專利名稱：一種載順鉑磁性納米球及其制備方法
技術領域：
本發明涉及納米技術領域，具體涉及一種載順鉑納米球及其制備方法。
背景技術：
順鉑(Cis-dichlorodiamine platinum)是臨床上最為常用的細胞周期非特異性高效抗腫瘤藥物，可用于治療卵巢癌、睪丸癌、膀胱癌、胃腸道腫瘤，尤其是頭頸部腫瘤，其抗癌機制主要是通過DNA之間或DNA同蛋白質之間形成交聯物從而抑制DNA的復制。然而，以順鉑為主的化療還存在很多問題①順鉑分子量低，在血液循環中轉運過快，不能很好的發揮抗癌作用；②靜脈給藥，全身化療，毒副作用大；③長期化療后，易導致機體耐藥。為了提高腫瘤組織中的藥物濃度、減少藥物對正常組織的損害，提高治療效果，已進行很多有關藥物載體和靶向化療的研究。目前研究較多的有脂質體、聚合物、多糖等，這些載體可控制藥物的釋放，但不具備靶向性。
發明內容
本發明的目的在于克服已有順鉑藥物治療中存在的缺點，提供一種載順鉑磁性納米球。
本發明的另一個目的是提供上述載順鉑磁性納米球的制備方法。
本發明的載順鉑磁性納米球，主要由納米四氧化三鐵顆粒、羧基多糖和順鉑組成，納米四氧化三鐵顆粒表面吸附羧基多糖，羧基多糖中的自由羧基與順鉑以配位鍵結合，納米四氧化三鐵顆粒∶羧基多糖∶順鉑的質量比＝1∶3～7∶0.1～1。納米四氧化三鐵顆粒的平均直徑在6～10納米左右。所采用的羧基多糖為海藻酸或海藻酸的堿金屬鹽中的一種，也可以為羧甲基葡聚糖。一般羧基多糖的重均分子量在0.5～5萬之間，最佳在0.8～1.5萬之間。如果羧基多糖的重均分子量太小，羧基多糖在納米四氧化三鐵顆粒表面的吸附量小，形成的位阻作用較小，不利于納米顆粒的穩定；如果羧基多糖的重均分子量太大，則容易通過搭橋作用使改性顆粒聚沉。
本發明是在羧基多糖存在下采用化學共沉淀法制備羧基多糖改性納米四氧化三鐵顆粒，然后通過羧基多糖中自由羧基與鉑原子的配位作用實現順鉑與納米磁性顆粒的耦聯，得到載順鉑磁性納米球。化學共沉淀法制備四氧化三鐵的化學反應式為
或順鉑與多糖鏈中自由羧基的化學反應式為 本發明的載順鉑磁性納米球的制備方法如下所示①羧基多糖存在下合成納米四氧化三鐵顆粒將Fe2+、Fe3+按摩爾比為1.0～1.4∶2配制成混合溶液；然后加入氨水和羧基多糖的混合液，氨水∶Fe3+的摩爾比為12～40∶1，羧基多糖對所合成的四氧化三鐵的質量比為2～5∶1；在攪拌下反應40～60分鐘，攪拌速度控制在800～1000轉/分，反應溫度控制在85～95℃之間，得到含有不穩定大顆粒的水基四氧化三鐵磁性液體。
②離心分離去除不穩定的大顆粒用離心機將所制得的水基四氧化三鐵磁性液體作離心處理，去除沉淀的大顆粒，收集上層清液，即為穩定的水基磁性液體。
③超濾去除水基磁性液體中游離的羧基多糖和其他電解質采用超濾裝置對水基磁性液體進行反復洗滌超濾，直到濾出洗滌液的電導率下降至1000us/cm以下，得到羧基多糖改性納米四氧化三鐵顆粒磁性液體。
④羧基多糖改性納米四氧化三鐵顆粒與順鉑的耦聯將順鉑與羧基多糖改性納米四氧化三鐵顆粒水基磁性液體混合(其中羧基多糖改性納米四氧化三鐵顆粒∶順鉑的質量比為3～30∶1)，在25～45℃條件下反應24～48小時，最后將反應液在蒸餾水中透析去除游離的順鉑，得到載順鉑磁性納米球。
步驟①所述的氨水用量，即氨水∶三氯化鐵兩者的摩爾比應控制在12～40∶1，以保證反應體系的pH值穩定在8～9.5之間，保證四氧化三鐵晶核的形成。
上述制備方法步驟④中水基磁性液體的含鐵濃度在2～15mg/ml之間，磁性液體的濃度太低，不利于耦聯反應的進行，如果濃度太高，納米顆粒容易聚集析出或形成凝膠。羧基多糖改性納米四氧化三鐵顆粒和順鉑的反應質量配比為3～30∶1，如果反應配比太大，單位顆粒的載藥量將過小，如果反應配比太小，載藥顆粒穩定性較差。反應溫度在25～45℃之間，反應溫度低，則反應速率低，所需的反應時間就較長，而反應溫度過高，耦聯反應的程度會降低，最優選的反應溫度為37℃。
載順鉑磁性納米球不僅具有緩釋作用，還可以通過在腫瘤組織附近設置一定強度的磁場來實現磁靶向給藥；此外，腫瘤細胞攝取磁性顆粒后，由于磁粒不透放射線，可明顯增強放療效果；并可通過施加交變磁場，使進入癌細胞內的磁性納米球發生相應的取向運動而產熱，進一步增強順鉑的細胞毒性作用。
本發明同已有技術相比，具有如下有益效果1、本發明所制備的載順鉑磁性納米球的摩爾顆粒載藥量達到1000摩爾，順鉑的可逆連接釋放度(指順鉑的可逆釋放量對順鉑反應總量的百分比)達到65％。
2、本發明所制備的載順鉑磁性納米球平均水動力直徑小于100nm，容易被癌細胞攝取；3、本發明所制備的載順鉑磁性納米球的飽和磁化強度可達到約3kA/m。
4、本發明所制備的載順鉑磁性納米球的表面電位在-30mV至-50mV之間，在血清中可保持穩定分散。
5、體外細胞毒性實驗表明，本發明所制備的載順鉑磁性納米球對人鼻咽癌CNE2細胞的半數殺傷率(LD50)為2.3-2.4μg/ml，比順鉑的半數殺傷率(1.44μg/ml)低1.60倍，但均＜5μg/ml，而且在藥物濃度達到9.45μg/ml時，殺傷率近80％，藥效顯著。
以上數據的測定方法是載順鉑磁性納米球的載藥量和順鉑可逆連接釋放度采用鄰苯二胺比色法進行測定，水動力學直徑采用光子相關光譜進行測定，載順鉑磁性納米球的飽和磁化強度采用振動樣品磁強計測定，表面電位測定在馬爾文3000HSA Zetasizer儀上進行，對人鼻咽癌CNE2細胞的半數殺傷率采用噻唑籃還原(MTT)法測定。
圖1為本發明的載順鉑磁性納米球的結構示意圖；圖2為本發明方法制得的載順鉑磁性納米球的透射電鏡照片；圖3為本發明方法制得的順鉑磁性納米球被鼻咽癌細胞攝取的透射電鏡照片。
具體實施例方式
實施例1①取9.6g FeCl3.6H2O，配成質量濃度為60％的FeCl3溶液，稱量5g FeSO4.7H2O，配成質量濃度為20％的FeSO4溶液，將兩種溶液混合配成鐵鹽混合溶液(硫酸亞鐵∶三氯化鐵兩者的摩爾比＝1∶2)。將20g重均分子量為2萬的海藻酸鈉溶解在100ml濃度為25Wt％的濃氨水中配成海藻酸鈉氨水混合溶液(氨水∶三氯化鐵的摩爾比為40∶1，海藻酸鈉對四氧化三鐵的質量比為5∶1)。將鐵鹽混合溶液和海藻酸鈉氨水混合溶液在800轉/分的攪拌下混合，然后攪拌下反應50分鐘，反應溫度穩定在90℃。②反應結束后，用離心機將所制得的水基四氧化三鐵磁性液體作離心處理，去除沉淀的大顆粒，保證納米四氧化三鐵顆粒大小均勻并穩定分散在水中，收集上層清液，得到穩定的水基四氧化三鐵磁性液體。③采用超濾裝置對水基磁性液體進行反復洗滌超濾，直到濾出洗滌液的電導率下降至1000us/cm以下，得到海藻酸鈉改性納米四氧化三鐵顆粒磁性液體(海藻酸鈉對納米四氧化三鐵顆粒的質量比約為5∶1)。④取2ml含鐵量為5mg/ml的海藻酸鈉改性納米四氧化三鐵磁性液體(約含60mg的海藻酸鈉改性納米四氧化三鐵顆粒)與10mg順鉑在37℃條件下反應24小時，然后將反應液在蒸餾水中透析去除游離的順鉑，得到在水中穩定分散的載順鉑磁性納米球，順鉑的可逆連接釋放量約為6.5mg，其中納米四氧化三鐵顆粒∶羧基多糖∶順鉑的質量比＝1∶5∶0.65，摩爾顆粒載藥量達到850摩爾左右，載順鉑磁性納米球的結構如圖1所示，透射電鏡照片如圖2所示。載順鉑磁性納米球平均水動力直徑小于100nm，容易被癌細胞攝取鼻咽癌細胞攝取，其被鼻咽癌細胞攝取的透射電鏡照片如圖3所示。載順鉑磁性納米球的飽和磁化強度達到3kA/m。載順鉑磁性納米球表面電位約為-42mV，在血清中可保持穩定分散。體外細胞毒性實驗表明，所制備的載順鉑磁性納米球對人鼻咽癌CNE2細胞的半數殺傷率(LD50)為2.37μg/ml。
實施例2①取9.6 g FeCl3.6H2O，配成質量濃度為30％的FeCl3溶液，稱量6g FeSO4.7H2O，配成質量濃度為15％的FeSO4溶液，將兩種溶液混合配成鐵鹽混合溶液(硫酸亞鐵∶三氯化鐵兩者的摩爾比＝1.2∶2)。將16g重均分子量為2萬的海藻酸鉀溶解在80 ml濃度為25Wt％的濃氨水中配成海藻酸鉀氨水混合溶液(氨水∶三氯化鐵的摩爾比為32∶1，海藻酸鉀對四氧化三鐵的質量比為4∶1)。將鐵鹽混合溶液和海藻酸鉀氨水混合溶液在800轉/分的攪拌下混合，然后攪拌下反應50分鐘，反應溫度穩定在90℃。步驟②和步驟③同實施例1，得到海藻酸鉀改性納米四氧化三鐵顆粒(海藻酸鉀對納米四氧化三鐵顆粒的質量比為5∶1)。④取2ml含鐵量為2.5mg/ml的海藻酸鉀改性納米四氧化三鐵磁性液體(約含30mg的海藻酸鉀改性納米四氧化三鐵顆粒)與10mg順鉑在37℃條件下反應24小時，得到在水中部分穩定分散的載順鉑磁性納米球，順鉑的可逆連接釋放量約為4.5mg，其中納米四氧化三鐵顆粒∶羧基多糖∶順鉑的質量比＝1∶5∶0.9，摩爾顆粒載藥量達到1000摩爾左右。
實施例3①取9.6 g FeCl3.6H2O，配成質量濃度為45％的FeCl3溶液，稱量7 g FeSO4.7H2O，配成質量濃度為20％的FeSO4溶液，將兩種溶液混合配成鐵鹽混合溶液(硫酸亞鐵∶三氯化鐵兩者的摩爾比＝1.4∶2)。將16g重均分子量為2萬的海藻酸溶解在100 ml濃度為25Wt％的濃氨水中配成海藻酸氨水混合溶液(氨水∶三氯化鐵的摩爾比為40∶1，海藻酸對四氧化三鐵的質量比為4∶1)。將鐵鹽混合溶液和海藻酸氨水混合溶液在800轉/分的攪拌下混合，然后攪拌下反應50分鐘，反應溫度穩定在90℃。步驟②和步驟③同實施例1，得到海藻酸改性納米四氧化三鐵顆粒(海藻酸對納米四氧化三鐵顆粒的質量比約為5∶1)。④取3ml含鐵量為10mg/ml的海藻酸改性納米四氧化三鐵磁性液體(約含180mg的海藻酸改性納米四氧化三鐵顆粒)與10mg順鉑在37℃條件下反應24小時，得到在水中穩定分散的載順鉑磁性納米球，順鉑的可逆連接釋放量約為6.8mg，其中納米四氧化三鐵顆粒∶羧基多糖∶順鉑的質量比＝1∶5∶0.23，摩爾顆粒載藥量達到300摩爾左右。
實施例4①取9.6g FeCl3.6H2O，配成質量濃度為60％的FeCl3溶液，稱量6g FeSO4.7H2O，配成質量濃度為20％的FeSO4溶液，將兩種溶液混合配成鐵鹽混合溶液(硫酸亞鐵∶三氯化鐵兩者的摩爾比＝1.2∶2)。將16g重均分子量為0.8萬的海藻酸溶解在100ml濃度為25Wt％的濃氨水中配成海藻酸氨水混合溶液(氨水∶三氯化鐵的摩爾比為40∶1，海藻酸對四氧化三鐵的質量比為4∶1)。將鐵鹽混合溶液和海藻酸氨水混合溶液在800轉/分的攪拌下混合，然后攪拌下反應50分鐘，反應溫度穩定在90℃。步驟②和步驟③同實施例1，得到海藻酸改性納米四氧化三鐵顆粒(海藻酸對納米四氧化三鐵顆粒的質量比約為3∶1)。④取3ml含鐵量為10mg/ml的海藻酸改性納米四氧化三鐵磁性液體(約含120mg的海藻酸改性納米四氧化三鐵顆粒)與10mg順鉑在37℃條件下反應24小時，得到在水中穩定分散的載順鉑磁性納米球，順鉑的可逆連接釋放量約為6.8mg，其中納米四氧化三鐵顆粒∶羧基多糖∶順鉑的質量比＝1∶3∶0.23，摩爾顆粒載藥量達到300摩爾左右。
實施例5①取9.6 g FeCl3.6H2O，配成質量濃度為60％的FeCl3溶液，稱量6g FeSO4.7H2O，配成質量濃度為20％的FeSO4溶液，將兩種溶液混合配成鐵鹽混合溶液(硫酸亞鐵∶三氯化鐵兩者的摩爾比＝1.2∶2)。將16g平均分子量為4萬的海藻酸鈉溶解在100ml濃度為25Wt％的濃氨水中配成海藻酸鈉氨水混合溶液(氨水∶三氯化鐵的摩爾比為40∶1，海藻酸鈉對四氧化三鐵的質量比為4∶1)。將鐵鹽混合溶液和海藻酸鈉氨水混合溶液在800轉/分的攪拌下混合，然后攪拌下反應50分鐘，反應溫度穩定在90℃。步驟②和步驟③同實施例1，得到海藻酸鈉改性納米四氧化三鐵顆粒(海藻酸鈉對納米四氧化三鐵顆粒的質量比約為7∶1)。④取3ml含鐵量為10mg/ml的海藻酸改性納米四氧化三鐵磁性液體(約含240mg的海藻酸改性納米四氧化三鐵顆粒)與10mg順鉑在37℃條件下反應24小時，得到在水中穩定分散的載順鉑磁性納米球，順鉑的可逆連接釋放量約為6.8mg，其中納米四氧化三鐵顆粒∶羧基多糖∶順鉑的質量比＝1∶7∶0.23，摩爾顆粒載藥量達到300摩爾左右。
實施例6①取9.6 g FeCl3.6H2O，配成質量濃度為60％的FeCl3溶液，稱量4.6g FeCl2.4H2O，配成質量濃度為20％的FeCl2.4H2O溶液，將兩種溶液混合配成鐵鹽混合溶液(氯化亞鐵∶三氯化鐵兩者的摩爾比＝1.2∶2)。將8g平均分子量為2萬的羧甲基葡聚糖溶解在60ml濃度為25Wt％的濃氨水中配成羧甲基葡聚糖氨水混合溶液(氨水∶三氯化鐵的摩爾比為24∶1，羧甲基葡聚糖對四氧化三鐵的質量比為4∶1)。將鐵鹽混合溶液和羧甲基葡聚糖氨水混合溶液在800轉/分的攪拌下混合，然后攪拌下反應40分鐘，反應溫度穩定在90℃；步驟②和步驟③同實施例1，得到羧甲基葡聚糖改性納米四氧化三鐵顆粒(羧甲基葡聚糖對納米四氧化三鐵顆粒的質量比約為3∶1)。④取2ml含鐵量為10mg/ml的羧甲基葡聚糖改性納米四氧化三鐵磁性液體(約含80mg羧甲基葡聚糖改性納米四氧化三鐵顆粒)與10mg順鉑在37℃條件下反應24小時，得到在水中穩定分散的載順鉑磁性納米球，順鉑的可逆連接釋放量約為6.9mg，其中納米四氧化三鐵顆粒∶羧基多糖∶順鉑的質量比＝1∶3∶0.34。
實施例7①取9.6 g FeCl3.6H2O，配成質量濃度為60％的FeCl3溶液，稱量4.6g FeCl2.4H2O，配成質量濃度為20％的FeCl2.4H2O溶液，將兩種溶液混合配成鐵鹽混合溶液(氯化亞鐵∶三氯化鐵兩者的摩爾比＝1.2∶2)。將16g平均分子量為2萬的羧甲基葡聚糖溶解在80ml濃度為25Wt％的濃氨水中配成羧甲基葡聚糖氨水混合溶液(氨水∶三氯化鐵的摩爾比為32∶1，羧甲基葡聚糖對四氧化三鐵的質量比為4∶1)。將鐵鹽混合溶液和羧甲基葡聚糖氨水混合溶液在800轉/分的攪拌下混合，然后攪拌下反應40分鐘，反應溫度穩定在90℃。步驟②和③同實施例1，得到羧甲基葡聚糖改性納米四氧化三鐵顆粒(羧甲基葡聚糖對納米四氧化三鐵顆粒的質量比約為3∶1)。④取3ml含鐵量為10mg/ml的羧甲基葡聚糖改性納米四氧化三鐵磁性液體(約含120mg羧甲基葡聚糖改性納米四氧化三鐵顆粒)與10mg順鉑在45℃條件下反應24小時，得到在水中穩定分散的載順鉑磁性納米球，順鉑的可逆連接釋放量約為6.6mg，其中納米四氧化三鐵顆粒∶羧基多糖∶順鉑的質量比＝1∶3∶0.22。
實施例8步驟①②③同實施例3，得到海藻酸改性納米四氧化三鐵顆粒(海藻酸對納米四氧化三鐵顆粒的質量比約為5∶1)。④取2ml含鐵量為10mg/ml的海藻酸改性納米四氧化三鐵磁性液體(約含120mg的海藻酸改性納米四氧化三鐵顆粒)與10mg順鉑在25℃條件下反應48小時，得到在水中穩定分散的載順鉑磁性納米球，順鉑的可逆連接釋放量約為5.6mg，其中納米四氧化三鐵顆粒∶羧基多糖∶順鉑的質量比＝1∶3∶0.28。
權利要求
1.一種載順鉑磁性納米球，由納米四氧化三鐵顆粒、羧基多糖和順鉑組成。
2.根據權利要求1所述的載順鉑磁性納米球，其特征在于納米四氧化三鐵顆粒∶羧基多糖∶順鉑的質量比＝1∶3～7∶0.1～1。
3.根據權利要求1或2所述的載順鉑磁性納米球，其特征在于所述羧基多糖為海藻酸或海藻酸的堿金屬鹽或羧甲基葡聚糖。
4.根據權利要求3所述的載順鉑磁性納米球，其特征在于所述羧基多糖的重均分子量在0.5萬～5萬之間。
5.根據權利要求4所述的載順鉑磁性納米球，其特征在于所述羧基多糖的重均分子量在0.8萬～1.5萬之間。
6.一種制備權利要求1所述的載順鉑磁性納米球的方法，其特征在于包括以下步驟①羧基多糖存在下合成納米四氧化三鐵顆粒將Fe2+、Fe3+按摩爾比為1.0～1.4∶2配制成混合溶液；然后加入氨水和羧基多糖的混合液，氨水∶Fe3+的摩爾比為12～40∶1，羧基多糖對所合成的四氧化三鐵的質量比為2～5∶1；在攪拌下反應40～60分鐘，攪拌速度控制在800～1000轉/分，反應溫度控制在85～95℃之間，得到含有不穩定大顆粒的水基四氧化三鐵磁性液體；②離心分離去除不穩定的大顆粒用離心機將所制得的水基四氧化三鐵磁性液體作離心處理，去除沉淀的大顆粒，收集上層清液，即為穩定的水基磁性液體；③超濾去除水基磁性液體中游離的羧基多糖和其他電解質采用超濾裝置對水基磁性液體進行反復洗滌超濾，直到濾出洗滌液的電導率下降至1000us/cm以下，得到羧基多糖改性納米四氧化三鐵顆粒磁性液體；④羧基多糖改性納米四氧化三鐵顆粒與順鉑的耦聯將順鉑與羧基多糖改性納米四氧化三鐵顆粒水基磁性液體混合，羧基多糖改性納米四氧化三鐵顆粒∶順鉑的質量比為3～30∶1，在25～45℃條件下反應24～48小時，最后將反應液在蒸餾水中透析去除游離的順鉑，得到載順鉑磁性納米球。
7.根據權利要求6所述的載順鉑磁性納米球的制備方法，其特征在于步驟①的反應溫度為37℃。
8.根據權利要求7所述的載順鉑磁性納米球的制備方法，其特征在于所述水基磁性液體的含鐵濃度在2～15mg/ml之間。
全文摘要
本發明涉及一種載順鉑載藥納米球及其制備方法，目的在于克服已有技術存在的缺點，提供一種具有磁靶向性的載順鉑磁性納米球及其制備方法。本發明是在羧基多糖存在下采用化學共沉淀法制備羧基多糖改性納米四氧化三鐵顆粒，然后通過納米四氧化三鐵顆粒表面羧基多糖中自由羧基與鉑原子形成配位作用，實現順鉑與納米四氧化三鐵顆粒的耦聯，得到載順鉑磁性納米球。本發明所制備的載順鉑磁性納米球平均直徑小于100nm、磁響應性較強，可在血清中穩定分散，有望應用于緩釋給藥系統，并實現惡性腫瘤的磁靶向化療和磁性液體細胞內熱療。
文檔編號A61K31/282GK1785161SQ20051010027
公開日2006年6月14日 申請日期2005年10月14日 優先權日2005年10月14日
發明者謝民強, 徐雪青, 沈輝, 李仲漢, 陳帥君, 許家瑞 申請人:中山大學