基纖維素、微晶纖維素、聚維酮、微粉硅膠、甜菊素、硬脂酸鎂、滑石粉過80目篩，稱取如下量甲鈷胺 0.5g羧甲基淀粉鈉10g低取代-羥丙基纖維素 30g微晶纖維素 50g聚維酮 1g微粉硅膠5g甜菊素 5g按照等量遞加原則將輔料與甲鈷胺混合均勻，加入適量30％乙醇制成軟材，過20目尼龍篩，制成顆粒，并于60℃干燥，過20目篩，整粒，稱取約1g硬脂酸鎂和1g滑石粉，過篩并與顆粒混合均勻，壓片，共1000片，檢驗合格后包裝。
比較例1本實驗例對實施例1-4的產品進行崩解時限和分散均勻性的測定，說明本發明分散片具有良好的崩解分散性能。
崩解時限按中國藥典2000版二部附錄崩解時限測定法測定，以20℃±1℃水為溶劑，3分鐘內應完全崩解。
分散均勻性取兩片，置于100毫升20℃±1℃水中振搖，記錄全部崩解并能通過2號篩的所需時間。
表5

實驗例1本實驗例為實施例1-3產品甲鈷胺分散片質量標準研究試驗。
含量限度本品為甲鈷胺分散片。規格為每片含甲鈷胺(C63H91C0O14P)500μg，實施例1-3產品含量測定結果為100.24％、101.36％、99.14％。結果表明，三批樣品的含量均在90.0％～110.0％之間，因此本品的含量限度定為標示量的90.0％～110.0％。
性狀無臭無味，色深紅，輔料均為白色，壓制成片后，顯淡紅色。故本品性狀為淡紅色片。三批樣品性狀見表6。
表6 三批樣品性狀檢查結果

鑒別光譜法鑒別避光操作。取產品，研細，加水制成每1ml約含甲鈷胺50μg的溶液，濾過，取濾液照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄VIA)測定，可見本品在波長266、342、522nm左右處有最大吸收，結果見下表7表7 三批樣品最大吸收波長測定結果

根據上述結果，可將266±1nm、342±1nm、522±1nm作為特征吸收波長用于產品鑒別。
高效液相色譜法鑒別在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時間與對照品主峰的保留時間一致，三批樣品供試品溶液主峰的保留時間均與對照品主峰的保留時間一致。
化學顯色反應鑒別取本品細粉適量(約相當于甲鈷胺1mg)，加硫酸氫鉀50mg，置坩堝中，灼燒至熔融，放冷，加水3ml，煮沸使溶解，加酚酞指示液1滴，滴加氫氧化鈉溶液至顯淡紅色后，加醋酸鈉0.5g，稀醋酸0.5ml與1-亞硝基-2-萘酚-3.6-二磺酸鈉0.5ml，即顯紅色或橙紅色，加鹽酸0.5ml，煮沸1分鐘，顏色不消失。三批樣品均顯上述反應。取輔料的混合物適量，同法操作，不顯上述反應，表明輔料不干擾此項鑒別。檢查按照中國藥典2000年版二部片劑通則項下要求，制定本品的檢查項目。有關物質本品的有關物質檢測采用HPLC法。自身對照法計算，色譜條件與系統適用性同“含量測定”項。
最低檢測限參照中國藥典2000年版二部附錄XVIIIA中方法，以信噪比約為3∶1的相應注入甲鈷胺的量確定檢測限。
取對照品適量，精密稱定，連續稀釋制成每1ml含甲鈷胺0.181μg/ml的溶液，進樣20μl，觀察主成分峰高約為基線噪音的3倍，以此得出甲鈷胺最低檢測限為3.62ng。
專屬性輔料的干擾試驗由于本品含量極低，僅為500μg/片，樣品大部分為輔料，應考察是否影響有關物質的測定。我們按片劑處方，稱取輔料適量(約相當于甲鈷胺分散片4片的輔料量)，置10ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，濾過，取續濾液10μl進樣。照有關物質項下測定并記錄色譜圖，基本無雜峰出現。
加速破壞試驗為驗證該方法能否檢測出樣品中的有關物質和在放置時降解產生的雜質，我們對樣品進行了在強光照射、高溫、高濕和酸、堿、氧化等條件下的破壞性試驗，通過檢測其中的雜質以確定方法的專屬性。
1)高溫試驗 取105℃放置40小時的樣品，照有關物質測定項下操作。
2)光照試驗 取經4500lx光照2天的樣品，照有關物質測定項下操作。
3)高濕試驗 取在RH92.5％條件下放置10天的樣品，照有關物質測定項下操作。
4)酸破壞試驗 取本品研細的細粉適量(約相當于甲鈷胺4mg)，置10ml量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液5ml，搖勻，放置6小時，再用氫氧化鈉溶液調節pH值至6.0左右，加流動相稀釋至刻度，搖勻，照有關物質測定項下操作。
5)堿破壞試驗 取本品研細的細粉適量(約相當于甲鈷胺4mg)，置10ml量瓶中，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液5ml，搖勻，放置1小時，再用鹽酸溶液調節pH值至6.0左右，加流動相稀釋至刻度，搖勻，照有關物質測定項下操作。
6)氧化試驗 取本品研細的細粉適量(約相當于甲鈷胺4mg)，置10ml量瓶中，加濃度為3％的雙氧水5ml，搖勻，放置6小時，加流動相稀釋至刻度，搖勻，照有關物質測定項下操作。
測定法避光操作。取本品，研細，精密稱取細粉適量，加流動相振搖溶解并稀釋制成每1ml約含甲鈷胺400μg的溶液，濾過，取續濾液作為供試品溶液；精密量取供試品溶液3.0ml置100ml容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。精密量取對照溶液10μl注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主成分峰高為滿量程的10～20％。另分別精密量取供試品溶液和對照溶液各10μl，進樣，記錄色譜圖至主成分峰的保留時間的3倍。供試品溶液中的各有關物質峰面積總和均不得大于對照溶液主峰面積，三批樣品測定結果見表8。
表8 三批樣品有關物質測定結果

有關物質％＝供試品溶液中有關物質峰面積的和/對照溶液主峰面積×3％依據以上檢測結果，將本品有關物質的限度定為不得過3.0％。含量均勻度屬小劑量片劑，為保證含量均勻，符合中國藥典2000年版之規定，應做含量均勻度檢查。按中國藥典2000年版二部附錄V D高效液相色譜法測定，色譜條件見“含量測定”項。
測定法對照品溶液的制備避光操作。取105℃干燥至恒重的甲鈷胺對照品適量，精密稱定，加流動相振搖溶解并稀釋制成每1ml約含甲鈷胺50μg的溶液，即得。
供試品溶液的制備避光操作。取本品1片，置10ml量瓶中，加流動相適量，振搖，使甲鈷胺溶解并稀釋至刻度，濾過，取續濾液作為供試品溶液。精取對照品溶液和供試品溶液各10μl，分別注入高效液相液相色譜儀，按外標法以峰面積計算含量，應符合中國藥典2000年版二部附錄X E的規定，結果見表9。
表9 甲鈷胺分散片含量均勻度測定結果


溶出度測定方法擬采用高效液相法測定，參照含量測定方法進行。
回收率試驗分別精密稱取甲鈷胺適量(高、中、低三組)，按處方量加入相應的各輔料，置100ml溶出杯中，槳法75轉，攪拌10分鐘，取溶液適量濾過，并配制成高、中、低三組濃度(分別相當于測定濃度5μg/ml的120％、100％和80％)的9份溶液；另精密稱取甲鈷胺對照品適量，加流動相定量稀釋制成5μg/ml的對照品溶液。分別取供試品溶液和對照品溶液各20μl注入高效液相色譜儀，依法測定，按外標法以峰面積計算，回收率。結果見表10。
表10 甲鈷胺溶出度測定方法學回收率試驗結果

本法測定溶出度準確度較高。
溶出條件的選擇小杯法的確定因甲鈷胺分散片的標示量為500μg，含量較小，因此我們采用小杯法測定甲鈷胺的溶出度，溶劑量為100ml。
溶出介質的確定甲鈷胺在水中略溶，為胃溶片，因此我們選擇了水、0.1mol/L的鹽酸作為溶劑進行試驗，轉速為75轉/分，3、5、10分鐘分別取樣，測定結果見表11，表12。
表11 溶出介質為水的溶出度(％)

表12 溶出介質為0.1mol/ml鹽酸的溶出度(％)

試驗結果表明，甲鈷胺分散片在水和0.1mol/l鹽酸兩種介質的溶出結果無明顯差異，因用水更為方便，因此我們確定水為溶出介質。
溶出轉速的選擇我們初步選擇了50轉/分鐘、75轉/分鐘兩種轉速，進行了試驗，在3、5、10分鐘分別取樣，進行測定，測定結果見表13、表14。
表13 轉速為50轉/分鐘的溶出度(％)

表14 轉速為75轉/分鐘的溶出度(％)

結果表明，轉速為75轉/分鐘時，3分鐘平均溶出度達88.66％，5分鐘時基本完全溶出；轉速為50轉/分鐘則溶出度偏低。為使試驗準確，故確定轉速為75轉/分鐘。溶出均一性試驗我們在以水為溶出介質，轉速為75轉/分鐘的條件下，用三批樣品作了同批和批間溶出均一性試驗。
5.3.3.1批內均一性試驗取實施例1產品，測定6次溶出度，結果見下表15。
表15 溶出度均一性試驗結果


按上述六組溶出結果繪制溶出曲線，見圖22。結果表明此溶出度測定方法重現性較好。
5.3.3.2批間溶出均一性試驗取三批樣品(實施例1、2、3)分別進行1次溶出度測定，結果見下表16表16 甲鈷胺分散片批間溶出均一性試驗


按上述結果繪制三批樣品的溶出曲線，見圖23。
表17三批樣品的批間溶出差異結果

結果表明不同批次間的溶出度測定結果RSD小于5％，本品的生產工藝較穩定。溶出度測定法避光操作。取本品，照溶出度測定方法(中國藥典2000年版二部附錄XC第三法)，以100ml水為溶劑，轉速為75轉/分鐘，依法操作。經10分鐘，取溶液適量，濾過，取續濾液作為供試品溶液。另精密稱取105℃干燥至恒重的甲鈷胺對照品適量，加流動相溶解，并稀釋制成每1ml含甲鈷胺5μg的溶液，作為對照品溶液。精取對照品溶液和供試品溶液各20μl，分別注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，按外標法以峰面積計算每片的溶出量，溶出度計算公式為溶出度(％)＝(A樣/W樣)/(A標/W標)。三批樣品溶出度測定依照上述方法，測定三批樣品的溶出度，測定結果見表18。
表18 三批樣品溶出度檢查結果

根據上述樣品的測定結果，本品10分鐘時的溶出量限量定為標示量的80％是較為合適的。分散均勻性照“中國藥典2000年版二部附錄IA片劑”中“分散片”的要求檢查，三批樣品在3分鐘內均全部崩解并通過2號篩。結果見下表19表19 三批樣品分散均勻性檢查結果

結果表明本品的分散均勻性符合規定。微生物限度檢查照微生物限度檢查法(中國藥典2000年版二部附錄ⅪJ)測定，三批樣品檢查結果見下表20表20 微生物限度檢查結果

含量測定采用高效液相色譜法(中國藥典2000年版二部附錄VD)。色譜條件與系統適用性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.03mol/L磷酸二氫鉀溶液(18∶82)，用磷酸或0.2mol/L氫氧化鉀調節pH至4.5為流動相；檢測波長為342nm。嚴格避光操作。理論板數以甲鈷胺主成分峰計算，應不低于2000，主成分峰與相鄰雜質峰的分離度應符合要求。
按上述色譜條件，嚴格避光操作，檢測三批樣品(實施例1、2、3)，記錄色譜圖，計算理論板數分別為n＝3477、3480、3537，分離度R＞1.5，符合要求。
系統適用性重復性試驗取200μg/ml的甲鈷胺溶液10μl，連續進樣5次，記錄峰面積，結果RSD為0.68％，小于2％，符合規定。
方法的驗證線性關系和范圍避光操作。精密稱取甲鈷胺對照品21.7mg，置50ml量瓶中，加流動相溶解配成434ug/ml的溶液，精密吸取0.2、2、4、8、16、25ml置于25ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度。配制成每1ml含甲鈷胺3.472、34.72、69.44、138.88、277.76、434μg的溶液，精取10μl進樣，每個濃度進樣2次，取平均值，以峰面積(A)對樣品濃度(C)作回歸計算，回歸方程，結果見表21。
表21 甲鈷胺峰面積與濃度的線性關系

標準曲線見圖2。
回收率試驗分別精密稱取甲鈷胺適量，按處方量加入相應的各輔料，用流動相溶解，濾過，并配制成高、中、低三組濃度(分別相當于測定濃度200μg/ml的120％、100％和80％)的9份溶液；另精密稱取甲鈷胺對照品適量，加流動相定量稀釋制成200μg/ml的對照品溶液。分別取供試品溶液和對照品溶液各10μl注入高效液相色譜儀，依法測定，按外標法以峰面積計算回收率。結果見表22表22 甲鈷胺含量測定方法學回收率試驗結果

結果表明本法測定甲鈷胺的含量準確度較高。溶液穩定性避光操作。配制濃度為200μg/ml的溶液，在0、4、8、24、48小時分別進樣10μl，記錄色譜圖，并計算其相對標準偏差RSD，結果見表23。
表23 溶液穩定性測定結果

專屬性比較輔料的HPLC色譜圖與樣品的HPLC圖譜，可見片劑的輔料不干擾甲鈷胺的含量測定。
測定法對照品溶液的制備避光操作。取105℃干燥至恒重的甲鈷胺對照品適量，精密稱定，加流動相溶解，并稀釋制成每1ml含甲鈷胺為200μg的溶液，即得。
供試品溶液的制備避光操作。取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當于甲鈷胺2mg)置10ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，即得每1ml含甲鈷胺為200μg的溶液。
測定法分別取供試品溶液和對照品溶液各10μl注入高效液相，依法測定，按外標法以峰面積計算，即得。
測定三批樣品結果見表24。
表24 甲鈷胺分散片三批樣品含量測定結果

結論三批甲鈷胺分散片含C63H91CoN13O14P均在標示量的90.0～110.0％規定內。
同批樣品6次的溶出曲線圖見圖3。
三批樣品溶出均一性曲線圖見圖4。
實驗例2本實驗例為本發明產品的穩定性實驗數據。
1.樣品實施例1、2、3產品，規格500μg/片。
2.考察項目及條件2.1因素影響試驗2.1.1強光照射試驗取供試樣品一批(批號030820)，置于密閉潔凈容器中，在4500lx±500lx光照下放置，分別于0、5、10天取樣，按照考察內容進行檢測。
2.1.2高溫試驗取供試樣品，在60℃條件下放置，分別于0、5、10天取樣，按照考察內容進行檢測。
2.1.3高濕度試驗取供試樣品，開口置于密閉恒濕的潔凈容器中，在RH90.0％±5％(飽和KNO3溶液，RH92.5％)和RH75％±5％(飽和NaCl溶液)條件下放置，分別于0、5、10天取樣，按照考察內容進行檢測。
2.2加速試驗供試品3批，模擬上市包裝，在溫度40℃±2℃，相對濕度75％±5％的條件下放置6個月；分別在考察的0、1、2、3、6個月末，取樣一次，按照考察的內容進行項目檢測。
2.3長期試驗供試品3批，模擬上市包裝，在溫度25℃±2℃，相對濕度60％±10％的條件下放置12個月，分別與考察的0、3、6個月末取樣一次，按照考察的內容進行項目檢測。
3.考察內容外觀色澤、分散均勻性、含量、有關物質、溶出度4.結果4.1因素影響試驗4.1.1光照試驗光照10天后，甲鈷胺分散片中有關物質從1.68％升至10.61％，光照10天后含量從100.37％降到78.13％，均有很大變化，溶出度稍有減少，其它指標無明顯變化，見表25、圖1～10。
4.1.2高溫試驗60℃高溫條件放置10天后，甲鈷胺分散片的有關物質從1.68％升至2.74％，其他指標無明顯變化，見表26、圖11～14。
4.1.3高濕度試驗RH92.5％高濕條件放置5天后，重量增加9.32％，按照要求改在RH75％高濕度條件下考察，放置10天后，重量增加2.14％，其他指標基本無變化，見表27、圖15～18。
4.2加速試驗條件加速試驗條件放置6個月后，三批樣品中甲鈷胺有關物質分別從1.68％、1.56％、1.76％升至2.24％、2.18％、2.23％，稍有增加，含量等其他指標無明顯變化，見表28、圖19～42。
4.3長期試驗長期試驗到目前進行了9個月，并仍在繼續。在本試驗的條件下，放置9個月后，三批樣品中甲鈷胺分散片的有關物質、含量等指標基本無變化，見表29；圖43～57。
5.結論因素試驗結果表明，甲鈷胺分散片對光較敏感，有關物質增加，高溫條件對甲鈷胺分散片有關物質、含量稍有影響，高濕條件片重增加較為明顯，但不影響其他質量指標；加速試驗和長期放置試驗9個月后，本品的質量沒有明顯的變化，各項指標仍在質量標準的要求范圍內。因此，本品應避高溫并嚴格避光、密閉保存，有效期定為2年。
表25 光照(4500lx)試驗結果實施例1

表26 高溫(60℃)試驗結果實施例2


表27 高濕(RH75％)影響試驗結果實施例3

表28 加速試驗結果

表29 長期試驗結果

實驗例3本實驗例為本發明產品藥理研究資料。
1藥理作用1.1甲鈷胺易為神經細胞的亞微結構如細胞核、線粒體等所攝取給Wistar鼠肌注甲鈷胺和氰鈷胺，投藥2，5，18h后將鼠處死，觀察顯示甲鈷胺在5h內可以很好地轉移進入細胞器內，18h時仍然保持高濃度，從而有效地發揮藥理作用，而氰鈷胺則很差。
1.2甲鈷胺促進神經細胞內核酸和蛋白質的合成給大白鼠飼以缺乏維生素B12和葉酸的飲食，通過攝入3H標記的尿苷來觀察脊神經細胞RNA的動力學改變，發現用甲鈷胺組與腺苷鈷胺組及正常飲食組相比，前者RNA是增加的。
1.3甲鈷胺促進髓鞘磷脂合成將甲鈷胺和其他維生素B12分別加入鼠小腦細胞培養液中觀察神經髓鞘形成，甲鈷胺組可見鼠神經髓鞘形成增加，而其它維生素B12組則無此現象。
1.4甲鈷胺促進軸漿轉運和軸突再生用鏈脲菌素造成大鼠糖尿病模型，大鼠軸漿轉運速度降低50％。甲鈷胺通過促進蛋白質的合成，使軸索骨架蛋白輸送正常化，從而使軸漿轉運恢復正常。甲鈷胺組與對照組的軸漿轉運速度有顯著性差異。用丙烯酰胺造成鼠周圍神經病變(軸突變性)模型，肌注甲鈷胺組與肌注生理鹽水組相比，前者的軸突和髓鞘的數目較多。表明甲鈷胺能刺激軸突再生。
1.5甲鈷胺加速突觸傳遞的恢復和腦內乙酰膽堿含量的正常化大白鼠坐骨神經擠壓變性后，其中一組用甲鈷胺，另一組則不用。以胞內微電極方法測量終板電位，結果發現甲鈷胺組的終板電位的恢復較早，表明甲鈷胺可以加速突觸傳遞。以缺乏膽堿的飼料飼養大鼠進行實驗，發現甲鈷胺可使低下的腦內乙酰膽堿含量正常化。
1.6甲鈷胺具有促進神經再生的功能切斷家兔腓神經并予以縫合，對甲鈷胺組(500ug·d-1，共30d)和對照組的神經組織學檢查，包括運動神經傳導速度和軸漿轉運。在背側神經根注射3H-亮氨酸，以觀察軸漿轉運速度。實驗表明甲鈷胺組和對照組的有髓神經纖維數量都比縫合時有增長，但甲鈷胺組明顯增多，甲鈷胺組中亮氨酸在軸突內轉運的數量更多，速度更快(P＜0.01＝。甲鈷胺組的運動神經傳導速度亦有明顯改善(P＜0.01)。
2藥物動力學大白鼠口服57Co-CH3B12(25ugkg-1)，72h后，腎、腎上腺、胰、肝、胃的濃度較高，肌肉、睪丸、腦神經等處濃度較低。給大白鼠靜脈注射57Co-CH3B12(10ug·kg-1)，24h后，腎、腎上腺、腸、胰、腦垂體的濃度較高，眼、脊髓、腦、肌肉等處濃度低。主要從糞尿中排出。甲鈷胺片劑，健康人一次口服120ug，1500ug，均在給藥后3h達到血藥峰值，其吸收呈劑量依賴性。t1/2等藥代動力學參數如表30所示。
表30 甲鈷胺的藥代動力學參數


服藥后8h，尿中總B12的排泄量為用藥后24h排泄量的40％～80％。健康人連續使用12周，1500ugd-1至停藥后4周的血清總B12的變化值如下給藥4周后，血清總B12的變化值約為給藥前的2倍，以后逐漸增加，到12周后約2.8倍，中止給藥4周的1.8倍。健康人一次肌注或靜注甲鈷胺500ug，肌注Tmax為0.9±0.1h，靜注Tmax3min。最高血清總B12濃度增加部分(Cmax)分別為22.4±1.1、85.0±8.9ng·ml-1。給藥后144h，肌注、靜注給藥的AUC分別為204±12.9，358.6±34.4ng·h·ml-1。健康人靜注甲鈷胺連用10d，血清總B12濃度(Cmin)隨著給藥天數的增加而上升。第一天、第二天、第三天給藥后的Cmin分別為3.9±1.2ng·ml-1、5.3±1.8ng·ml-1、6.8±1.5ng·ml-1，后一濃度一直維持到給藥后期。
實驗例4本實驗例為本發明產品毒理研究資料。
I.急性毒性小鼠經口服用甲鈷胺的LD50大于1000mg/kg。大鼠經口服用甲鈷胺的LD50大于500mg/kg。
II.亞急性毒性大鼠口服給藥1個月，劑量分別為0.2、2.0、20mg/kg/日，一般癥狀、體重、血液、尿臟器重量及病理組織學檢查等均無特殊變化。
III.長期毒性大鼠口服給藥6個月，劑量分別為0.2、2.0、20mg/kg/日，一般癥狀、體重、血液、尿、臟器重量及病理組織學檢查等均無特殊變化。
IV.生殖毒性在大鼠和小鼠的器官形成期口服給藥，劑量分別為0.2、2.0、20mg/kg/日，胎仔和新生仔均未出現異常，也未見有致畸現象發生。
V.無機汞的甲基化在試管內，本品與氯化汞反應生成甲基汞，但是在人血液等蛋白質存在的條件下觀察不到這項反應。
VI.另外，用無機汞添加的飼料飼養大鼠時，沒有因經口投與本品而增加生物體的甲基汞。進一步用無機汞添加的飼料飼養雄性大鼠，并經口投與6個月，分別給予1.5、15mg/kg/日甲鈷胺，在一般癥狀、血液、尿檢及病理組織學的觀察中，其結果均未見因同時投與無機汞和甲鈷胺而帶來的影響。
權利要求
1.一種甲鈷胺分散片，其特征在于，所述的分散片每1000片含有以下組分甲鈷胺 0.5g羧甲基淀粉鈉5-10g低取代-羥丙基纖維素 15-30g微晶纖維素 50-65g聚維酮 1-3g微粉硅膠5g甜菊素 5g硬脂酸鎂1g滑石粉 1g。
2.根據權利要求1所述的甲鈷胺分散片，其特征在于，所述的分散片每1000片含有以下組分甲鈷胺 0.5g羧甲基淀粉鈉5g低取代-羥丙基纖維素 15g微晶纖維素 65g聚維酮 3g微粉硅膠5g甜菊素 5g硬脂酸鎂1g滑石粉 1g。
3.根據權利要求1或2所述的甲鈷胺分散片，其特征在于，所述的分散片規格為500μg/片。
4.甲鈷胺分散片的制備方法，其特征在于，所述方法為在避光條件下，將甲鈷胺原料過100目篩，羧甲基淀粉鈉、低取代-羥丙基纖維素、微晶纖維素、聚維酮、微粉硅膠、甜菊素、硬脂酸鎂、滑石粉過80目篩，稱取如下量甲鈷胺 0.5g羧甲基淀粉鈉5-10g低取代-羥丙基纖維素 15-30g微晶纖維素50-65g聚維酮1-3g微粉硅膠 5g甜菊素5g按照等量遞加原則將輔料與甲鈷胺混合均勻，加入適量30％乙醇制成軟材，過20目尼龍篩，制成顆粒，并于50～60℃干燥，過20目篩，整粒，稱取約1g硬脂酸鎂和1g滑石粉，過篩并與顆粒混合均勻，壓片，共1000片，檢驗合格后包裝。
全文摘要
本發明提供了一種甲鈷胺分散片及其制備方法，所述的分散片每1000片含有以下組分甲鈷胺0.5g、羧甲基淀粉鈉5－10g、低取代－羥丙基纖維素15－30g、微晶纖維素50－65g、聚維酮1－3g、微粉硅膠5g、甜菊素5g、硬脂酸鎂1g、滑石粉1g。該分散片在避光條件下制備。將甲鈷胺原料過100目篩，輔料過80目篩，稱量，按照等量遞加原則將輔料與甲鈷胺混合均勻，加入適量30％乙醇制成軟材，過20目尼龍篩，制成顆粒，并于50～60℃干燥，過20目篩，整粒，稱取約1g硬脂酸鎂和1g滑石粉，過篩并與顆粒混合均勻，壓片，檢驗合格后包裝。本發明甲鈷胺分散片分散性好，均一性好，溶出度好，使吸收更為迅速，生物利用度更高，服用更方便，尤其適合老、幼和吞服固體困難的病患者。
文檔編號A61P3/10GK1742748SQ20051010579
公開日2006年3月8日 申請日期2005年9月29日 優先權日2005年9月29日
發明者周卓和 申請人:周卓和