抑制PCNA基因表達的siRNA序列及其應用的制作方法

專利名稱：抑制PCNA基因表達的siRNA序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學與生物醫藥領域，尤其涉及一種高效抑制PCNA基因表達的siRNA序列及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
人增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)作為DNA聚合酶δ、ε的輔助蛋白，是細胞DNA復制及修復必須的輔助因子之一，并通過與各種蛋白相互作用，對細胞周期控制、染色體有絲分裂等多種事件進行協同調控，許多細胞內外增殖信號都必須經過PCNA的參與，才能引發細胞DNA合成及分裂增殖。經研究發現PCNA在多種腫瘤細胞中高表達，并與腫瘤的大小、組織學分級、核分裂相計數、轉移及預后密切正相關，而在靜止期細胞表達量很少或不表達。PCNA的表達量常常作為臨床腫瘤組織的增殖指標，輔助判斷腫瘤分級與預后。理論上，抑制PCNA的表達，可以阻斷腫瘤細胞的增殖通路，在腫瘤的基因治療中具有十分誘人的應用前景。國內外實驗研究表明，將PCNA反義寡核苷酸導入細胞，降解PCNA mRNA，抑制PCNA表達，能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖，并誘導細胞凋亡。但反義寡核苷酸效果較差，限制了其應用。最近發展起來的小干擾RNA(siRNA)介導的RNA干擾(RNAi)技術可以比以往的任何手段更高效、特異、方便的沉默靶基因的表達，極低量的siRNA就可以得到良好的基因抑制效果。通過RNAi技術，可較方便地獲得與基因敲除類似的表型，近年來受到極為廣泛的關注。惡性腫瘤的發生發展常與一些關鍵基因的過高表達或突變有關，應用siRNA沉默致病基因在惡性腫瘤基因治療中具有良好的發展前景。
siRNA和傳統的反義寡核苷酸(ASODN)均在mRNA水平特異性關閉靶基因表達。ASODN與靶mRNA結合后，通過激活RNase H特異性降解RNA-DNA復合物，或與靶基因的雙鏈DNA結合形成三鏈復合物，阻礙基因的轉錄。但ASODN穩定性較差，能非特異性結合細胞內源性蛋白而具有細胞毒性，修飾后的ASODN穩定性有所增加但毒性更甚。而且，抑制靶基因表達需高濃度ASODN才能起作用，這使細其胞毒性進一步加重。十多年來，ASODN應用于基因治療的研究進展緩慢。RNA干擾(RNAi)是近幾年發展起來的一種阻抑基因表達的新方法，雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞后，在Dicer酶的作用下，降解為21-23bp，3’端帶有2個突出堿基的siRNA(small interference RNA)，并與細胞內核酸內外切酶、解鏈酶、Argonaute蛋白等結合，形成具有多個亞單元的核糖核苷酸蛋白復合物——RISC(RNA-inducing silencing complex)，高效遞進式介導細胞內源性的同源mRNA的降解。哺乳動物細胞內，導入長雙鏈RNA可導致基因表達廣泛抑制，直接應用短雙鏈的siRNA同樣高效介導RNAi，并避免非特異性基因抑制效應。與ASODN作用效果相比較，siRNA具有顯著優勢。首先，siRNA作用特異性更高；其次，少量的siRNA即可發揮顯著的同源mRNA降解作用，siRNA抑制細胞增殖的IC50值比針對相同基因的效果最佳的或同靶點ASODN的IC50低100～1000倍，降解效率明顯高于ASODN；另外，siRNA導入細胞后，能高效迅速的結合到RISC中，大大減少非特異結合細胞內源性蛋白的幾率，使siRNA穩定性增強而細胞毒性減弱。
但是，作用于相同靶基因不同位點的siRNA的作用效果差異很大，可能與siRNA的堿基分布，兩端自由能大小及靶mRNA的二級結構等有關。在siRNA沉默特定基因的實驗中，為保證siRNA能高效降解靶mRNA，一般需要針對靶基因設計合成多條不同序列的siRNA，在從中篩選出有效序列。有效siRNA序列的設計篩選是siRNA介導RNAi實驗的關鍵點之一。

發明內容
為了解決上述現有技術中存在的不足之處，本發明的首要目的在于提供一組能高效抑制人PCNA基因表達的siRNA序列。
根據生物信息學方法在genebank獲取人PCNA mRNA序列(LOCUSNM_002592)，采用RNA strcture分析軟件對PCNA mRNA序列的二級結構進行預測，總結以往提出的siRNA設計原則，綜合分析其GC含量、兩端自由能大小、mRNA作用位點的二級結構、siRNA對堿基偏愛性的要求等，在siRNA在線設計軟件設計結果的基礎上，進一步尋找合適的siRNA靶序列，初步選擇出四條符合要求的siRNA序列。采用NCBI GenBank(美國國立醫學圖書館和美國國立衛生研究院編寫)提供的BLAST軟件，對選擇的靶序列進行同源分析，排除siRNA非特異性地抑制其他基因片段的可能，四條序列的堿基序列及作用位點如表1所示表1 靶向PCNA mRNA設計的一組siRNA

上述正義鏈和反義鏈3’端均以UU或dTdT為懸垂修飾。
本發明的另一個目的在于提供上述PCNA siRNA在制備抗腫瘤藥物中及基因功能研究中的應用。
本發明針對人PCNA的mRNA序列設計合成了一組siRNA，篩選出三條PCNA siRNA(PCNA siRNA2、PCNA siRNA3、PCNA siRNA4)能明顯抑制腫瘤細胞增殖，其中以PCNA siRNA2、PCNA siRNA4效果最好。經RT-PCR及免疫細胞化學方法檢測，發現PCNA siRNA2、PCNA siRNA4可顯著成功下調PCNA mRNA及蛋白水平的表達，并在三種不同的腫瘤細胞上驗證了設計合成的PCNA siRNA對腫瘤細胞增殖等生物學特性的影響，為PCNA siRNA應用于惡性腫瘤的臨床治療奠定基礎。
本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果首先，PCNA是腫瘤基因治療的良好靶點，應用siRNA介導的RNAi技術可以比以往的任何手段更高效、特異、方便的抑制靶基因的表達。本發明篩選出能高效抑制PCNA基因表達的siRNA序列，并作用于腫瘤細胞，檢測微量PCNA siRNA抑制PCNA表達后腫瘤細胞在增殖、細胞周期及凋亡方面的變化，為PCNA siRNA應用于惡性腫瘤的臨床治療奠定重要基礎。
其次，由于PCNA基因在胚胎發育中的重要作用，PCNA基因敲除的動物模型至今仍無法獲得，限制了PCNA基因功能的進一步研究。siRNA介導的RNAi可以高效特異抑制PCNA基因的表達，可達到近似基因敲除的效果。本發明篩選除出能高效抑制PCNA基因表達的siRNA序列，為PCNA基因功能的進一步研究奠定重要基礎。


圖1為RT-PCR結果圖；圖2為免疫細胞化學結果圖；圖3為克隆形成抑制實驗部分結果圖(吉姆薩染色，×100)；圖4為細胞周期分析結果圖；圖5為annexinV-PI雙染流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況圖；圖6為Hchest33258染色細胞形態學變化圖。
具體實施例方式
下面結合實施例，對本發明做進一步地詳細說明。
實施例1根據生物信息學方法在genebank獲取人PCNA mRNA序列(LOCUSNM 002592)，采用RNA strcture分析軟件對PCNA mRNA序列的二級結構進行預測，總結以往提出的siRNA設計原則，綜合分析其GC含量、兩端自由能大小、mRNA作用位點的二級結構、siRNA對堿基偏愛性的要求等，在siRNA在線設計軟件設計結果的基礎上，進一步尋找合適的siRNA靶序列。初步選擇出四條符合要求的siRNA序列。采用NCBI GenBank(美國國立醫學圖書館和美國國立衛生研究院編寫)提供的BLAST軟件，對選擇的靶序列進行同源分析，排除siRNA非特異性地抑制其他基因片段的可能，四條序列的堿基序列及作用位點如表1所示(正義鏈及反義鏈3’端均以UU或dTdT為懸垂修飾)。
實施例2改良MTT法篩選有效抑制癌細胞增殖的序列將人肝癌SMMC7721細胞、人結腸癌Caco2細胞、人胃癌SCG7901細胞分別調至5×104/mL濃度，接種于96孔板，100μL/孔，24h后吸盡培養液上清，更換為60μL無血清OPTI-MEM培養液(Gibico CO.)，用無血清OPTI-MEM培養液分別稀釋4條轉錄得到的siRNA(PCNA siRNA1、PCNA siRNA2、PCNAsiRNA3、PCNA siRNA4)和脂質體lipofectamineTM2000(Invitrogen)，室溫孵育5min后，再將siRNA與脂質體混合，室溫孵育30min后，逐滴加入孔板，每孔終體積100μL，每種細胞的siRNA作用濃度分別設為25nmol/L、50nmol/L、100nmol/L，放置孵箱孵育6h后，每孔加入100μL含血清培養液繼續培養。設已經證明有較好效果的PCNA反義寡核苷酸組(序列為5’-GAC CAG GCGCGC CTC GAA-3’，全硫代修飾，濃度設為20μmol/L)作為陽性對照，另設空白對照組及單純脂質體組，脂質體0.2μL/孔。CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所)檢測細胞增殖抑制情況。轉染時間分別達到24h、48h、72h后，每孔加入MST試劑10μL，室溫孵育60min，酶標儀(Bio-Rid)檢測每孔吸光度，計算細胞的增殖抑制率。
表2 四對PCNA siRNAs(50nmol/L)轉染不同腫瘤細胞48小時后細胞增殖抑制率(％).

1)ASODN終濃度20μmol/L； LipolipofectamineTM2000，0.2μL/孔2)PCNA siRNA2與.PCNA siRNA4對不同細胞的增殖抑制作用顯著強于其他各組，P＜0.01表3 PCNA siRNA2在不同劑量及作用時間下對Caco2的增殖抑制率(％)

1)與相同濃度的其他各組比較差別有統計學意義，P＜0.052)與相同作用時間的其他各組比較差別有統計學意義，P＜0.05表4 PCNA siRNA4在不同劑量及作用時間下對Caco2的增殖抑制率(％)

1)與相同濃度的其他各組比較差別有統計學意義，P＜0.052)與相同作用時間的其他各組比較差別有統計學意義，P＜0.05再選擇抑制腫瘤細胞效果最好的PCNA siRNA2、PCNA siRNA4轉染結腸癌Caco2細胞，檢測轉染后PCNA mRNA及蛋白表達水平變化，siRNA濃度均為50nmol/L，轉染48h后檢測。
實施例3RT-PCR檢測PCNAmRNA表達取人結腸癌Caco2細胞，細胞處理及轉染方法如上述，PCNA siRNA2、PCNA siRNA4濃度均為50nmol/L，以20μmol/L的PCNAASODN作陽性對照。轉染48h后，TRIZOL(Invitrogen)法常規提取細胞總RNA，ReverTra Dash TMRT-PCR試劑盒(Toyobo Co.Japan code no.PCR400美津生物公司)反轉錄為cDNA，PCR條件設置為94℃預變性5min后，94℃持續30s，56℃持續30s，72℃持續1min，共30個循環，72℃后延伸5min。引物序列參照文獻合成，PCNA擴增引物序列為P1 5’aaa cca gct aga ctt tcc tc 3’；P2 5’tca cgc cca tgg cca ggt tg3’，同時擴增β-actin作為內參，引物序列為P1’ 5’atc tgg cac cac acc ttc ta 3’，P2’ 5’ctt ctt aat gtc acg cac ga 3’，擴增產物經瓊脂糖電泳后拍照，gene tool軟件分析計算PCNAmRNA表達抑制率。如圖1所示，泳道1Marker(依次為100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp)；泳道2PCNA siRNA2-50nmol/L組；泳道3PCNA siRNA2-100nmol/L組；泳道4PCNA siRNA4-50nmol/L組；泳道5PCNA siRNA4-100nmol/L組；泳道6ASODN 20μmol/L組；泳道7對照組。PCNA siRNA顯著下調靶基因mRNA水平，基因表達抑制效果明顯強于ASODN。50nmol/L與100nmol/L兩組間差異不明顯。RT-PCR電泳結果經genetool軟件分析，50nM PCNA siRNA2與100nM PCNA siRNA2抑制率分別為70.5％、82.4％，50nM PCNA siRNA4與100nM PCNA siRNA4的抑制率分別為73.5％、79.4％。
實施例4免疫細胞化學法檢測PCNA蛋白表達將經過處理的蓋玻片置入24孔板，每孔加入1mL 5×104/mL濃度的細胞，24h后按上述方法進行轉染，48h取出玻片，中性緩沖福爾馬林固定，0.3％的Triton-X-100透膜處理，3％甲醇雙氧水(A液)阻斷內源性過氧化物酶，血清封閉后加入鼠抗人PCNA單克隆抗體，37℃孵育2h后，依次加入生物素標記的二抗，鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物的三抗，DAB(二氨基聯苯胺)顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。PCNA為核內蛋白，當顯色結果陰性時，為顯示細胞核位置，用蘇木素輕度染核。有陽性顯色結果則不復染。如圖2所示，A正常對照Caco2細胞，PCNA陽性表達于細胞核(棕黃色)；B50nmol/L siRNA轉染后48h Caco2細胞，幾乎見不到陽性著色細胞，蘇木素極輕度復染以便核定位。
實施例5克隆形成抑制實驗檢測細胞克隆形成能力各組細胞處理方法同上，轉染8h后，各組細胞均用胰酶消化，計數3次取均值，再將細胞以300/mL的濃度接種于24孔板，1mL/孔，孵箱內孵育12天后收板，3∶1的甲醇∶冰醋酸固定液固定，吉姆薩染色后，顯微鏡下觀察照相。如圖3所示，A正常對照；B20μmol/LPCNAASODN；C50nmol/LPCNAsiRNA2；D50nmol/L PCNA siRNA4。PCNA siRNA使腫瘤細胞克隆形成數量及克隆大小顯著降低，比百倍濃度的ASODN的抑制作用更強，差異明顯。(注為24孔板稀釋培養法，400/孔，37℃，5％CO2，飽和濕度條件培養7天。)實施例6PI單染流式細胞儀檢測細胞周期及亞二倍體峰各組細胞按上述方法處理，于轉染后48h后胰酶消化收集，預冷的PBS(磷酸緩沖液)反復洗滌后，用體積分數為70％乙醇4℃下固定30min。上機前用含Rnase(RNA酶)及PI(propidium iodide，碘化丙錠)的染色液染色，30min后流式細胞儀(Becton Dickinson公司)測定各組細胞的DNA含量，計算細胞生長周期變化及亞二倍體峰比例，用CELLQUEST軟件分析處理結果。如圖4所示，A圖為正常對照組細胞，未出現M1凋亡峰，M2峰代表G0/G1期細胞，比例為69.73％，M3峰代表S期細胞，比例為16.96％，M4代表G2/M期細胞，比例為13.23％；B圖為50nmol/L siRNA轉染后48h細胞，檢測結果出現明顯的M1凋亡峰，S期細胞比例上升到25.39％，G2/M期細胞上升到25.25％。PI單染后流式細胞儀檢測細胞周期結果顯示，siRNA轉染后細胞周期明顯阻滯于G2/M期，S期細胞亦明顯增加，并出現明顯的凋亡峰。以往研究表明，PCNA在細胞由G0/G1期向S期轉化及G2/M期轉化中均具有十分重要的作用，PCNA表達抑制可以使細胞阻滯于G0/G1期或G2/M期，而以G0/G1期阻滯的報道多見。PCNA基因表達抑制后，細胞周期阻滯點不同的原因待進一步研究。細胞種類特異性或對PCNA表達抑制的程度不同是可能的原因。
實施例7Annexin V-PI雙染測定細胞凋亡比例，熒光顯微鏡觀察細胞凋亡形態細胞處理及轉染方法同上，轉染后48h胰酶消化收集各組細胞，Annexin V-PI雙染試劑盒(寶賽，北京)檢測細胞凋亡率變化。取適當濃度的細胞經預冷PBS反復洗滌，200ul Binding Buffer(結合反應液)重懸后，分別加入10ulAnnexin V-FITC(異硫氰基熒光素標記的膜連蛋白V)和5ul PI(碘化丙啶)，輕輕混勻，避光室溫反應15min，再加入300ul Binding Buffer，立即上機檢測。Annexin V-FITC+，PI-的細胞群(即LR細胞群)為早期凋亡細胞。如圖5所示，siRNA設為12.5nmol/L、25nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L六個梯度。與空白對照組相比，流式細胞儀檢測到siRNA轉染后細胞出現明顯的早期凋亡群，并呈一定的濃度依賴性，當濃度達到50nmol/L后，凋亡的比例不再隨濃度增加而明顯增加。左下限LL為正常細胞，右下限LR為早期凋亡細胞，右上限UR為晚期凋亡細胞及壞死細胞。空白對照組LR＝4.01％，siRNA 12.5nmol/L組LR＝22.35％，siRNA 25nmol/L組LR＝29.11％，siRNA50nmol/L組LR＝37.46％，siRNA 100nmol/L組LR＝42.77％，siRNA 200nmol/L組LR＝43.20％。
另取一部分細胞，經預冷PBS反復洗滌后，涂片固定，Hochest33258避光染色15min，流水沖洗10min后熒光顯微鏡觀察細胞凋亡形態并照相。如圖6所示，Hchest33258染色觀察細胞形態學變化。圖6A為正常對照組細胞；圖6B為50nmol/L siRNA處理后的細胞，出現核固縮、碎裂等典型的凋亡形態學變化。
綜上所述，本發明篩選出的PCNA siRNA2、PCNA siRNA4能夠通過高效抑制細胞內PCNA基因的表達。轉染腫瘤細胞，可阻斷腫瘤細胞的增殖途徑而顯著抑制細胞增殖，明顯阻滯細胞周期，并高效誘導腫瘤細胞的凋亡，為PCNAsiRNA應用于惡性腫瘤的基因治療奠定了重要的實驗基礎。同時，篩選出的PCNA siRNA序列能高效沉默細胞內PCNA基因的表達，為PCNA基因功能的進一步研究奠定基礎。
SEQUENCE LISTING<110>暨南大學<120>抑制PCNA基因表達的siRNA序列及其應用<130>4<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>19<212>RNA<213>Artificial sequence<220>
<223>根據生物信息學方法在genebank獲取人PCNA mRNA序列，采用RNAstrcture分析軟件及siRNA在線設計軟件設計的PCNA siRNA1正義鏈<400>1ccucaccagu auguccaaa 19<210>2<211>19<212>RNA<213>Artificial sequence<220>
<223>根據生物信息學方法在genebank獲取人PCNA mRNA序列，采用RNAstrcture分析軟件及siRNA在線設計軟件設計的PCNA siRNA1反義鏈<400>2uuuggacaua cuggugagg 19<210>3<211>19<212>RNA<213>Artificial sequence<220>
<223>根據生物信息學方法在genebank獲取人PCNA mRNA序列，采用RNAstrcture分析軟件及siRNA在線設計軟件設計的PCNA siRNA2正義鏈
<400>3gccacuccac ucucuucaa 19<210>4<211>19<212>RNA<213>Artificial sequence<220>
<223>根據生物信息學方法在genebank獲取人PCNA mRNA序列，采用RNAstrcture分析軟件及siRNA在線設計軟件設計的PCNA siRNA2反義鏈<400>4uugaagagag uggaguggc 19<210>5<211>19<212>RNA<213>Artificial sequence<220>
<223>根據生物信息學方法在genebank獲取人PCNA mRNA序列，采用RNAstrcture分析軟件及siRNA在線設計軟件設計的PCNA siRNA3正義鏈<400>5gaugccuucu ggugaauuu 19<210>6<211>19<212>RNA<213>Artificial sequence<220>
<223>根據生物信息學方法在genebank獲取人PCNA mRNA序列，采用RNAstrcture分析軟件及siRNA在線設計軟件設計的PCNA siRNA3反義鏈<400>6aaauucacca gaaggcauc 19<210>7<211>19
<212>RNA<213>Artificial sequence<220>
<223>根據生物信息學方法在genebank獲取人PCNA mRNA序列，采用RNAstrcture分析軟件及siRNA在線設計軟件設計的PCNA siRNA4正義鏈<400>7guugauggau uuagauguu 19<210>8<211>19<212>RNA<213>Artificial sequence<220>
<223>根據生物信息學方法在genebank獲取人PCNA mRNA序列，采用RNAstrcture分析軟件及siRNA在線設計軟件設計的PCNA siRNA4反義鏈<400>8aacaucuaaa uccaucaac 19
權利要求
1.一種抑制人PCNA基因表達的siRNA序列，包括下述序列中的任一條或一條以上PCNA siRNA1 正義鏈5’CCU CAC CAG UAU GUC CAA A 3’反義鏈5’UUU GGA CAU ACU GGU GAG G 3’；PCNA siRNA2 正義鏈5’GCC ACU CCA CUC UCU UCA A 3’反義鏈5’UUG AAG AGA GUG GAG UGG C 3’；PCNA siRNA3 正義鏈5’GAU GCC UUC UGG UGA AUU U 3’反義鏈5’AAA UUC ACC AGA AGG CAU C 3’；PCNA siRNA4 正義鏈5’GUU GAU GGA UUU AGA UGU U 3’反義鏈5’AAC AUC UAA AUC CAU CAA C 3’。
2.根據權利要求1所述的一種抑制人PCNA基因表達的siRNA序列，包括以下三條序列PCNA siRNA2 正義鏈5’GCC ACU CCA CUC UCU UCA A 3’反義鏈5’UUG AAG AGA GUG GAG UGG C 3’；PCNA siRNA3 正義鏈5’GAU GCC UUC UGG UGA AUU U 3’反義鏈5’AAA UUC ACC AGA AGG CAU C 3’；PCNA siRNA4 正義鏈5’GUU GAU GGA UUU AGA UGU U 3’反義鏈5’AAC AUC UAA AUC CAU CAA C 3’。
3.根據權利要求1所述的一種抑制人PCNA基因表達的siRNA序列，包括以下兩條序列PCNA siRNA2 正義鏈5’GCC ACU CCA CUC UCU UCA A 3’反義鏈5’UUG AAG AGA GUG GAG UGG C 3’；PCNA siRNA4 正義鏈5’GUU GAU GGA UUU AGA UGU U 3’反義鏈5’AAC AUC UAA AUC CAU CAA C 3’。
4.根據權利要求1或2或3所述的一種抑制人PCNA基因表達的siRNA序列，其特征在于，所述正義鏈和反義鏈均以UU或dTdT為懸垂修飾。
5.權利要求1或2或3所述的任一條或一條以上的siRNA序列在制備抗腫瘤藥物的應用。
全文摘要
本發明屬于分子生物學與生物醫藥領域，公開了一種高效抑制PCNA基因表達的siRNA序列及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。應用PCNA siRNA可以更高效、特異、方便的抑制靶基因的表達，本發明篩選出能高效抑制PCNA基因表達的siRNA序列，并作用于腫瘤細胞，檢測微量PCNA siRNA抑制PCNA表達后腫瘤細胞在增殖、細胞周期及凋亡方面的變化，為PCNA siRNA應用于惡性腫瘤的臨床治療奠定重要基礎。
文檔編號A61P35/00GK1793360SQ200510100978
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月10日 優先權日2005年11月10日
發明者史金桃, 蔣建偉, 曾慧蘭, 曹明溶 申請人:暨南大學