專利名稱：吲哚－2,3－二酮在制備抗病毒或免疫增強劑藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及吲哚-2，3-二酮(indole-2，3-dine)在制備抗病毒或免疫增強劑的藥物中的應用。
背景技術：
病毒感染性疾病是嚴重危害人類健康的一大類疾病，特別是SARS病毒又一次給人類引起的災難。近一個世紀以來盡管人們一直致力于抗病毒治療的研究，但成效不顯著，至今特異、有效的抗病毒化合物仍很少。其中有諸多抗病毒的措施，如在病毒感染細胞的各個環節干擾或阻斷其對宿主細胞的影響，通過提高機體免疫功能清除體內游離的病毒與病毒感染細胞以達到治愈病毒感染的目的，但抗病毒治療技術卻遠沒有達到根本解決問題的水平。由于病毒必須在活細胞內增殖，因此理想的抗病毒藥物是在殺傷病毒感染細胞的同時不影響宿主細胞的正常代謝，目前傳統的抗病毒制劑在殺傷病毒感染細胞的同時，對正常細胞也有很大的損傷。
利用天然活性物質進行抗病毒治療研究是近幾年發展起來的抗病毒治療技術，雖然該研究多處于臨床應用前的試驗研究階段，但已顯示出巨大的應用潛力。天然藥物研制正成為各國新藥研究的新熱點，天然藥物資源的開發利用己取得了令人矚目的進展。天然藥物不僅有殺病毒作用，還有免疫增強作用。
吲哚-2，3-二酮是來自于龍蝦并維持其生存所必需的一種天然海洋活性物質，現已證明也是存在于海洋生物、中藥青黛和人體內的天然活性物質。吲哚-2，3-二酮是成分單一的橙紅色有機天然物質，化學結構明確，其單體已可合成，結構式為 吲哚-2，3-二酮本發明人從事海洋活性物質吲哚-2，3-二酮的綜合開發利用研究，長期研究和大量試驗結果表明，吲哚-2，3-二酮具有良好的抗病毒作用和免疫增強作用，并且其毒性低，副作用小，在抗病毒感染方面有良好的應用前景。目前傳統的抗病毒制劑在殺傷病毒感染細胞的同時，對正常細胞也有很大的損傷，嚴重地限制了應用和推廣。吲哚-2，3-二酮作為一種結構明確的天然海洋活性物質，毒性低，既對正常細胞有保護作用，又具有抗病毒和免疫增強的作用，這是目前人工合成抗病毒藥(除中藥外)所不具有的優點，有著巨大的新藥開發價值。
發明內容
本發明目的是提供吲哚-2，3-二酮在制備抗病毒或免疫增強劑的藥物中的應用。
所述的病毒為HIV病毒、流感病毒、出血熱病毒或單皰疹病毒。
所述的吲哚-2，3-二酮為天然產物或人工合成產品。人工合成的吲哚-2，3-二酮，其純化方法包括用超純水和無水乙醇按1∶1-8比例混合，加入人工合成的吲哚-2，3-二酮，在磁性攪拌器中緩慢加熱至溶解，然后逐漸冷卻呈針形橘紅色結晶，加熱溫度為50-80℃，濾去上清液，按上述方法重復純化1-3次，以減少重金屬離子，其結晶純度達99％；將經純化的吲哚-2，3-二酮研磨成粉末過80目篩，與藥用淀粉按1∶1-10重量比例混勻制成50mg或100mg規格的膠囊。或將經純化的吲哚-2，3-二酮研磨成粉末過80目篩，按濕法制粒工藝制成50mg或100mg規格的片劑。
服用方法預防病毒感染時可應用膠囊或片劑，每人每日50-100mg；治療病毒感染時可用膠囊或片劑，每人每日100-200mg，可分2-3次飯后服用。
本發明吲哚-2，3-二酮在制備抗病毒或免疫增強劑的藥物中應用的有益效果如下采用選擇代表性仙臺病毒(SV)病毒株，建立體外病毒感染細胞模型和正常對照細胞，在細胞水平觀察天然活性物質吲哚-2，3-二酮的抗病毒活性。通過建立仙臺病毒(SV)感染動物模型，觀察不同劑量吲哚-2，3-二酮在一定時間內對試驗動物的免疫促進作用，在機體水平觀察不同劑量吲哚-2，3-二酮對免疫指標的改善作用。研究表明
1、吲哚-2，3-二酮在濃度為0.156mg~0.039mg/ml時，藥物的細胞毒性作用消失，同時顯示抗病毒作用。抗病毒作用有一定的量效關系。在0.313mg/ml以上濃度，吲哚-2，3-二酮對細胞顯示毒性作用。在0.156mg/ml濃度時，吲哚-2，3-二酮對細胞不再顯示毒性作用，表明吲哚-2，3-二酮有效濃度在微摩爾水平，具有抗病毒作用，與毒性濃度差距很大，因此其不良反應較小。
2、與接種病毒灌胃鹽水的鹽水對照比較高劑量吲哚-2，3-二酮(1mg/0.2ml-4mg/0.2ml)可以促進血抑抗體的產生，表明吲哚-2，3-二酮在抗病毒同時具有免疫增強作用。
3、吲哚-2，3-二酮對小鼠的LD50為1091±359mg·kg-1(95％可信區間751~1374mg·kg-1)。
4、吲哚-2，3-二酮毒性較低；濃度為0.156mg~0.039mg/ml時，藥物的細胞毒性作用消失，同時顯示抗病毒作用。抗病毒作用有一定的量效關系。
圖1為吲哚-2，3-二酮對SV致細胞病變具有抑制作用的示意圖；圖2為血凝抑制試驗結果示意圖。
具體實施例方式
下面通過試驗例進一步闡述本發明吲哚-2，3-二酮在制備抗病毒或免疫增強劑藥物中應用的有益效果。
試驗例一吲哚-2，3-二酮抗病毒藥效學研究試驗材料1、吲哚-2，3-二酮由青島醫學院藥理組提供。取10％的吲哚-2，3-二酮(8磅滅菌)，4℃保存備用。用前倍比系列稀釋，共稀釋11個濃度(5％~0.00488％)。
2、昆明(KM)種小鼠雌性，6周，18.5-22.5g，由河北省試驗動物中心提供3、仙臺病毒(SV)由中國醫學科學院動物所病毒室提供，將SV接種9日齡雞胚尿囊，37℃培養72小時，4℃過夜，凍死雞胚、凝固血液。取雞胚尿囊液用血凝法測效價，選取效價大于1∶128的尿囊液小份額分裝，液氮中凍存(SV雞胚尿囊液)。
4、取健康人“O”型靜脈血，加入10倍體積阿氏保存液(葡萄糖2.05克，枸櫞酸鈉0.8克，氯化納0.42克，加蒸餾水到100毫升)，4℃保存備用。
試驗方法1、病毒血凝效價滴定取U型底24孔血凝板，第一孔加入0.4ml 2％NCS-PBS，其余孔加0.3ml。第一孔中加入SV雞胚尿囊液0.2ml，混勻，從第一孔中取0.3ml加入第二孔，0.3ml系列二倍稀釋，共稀釋8個濃度，2％NCS-PBS做對照，各孔中均再加入0.3ml的0.5％人“O”型紅細胞懸液，搖勻，置22℃溫箱30-60分鐘，判定出現凝集“++++”的最高稀釋度為血凝素效價(一個單位)。各試驗和對照孔均設復份。
2、細胞半數感染量(TCID50，)滴定BHK-21傳代細胞接種在96孔培養板上，置二氧化碳培養箱37℃培養，長成單層后，棄上清，各孔分別加入0.1ml不同稀釋度的SV雞胚尿囊液，吸附1.5小時，棄掉上清，用無血清的DMEM 0.1ml洗一次，棄掉，再每孔加入無血清的DMEM 0.2ml。置二氧化碳培養箱37℃培養，每天在倒置顯微鏡下觀察結果，連續三天，記錄各孔病變情況。以1/2孔出現病變的最高SV雞胚尿囊液稀釋度作為TCID50。
3、吲哚-2，3-二酮抗病毒作用觀察BHK-21傳代細胞接種在96孔培養板上，置二氧化碳培養箱37℃培養，長成單層后，棄上清，試驗組各孔分別加入0.1ml含100TCID50的SV雞胚尿囊液，吸附1.5小時，棄掉上清，用無血清的DMEM 0.1ml洗一次，棄掉，再每孔加入無血清的DMEM 0.18ml，加不同稀釋度的吲哚-2，3-二酮20微升。置二氧化碳培養箱37℃培養，每天在倒置顯微鏡下觀察結果，連續三天，記錄各孔病變情況。試驗組及對照組處理如下(1)試驗組含100TCID50病毒，含不同濃度的吲哚-2，3-二酮。
(2)吲哚-2，3-二酮對照不含病毒，含不同濃度的吲哚-2，3-二酮。
(3)病毒對照含100TCID50病毒，不含吲哚-2，3-二酮。
(4)正常對照不含病毒和吲哚-2，3-二酮。
4、灌胃吲哚-2，3-二酮促進小鼠抗病毒免疫(1)病毒接種KM小鼠按體重隨機分成四組(高劑量、低劑量、NS對照、正常對照)，每組10只，連續灌胃給藥5天，于灌胃給藥第二天，高劑量、低劑量、NS對照組小鼠均經滴鼻接種SV液，每只小鼠50微升。正常對照組不接種病毒。在接種后第7天摘眼球采血，分離血清做血球凝集抑制試驗。
(2)血球凝集抑制試驗待檢血清置56℃水浴箱滅活30分鐘，在血凝反應板上自1∶10起做倍比系列稀釋，共6孔，再滴加等體積已稀釋好的4單位血凝素，同時做RBC對照；血清對照；血凝素對照，置22℃溫箱作用30分鐘，全部試驗孔和對照孔內滴加相當于待檢血清2倍體積的0.5％人“O”型紅細胞懸液，搖勻，置22℃溫箱作用60分鐘。
試驗結果1、病毒血凝效價滴定系列稀釋的SV雞胚尿囊液加入等體積的紅細胞懸液，血凝結果見表1。該SV雞胚尿囊液的血凝效價為1∶192(包括紅細胞懸液的體積)。做1∶192稀釋為一個血凝素單位，實際使用4個單位。
表1SV雞胚尿囊液血凝效價
2、細胞培養觀察吲哚-2，3-二酮抗病毒作用吲哚-2，3-二酮對SV致細胞病變具有抑制作用見圖1和表2。
(1)試驗組含100TCID50病毒，含不同濃度的吲哚-2，3-二酮。在吲哚-2，3-二酮濃度為0.156mg-0.039mg/ml時，藥物的細胞毒性作用消失，同時顯示抗病毒作用。抗病毒作用有一定的量效關系。
(2)吲哚-2，3-二酮對照組不含病毒，含不同濃度的吲哚-2，3-二酮。觀察吲哚-2，3-二酮對細胞的毒性作用。在0.313mg/ml以上濃度，吲哚-2，3-二酮對細胞顯示毒性作用。在0.156mg/ml濃度時，吲哚-2，3-二酮對細胞不再顯示毒性作用。
(3)病毒對照含100 TCID50病毒，不含吲哚-2，3-二酮。出現“++++”病變，說明病毒對照正常。
(4)正常對照不含病毒和吲哚-2，3-二酮。不出現病變，說明該對照正常。
圖1顯示吲哚-2，3-二酮對病毒細胞病變的保護作用，左圖為病毒對照，顯示細胞變圓，團縮，部分區域細胞脫落。右圖為0.156mg/ml吲哚-2，3-二酮試驗，顯示多數細胞貼壁，細胞形態基本為多邊形。
表2吲哚-2，3-二酮對SV致細胞病變作用
“-”無病變，表示細胞貼壁良好，基本無脫落。
“++++”重度病變，表示75％以上細胞出現脫落，變圓，團縮病變。
“+~+++”細胞病變介于“無病變”和“重度病變”之間。
3、灌胃吲哚-2，3-二酮誘導昆明小鼠抗體產生的作用KM小鼠按體重隨機分成四組(高劑量、低劑量、NS對照、正常對照)，連續灌胃給藥5天，于灌胃給藥第二天，前三組小鼠均經滴鼻接種SV液，在病毒接種后第7和14天取血清做血球凝集抑制試驗。結果見表3。
接種病毒后7天采血和14天采血均可以顯示，與接種病毒灌胃鹽水的鹽水對照比較高劑量吲哚-2，3-二酮可以促進血抑抗體的產生。低劑量吲哚-2，3-二酮只在7天采血時有效。
表3吲哚-2，3-二酮對小鼠血凝抑制抗體產生的作用
*抗體效價為最終效價，包括血球和血凝素體積。正常對照為不接種病毒的小鼠，“＜1∶40”指未檢測更低的稀釋度。
圖2為血凝抑制試驗的典型結果。左圖為7天采血試驗的組，血凝抑制效價為1∶320；右圖為鹽水對照，血凝抑制效價為1∶40-80二、吲哚-2，3-二酮的急性慢性毒性試驗試驗材料1、動物昆明種小鼠(二級)，體重18-22g，由河北醫科大學試驗動物中心提供，合格證號冀醫動字04056。
2、藥和試劑吲哚-2，3-二酮、西黃蓍膠試驗方法1、吲哚-2，3-二酮的急性慢性毒性試驗1.1動物分組昆明種小鼠50只，大鼠160只，雌雄兼有，體重18-20g，180-220g隨機分為5組，每組10只；試驗前禁食12h，自由飲水；控制室溫在20±2℃。
1.2藥品的配備西黃蓍膠用生理鹽水配制成1.25％的膠體供試驗使用；吲哚-2，3-二酮為橙色粉末狀，不溶于水，試驗前用1.25％的西黃蓍樹膠配制成所需濃度的懸濁液供試驗使用。
1.3給藥方法一次性ig，劑量分別為3，2，1.5，1，0.7g·kg-1，組間比為k＝0.7，ig容積0.6ml/只。試驗于上午進行。
1.4半數致死量(LD50)測定觀察給藥后24h各組動物的死亡和存活情況，計算死亡率，采用孫氏改良法計算LD50。
試驗結果1、吲哚-2，3-二酮的急性毒性試驗動物的一般表現中毒動物表現為少動、萎靡不振、行走不穩等。存活動物觀察7d，生長良好，體重增加，尸檢，心肝腎腦等組織肉眼觀察未發現異常變化。
2、半數致死量(LD50)的測定為用藥后24h的死亡率，采用孫氏改良法計算LD50＝1091±359mg·kg-1(95％可信區間為751～1374mg·kg-1)為確保長期用藥的安全性，按國家醫藥食品監督管理局、國家I類新藥慢性毒性試驗標準，對吲哚-2，3-二酮進行安全性綜合評價。吲哚-2，3-二酮按臨床用量的1.17、58.5、117倍的不同劑量給大鼠連續灌胃3個月、6個月及第7個月恢復期對大鼠的體重增長、進食情況以及行為活動等無顯著影響，對大鼠的血液學、血液生化學及心電圖等各項指標亦無明顯的不利影響。22種臟器與組織的病理組織學觀察與空白對照組比較均未見異常。
結果表明，吲哚-2，3-二酮長期大劑量口服用藥，對動物無明顯損害，未發現因蓄積而對機體產生的毒性反應，是一種安全可靠的藥物。
實施例1片劑的制備將超純水和無水乙醇按1∶5的比例混合，加入人工合成的吲哚-2，3-二酮，在磁性攪拌器中，在60℃溫度下緩慢加熱至溶解，然后逐漸冷卻呈針形橘紅色結晶，重復上述步驟，重復結晶3次，以減少重金屬離子。將吲哚-2，3-二酮結晶粉碎成過80目篩的粉末，各自稱量出吲哚-2，3-二酮50mg、乳糖125mg、淀粉320mg混合均勻，用濕法制粒、干燥，整粒后與5mg硬脂酸鎂混合，壓片，制成每片重量為500mg的片劑。
實施例2膠囊的制備將超純水和無水乙醇按1∶5比例混合，加入人工合成的吲哚-2，3-二酮，在磁性攪拌器中，在70℃溫度下緩慢加熱至溶解，然后逐漸冷卻呈針形橘紅色結晶，重復上述步驟，重復結晶3次，以減少重金屬離子。將吲哚-2，3-二酮結晶粉碎成過80目篩的粉末，各自稱量出吲哚-2，3-二酮50mg、淀粉445mg、硬脂酸鎂5mg，混合均勻，填充膠囊，制成每個內含500mg的膠囊劑。
權利要求
1.吲哚-2，3-二酮在制備抗病毒藥物或免疫增強劑中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述的病毒為HIV病毒、流感病毒、出血熱病毒或單皰疹病毒。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述的病毒為HIV病毒。
4.根據權利要求1-3任一項所述的應用，其特征在于所述的吲哚-2，3-二酮為天然產物或人工合成產品。
5.根據權利要求1-3任一項所述的應用，其特征在于所述的吲哚-2，3-二酮通過下列方法純化用超純水和無水乙醇按1∶1-8比例混合，加入吲哚-2，3-二酮，在磁性攪拌器中緩慢加熱至溶解，然后逐漸冷卻呈針形橘紅色結晶。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于加熱溫度為50-80℃。
7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，將所得到的針形橘紅色結晶再按相同方法重復純化1-3次，以減少重金屬離子。
8.根據權利要求1-3任一項所述的應用，其特征在于將所述的吲哚-2，3-二酮研磨成粉末過80目篩，與藥用淀粉按1∶1-10重量比例混勻制成50mg或100mg規格的膠囊。
9.根據權利要求1-3任一項所述的應用，其特征在于將所述的吲哚-2，3-二酮研磨成粉末過80目篩，按濕法制粒工藝制成50mg或100mg規格的片劑。
全文摘要
本發明涉及吲哚－2，3－二酮在制備抗病毒或免疫增強劑的藥物中的應用，所述的病毒包括HIV病毒、流感病毒、出血熱病毒或單皰疹病毒，所述的吲哚－2，3－二酮為天然產物或人工合成產品，其毒性低，副作用小，既對正常細胞有保護作用，又具有抗病毒作用和免疫增強作用。
文檔編號A61P31/22GK1759833SQ20051010569
公開日2006年4月19日 申請日期2005年9月30日 優先權日2005年9月30日
發明者岳旺, 劉占濤, 王蕾, 仲偉珍, 楊志宏, 徐敏 申請人:青島大學