專利名稱：一種用于治療上皮來源腫瘤的基因藥物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種基因藥物，尤其是指一種用于治療乳腺癌、胃癌、口腔鱗癌、鼻咽癌等上皮來源腫瘤的基因藥物，本發明還涉及該基因藥物的制備方法。
背景技術：
傳統的腫瘤治療方法包括化療、放療和手術等，但從臨床的治療效果來看，都不能徹底根治腫瘤。而且由于放、化療的非特異性殺傷作用，對機體的毒性較大，而且長期使用會產生腫瘤組織的治療耐受。手術對早期腫瘤病人療效明顯，但由于很多腫瘤發現晚，無法實施，并且術后的復發和轉移問題一直困擾著外科醫生。如果抓住腫瘤細胞與正常細胞之間基因表達的不同，采用腺病毒介導轉染的方法，調整腫瘤細胞內基因的表達，通過調控生理功能的方式，特異性地達到抑制腫瘤細胞的目的。這種所謂基因治療的方法具有效率高、特異性強以及對正常組織毒性低的優點。自1990年美國NIH開展世界第一個基因治療臨床試驗以來，在此后的十幾年間，基因治療作為一個給人類帶來巨大希望的全新領域，其研究蓬勃發展，備受矚目。截至目前，已有1020項基因治療的臨床試驗在全世界5大洲23個國家開展。2004年，世界第一個腫瘤基因治療藥物在中國深圳誕生，使基因治療作為一種新療法應用于臨床成為現實，使世界基因治療的發展進入了一個新階段。
為了開拓腫瘤治療的基因藥物，本發明的發明人采用一種特異性的腫瘤抑制基因14-3-3σ，并將其用目前認為基因治療最為理想的載體腺病毒進行包裝(即Ad-14-3-3σ)，且應用于臨床各種上皮來源腫瘤的治療。選用這一基因的原因在于14-3-3σ在正常人的上皮組織中表達，但在多種上皮來源的腫瘤如乳腺癌、胃癌、口腔鱗癌、鼻咽癌中表達減少、缺失或功能不全。我們以往研究表明14-3-3σ過表達可抑制Her2過表達的乳腺癌細胞株MCF-7和Her18的增殖和成瘤性，然而14-3-3σ能否抑制上皮來源的鼻咽癌細胞和Akt過表達的細胞，特別是乳腺癌MDA-MB-361細胞國內外尚未見報道。
發明內容
本發明的其中一個目的在于提供一種治療效果好、適用面廣的一種用于治療上皮來源腫瘤的基因藥物。
本發明的另一個目的是提供一種可大規模生產，成本低的上述基因藥物的制備方法。
本發明的前一目的是這樣實現的一種用于治療上皮來源腫瘤的基因藥物，是由14-3-3σ基因與腺病毒的重組體。
上述一種用于治療上皮來源腫瘤的基因藥物中14-3-3σ基因具有SEQ ID NO1序列。
本發明的后一目的是這樣實現的使用RT-PCR方法獲取14-3-3σ的cDNA序列，經測序無誤后，體外PCR擴增其基因全長，用特異性的核酸內切酶切割擴增產物和腺病毒穿梭質粒，轉染HEK293細胞株，進行重組病毒的包裝即得。
本發明選用14-3-3σ進行腫瘤基因治療，14-3-3σ基因的表達產物14-3-3σ蛋白具有抑癌途徑廣泛、抑癌作用確切并且不良反應小等優點。如抑制CDK2，CDK4和CDK1產生細胞周期的阻滯作用，使細胞周期停滯在G2/M期，直接抑制腫瘤增殖，并有利于增加放化療的敏感性；14-3-3σ蛋白還能夠調節抑癌蛋白p53的表達，增加后者活性產生抑癌作用；另外，14-3-3σ在p53有突變的腫瘤細胞中可以通過調節非p53依賴的Akt/PKB通路達到抑瘤的作用。14-3-3σ的基因片段較短，有利于獲得有效的病毒重組體。
本發明選用腺病毒作為14-3-3σ基因轉染的載體，腺病毒在基因治療的應用有相對較長的歷史，積累了很多成功的經驗和失敗的教訓，對其生物學特性有較全面的了解，與其它一些病毒載體相比，具有安全(不會引起宿主染色體的突變)、轉染效率高，承載外源基因量大、在體內可以長期維持活性等優點。因此，是目前已知基因治療的最為理想的載體。
本發明中采用14-3-3σ基因重組腺病毒應用于腫瘤治療，具有下述優點(1)重組腺病毒構建簡單，可以大規模生產，降低成本，有很廣闊的臨床應用前景。
(2)腺病毒可以高效地將目的基因攜帶入腫瘤細胞內，并有效表達較長一段時間。
(3)對腫瘤細胞有特異的和高效的殺傷作用，并且不良反應小。
(4)對于上皮來源的腫瘤(占全部腫瘤的絕大多數)都有不同程度的抑制作用，應用面廣。
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步地詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。
圖1是本發明的14-3-3σ基因與腺病毒的重組流程示意圖；圖2 14-3-3σ對鼻咽癌CNE2細胞活性的影響(MTT法)；圖3 14-3-3σ對鼻咽癌CNE2細胞增殖的影響(BrdU實驗)；圖4 14-3-3σ對鼻咽癌CNE2細胞增殖的影響(軟瓊脂克隆形成實驗)；圖5 14-3-3σ對鼻咽癌CNE2細胞在裸鼠成瘤性的影響圖6 14-3-3σ對鼻咽癌CNE2細胞周期的影響(流式細胞儀檢測)；圖7 14-3-3σ對鼻咽癌CNE2細胞周期的影響(流式細胞儀檢測)；圖8 14-3-3σ對鼻咽癌CNE2細胞凋亡的影響(DNA片段檢測試劑盒)；圖9 14-3-3σ對Akt和CDK2活性的影響(體外激酶分析法)；圖10 乳腺癌組織中14-3-3σ表達及與磷酸化Akt表達的關系(免疫組化法)；圖11 乳腺癌MDA-MB-361細胞14-3-3σ、p-Akt和p27等蛋白表達(Western Blot)；圖12 14-3-3σ對Rat1-Akt細胞活性的影響(MTT法)；
圖13 14-3-3σ對Rat1-Akt細胞增殖的影響(BrdU實驗)；圖14 14-3-3σ對Rat1-Akt細胞增殖的影響(軟瓊脂克隆形成實驗)；圖15 14-3-3σ對Rat1-Akt和MDA-MB-361細胞成瘤性的影響(半體內抑瘤實驗)；圖16 14-3-3σ對Rat1-Akt細胞的抑瘤作用(體內抑瘤實驗)；圖17 14-3-3σ對Akt蛋白、Akt磷酸化活性和磷酸化底物水平的影響(Western Blot)；圖18 14-3-3σ對Rat1-Akt細胞p27定位的影響(免疫熒光)。
具體實施例方式
實施例1 14-3-3σ基因與腺病毒的重組參閱圖1所示，使用RT-PCR方法獲取14-3-3σ的cDNA序列，經測序無誤后，體外通過PCR法擴增其基因全長，用特異性的核酸內切酶切割擴增產物和腺病毒穿梭質粒，構建攜帶14-3-3σ基因的穿梭質粒，將擴增的14-3-3σ基因與信號肽HA基因亞克隆到原核質粒PUC19，再利用Cla1和BamH1亞克隆到pQB1-AdCMV5(含腺病毒E1A)，與QB1-viralDNA進行共轉染，陽性病毒克隆經PCR篩選，得到Ad-HA-14-3-3σ基因重組體，擴增，轉染HEK293細胞培養，粗分離的14-3-3σ基因重組腺病毒經超離心純化，除菌分裝，添加劑加入，低溫保存。
實施例2 14-3-3σ應用于低分化鼻咽癌的治療1.四甲基偶氮唑藍(MTT)實驗檢測細胞活性用無小牛血清的RPIM1640培養液稀釋至3×107cells/L的細胞懸液，再分別用MOI為5、10、15的Ad-14-3-3σ和Ad-β-gal或PBS(等量)轉染細胞，并接種96孔培養板(100μl/well)，每組設5個復孔。置37℃，5％CO2濃度條件下培養2h，每孔加含20％小牛血清的RPIM1640培養液100μl，繼續培養22h、46h、70h和94h后，加入3％MTT 20μl/well，37℃孵育4h，棄上清，每孔加入DMSO100μl，混勻15min后，檢測590nm處的A值，并計算抑瘤百分率，即抑瘤百分率(％)＝(處理組A值-陰性對照組A值)/(對照組A值-陰性對照組A值)×100％。在同一條件下重復本實驗3次，取其平均值為實驗結果。MTT實驗結果顯示腺病毒介導14-3-3σ(MOI5、10、15)轉染24h、48h、72h和96h均可抑制CNE2細胞的活性。其中，隨著轉染時間的延長，抑制作用更為明顯，與轉染相同MOI的Ad-βgal或PBS對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，且Ad-14-3-3σ在低濃度時就能對細胞活性產生明顯抑制作用，劑量依賴關系不明顯。結果表明14-3-3σ基因轉染可抑制CNE2細胞的活性，且抑制作用呈時效關系，參閱表1和圖2所示。
表114-3-3σ對鼻咽癌CNE-2細胞活性的影響(X±SD)％
2.BrdU實驗檢測細胞增殖能力5-溴-2′脫氧尿嘧啶(BrdU)標記及檢測試劑盒購自Roche公司，實驗程序參照試劑盒使用說明。即把經胰酶消化的對數生長期CNE2細胞放入有蓋的培養玻片，分別用MOI為5、10的Ad--14-3-3σ和Ad-β-gal或PBS(等量)轉染細胞，置37℃5％CO2培養箱培養30h，待其長到50％滿時，吸棄培養液，每孔加入200μl BrdU標記培養液(1∶1000)，37℃，5％CO2條件下培養15～30min，棄上清，每孔用洗液1ml洗滌，重復三次，再加入70％酒精和50mM MGlycin混合液(PH2.0)200μl，置-20℃條件下固定細胞，20min后，重復洗滌三次，加入抗BrdU的工作液(1∶10)200μl，置37℃，5％CO2條件下培養30min，重復洗滌三次，吸干洗液后，加入適量的計數液封片，于熒光顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野，觀察300個細胞中的陽性細胞數，計算BrdU標記陽性細胞百分率，即BrdU陽性細胞百分率(％)＝陽性細胞數/細胞總數×100％。
BrdU實驗結果顯示經MOI為5或10的Ad-HA-14-3-3σ轉染的CNE2細胞BrdU陽性百分率分別為12％或42％；而用等量Ad-β-gal處理的CNE2細胞BrdU陽性率分別為86％或75％，PBS處理的CNE2細胞BrdU陽性率為99％，前者與后者比較差異有統計學意義(P＜0.05)，參閱圖3所示。
3.軟瓊脂克隆形成實驗測細胞增殖能力先把預熱已融解的1％瓊脂溶液與等量的含30％小牛血清雙倍RPIM1640培養液混勻后，加入24孔板，鋪好下層瓊脂，然后用無血清的RPIM1640稀釋細胞為2×104/ml，再用MOI為5、10、15的Ad-14-3-3σ和Ad-β-gal或PBS(等量)轉染細胞，37℃孵育2h后，各取100μl放入含30％小牛血清的雙倍RPIM1640培養液，同時與等量預熱融解的0.8％瓊脂溶液混勻，加入到鋪有凝固下層瓊脂的孔中，使每孔的細胞數為2000個，每孔設4個重復孔，把培養板放入濕盒，并置于37℃，5％CO2培養箱中培養14d，每孔加入p-iodonitrotetrazolium violet(1mg/ml，PBS)溶液0.1ml進行染色，培養過夜，取出后置于4℃冰箱，待上層瓊脂完全凝固后攝像和計算集落數。軟瓊脂集落形成實驗結果也顯示Ad-HA-14-3-3σ(MOI5、10和15)轉染的細胞其集落數少于對照組(用PBS或Ad-β-gal(MOI5、10、15)處理后的細胞)(P＜0.05)，且MOI為5、10或15的Ad-HA-14-3-3σ轉染組之間差別不大(p＞0.05)，參閱圖4所示，這些均提示14-3-3σ的過表達可抑制鼻咽癌CNE2細胞的增殖能力。
4.Ad-14-3-3σ在體內對鼻咽癌的作用(動物實驗)將4-5周齡的裸鼠分為五組，即MOI為5和10的Ad-HA-14-3-3σ治療組、MOI為5和10的Ad-β-gal和PBS(等量)對照組，每組6只。用MOI為5、10的Ad-HA-14-3-3σ、Ad-β-gal和PBS(等量)轉染CNE2細胞，48h后收集細胞，用DMEM培養液調細胞數為1×107/ml，每只裸鼠右頸背部皮下注入0.2ml的細胞懸液復制荷鼻咽癌裸鼠模型，然后每3天測量腫瘤的大小，以計算腫瘤的體積和抑瘤百分率，即腫瘤體積(mm3)＝L×W2/2；抑瘤率(％)＝(對照組瘤體積-實驗組瘤體積)/對照組瘤體積×100％。另外觀察各組小鼠腫瘤形成出現的時間。
實驗組和對照組細胞在體外先經MOI為5和10的Ad-HA-14-3-3σ和Ad-β-gal或PBS處理后，接種于裸鼠復制腫瘤模型，以觀測14-3-3σ對鼻咽癌CNE2細胞成瘤性的影響，結果發現兩個Ad-HA-14-3-3σ實驗組腫瘤體積均明顯小于對照組(Ad-β-gal或PBS處理)(P＜0.05)。而Western blot結果發現腫瘤組織內14-3-3σ蛋白表達增多，提示14-3-3σ轉染可抑制CNE2細胞的成瘤性，參閱表2、圖5所示。
表2 14-3-3σ對鼻咽癌CNE2細胞在裸鼠成瘤性的影響(X±SD)％ 5.Ad-HA-14-3-3σ抑制鼻咽癌CNE2細胞機制的探討5.1流式細胞術檢測細胞周期的分布和凋亡峰分別用MOI為5、10和15的Ad-HA-14-3-3σ和Ad-β-gal或PBS(等量)轉染CNE-2細胞36h，經胰酶消化后收集細胞，離心、棄上清并用PBS洗滌細胞2次后，將2×106細胞重懸于0.1ml PBS中，在輕微振蕩下，緩慢滴加3ml 70％酒精(4℃)固定細胞，4℃過夜，離心后棄上清，用PBS洗滌2次，再將細胞重懸于0.5ml PI染液中(50μg/mL PI，20μg/mL RNaseA溶于PBS，新鮮配制)，37℃孵育20min后用FACS檢測。
用FACS檢測發現Ad-14-3-3σ轉染后，CNE-2細胞出現G2期細胞比例的增加，在MOI5、10和15濃度時G2期細胞比例分別為72.6％、72.6％和42.5％，與空白對照組(17.7％)相比明顯增加；而使用MOI為5、10和15的Ad-β-gal作為重組腺病毒對照，當用MOI為5、10和15處理CNE2細胞時，其G2期細胞比例分別為19.7％、20.3％和16.4％，與空白對照組無明顯差異(p＞0.05)。同時發現，14-3-3σ基因重組腺病毒轉染組與空白對照組或Ad-β-gal對照組相比，sub-G1期的細胞比例增加，參閱圖6所示，圖中A為空白對照，B為β-Gal重組腺病毒5MOI、10MOI和15MOI組，C為14-3-3σ重組腺病毒5MOI、10MOI和15MOI。其中15MOI Ad-14-3-3σ組sub-G1期細胞比例增加尤為明顯，高達19.8％。這些提示Ad-14-3-3σ轉染CNE2細胞，可引起CNE2細胞G2期阻滯和凋亡，參閱圖7所示。
5.2DNA裂解片段定量檢測細胞的凋亡分別用MOI為5、10和15的Ad-HA-14-3-3σ和Ad-β-gal或PBS(等量)處理CNE-2細胞16h，收集細胞(包括漂浮和貼壁細胞，加入RIPA)液在溫室下作用30min以裂解細胞，然后離心，取上清并稀釋細胞抽提液至合適的濃度，用細胞死亡ELISA試劑盒檢測DNA裂解片段，以定量評價細胞的凋亡程度。具體操作程序參照DNA裂解片段定量試劑盒說明書。
分別用DNA裂解片斷定量試劑盒檢測細胞內DNA的斷裂碎片來反映細胞凋亡水平。結果發現轉染了Ad-14-3-3σ與轉染Ad-β-Gal對照組或空白對照組比，DNA的斷裂碎片明顯增多(P值均小于0.05)，其中5MOI和10MOI組增多更為明顯參閱圖8所示。同時細胞周期檢測顯示，轉染14-3-3σ實驗組sub-G1期細胞比例增加，當MOI為15時，可高達19.8％參閱圖7所示，圖中AG2期細胞抑制率；B亞G1期細胞的比例。這些提示14-3-3σ轉染可誘導CNE2細胞凋亡。
5.3體外激酶分析法檢測CDK2和Akt活性先用Ad-HA-14-3-3σ(MOI＝5)處理細胞，對照組用Ad-β-gal(MOI＝5)或PBS(等量)代替，然后細胞經無鈣PBS洗滌后，用約400μl RIPI緩沖液裂解細胞并加超聲粉碎30sec。4℃離心收集上清。用DC蛋白定量試劑盒檢測上清OD值，然后根據標準曲線計算樣本蛋白濃度，取等量蛋白的細胞上清液，用抗Akt抗體和抗CDK2單抗做免疫沉淀，經洗滌后加入1μl含有10μCi[γ-32P]ATP的Flag-p27或GSK3β和HH1與沉淀的免疫復合物共培養，隨后各組等量上樣，電泳，經放射自顯影顯示磷酸化p27或GSK3β和HH1的水平。
采用體外激酶分析法檢測14-3-3σ對細胞Akt活性和CDK2活性的影響，首先用抗Akt抗體或抗CDK2抗體作免疫沉淀，然后將帶有放射核素32P標記的重組體純化的p27和Gsk3β作為Akt激酶的底物，HH1作為CDK2激酶的底物，通過檢測相應底物的磷酸化水平，以反映Akt激酶或CDK2激酶的活性。結果表明14-3-3σ可降低Akt激酶和CDK2激酶的活性，提示14-3-3σ的抑瘤作用可能是通過降低Akt和CDK2激酶活性而阻滯細胞周期和誘導凋亡來實現的，參閱圖9所示。
實施例3 14-3-3σ應用于Akt過表達的腫瘤的治療1.乳腺癌組織或細胞中14-3-3σ和p-Akt或p27等蛋白的表達及相互關系1.1免疫組化法檢測患者乳腺癌組織中14-3-3σ及p-Akt蛋白的表達收集33例原發性乳腺癌患者的石蠟標本，制成切片。用二甲苯脫蠟至水后，將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液中，調節pH至6.0，加熱促進抗原修復。將單克隆抗體14-3-3σ(c-18)以1∶50稀釋，滴入載玻片，置室溫孵育1h，磷酸化Akt(ser473)按1∶100稀釋，也加入載玻片孵育。然后用一般的免疫組化染色方案進行染色，使用ABC酶底物試劑盒標記蛋白，用蘇木素復染載玻片，脫水、透明、封片。在顯微鏡下觀察結果，陽性染色為細胞核呈棕黃色。在觀察結果時，將載玻片上標記蛋白著色深淺程度分為1、2、3、4四個等級，標記蛋白著色的數量也分為0、1(陽性細胞＜10％＝、2(陽性細胞10％-50％)、3(陽性細胞＞50％)四個等級。以此為標準，結合著色深淺及染色細胞數量來綜合判斷，區分標記蛋白14-3-3σ和p-Akt是否為高表達或低表達。實驗結果采用Fisher精確概率法進行統計學處理。
在33例乳腺癌標本中各切取了2張白片，分別用抗14-3-3σ和抗磷酸化Akt(ser473)單抗做免疫組化。按照標記蛋白高低表達的標準判讀，并進行統計分析。33例乳腺癌標本中發現有14例14-3-3σ蛋白低表達(42％)。在這些14-3-3σ低表達的腫瘤中，75％磷酸化Akt高表達，P＝0.0024。另外在有14-3-3σ表達的腫瘤組織中，可見磷酸化Akt(ser473)表達降低，參閱圖10中A圖所示。這些結果顯示乳腺癌中14-3-3σ的表達與磷酸化Akt(ser473)的表達呈負相關，參閱圖10中B圖所示。
1.2Western Blot方法檢測乳腺癌MDA-MB-361細胞14-3-3σ、p-Akt和p27等蛋白表達腫瘤細胞經無鈣PBS沖洗后，每碟用400μlRIPA緩沖液裂解細胞并加超聲粉碎30sec。4℃離心收集上清。用DC蛋白定量試劑盒檢測上清液OD值，根據標準曲線計算樣本蛋白濃度，經RIPA緩沖液稀釋調整蛋白濃度，每孔等量蛋白上樣。采用polyvinylidine fluoride膜印跡蛋白，經ECL kit化學發光檢測盒標記蛋白，把結果記錄在Kodak X-omatic AR膠片上(Eastman Kodak Co，Rochester，NY)。
MDA-MB-361為一個HER2/神經過度表達的人乳腺癌細胞系，Western Blot方法檢測結果顯示與Rat1細胞相比，MDA-MB-361細胞Akt過表達，同時可見Akt磷酸化底物增多，14-3-3σ和p27的表達減少，其蛋白表達情況與Rat1-Akt細胞相似，參閱圖11所示。
1.Ad-14-3-3σ在體外對Akt過表達細胞的作用(MTT法，BrdU、軟瓊脂集落形成實驗)
2.1四甲基偶氮唑藍(MTT)實驗測細胞活性胰酶消化對數生長期的細胞，用無小牛血清的DMEM培養液稀釋至3×107cells/L的細胞懸液，再分別用MOI為5的Ad-14-3-3σ和Ad-β-gal或PBS(等量)轉染Akt過表達的Rat1-Akt細胞，并接種96孔培養板(100μl/well)，每組設5個復孔。置37℃，5％CO2濃度條件下培養2h，每孔加含20％小牛血清的DMEM培養液100μl，繼續培養22h、46h或70h后，加入3％MTT 20μl/well，37℃孵育4h，棄上清，每孔加入DMSO100μl，靜置15min后混勻，檢測590nm處的A值，并計算抑瘤百分率(％)。所得實驗數據均在檢測的線性范圍之內。抑瘤百分率的計算公式(處理組A值-陰性對照組A值)/(對照組A值-陰性對照組A值)×100％。在同一條件下重復本實驗3次，取3次實驗的平均值為實驗結果。
MTT實驗結果顯示腺病毒介導14-3-3σ(MOI5)轉染24h，48h和72h均可抑制Rat1-Akt細胞的活性。其中，隨著轉染時間的延長，抑制作用更為明顯，如在轉染72h時，其抑制率接近100％；與轉染Ad-β-gal或PBS對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，參閱圖12所示。說明14-3-3σ基因的轉染可抑制Rat1-Akt細胞的活性。
2.2BrdU實驗檢測細胞增殖能力(DNA的合成)5-溴-2′脫氧尿嘧啶(BrdU)標記及檢測試劑盒購自Roche公司，實驗程序參照試劑盒使用說明。把經胰酶消化的對數生長期的細胞放入有蓋的培養玻片，分別用MOI為5的Ad-14-3-3σ、Ad-β-gal和PBS(等量)轉染Rat1-Akt細胞，置37℃，5％CO2培養箱培養30h，待其長到50％滿時，吸棄培養液，每孔加入200μl BrdU標記培養液(1∶1000)，37℃，5％CO2條件下培養15～60min，棄上清，用洗液1ml/well洗三次，再加入70％酒精和50mMMGlycin混合液(PH2.0)200μl/well，置-20℃條件下固定細胞，20min后，重復洗滌三次，每孔加入抗BrdU的工作液(1∶10)200μl，置37℃，5％CO2條件下培養30min，重復洗滌三次，吸干洗液后，加入適量的計數液封片，于熒光顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野，觀察300個細胞中的陽性細胞數，計算BrdU標記陽性細胞百分率，即等于陽性細胞數/細胞總數×100％。
BrdU實驗結果分析顯示Ad-HA-14-3-3σ轉染細胞BrdU陽性率為45％，而對照組用PBS或Ad-β-gal處理后的細胞BrdU陽性率分別為100％或98％，兩者比較差異有統計學意義(P＜0.05)，參閱圖13所示。
2.3軟瓊脂克隆形成實驗測細胞增殖能力先把預熱已融解的1％瓊脂溶液與等量的含30％小牛血清雙倍DMEM培養液混勻后，加入24孔板，鋪好下層瓊脂，然后用無血清的DMEM稀釋細胞為2×104/ml，再用MOI為5的Ad--14-3-3σ和Ad-β-gal或PBS(等量)轉染細胞，37℃孵育2h后，各取100μl放入含30％小牛血清的雙倍DMEM培養液，同時與等量預熱融解的0.8％瓊脂溶液混勻，加入到鋪有凝固下層瓊脂的孔中，使每孔的細胞數為2000個，每孔設4個重復孔，把培養板放入盒，并置于37℃，5％CO2培養箱中培養14天，取出后每孔加入0.1ml p-iodonitrotetrazolium violet(1mg/ml，PBS)溶液染色，培養過夜，取出后置于4℃冰箱，待上層瓊脂完全凝固后攝像和計算集落數及集落的相對百分數(PBS處理組設為100％)。軟瓊脂集落形成實驗結果也顯示Ad-HA-14-3-3σ轉染的細胞其集落數少于對照組(用PBS或Ad-β-gal處理后的細胞)，參閱圖14所示，這些均提示14-3-3σ的過表達可抑制Rat1-Akt細胞的增殖能力。
3.裸鼠荷瘤模型觀測14-3-3σ對Akt過表達細胞成瘤性的影響3.1半體內抑瘤實驗(以反映14-3-3σ對細胞成瘤性的影響)將4-5周齡的裸鼠分為3組，即Ad-HA-14-3-3σ(MOI＝5)治療組和Ad-β-gal或PBS對照組，每組6只。用MOI為5的Ad-HA-14-3-3σ、Ad-β-gal和PBS(等量)轉染Akt過表達的Rat1-Akt和MDA-MB-361細胞，48h后收集細胞，用DMEM培養液調細胞數為1×107/ml，分別于每只裸鼠右頸背部皮下和乳腺的脂肪墊內注入0.2ml的細胞懸液復制荷Rat1-Akt裸鼠模型，然后每3天測量腫瘤的大小1次，以計算腫瘤的體積和抑瘤率，計算公式為腫瘤體積(mm3)＝L×W2/2；抑瘤率(％)＝(對照組瘤體積-實驗組瘤體積)/對照組瘤體積×100％。另外觀察各組裸鼠腫瘤形成出現的時間。
實驗組和對照組細胞在體外先經Ad-HA-14-3-3σ和Ad-β-gal或PBS處理后，接種于裸鼠復制腫瘤模型，以觀察腫瘤生長情況，結果發現轉染Ad-HA-143-3σ實驗組腫瘤體積明顯小于對照組(Ad-β-gal或PBS處理)，差異有統計學意義(P＜0.05)。提示14-3-3σ轉染可抑制Rat1-Akt和MDA-MB-361細胞的成瘤性，參閱圖15中A、B所示。
3.2體內抑瘤實驗(以反映14-3-3σ抑瘤作用)將4-5周齡裸鼠分為5組，即3個MOI為5的Ad-HA-14-3-3σ治療組，Ad-β-gal和PBS對照組，每組6只，每只裸鼠右頸背部皮下注入0.2ml細胞懸液(1×107/ml)，復制裸鼠荷瘤模型。其中治療組又分為3組，即每天注射給藥一次連續15次，每3天注射給藥一次共5次和僅于接種腫瘤后第一天注射給藥1次，對照組注射Ad-β-gal(MOI＝5)和PBS(等量)，每天一次。同樣每三天測量腫瘤大小1次，計算腫瘤體積和抑瘤率，同時觀察各組裸鼠腫瘤形成出現的時間。第15d后處死動物，取腫瘤組織用Western Blot方法測定14-3-3σ蛋白等表達的情況。
體內抑瘤實驗結果也顯示Ad-HA-14-3-3σ治療組腫瘤體積明顯小于對照組(Ad-β-gal或PBS處理)，其中每日給Ad-HA-14-3-3σ治療的裸鼠15天后其腫瘤體積在50mm3以內，而每三日或每15日給一次Ad-HA-14-3-3σ治療的裸鼠，其腫瘤體積分別為120mm3或180mm3，對照組Ad-β-gal或PBS處理其腫瘤體積都為250mm3，且三組不同時限給Ad-HA-14-3-3σ治療組腫瘤出現時間較對照組晚，其中又以每日連續給Ad-HA-14-3-3σ治療組腫瘤出現時間最晚，提示14-3-3σ有體內抑瘤作用，參閱圖16所示。
4.Western Blot實驗經無鈣PBS沖洗后，稱取約100mg腫瘤組織，剪成碎片后按1∶10(w/v)加入RIPA緩沖液裂解細胞并加超聲粉碎30sec。4℃離心收集上清。用DC蛋白定量試劑盒檢測上清液OD值，根據標準曲線計算樣本蛋白濃度，經RIPA緩沖液稀釋調整蛋白濃度，每孔等量蛋白上樣。采用polyvinylidine fluoride膜印跡蛋白，經ECL kit化學發光檢測盒標記蛋白，把結果記錄在Kodak X-omatic AR膠片上(Eastman Kodak Co，Rochester，NY)。
用Western Blot方法測定腫瘤組織內14-3-3σ蛋白、Akt蛋白、Akt-473或308位點磷酸化及磷酸化底物水平，結果發現，每日一次連續瘤內注射給藥15天治療組裸鼠腫瘤組織中，有14-3-3σ蛋白的表達，而對照組(Ad-β-gal或PBS處理組)腫瘤組織中14-3-3σ蛋白表達缺如。這提示腺病毒轉染14-3-3σ基因在Rat1-Akt細胞中成功表達.同時發現有14-3-3σ蛋白表達的腫瘤組織伴有Akt蛋白的減少，Akt-308位點磷酸化活性降低和Akt磷酸化底物水平的減少，而Akt-473位點磷酸化活性變化不大，參閱圖17所示。這些提示14-3-3σ可抑制Akt蛋白的表達、Akt磷酸化活性和磷酸化底物的水平。
5.免疫熒光Rat1-Akt細胞分別用MOI為5的Ad-HA-14-3-3σ和Ad-β-gal或PBS(等量)(對照組)處理，然后用甲醇∶丙酮(1∶1v/v)常溫下固定2min后，以兔抗p27抗體孵育1h，再用與Alexa568交聯的抗兔抗體(分子探針)孵育1h，以觀測p27定位。為研究外源性HA-14-3-3σ的亞細胞定位，先加抗HA的單克隆抗體(12CA5，Babco)孵育1h后，再加與Alexa488交聯的抗鼠二抗(分子探針)孵育1h。為使染色完全，以上細胞同時加入1μl(0.1μg/ml)4’，6二脒基-2-苯吲哚鹽酸(DAPI)(Sigma)孵育作核染色。用Axioplan 2型熒光顯微鏡(Zeiss)觀測免疫熒光在細胞內的分布，以確定各蛋白分子的亞細胞定位。
采用免疫熒光法檢測14-3-3σ對Rat1-Akt細胞內p27亞細胞定位的影響，結果發現經Ad-β-gal(MOI＝5)或PBS(等量)處理的Rat1-Akt細胞，48h時其p27大量存在于胞漿，14-3-3σ蛋白表達缺如；同時發現用腺病毒介導轉染14-3-3σ基因48h后，在Rat1-Akt細胞內出現大量14-3-3σ蛋白表達的同時，細胞漿內p27的定位顯著減少，而胞核的p27增多，參閱圖18所示。結果提示，14-3-3σ可阻斷Akt介導的p27在胞漿中的錯位。
附件SEQ ID NO11gagagacaca gagtccggca ttggtcccag gcagcagtta gcccgccgcc cgcctgtgtg61 tccccagagc catggagaga gccagtctga tccagaaggc caagctggca gagcaggccg121 aacgctatga ggacatggca gccttcatga aaggcgccgt ggagaagggc gaggagctct181 cctgcgaaga gcgaaacctg ctctcagtag cctataagaa cgtggtgggc ggccagaggg241 ctgcctggag ggtgctgtcc agtattgagc agaaaagcaa cgaggagggc tcggaggaga301 aggggcccga ggtgcgtgag taccgggaga aggtggagac tgagctccag ggcgtgtgcg361 acaccgtgct gggcctgctg gacagccacc tcatcaagga ggccggggac gccgagagcc421 gggtcttcta cctgaagatg aagggtgact actaccgcta cctggccgag gtggccaccg481 gtgacgacaa gaagcgcatc attgactcag cccggtcagc ctaccaggag gccatggaca541 tcagcaagaa ggagatgccg cccaccaacc ccatccgcct gggcctggcc ctgaactttt601 ccgtcttcca ctacgagatc gccaacagcc ccgaggaggc catctctctg gccaagacca661 ctttcgacga ggccatggct gatctgcaca ccctcagcga ggactcctac aaagacagca721 ccctcatcat gcagctgctg cgagacaacc tgacactgtg gacggccgac aacgccgggg781 aagagggggg cgaggctccc caggagcccc agagctgagt gttgcccgcc accgccccgc841 cctgccccct ccagtccccc accctgccga gaggactagt atggggtggg aggccccacc901 cttctcccct aggcgctgtt cttgctccaa agggctccgt ggagagggac tggcagagct961 gaggccacct ggggctgggg atcccactct tcttgcagct gttgagcgca cctaaccact1021 ggtcatgccc ccacccctgc tctccgcacc cgcttcctcc cgaccccagg accaggctac1081 ttctcccctc ctcttgcctc cctcctgccc ctgctgcctc tgatcgtagg aattgaggag1141 tgtcccgcct tgtggctgag aactggacag tggcaggggc tggagatggg tgtgtgtgtg1201 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgcgcgcg cgccagtgca agaccgagat tgagggaaag1261 catgtctgct gggtgtgacc atgtttcctc tcaataaagt tcccctgtga cactcaaaaa1321 aaaaaaaaaa aaaaaa
權利要求
1.一種用于治療上皮來源腫瘤的基因藥物，其特征是由14-3-3σ基因與腺病毒的重組體。
2.根據權利要求1所述一種用于治療上皮來源腫瘤的基因藥物，其特征是14-3-3σ基因具有SEQ ID NO1序列。
3.權利要求1或2所述用于治療上皮來源腫瘤的基因藥物的制備方法，其特征是使用RT-PCR方法獲取14-3-3σ的cDNA序列，經測序無誤后，體外PCR擴增其基因全長，用特異性的核酸內切酶切割擴增產物和腺病毒穿梭質粒，轉染HEK293細胞株，進行重組病毒的包裝即得。
全文摘要
本發明公開了一種用于治療上皮來源腫瘤的基因藥物及其制備方法，屬基因藥物領域，是出14－3－3σ基因與腺病毒的重組體。方法是使用RT－PCR方法獲取14－3－3σ的cDNA序列，經測序無誤后，體外PCR擴增其基因全長，用特異性的核酸內切酶切割擴增產物和腺病毒穿梭質粒，轉染HEK293細胞株，進行重組病毒的包裝即得。本發明的基因藥物可實現大規模生產，成本低的優點，可用于乳腺癌、胃癌、口腔鱗癌、鼻咽癌等上皮來源腫瘤的治療。
文檔編號A61P35/00GK1915432SQ20051010212
公開日2007年2月21日 申請日期2005年12月7日 優先權日2005年12月7日
發明者楊惠玲, 夏云飛, 李夢宏, 黃文林, 蘇勇, 夏洪平 申請人:中山大學