關節炎用草藥制劑的制作方法

專利名稱：關節炎用草藥制劑的制作方法
技術領域：
本發明廣義上涉及膳食補充劑和治療混合物領域，狹義上涉及包括用于改善關節炎和減輕與關節炎有關的炎癥和疼痛的草藥提取物的制劑。
背景技術：
本公開引用的參考文獻不必然是現有技術。引用這些參考文獻也不必定代表承認這些參考文獻是現有技術。在本文中所有出版物、專利和專利申請的引用，皆可視為整份文件的引用。
關節炎是影響肌肉及骨骼系統，特別是關節的疾病。它不是一個單一的疾病，它實際上涵蓋了與關節受影響的100多種臨床癥狀。按照關節炎基金會的報道，僅在美國受到關節炎折磨的成年人和兒童分別超過七千萬和三十萬。
類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)是關節炎的一種，也是關節炎最常見的一種。RA在工業發達國家發病率為0.5～1.0％，它是一種慢性炎癥和破壞性關節疾病，通常會導致顯著的病殘和隨之而來的生活質量下降。RA在女性的發病率是男性的兩至三倍，在任何年齡段均可發生，40～60歲是發病高峰期。RA治療費用高昂，如果未予適當治療，會引起壽命的縮短。除了炎性過程引起的關節腫脹和疼痛之外，關節外的受累，包括從類風濕性皮下小結到對生命構成威協的結節性脈管炎，均是RA的特征，RA的最終標志是關節的破壞。
強直性脊柱炎(Ankylosis spondylitis，AS)是另一種常見的關節炎。AS是一種主要引起脊柱和骶髂的關節發炎的風濕性疾病，也能引起眼、肺和心瓣膜的炎癥。它表現出來的癥狀包括終身的間歇性背部疼痛，脊柱、外周關節和內臟器官的嚴重慢性疾病，隨著發病過程的進行逐漸引起嚴重的關節及背部僵硬、運動功能受損和畸形。在美國，10萬人口中約有129人患此病，多發于青少年和青壯年男子。AS的發病與種族有關，在美國原住民(Native Americans)中最常見。
在現有已授權的專利中，有幾篇報道了用于減輕由關節炎和其它類似病引起的疼痛和炎癥的局部用藥制劑。例如，US6274176(Tomer)教導了一種可食用的制劑，其組成包括小白菊、姜、姜黃、芫荽、積雪草、月見草、纈草、風鈴木、百里香和接骨木。
授權給侯氏的專利US6350476則教導了另一種制劑，其組成包括源于千金藤屬、薏苡屬、半夏屬、梅屬、黃檗屬、槐屬、通脫木屬、百部屬、甘草屬、雷公藤屬、連翹屬和豨薟屬的植物。令人感興趣地的是，專利US6350476是基于侯氏早期的另一個專利US5908628，在專利US5908628中，其組成除包括專利US6350476的所有植物外，還加入了滑石和蠶沙。但候氏隨后的研究發現滑石和蠶沙并不是必需的，在這個發現的基礎上形成了專利US6350476所保護的內容。
其它具有相似用途的發明均采用了許多草藥組分。任氏的中國專利第98125678.3號報道了一種可有效減輕疼痛和炎癥的軟膏，該軟膏含有27味草藥組分，即石斛、熟地黃、制附子、續斷、補骨脂、雷公藤、青風藤、桂枝、羌活、獨活、白芍、威靈仙、伸筋草、黃芪、防己、防風、蒼術、白術、細辛、地龍、雞血藤、赤芍、知母、地鱉蟲、烏藥、甘草和牛膝。
王氏的中國專利第99120466.2號報道了一種外用藥劑，它含有43種傳統中藥材，包括天麻、三七、杜仲、仙靈脾、土鱉蟲、川烏、草烏、全蝎、蜈蚣、何首烏、穿山甲、水蛭、乳香、沒藥、當歸、川芎、丹參、桃仁、赤芍、雞血藤、紅花、血竭、續斷、桑寄生、牡丹皮、姜黃、川牛膝、五加皮、烏梢蛇、象皮、血余炭、麻黃、細辛、防風、獨活、白芷、天南星、大黃、葛根、罌粟殼、冰片、芥子、鉛丹和麻油。
上述現有專利均是外用藥劑，這些藥物在治療關節炎中具有一定作用，但這些外用藥劑發揮藥效均需穿透過皮膚組織等后進入肌肉和關節才可實現，有一定的局限性。因此，本發明的目的之一就是針對此點開發一種能改善關節炎的草藥制劑。

發明內容
本發明一方面提供適于減輕與關節炎有關癥狀的口服制劑或者適于預防性改善關節炎的口服制劑。本制劑同時還提供由草藥中提取有效提取物的方法，該提取物可在上述口服制劑中使用。
本發明的制劑包括青藤屬(Sinomenium spp.)、烏頭(Aconitum carmichaeli Debx.)、芍藥(Paeonia lactiflora Pall.)、牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)和姜黃(Curcuma longa L.)的提取物。本制劑包括青風藤(Caulis Sinomenii)、制附子(Radix Aconitii Lateralis Preparata)、白芍(RadixPaeoniae Alba)、牡丹皮(Cortex Moutan)和姜黃(Rhizoma Curcumae Longae)的提取物。
本發明的制劑基本上由青風藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黃組成。
本發明的制劑由青風藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黃組成。
在優選的實施方案中，這種制劑包括以下重量比的植物原料青風藤2-10份，制附子1-6份，白芍3-15份，牡丹皮1-8份和姜黃1-8份，或者在比例下各種植物相當量的新鮮植物原料。
在本發明的一項實踐中，本發明的制劑包括大約以下重量比的植物原料青風藤5份，制附子3份，白芍6份，牡丹皮3份和姜黃3份。
在另一實踐中，本發明的制劑包括大約以下重量比的植物原料青風藤4份，制附子3份，白芍5份，牡丹皮3份和姜黃2份。
另一方面，本發明教導減小草藥青風藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黃的尺寸，并以適當的溶劑進行提取，隨后進行濃縮并制備成適用于口服制劑的提取物的方法。
本發明優選的第一實施方案是減小步驟優選通過粉碎草藥完成。提取步驟包括以乙醇回流提取青風藤、制附子和白芍制備提取物1；以超臨界二氧化碳萃取牡丹皮制備提取物2；以乙醇提取牡丹皮超臨界二氧化碳萃取后的殘渣以制備提取物3；以超臨界二氧化碳萃取姜黃以制備提取物4；然后以乙醇提取姜黃超臨界二氧化碳萃取的殘渣以制備提取物5。本發明的提取物通過混合提取物1、2、3、4和5形成。
在本發明中，這些提取方法的任何一種均可后繼以純化工藝以純化各提取物并獲得純化的提取物，首選的純化工藝是聚合吸附樹脂(大孔吸附樹脂)。
本發明優選的另一實施方案是減小草藥青風藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黃的尺寸；獲得青風藤的水提取物，制附子和白芍的乙醇提取物，牡丹皮的超臨界流體萃取物，牡丹皮的乙醇提取物，姜黃的超臨界流體提取物，姜黃的乙醇提取物作為提取物；接著這些提取物與適當賦形劑混合，填充膠囊，以獲得便于口服給藥的制劑。
又一方面，本發明提供包括從青風藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黃提取的幾種主要活性成分的組合物。這幾種主要活性成分是青藤堿、芍藥苷、丹皮酚和姜黃素。該組合物還進一步包括去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素。
另一方面，本發明還提供一種治療哺乳動物關節炎的方法，包括經口給予治療有效量的組合物，這些組合物由以上方案給出或者通過以上教導的方法獲得。
本發明還教導以上給出的組合物在適于治療哺乳動物關節炎的藥劑中的用途。
因此，本發明進一步還涉及藥劑或健康補充劑，在關節炎和關節炎癥狀(例如歸因于類風濕性關節炎和關節強硬性脊椎柱炎的癥狀)的治療中，它可以經口或全身應用至整個身體以在更深的組織內發揮其作用。
本發明還提供通過色譜分析控制本發明的產品質量的方法和標準。


圖1A和1B分別表示青藤堿對照品和混合物Dp內青藤堿的HPLC色譜圖。
圖2A和2B分別表示芍藥苷對照品和混合物Dp內芍藥苷的HPLC色譜圖。
圖3A和3B分別表示姜黃素對照品和混合物Dp內姜黃素的HPLC色譜圖。
圖4分別表示青藤堿對照品和組合物內青藤堿的TLC色譜圖。
圖5分別表示芍藥苷對照品和組合物內芍藥苷的TLC色譜圖。
圖6分別表示次烏頭堿對照品和組合物內次烏頭堿的TLC色譜圖。
圖7分別表示丹皮酚(paenonol)對照品和組合物內丹皮酚的TLC色譜圖。
圖8分別表示姜黃素對照品和組合物內姜黃素的TLC色譜圖。
圖9A表示制備的不含制附子的組合物的HPLC色譜圖，而圖9B和9C分別表示烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿對照品和組合物內烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿的HPLC色譜圖。
圖10A表示制備的不含青風藤的組合物的HPLC色譜圖，而圖10B和10C分別表示青藤堿對照品和組合物內青藤堿的HPLC色譜圖。
圖11A表示制備的不含白芍的組合物的HPLC色譜圖，而圖11B和11C分別表示芍藥苷對照品和組合物內芍藥苷的HPLC色譜圖。
圖12A表示制備的不含牡丹皮的組合物的HPLC色譜圖，而圖12B和12C分別表示丹皮酚對照品和組合物內丹皮酚的HPLC色譜圖。
圖13A表示制備的不含姜黃的組合物的HPLC色譜圖，而圖13B和13C分別表示姜黃素對照品和組合物內姜黃素的HPLC色譜圖。
圖14A、14B和14C分別表示在佐劑誘導的關節炎中混合物Dp在參數足體積、關節炎指數和體重方面的抗關節炎作用。
圖15A、15B和15C分別表示在佐劑誘導的關節炎中，由包囊工藝得到的膠囊在參數腳足體積、關節炎指數和體重方面的抗關節炎作用。
圖16A、16B和16C分別表示在II型膠原誘導的關節炎中，由包囊工藝得到的膠囊在參數腳足體積、關節炎指數和體重方面的抗關節炎作用。
圖17表示由包囊工藝得到的膠囊長期給藥對正常SD大鼠體重的影響。
具體實施例方式
如本說明書和權利要求所使用的，術語“包括(comprise)”、“包括comprises”、“包括comprising”意指“包括，但不必需限于”。例如，一種包含A、B和C的方法、裝置、分子或其它項目，可準確地說包括A和B。同樣，一種“包括A和B”的方法、裝置、分子或其它項目，也可包括任何數目的額外步驟、組分、原子或其它項目等。術語“基本上組成”意指術語“包括”更窄的觀點，其中額外步驟、組分、原子或其它項目受更多限制，例如，至多一些額外的這樣的步驟或項目。術語“組成”意指包含A、B和C的方法、裝置、分子或其它項目僅限于A、B和C。
同樣，除非另外說明，本文使用的所有技術和科學術語具有和本發明所屬的領域普通技術人員通常理解相同的含義。
全面描述按照中華人民共和國藥典(2000年版一部)的標準和要求鑒別本發明的實驗制劑和研究中使用的所有草藥組分。對規定的形態學、顯微鏡檢查、以及化學分析等指標進行檢驗。本文使用的植物學和草藥命名和中華人民共和國藥典(2000年版一部)中使用的相同，并且應當按照此出版物解釋。在本文中，術語“植物原料”或“草藥原料”指本發明使用的草藥和草藥的各種部位或組織。可交換地使用這些術語。
1本發明的制劑的組分1.1組分在以下如何制備按照本發明的制劑的說明中，植物原料是組分1得自草藥青藤屬(Sinomenium spp.)的草藥青風藤(Sinomenium acutum(Thunb.)Rehd.et Wils.)或者草藥毛青藤(Sinomenium acutum(Thunb.)Rehd.et Wils.var.cinereum Rehd.etWils.)。
組分2是草藥烏頭(Aconitum carmichaeli Debx.)。
組分3是草藥芍藥(Paeonia lactiflora Pall.)。
組分4是草藥牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)。
組分5是草藥姜黃(Curcuma longa L.)。
特別地，植物原料是組分1是青風藤或者草藥青風藤或草藥毛青藤的主干。
組分2是制附子，草藥烏頭的側根。
組分3是白芍，草藥芍藥的根。
組分4是牡丹皮，牡丹草藥牡丹的莖皮。
組分5是姜黃，草藥姜黃的根莖。
所述青風藤、制附子、白芍、牡丹皮、姜黃的定義如下青風藤(Caulis Sinomenii)青風藤是草藥青風藤或草藥毛青藤的干燥藤莖，在全國均有栽培。制附子(Radix Aconiti Lateralis Preparata)制附子是草藥烏頭側根的炮制品。烏頭屬的植物產生各種C19非二萜類和C20二萜類化合物。這些化合物中，某些8-乙酰基-14-芳酰基二酯C19生物堿，如烏頭堿是極毒的。這種生物堿組分和它們的濃度會隨種類、采集的地點時間和炮制的方法變化而變化。盡管它們有毒，但由于它們的藥學價值，烏頭根仍然是一種重要的中藥。但為了用藥安全，烏頭的根或側根在干燥以便貯藏之前，均需通過在水中煮幾個小時進行炮制以減毒。白芍(Radix Paeoniae Alba)白芍(白牡丹根；Baishao)，芍藥的去皮干燥根，是中國傳統滋補藥材之一。它還被用作解痙和疼痛緩解劑，并且長期被用于調節月經，治療月經失調以及減輕腹部痙攣疼能和肌肉強直。
牡丹皮(Cortex Moutan)牡丹皮，芍藥科牡丹草藥牡丹莖和根的皮。干品稱為牡丹皮(Moutan bark、tree peony bark、Mudanpi)。通常在秋季采集，除去多纖維的部分后再干燥。
姜黃(Rizhoma Curcumae Longae)姜黃是一種重要的中藥制劑原料和染料，它含豐富的酚類化合物，即姜黃素類成分。姜黃素[1，7-雙(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1，6-庚二烯-3，5，-二酮]，是一種常用的天然黃色顏料，廣泛用于食品染色，如酸菜和小吃。
1.2組分的比例本發明教導一種制劑，以干重計包括以下比例的植物原料青風藤2-10份；制附子1-6份；白芍3-15份；牡丹皮1-8份；和姜黃1-8份。
2材料和方法2.1草藥青風藤，安徽省的野生產品，購自廣東中粵藥材聯合公司。
制附子，成都市江油縣中藥材生產質量管理規范(GAP)基地的產品，姜黃，成都市雙流縣姜黃GAP基地的產品，均購自四川省成都市藥材市場。白芍，安徽省亳州市白芍GAP基地的產品，牡丹皮，安徽省銅陵市牡丹皮GAP基地的產品，均購自安徽省亳州藥材市場。
由于中藥材通常多是經過干燥后再出售。因此，本發明中所給出的重量為各藥材的干重量。
2.2設備采用RT-80粉碎機(CERT-04，FARGO，臺灣，中國)、中藥多功能提取罐(DT-3m3，中國溫州)、減壓回收罐(ZWN-1000，中國天津)和超臨界二氧化碳萃取器裝置(HA421-40-96，中國南通)制備各種草藥提取物。采用體積測量儀(plethymometer)(UGO Basile，意大利)和IITC 336p甩尾痛覺測試計(IITC Inc，Woodland Hills，美國加利福尼亞)以評價各種草藥提取物的抗炎和鎮活性。
2.3提取方法2.3.1一般提取方法一般提取方法包括減小草藥原料的尺寸，接著以適當的溶劑回流提取。尺寸上的減小可通過粉碎這些原料達到。
然后通過減壓蒸發以濃縮或干燥提取物。為了獲得藥效最佳的提取物的制備方法，本發明對水、乙醇和超臨界二氧化碳提取方法進行了組合。在制備過程中的任何一點、任何步驟的中間產物均可采用濃縮、澄清或純化步驟。其后，部分提取物做了進一步純化和試驗，以便改善其藥效。以下介紹已經嘗試過的方法。
2.3.2具體提取方法方法A-制備混合物A將青風藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黃粉碎成粗粉。青風藤、制附子和白芍加水(草藥的6倍量，w/w)回流提取3次，每次1小時。水提取液經混合、過濾，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至100％(w/v)濃度，得提取物A1。牡丹皮和姜黃采用超臨界流體萃取(SFE)技術以超臨界二氧化碳(21.7L/h)萃取，分別得提取物A2和A3。將提取物A1、A2和A3混合均勻得混合物A。
方法B-制備混合物B將青風藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黃粉碎成粗粉。青風藤、制附子和白芍加80％乙醇(草藥的4倍量，w/w)回流提取3次，每次1小時。乙醇提取液經混合、過濾，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至100％(w/v)濃度，得提取物B1。牡丹皮和姜黃采用SFE以超臨界二氧化碳(21.7L/h)萃取，分別得提取物B2和B3。將提取物B1、B2和B3混合均勻得混合物B。
方法C-制備混合物C將青風藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黃粉碎成粗粉。青風藤、制附子和白芍加水(草藥的6倍量，w/w)回流提取3次，每次1小時。水提取液經混合、過濾，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至100％(w/v)濃度，得提取物C1。牡丹皮采用SFE以超臨界二氧化碳(21.7L/h)萃取得提取物C2，牡丹皮在SFE之后的殘渣以80％乙醇(草藥的4倍量，w/w)回流提取3次，每次1小時。乙醇提取液經混合、過濾，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至100％(w/v)濃度，得提取物C3。姜黃采用SFE以超臨界二氧化碳(21.7L/h)萃取得提取物C4，姜黃在SFE之后的殘渣以80％乙醇(草藥的4倍量，w/w)回流提取3次，每次1小時。乙醇提取液經混合、過濾，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至100％(w/v)濃度，得提取物C5。將提取物C1、C2、C3、C4和C5混合均勻得混合物C。
方法D-制備混合物D將青風藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黃粉碎成粗粉。青風藤、制附子和白芍加80％乙醇(草藥的4倍量，w/w)回流提取3次，每次1小時。乙醇提取液經混合、過濾，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至100％(w/v)濃度，得提取物D1。牡丹皮采用SFE以超臨界二氧化碳(21.7L/h)萃取得提取物D2，牡丹皮在SFE之后的殘渣以80％乙醇(草藥的4倍量，w/w)回流提取3次，每次1小時。乙醇提取液經混合、過濾，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至100％(w/v)濃度，得提取物D3。姜黃采用SFE以超臨界二氧化碳(21.7L/h)萃取得提取物D4，姜黃在SFE之后的殘渣以80％乙醇(草藥的4倍量，w/w)回流提取3次，每次1小時。乙醇提取液經混合、過濾，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至100％(w/v)濃度，得提取物D5。將D1、D2、D3、D4和D5混合均勻得混合物D。
方法E-制備混合物E將青風藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黃粉碎成粗粉。青風藤以0.1％鹽酸溶液(pH2.0，草藥的6倍量，w/w)浸泡提取(室溫)3次，每次12小時。鹽酸提取液經混合、過濾，以1％氫氧化鈉溶液調節至pH6.0，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至100％(w/v)濃度，得提取物E1。牡丹皮和姜黃采用SFE以超臨界二氧化碳(21.7L/h)萃取分別得提取物E2和E3。制附子、白芍和牡丹皮在SFE之后的殘渣加80％乙醇(草藥的4倍量，w/w)回流提取3次，每次1小時。乙醇提取液經混合、過濾，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至100％(w/v)濃度，得提取物E4。姜黃在SFE之后的殘渣以10％氫氧化鈉溶液(pH10.0，草藥的6倍量，w/w)浸泡提取3次，每次1小時。提取液經混合、過濾，以1％鹽酸溶液調節至pH4.0，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至100％(w/v)濃度，得提取物E5。將E1、E2、E3、E4和E5混合均勻得混合物E。
方法F-制備混合物F將青風藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黃粉碎成粗粉，加水(草藥的6倍量，w/w)回流提取3次，每次1小時，水提取液經混合、過濾，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至100％(w/v)濃度，得提取物F，為五種草藥的水提取物。
方法G-制備混合物G將青風藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黃粉碎成粗粉，加80％乙醇(草藥的4倍量，w/w)回流提取3次，每次1小時，乙醇提取液經混合、過濾，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至100％(w/v)濃度，得提取物G，為五種草藥的乙醇提取物。
2.3.3純化方法上述各種可行方法中任何一種的制劑提取物可進一步純化。一種增加期望的純度的方法是使提取物經受一種或多種分離技術，通過減少不需要的組分，從而增加提取物中所需組分的相對豐度。
一項優選的分離技術是使用聚合吸附樹脂，它在一定條件下優先結合想要保留的組分但不結合不需要保留的組分。其后，改變這些條件(例如pH、洗脫劑極性)以釋放結合組分。
2.3.4包囊方法以下這些常規步驟教導本發明的提取物如何包裝成適于口服給藥的膠囊。首先將提取物制成干粉，接著用于填充膠囊殼。另一方法是在填充膠囊殼之前，將提取物和適當的賦形劑混勻。
2.3.5第一實施例本發明的第一實施例采用方法D得到提取物，接著通過純化方法實施例以說明如何實施本發明。
第一實踐的配方包括以下重量比的草藥青風藤5份，制附子3份，白芍6份，牡丹皮3份和姜黃3份。
以下步驟用于第一實踐的配方比例提取物的制備。
五種干燥草藥分別粉碎成粗粉。青風藤62.5g，制附子37.5g，和白芍75g粉碎并加上80％乙醇1250ml回流提取3次，每次1小時。乙醇提取液經混合和過濾，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至100％(w/v)濃度，得提取物1約175ml(即，在175ml最終體積的提取物1中提取總計175g的草藥)。
牡丹皮37.5g采用SFE以超臨界二氧化碳(21.7L/h)萃取得提取物2約0.8g。SFE之后的殘渣以80％乙醇187.5ml回流提取3次，每次1小時。乙醇提取液經混合、過濾，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至100％(w/v)濃度，得提取物提取物3約37.5ml。
姜黃37.5g采用SFE以超臨界二氧化碳(21.7L/h)萃取得提取物4約2.8ml。SFE之后的殘渣以80％乙醇187.5ml回流提取3次，每次1小時。乙醇提取液經混合、過濾，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至100％(w/v)濃度，得提取物5約37.5ml。
將提取物1、3和5混合，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至近干燥，殘渣溶于40ml的80％乙醇，將該乙醇溶液在Amberlite XAD-7HP聚合樹脂(Rohm和Haas公司，USA.)柱(100×5cm，樹脂高度65cm)上樣。該柱事先已采用蒸餾水5000ml、95％乙醇2000ml和蒸餾水2000ml順次沖洗預處理。上樣后以5％乙醇1900ml、40％乙醇3000ml和80％乙醇3000ml順次洗脫。收集40％乙醇和80％乙醇的洗出液，混合，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至500ml體積，隨后進一步凍干得到純化提取物13.1g。將純化部分提取物(13.1g)、提取物2(0.9g)和提取物4(2.67ml)混勻得混合物約16.1g。由于該混合物是通過對方法D得到的提取物進行純化后得到，因而這種混合物稱為混合物Dp，這個名稱在說明書的其它章節含義相同。
2.3.6第二實施例本發明的第二實施例說明制劑如何進一步加工成適于口服給藥形式的實例，這個過程是說明如何在述提取步驟后，加入適當的賦形劑以制成膠囊。
第二實踐的配方包括以下重量比的草藥青風藤4份，制附子3份，白芍5份，牡丹皮3份和姜黃2份。以下步驟用于第二實踐的配方比例的提取物的制備。
五種干燥草藥分別粉碎成粗粉。
青風藤720g以水5760ml浸泡0.5小時，回流提取3次，每次1.5小時，水提取液經混合、過濾，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至相對密度為1.10～1.11(70℃)的濃縮液。待濃縮液冷至室溫后，加入雞蛋清7.2g，混合均勻，再煮沸混合物以澄清青風藤濃縮提取液，隨后離心過濾，濾出的上清液經減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至相對密度為1.13～1.15(70℃)，隨后在連續攪拌的情況下于濃縮液中再入乙醇至含醇量達63％(以體積計)，室溫放置24小時，過濾，濾液再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至相對密度為1.13～1.15(70℃)，加入β-環糊精12.6g并調節相對密度調節至1.10～1.11(70℃)，噴霧干燥(入口溫度140℃，出口溫度100℃)，得提取物1約65.7g。
制附子540g和白芍900g混合以80％乙醇7200ml浸泡0.5小時，回流提取3次，每次1.5小時，醇提取液經合并、過濾，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至相對密度為1.13～1.15(70℃)。調節相對密度至1.10～1.11(70℃)，噴霧干燥(入口溫度140℃，出口溫度100℃)，得提取物2約175.1g。
牡丹皮粗粉520g采用SFE以超臨界二氧化碳(250L/h)萃取，得提取物3約11.6g。SFE之后的殘渣以80％乙醇2600ml浸泡0.5小時，回流提取3次，每次1小時。醇提取液經合并、過濾，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至相對密度為1.09～1.11(70℃)，。待濃縮液冷至室溫后，加入雞蛋清3.9g，混合均勻，再煮沸混合物以澄清牡丹皮濃縮提取液，隨后離心過濾，濾出的上清液經減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至相對密度為1.13～1.15(70℃)，加入β-環糊精9.5g并調節相對密度為1.10～1.11(70℃)，噴霧干燥，得提取物4約49.1g。
姜黃粗粉360g采用SFE以超臨界二氧化碳(250L/h)萃取，得提取物5約26.7ml。SFE之后的殘渣以80％乙醇2160ml浸泡0.5小時，回流提取3次，每次1小時。醇提取液經合并、過濾，再減壓(70℃，0.08Mpa)濃縮至相對密度為1.20(70℃)，加入淀粉18.0g，真空干燥(70℃，0.09Mpa)，粉碎，得提取物6約37.3g。
將提取物3(11.6g)與β-環糊精100g混合均勻，再與提取物5(26.7ml)混合均均，隨后依次加入提取物1(65.7g)、提取物2(175.1g)、提取物4(49.1g)、提取物6(37.3g)和羧甲基淀粉鈉15.3g，用適量淀粉調節藥粉總量至500g，混合均勻，干壓制粒，于顆粒加入羧甲基淀粉鈉8.5g和硬脂酸鎂1.5g，混合均勻，將0號膠囊，每粒膠囊調重至0.51g。
此項實踐下得到的提取物用于以下質量控制節描述的分析實驗。
2.4方法A-G的比較從上述方法A-G中確定最優提取方法的指標為已知活性成分的提取量和藥理作用強度。
各種方法得到的提取物中已知主要活性成分的定量通過高效液相色譜(HPLC)測定。本發明中使用的草藥的已知活性成分分包括青藤堿、芍藥苷、丹皮酚和姜黃素。
用于含量測定的化學對照品為青藤堿、芍藥苷、丹皮酚和姜黃素，均購自中華人民共和國國家藥品生物制品檢定所。去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素為自行制備并經檢定。乙腈、乙酸和三乙胺(HPLC級)購自Merck(Darmstadt，德國)。
HPLC系統為Agilent quatemary HPLC model HP 1100系列(Hewlett-Packard，Palo Alto，CA)，配備有Altima C18柱(250×4.5mm，5μm)和DAD檢測器。Swinnex型微孔過濾器(孔徑＝0.45μm)購自Millipore(Millipore，香港)。
標準溶液的配制準確稱量青藤堿、芍藥苷、丹皮酚和姜黃素，于甲醇中溶解得每個化合物濃度為0.2～0.5mg/ml的溶液。
樣品溶液制備干燥提取物0.1g置錐形瓶內，加甲醇20ml，精確稱重，超聲處理20分鐘，冷卻，再稱重，用甲醇補足重量，劇烈振搖，濾過(0.45μm)，得樣品溶液。
色譜條件流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)，使用之前經0.45μm微孔過濾器過濾和脫氣，采用梯度洗脫，乙腈在0、30、40和50分鐘的比例分別是10％、90％、10％和10％。流速為0.8ml/分鐘，在恒溫條件下(25±0.1℃)分別于波長262nm、230nm、270nm和430nm進行青藤堿、芍藥苷、丹皮酚和姜黃素的檢測。
對混合物Dp測定的色譜圖見圖1-3。圖1A和1B分別表示青藤堿對照品和混合物Dp內青藤堿的HPLC色譜圖；圖2A和2B分別表示芍藥苷對照品和混合物Dp內芍藥苷的HPLC色譜圖，而圖3A和3B分別表示姜黃素對照品和混合物Dp內姜黃素的HPLC色譜圖。
2.5質量控制標準為了質量控制，以下測定實驗用于檢測制劑內某些標志物或主要活性成分的存在(青藤堿，芍藥苷，丹皮酚，姜黃素，次烏頭堿，烏頭堿，中烏頭堿和次烏頭堿)。這些試驗應用于通過以上包囊方法得到的包裝成膠囊形式的制劑的同時，它們還可應用于方法A-G生產的提取物和混合物Dp。
通過利用以下測定實驗的組合，可以進行本發明組合的植物原料的檢驗。
2.5.1分析1青風藤的鑒別取第二實例下膠囊內容物0.25g，研細，加乙醇10ml，密塞，超聲處理(270W，25kHz)30分鐘，濾過，濾液吹干，殘渣加乙醇1ml使溶解，作為供試品溶液。另取青風藤對照藥材0.3g，同法制成對照藥材溶液。再取青藤堿對照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2000版一部附錄VIB)試驗，吸取上述溶液各5μl，分別點樣于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲醇-三乙胺(7∶2∶0.5∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以改良碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，分別在與對照品和對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。色譜圖見圖4。結果顯示提取物中含有活性成分/標志物青藤堿。
2.5.2分析2白芍的鑒別取分析1項下的供試品溶液作為供試品溶液。另取白芍對照藥材0.4g，同法制成對照藥材溶液。再取芍藥苷對照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2000版一部附錄VI B)試驗，吸取上述溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以香草醛濃硫酸試液，105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，分別在與對照品和對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。色譜圖見圖5。結果顯示提取物中含有活性成分/標志物芍藥苷。
2.5.3分析3制附子的鑒別取第二實例下膠囊內容物1g，研細，加0.05M的鹽酸溶液10ml，密塞，超聲(270W，25kHz)30分鐘，旋渦振蕩2分鐘后，以醋酸乙酯旋渦振蕩提取3次，每次10ml，棄去醋酸乙酯層。酸水溶液再以氯仿提取三次，每次10ml，合并氯仿提取液，空氣吹干。殘渣加乙醇1ml使溶解，作為供試品溶液。另取附子對照藥材1.5g，同法制成對照藥材溶液。再取次烏頭堿對照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2000版一部附錄VI B)試驗，吸取上述溶液各10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-醋酸乙酯-三乙胺(8∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以改良碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，分別在與對照品和對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。色譜圖見圖6。結果顯示提取物中含有活性成分/標志物次烏頭堿。
2.5.4分析4牡丹皮的鑒別取分析1項下的供試品溶液作為供試品溶液。另取牡丹皮對照藥材0.2g，同法制成對照藥材溶液。再取丹皮酚對照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2000版一部附錄VI B)試驗，吸取上述溶液各5μl，分別點樣于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-醋酸乙酯-甲酸(10∶2.5∶0.05)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，分別在與對照品和對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。色譜圖見圖7。結果顯示提取物中含有活性成分/標志物丹皮酚。
2.5.5分析5姜黃的鑒別取分析1項下的供試品溶液作為供試品溶液。另取姜黃對照藥材0.15g，同法制成對照藥材溶液。再取姜黃素對照品，加乙醇制成每1ml含0.3mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2000版一部附錄VI B)試驗，吸取上述溶液各5μl，分別點樣于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-甲酸(96∶4∶0.7)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，分別在與對照品和對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。色譜圖見圖8。結果顯示提取物中含有活性成分/標志物姜黃素。
2.5.6分析6烏頭類生物堿的限量取第二實例下膠囊內容物0.4g，精密稱定，置于50ml離心管中，加入0.05M鹽酸溶液10ml，超聲處理(270W，25kHz)40分鐘，旋渦振蕩2分鐘后，以醋酸乙酯旋渦振蕩提取2分鐘，每次10ml，重復3次，棄去醋酸乙酯層。酸水溶液再以氯仿旋渦振蕩提取2分鐘，每次10ml，重復3次，離心分層(3000轉每分鐘，5分鐘)，合并提取液，揮干。殘渣加0.01M鹽酸溶液超聲使溶解，旋渦振蕩2分鐘，定容至1.0ml，濾過(0.45μm濾膜)，取續濾液，作為供試品溶液。另取烏頭堿對照品，加0.01M的鹽酸溶液制成每1ml含0.05mg的溶液，作為對照品溶液。照高效液相色譜法(《中國藥典》2000版一部附錄VID)試驗。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-緩沖液(10mM碳酸銨溶液，加氨水調節pH至9.8)為流動相，采用梯度洗脫(0時乙腈比例為20％，10分鐘時乙腈比例線性上升到30％，20分鐘時乙腈比例線性上升到32％，50分鐘時乙腈比例線性上升到35％，75分鐘時乙腈比例線性上升到44％，80分鐘時乙腈比例線性上升到80％)；檢測波長為240nm。理論板數按烏頭堿的色譜峰計算應不低于2500，與雜質的分離度應大于1.5。精密吸取對照液與供試液各50μl，分別注入液相色譜儀，測定，即得。供試品色譜中，烏頭堿、中烏頭堿及次烏頭堿的峰面積總和應小于對照品色譜圖中烏頭堿的峰面積，即每1.0g組合物(約等于兩個膠囊內的量)中含有的烏頭生物堿(包括中烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿)的峰面積不應大于50μg烏頭堿(基于中烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿具有相同的吸光度)的峰面積。色譜圖見圖9。圖9A為不含制附子的組合物的HPLC色譜圖，而圖9B和9C分別表示烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿對照品和組合物內烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿的HPLC色譜圖。
2.5.7分析7青藤堿、芍藥苷、丹皮酚、姜黃素的定量色譜條件與系統適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-緩沖液(0.1％磷酸-0.2％三乙胺，pH3.5)為流動相，采用梯度洗脫0時乙腈比例為8％，25分鐘時乙腈比例線性上升到20％，30分鐘時乙腈比例線性上升到40％，55分鐘時乙腈比例線性上升到70％；檢測波長分別為240nm(芍藥苷)，262nm(青藤堿)，270nm(丹皮酚)及420nm(姜黃素)。理論板數按丹皮酚色譜峰計算應不低于2500。青藤堿，丹皮酚，芍藥苷及姜黃素與雜質的分離度應分別大于1.5。
對照品溶液的制備 精密稱取青藤堿、芍藥苷、丹皮酚和姜黃素適量，加50％乙醇溶解，制成每1ml含青藤堿約35μg，含芍藥苷約160μg，含丹皮酚約110μg，含姜黃素約40μg的混合對照溶液，即得。
供試品溶液的制備 取裝量差異項下內容物0.15g，精密稱定，置25ml量瓶，加50％乙醇20ml，超聲處理(270W，25kHz)30分鐘后，以50％乙醇定容至刻度，搖勻，靜置，濾過(0.45μm濾膜)，取續濾液，即得。
測定法 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5.0μl，注入液相色譜儀，測定，即得。
每1.0g組合物(約等于兩個膠囊內的量)中含有的青藤堿、芍藥苷、丹皮酚、姜黃素的量分別不應少于5.0μg，23.0μg，9.0μg和4.0μg。色譜圖分別見圖10-13。圖10A表示不含青風藤的組合物的HPLC色譜圖，而圖10B和10C分別表示青藤堿對照品和組合物內青藤堿的HPLC色譜圖。圖11A表示不含白芍的組合物的HPLC色譜圖，而圖11B和11C分別表示芍藥苷對照品和組合物內芍藥苷的HPLC色譜圖。圖12A表示不含牡丹皮的組合物的HPLC色譜圖，而圖12B和12C分別表示丹皮酚對照品和組合物內丹皮酚的HPLC色譜圖。圖13A表示不含姜黃的組合物的HPLC色譜圖，而圖13B和13C分別表示姜黃素對照品和組合物內姜黃素的HPLC色譜圖。
2.5.8分析8次烏頭堿的定量本測定使用分析6中的色譜法和制備的樣品溶液。
對照品溶液精密稱烏頭堿適量，以0.01M的鹽酸溶液溶解，稀釋制成每1ml中約含0.005mg的溶液作為對照品溶液。
每1.0g組合物(約等于兩個膠囊內的量)中含有的次烏頭堿的量不應少于7μg。色譜圖見圖9。
從各色譜圖結果可見，以上色譜分析技術適宜用于本發明制劑的質量控制。制劑的質量通過對主要標志性或主要活性化學成分的鑒別和測定而確定。
如果配方不完整或者提取方法不正確，會導致上述分析方法的結果異常，出現需鑒別成分的缺失或含量不合要求，這些情況下的制劑的質量均不合格，不可接受。
2.6動物嚙齒動物(大鼠和小鼠)購自香港中文大學實驗室動物服務中心和香港大學實驗室動物服務中心。動物放在不同的籠內(小鼠每籠15只動物和大鼠每籠5只)，并在實驗之前適應至少一周。自由攝取食物和飲水，但在每個具體實驗之前特定的禁食期除外。動物實驗室配備自動溫度(22±1℃)和照明控制(12小時光照/12小時黑暗)。
所有動物實驗的步驟及動物飼養管理均得到香港浸會大學的人體及動物實驗管理委員會(HASC)和HKSAR衛生署的批準，并且遵照美國國家衛生研究院的《實驗動物管理及使用手冊》的制度準則進行。
2.7藥物給藥給藥前，所有草藥提取物均制備成由10％花生油、10％吐溫-80和80％的提取物組成的乳劑，均采用口服給藥。劑量均表示為草藥重量(g)/體重(kg)。對照組動物給予由10％花生油、10％吐溫-80和80％水組成的空白乳劑。在進行藥液稀釋以及配制陽性對照藥時，均使用空白乳劑為溶媒。
2.8急性炎癥模型采用角叉菜膠或者雞蛋清誘導的急性炎癥模型研究本發明以上提取物的抗炎作用。
大鼠在左后足接受跖底注射角叉菜膠(0.1ml，1％，0.85％鹽水配制；Sigma Chemical Co.，StLouis，MO，USA)或雞蛋清(0.1ml，10％，0.85％鹽水配制)。
動物在實驗之前禁食24小時，在注射角叉菜膠1小時之前和24小時之后，或者注射雞蛋清3小時之前，各提取物分別灌胃給予動物，劑量見結果部分各表所示。藥物以交錯方式給予動物以使每個動物之間間隔時間一致。陽性對照組動物給予消炎痛。
足腫脹實驗的評估采用足體積測量器(Plethysmometer 7150，Ugo Basile，意大利)測量每個動物足腫脹體積(按ml)，精確度至小數點后兩位。在角叉菜膠注射之前和之后2、4、6、24小時，或者雞蛋清注射之后1、2、3和4小時進行測量。爪的腫脹率是足體積百分比差異并由以下公式計算腫脹率(％)＝(A-B)×100/B，這里A表示注射后不同時間點的足體積，B表示注射之前的足體積。
結果表示為平均值±SD。數據分析采用方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用LSD法(方差相等)或Tamhane’s T2法(方差不等)，p＜0.05為具有顯著性意義。
2.9鎮痛實驗采用大鼠甩尾實驗和小鼠扭體實驗研究本發明以上提取物的鎮痛作用。
2.9.1甩尾實驗甩尾實驗是急性疼痛的模型。此實驗中，通過測定輻射熱源直接作用于動物尾部產生刺激作為開始，到動物彈開其尾巴以避開輻射熱源作為結束間的時間測量潛伏期。正式實驗，需對動物進行篩選，對于體重為180g至220g的Spague-Dawley大鼠，如果反應潛伏期小于2秒或超過6秒則應排除在實驗之外。
實驗之前動物禁食24小時，各提取物分別于實驗前1小時灌胃給予動物，劑量見結果部分各表所示。藥物以交錯方式給予動物以使每個動物之間間隔時間一致。
實驗開始時，將每只大鼠輕輕放入儀器(IITC model 336甩尾痛覺測試計，IITC Inc.，Woodland Hills，California，U.S.A)的固定器內，再將動物的尾巴置于于尾槽內。啟動光源以施加輻射熱至尾巴上由末梢起1/3長度處，引起甩尾反應。記錄由啟動光源至動物彈開其尾巴以避開光源的時間，作為反應的潛伏期。實驗同時設定截止時間，通常為12秒至15秒，如果到達截止時間，動物仍未有反應，則以截止時間為潛伏期。截止時間的設定有助于防止動物尾部長時間間暴露于輻射熱下可能引起的組織損傷。
甩尾試驗的評估在藥物給藥后1、2和3小時測量甩尾反應。結果表示為平均值±SD。數據分析采用方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用LSD法(方差相等)或Tamhane’s T2法(方差不等)，p＜0.05為具有顯著性意義。
2.9.2扭體實驗扭體實驗中，通過于小鼠的腹膜內腔內注射乙酸誘導急性炎癥疼痛，其特征在于經后肢牽張腹部肌肉系統的收縮波，這種活動稱之為扭動反應。扭體發作的次數的多少可反映動物對乙酸引起疼痛的反應強弱。扭體實驗靈敏度較高，可用于評價非甾體抗炎藥的止痛活性。
ICR小鼠雌雄各半，體重18g至25g，實驗之前禁食24小時。
各提取物分別于乙酸注射前1或2小時灌胃給予動物，劑量見結果部分各表所示。藥物以交錯方式給予動物以使每個動物之間間隔時間一致。隨后動物被放入單獨的10×15cm樹脂玻璃觀察室10分鐘以上以適應環境。實驗時，于小腹腹腔注射用0.85％生理鹽水配制的0.8％乙酸溶液0.1ml，注射完成后將各動物放回觀察室。
2.9.3扭體實驗的評估觀察動物在注射乙酸后特定時間內(15或20分鐘)扭體反應發作的次數。結果表示為平均值±SD。數據分析采用方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用LSD法(方差相等)或Tamhane’s T2法(方差不等)，p＜0.05為具有顯著性意義。
2.10實驗性關節炎佐劑性關節炎(AA)和II型膠原性關節炎(CLA)均是廣泛使用的實驗性關節炎模型，對于研究風濕性關節炎的發病機理以及研究和開發抗關節炎藥物有重要意義。
2.10.1佐劑性關節炎佐劑性關節炎是最經典的動物關節炎模型，它不僅廣泛地用于炎癥和自身免疫疾病的病因、病理的研究，而且也大量地用于抗風濕藥物的臨床前研究。
結核桿菌懸浮液的制備和AA的誘導熱滅活的結核桿菌H37Ra購自Difco，Detroit，Michigan，U.S.A；礦物油購自Sigma-AldrichCo.，St.Louis，Montana，U.S.A。將熱滅活的結核桿菌和礦物油在玻璃研缽里研磨，得到0.625mg/ml的結核桿菌懸浮液。在體重為100g至130g的雄性Sprague-Dawley大鼠的尾基部皮下注射0.10ml的懸浮液以誘導關節炎。大鼠(每組7～12只)在免疫之后開始每天口服各提取物，以空白乳劑作陰性對照。
佐劑性關節炎的評估從第9日開始，每天進行關節炎指數評估，每隔一天測定體重和雙后足體積。關節炎指數按照每足的紅斑和關節軟組組織腫脹程度評為0至4級，分別評0至4分，每只動物最大關節炎指數為16分。后足體積采用足體積測量器(Plethysmometer 7150，Ugo Basile，意大利)測量。結果表示為兩只后足的平均體積。體重以0.1g精密度天平(Sartorius，Germany)測定。
結果表示為平均值±SD。數據分析采用SAS8.0軟件的廣義線性模型的重復測量，兩兩比較采用SNK法(Student Newman-Keuls)，p＜0.05為具有顯著性意義。
2.10.2II型膠原誘導的關節炎II型膠原誘導的關節炎(CIA)是自身免疫性疾病的實驗模型，它可通過以II型膠原免疫在嚙齒動物的易感種(大鼠和小鼠)中引起。這種模型和人類疾病有相似似處，包括疾病與組織相容基因位點中基因的連鎖，單核細胞浸潤，血管翳形成，纖維蛋清沉積，軟骨和骨破壞，以及自身反應性T和B細胞。CIA模型已經成為評價關節炎治療藥物的工業標準。免疫之后，這些動物產生自體免疫調節的多發性關節炎，它和人自身免疫性疾病風濕性關節炎共有幾個臨床、組織學和免疫學特征。由于CIA和風濕性關節炎之間的重要相似，此實驗模型已經是用于研發抗炎藥物的常規模型。
II型膠原(CII)的制備和關節炎的誘導牛II型膠原的0.05M乙酸溶液(批號082503)和弗氏不完全佐劑(批號091003)均購自Chondrex，LLC.Washington，U.S.A。將II型膠原與等體積的弗氏不完全佐劑(IFA)于勻漿機內(IKA-WERKE Gmbh & Co.KG，德國)在冰浴中勻漿30秒，形成乳液。冰水浴可防止II型膠原在勻漿期間的變性，變性的膠原不能誘導CIA的產生。
在體重為200g至380g的雌性Wistar大鼠尾基部的兩個部位皮內注射0.10ml乳液(每個部位0.05ml)。首次免疫的第7日進行同樣的注射以加強免疫。從關節炎誘導當日(0日)直到30日，動物每天口服給予提取物或消炎痛(陽性對照)(每組n＝5-6)。陰性對照組僅給予空白乳乳液。
II型膠原誘導的關節炎的評估從第9日開始，每天進行關節炎指數評估，每三天測定一次體重和雙后足體積。關節炎指數按照每足的紅斑和關節軟組組織腫脹程度評為0至4級，分別評0至4分，每只動物最大關節炎指數為16分。后足體積采用足體積測量器(Plethysmometer 7150，Ugo Basile，意大利)測量。結果表示為兩只后足的平均體積。體重以0.1g精密度天平(Sartorius，Germany)測定。
結果表示為平均值±SD。數據分析采用SAS8.0軟件的廣義線性模型的重復測量，兩兩比較采用SNK法(Student Newman-Keuls)，p＜0.05為具有顯著性意義。
2.11毒性毒性研究包括兩個內容1)混合物D、Dp和膠囊的最大耐受劑量(MTD)；2)膠囊的亞慢性毒性。
2.11.1最大耐受劑量(MTD)小鼠ICR小鼠，雌雄各半，體重18g-26g，自由攝取食物和飲水，但在實驗之前禁食16小時。兩組小鼠以交錯方式給予混合物D和Dp。在0日至6日和13日觀察小鼠的死亡率、毒性反應和全身癥狀。
大鼠SD大鼠，雌雄各半，體重110～140g，自由攝取食物和飲水，但在實驗之前禁食16小時。兩組SD大鼠以交錯方式給予膠囊和載體(0.3％羧甲基纖維素鈉)。在0日至13日之間觀察大鼠的死亡率、毒性反應和全身癥狀。
2.11.2亞慢性毒性亞慢性毒性實驗通常指持續給藥1至2月以上觀察毒性反應的研究，該時間接近實驗大鼠壽命的5％。進行亞慢性毒性實驗可觀察藥物的毒性反應，并研究安全系數。并且設計這種亞慢性研究以闡明異生物質，即中藥制劑，對結構和功能實體的無數毒性作用的任何一種。
SD大鼠，雌雄各半，體重90～110g，自由攝取食物和飲水。三組SD大鼠(每組3只大鼠)通過以交錯方式給予51.0g/kg和76.5g/kg劑量的膠囊，或者載體(0.3％0.3％羧甲基纖維素鈉)。動物每周給藥6日，每天一次。每天觀察大鼠的死亡率、毒性反應。根據每周的體重計算給藥體積。
3結果3.1最優提取方法的確定通過測量其抗炎(雞蛋清誘導的足腫脹)和鎮育作用(表1-3)的實驗，以及主要化學成分的提取率(表4)，評估按照上述不同方法，即方法A-G的七種提取物的效果。
3.1.1足腫脹實驗表1大鼠足腫脹實驗中提取物抗炎作用的比較(N＝6)

注意*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，與對照組在同一時間點比較。#P＜0.05，##P＜0.01與混合物D組在同一時間點比較。
3.1.2甩尾實驗表2大鼠甩尾實驗中提取物鎮痛作用的比較

注意*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，與對照組在同一時間點比較。#P＜0.05，##P＜0.01與混合物D組在同一時間點比較。
3.1.3扭體實驗表3小鼠扭體實驗中提取物鎮痛作用的比較

注意*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，與對照組在同一時間點比較。#P＜0.05，##P＜0.01與混合物D組在同一時間點比較。
3.1.4各種方法的提取率表4各種提取方法中主要活性成分的提取率(％，N＝2)

實驗結果顯示，對于由注射雞蛋清引起的大鼠急性炎癥，混合物D具有最有效的抗炎作用(表1)。對于由腹膜內乙酸注射誘導的小鼠急性疼痛反應，混合物D還顯示較強的鎮痛作用(表3)。然而，對于由輻射刺激誘導的大鼠急性疼痛反應，混合物B產生最強的鎮痛作用(表2)。
與其它提取方法相比，目標活性成分，如青藤堿、芍藥苷、芍藥酚、姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素的提取在采用方法D時較高(表4)。因而，選擇方法D得到的混合物D用于純化并進行隨后的實驗。雖然其它混合物不如混合物D一樣有效，但本發明中涉及的其它方法得到的混合物也同樣顯示了生物活性作用，因此也保留在本發明的范圍之內。
3.2混合物D和Dp之間的比較混合物D和Dp的比較包括兩者的收率、主要活性成分的回收率、抗炎鎮痛活性及毒性的。
3.2.1混合物D和Dp收率的比較測量得自方法D和Dp的提取物的重量，收率為所得提取物與原料的重量比。混合物D和Dp的提取物1、3和5的收率分別是12.50％和5.25％(表5)。純化率定義為混合物Dp收率和混合物D收率之間的差相對于混合物D收率的比。純化率顯示Dp純化方法所除去物質的相對量。
表5混合物D和混合物Dp的收率(N＝2)

3.2.2活性成分回收率的比較混合物D和Dp中青藤堿、芍藥苷和姜黃素的含量采用高效液相色譜(HPLC)測定。經純化之后，混合物Dp保留了混合物D內85.11％的青藤堿，99.11％的芍藥苷和74.22％的姜黃素。
表6選定的生活物性組分的回收率

3.2.3混合物D和Dp對角叉菜膠引起的急性炎癥作用的比較陽性對照藥消炎痛在給藥7小時內均抑制足腫脹，但在角叉菜膠刺激后24小時未觀察到這種作用。混合物D(15.36g/kg)和Dp(0.96g/kg和15.36g/kg)在藥物給藥之后25小時內均產生顯著的抗炎作用。混合物D在0.96g/kg劑量條件下于給藥后7小時和25小時產生顯著的抗炎作用。混合物D在15.36g/kg劑量條件下，混合物Dp在0.96g/kg和15.36g/kg劑量條件下于給藥后的3小時、5小時、7小時和25小時都顯著的抗炎作用(表7)。其作用均有明顯的量效和時效關系。
表7混合物D和Dp對由角叉菜膠引起的大鼠足腫脹的作用

注意***，P＜0.001；**，P＜0.01；*，P＜0.05，與對照組在同一時間點比較。
3.2.4雞蛋清誘導的大鼠足腫脹實驗中混合物D和Dp抗炎作用比較混合物D和Dp在藥物給藥后4小時都產生顯著的抗炎作用，其作用均有明顯的時效關系。(表8)表8混合物D和Dp對雞蛋清引起的足腫脹的作用

注意***，P＜0.001；**，P＜0.01；*，P＜0.05，與對照組在同一時間點比較；#，P＜0.05，與混合物Dp組在同一時間點比較。
3.2.5輻射熱刺激誘導的大鼠甩尾反應中混合物D和Dp鎮痛作用的比較給藥之后1小時混合物D和Dp都顯著延長了大鼠對輻射刺激的潛伏期。給藥后2小時混合物Dp仍然顯著延長了潛伏期(表9)。其作用均有明顯的時效關系。
表9混合物D和Dp對大鼠關于輻射熱刺激潛伏期的作用

注意*，P＜0.05，**，P＜0.01與對照組在同一時間點比較。
3.2.6由乙酸注射誘導的扭體實驗給藥后兩小時，混合物D和Dp對乙酸誘導的小鼠扭體活性都具有顯著的抑制作用。(表10)表10混合物D和Dp對小鼠扭體發作次數的作用

注意*，P＜0.05，**，P＜0.01與對照組比較。
3.2.7急性毒性死亡率以動物死亡數量/使用動物數量*100計算死亡率。給予混合物D和Dp的小鼠的死亡率分別是65.2％和10.5％(表11)。在混合物D和Dp藥物給藥之后，第一例死亡分別發生在0.62小時和0.46小時。
表11ICR小鼠在接受混合物D或混合物Dp之后的死亡率

體重單次給藥后觀察13日，給予混合物D和Dp且未死亡的ICR小鼠的體重在給藥之后均保持增加。在第13日，給予混合物D和Dp的動物的體重增加百分率分別是19.47％和32.30％(表12)。
表12ICR小鼠接受混合物D或混合物Dp之后體重增加

急性毒性全身癥狀死亡小鼠在死亡前均表現出昏迷并伴隨陣攣性和強直性驚厥。此外，死亡之前還可看見鎮靜、困難呼吸和鼻子腫大等現象。
存活的小鼠中，給予混合物D的小鼠分別只有13.0％和60.9％的動物出現糞便和毛發輕度變差。給予混合物Dp的小鼠分別有38.9％和11.1％的動物出現糞便和毛發輕度變差，這些情況保持1-2天。
3.3混合物Dp的藥理活性3.3.1混合物Dp對實驗性關節炎的影響膠原誘導的關節炎(CIA)CII/IFA免疫之后，陰性對照組的所有動物在13日至16日間開始出現關節炎癥狀(圖14)。在18日時關節炎指數到達最高點，19日至23日稍有變化(圖14A)，接著保持穩定至實驗結束，而后足體積至27日才達到坪值(圖14B)。疾病動物的體重也顯著減少(圖14C)。與此相反，每天口服給予23.08g草藥/kg的混合物Dp則顯著抑制了關節炎的發生與發展(圖16A和B)。與對照組相比，混合物Dp顯著抑制II型膠原誘導的足體積增加(圖14B)、逆轉關節炎指數發展的趨勢(圖14A)。混合物Dp還影響CIA大鼠的體重(圖14C)。
3.3.2混合物Dp對急性炎癥模型的影響混合物Dp對角叉菜膠引起的大鼠足腫脹模型的抑制作用角叉菜膠跖底注射誘導的大鼠足腫脹持續至少24小時，峰值時間是注射后6小時。陽性對照藥物消炎痛在給藥后7小時內抑制腫脹，在刺激24小時則觀察不到這種作用。混合物Dp在0.96g/kg和15.38g/kg劑量條件下給藥之后25小時產生顯著的抗炎作用。該作用有明顯的量效和時效關系。(表13)表13混合物Dp對角叉菜膠引起的大鼠足腫脹模型的作用

注意***，P＜0.001；**，P＜0.01；*，P＜0.05，與對照組在同一時間點比較混合物Dp對雞蛋清引起的大鼠足腫脹模型的抑制作用雞蛋清跖底注射誘導的大鼠足腫脹持續約4小時，峰值時間是注射后1小時。
混合物Dp以0.24g/kg、0.96g/kg和15.36g/kg劑量條件下給藥后6小時產生顯著抗炎作用。但在3.85g/kg劑量條件下盡管觀察到腫脹減小的趨勢，但無顯著的抗炎作用。該作用有明顯的量效和時效關系。(表14)
表14混合物Dp對雞蛋清引起的大鼠足腫脹模型的抑制作用

注意***，P＜0.001；**，P＜0.01；*，P＜0.05，與對照組在同一時間點比較3.3.3混合物Dp的鎮痛作用甩尾實驗混合物Dp在7.69和30.77g/kg劑量條件下給藥后1小時顯著延長大鼠對輻射熱刺激的潛伏期。此外，30.77g/kg混合物Dp在藥物給藥后2和3小時還顯著延長對輻射熱的潛伏期。但是在1.92g/kg盡管觀察到增加潛伏期的趨勢，但無顯著的鎮痛作用。該作用有明顯的量效和時效關系。(表15)表15混合物Dp對大鼠關于輻射熱刺激潛伏期的作用

注意*，P＜0.05，**，P＜0.01與對照組在同一時間點比較扭體實驗混合物Dp以15.38g/kg和30.77g/kg給藥后兩小時，兩個劑量都引起對乙酸誘導的小鼠扭體反應的顯著抑制。該作用有明顯的量效關系。(表16)表16混合物Dp對小鼠扭體發作次數的作用

注意*，P＜0.05，**，P＜0.01與對照組比較。
3.4第二實例下生產的膠囊的藥理活性3.4.1膠囊對實驗性關節炎的影響佐劑性關節炎佐劑免疫之后，陰性對照組動物于12日至21日間開始出現關節炎癥狀(圖15)。與對照組相比，膠囊顯著抑制佐劑關節炎誘導的足體積增加(圖15B)并逆轉關節炎指數發展趨勢(圖15A)。膠囊對AA大鼠體重無顯著影響(圖15C)。
II型膠原誘導的關節炎(CIA)CII/IFA免疫之后，陰性對照組動物于13至16日間開始出現關節炎癥狀(圖16)，在18日關節炎指數到達峰值，19日至23日稍有變化(圖16A)，接著保持穩定至實驗結束，而后足體積至27日才達到坪值(圖16B)。疾病動物體重顯著減少(圖16C)。與此相反，每天口服給予34.0g草藥/kg的膠囊顯著抑制關節炎的發展(圖16A、B和C)。與對照組相比，膠囊顯著抑制II型膠原誘導的足體積增加(圖16B)和逆轉關節炎指數發展趨勢(圖16A)。膠囊還影響CIA大鼠的體重(圖16C)。
3.4.2膠囊的鎮痛作用扭體實驗陽性對照藥延胡索乙素以0.09g/kg和青藤堿以0.0375g/kg，以及膠囊以6.375g/kg、12.750g/kg和25.50g/kg給藥后一小時，所有試驗藥物均對乙酸誘導的小鼠扭體反應產生抑制。與對照組相比，延胡索乙素、青藤堿和12.7g/kg和25.50g/kg的膠囊的抑制有顯著性意義。膠囊的該作用有明顯的量效關系。(表17)表17膠囊對小鼠扭體發作次數的作用

注意*，P＜0.05，**，P＜0.01與對照組比較。
3.4.3膠囊的毒性急性毒性膠囊以294g草藥/kg劑量單一給藥后14日未發現死亡率。與對照組相比，動物體重增加在第4和第7日有輕微減少(表18)，動物攝食量在第2和第5日有輕微降低(表19)。藥物給藥后一周，這些癥狀均逐漸恢復正常。
表18SD大鼠接受膠囊后體重增加N＝10)

表19SD大鼠接受膠囊后的攝食量(N＝10)

亞慢性毒性以動物死亡數量/使用動物數量*100％計算死亡率。在藥物以51.0和76.5g草藥/kg劑量給藥之后，直至97日未發現死亡率。
給藥97日，每組動物體重保持增加。在97日，0.3％CMC-Na溶液、51.0g草藥/kg和76.5g草藥/kg的膠囊給藥之后大鼠體重增加的百分比分別是183.7％、151.9％和154.8％(圖17)。
全身癥狀全身癥狀觀察主要包括皮膚、毛皮、眼黏膜、循環系統、自主和中樞神經系統、體馬達(somatomotor)活性、行為中的任何變化。記錄任何藥物毒性癥狀例如震顫、抽搐、流涎、腹瀉、嗜睡、瞌睡、病態、成束、瞳孔放大、瞳孔縮小、糞便、排出物或張力減退。
在給予0.3％CMC-Na溶液的大鼠中未發現異常觀察。在以51.0g草藥/kg膠囊給藥的大鼠中，從20日至97日發現立毛現象，從30日開始發現具有輕微的濕糞便。對于以76.5g草藥/kg的膠囊給藥的大鼠，從9日至97日均發現立毛和具有輕微的濕糞便。
4.討論4.1七種方法的比較通過生物活性和化學成分提取量上的比較，對提取工藝路線進行了篩選和優化。結果顯示在生物活性方面，包括對角叉菜膠誘導的足腫脹的急性抗炎作用，輻射熱刺激誘導的大鼠甩尾反應和腹膜內乙酸刺激誘導的小鼠扭體反應中的止痛作用，青藤堿、芍藥苷、丹皮酚和姜黃素、去甲氧基姜黃素及雙去甲氧基姜黃素的主要活性化學成分提取量等方面，由方法D生產的混合物D最佳。
因而，選擇方法D得到的混合物D進行純化并用于接下來的實驗。盡管如此，其它方法得到的混合物也具有藥理作用，故也保留在本發明范圍之內。
4.2混合物Dp的純化純化方法目的是由提取物中除去非活性物質，因此增加活性物質的相對豐度。
聚合吸附樹脂是從草藥提取物除去非活性物質的一種理想材料。在中藥純化方法越來越多地采用這些樹脂，這主要是因為于它們通常對糖苷、生物堿、黃酮和萜類具有選擇吸附性能，而這些成分多具有生物活性，并多被認為是中藥的藥效成分。Amberlite XAD-7HP是一種具有中等極性的較理想的聚合吸附樹脂，它可選擇性地吸附中等極性的化合物，例如青藤堿、芍藥苷和本發明中的一些其它物質。
結果(表5)表明純化率大約是60％，這顯示混合物D內接近60％的物質已經AmberliteXAD-7HP樹脂除去(以上3.2.1節給出了術語“純化率”的定義)。雖然本發明中使用AmberliteXAD-7HP樹脂，但本發明中草藥混合物的進一步純化并不限于使用這一種樹脂。
主要化學成分回收率的比較(表6)和原始提取物(混合物D)及純化物(混合物Dp)的主要藥理學活性和急性毒性上的比較(表7-10)證明這兩種提取物在藥理學上基本等效、在化學組成上基本相似，同時，混合物Dp的急性毒性較低(表11)。
回收率結果表明經Amberlite XAD-7HP樹脂純化后，85.11％的青藤堿，99.11％的芍藥苷和74.22％姜黃素被保留在純化后的提取物中(混合物Dp)(表6)。按照中國國家食品藥品監督管理局(SFDA)建議的標準，每種制劑方法中的回收率應不少于70％。我們的結果表明本發明的主要成分的回收率高于70％，因此符合SFDA的標準。這也提示該純化方法可能在很大程度上保留了大多數活性成分。這是維持制劑本身的藥理活性和臨床作用最重要的一點。
至于抗炎活性，結果表7和8均表明混合物D和Dp具有相似作用。某些情形下，混合物Dp甚至優于混合物D。例如，在角叉菜膠誘導的足腫脹實驗中，藥物以0.96g/kg的較低劑量給藥后3和5小時(表7)，以及雞蛋清誘導的足腫脹實驗藥物給藥后7小時(表8)，就可以觀察到這一點。至于鎮痛活性，結果證明混合物D和Dp在大鼠甩尾實驗及在小鼠扭體實驗中的作用比較接近(表9和10)。因此，純化混合物Dp在抗炎作用以及鎮痛作用中具有和混合物D基本相似的藥效作用強度。
動物口報混合物D和Dp之后的死亡率分別是65.2％和10.5％(表11)，這提示XAD-7柱處理除去了混合物D中潛在的毒性成分。灌藥后未死小鼠的體重在該研究期間繼續保持增加，這提示混合物D和Dp對生長都不具有明顯的抑制影響。糞便出現變差的情況提示混合物D和Dp對動物胃腸道可能有一些刺激。這些結果表明在急性毒性實驗中混合物Dp比混合物D毒性小。
這些結果表明，純化后樣品(混合物Dp)和純化前樣品(混合物D)不但化學上而且藥理學上基本相似，同時純化步驟還減少了混合物D的急性毒性。因此，Amberlite XAD-7HP樹脂用于本品的純化不僅可除去非活性成分，保留藥理活性，還可同時降低純化產品的毒性，所以純化效果是理想的、可以接受的。
4.3混合物Dp的生物活性實驗結果表明本發明的混合物Dp對II型膠原誘導(圖14)的關節炎具有顯著的抗關節炎作用，對由角叉菜膠或雞蛋清(表13和14)引起的足腫脹均有具有明顯的抗炎作用，對由輻射熱刺激引起的大鼠疼痛反應(表15)、或由乙酸刺激小鼠(表16)誘導的疼痛反應均具有明顯的鎮痛作用。在足腫脹實驗中，混合物Dp在0.96g/kg劑量時即產生顯著的抗炎作用，說明其有效劑量較低。
但鎮痛活性中，混合物Dp在7.69g/kg(甩尾實驗)或15.38g/kg(扭體實驗)時才能抑制疼痛反應，這表明混合物Dp的抗炎活性較其鎮痛作用強，這點有利于對類風濕性關節炎治療時通過直接作用其的病因病機起作用。通過本研究，混合物Dp的抗關節炎作用得到了明確。
4.4膠囊的生物活性實驗結果表明本發明的膠囊對佐劑誘導的關節炎和II型膠原誘導的關節炎均具有顯著的抗關節炎作用(圖15和16)，對由乙酸刺激小鼠誘導的疼痛反應也具有明顯的鎮痛作用(表17)。
4.5膠囊的毒性實驗結果表明本發明的膠囊在急性毒性(表18和19)和亞慢性毒性(圖17)中較低。一次性經口給藥294g/kg時，在SD大鼠中未出現動物死亡。其主要的中毒癥狀是在給藥后的第一周出現體重增加減少和食欲降低，但這些癥狀在第二周即得到恢復。對SD大鼠重復給予本膠囊，每周6日，每日一次經口給藥51.0或76.5g/kg時，共給藥97日，觀察到相似結果。
4.6化學組成和比例雖然本發明所涉及到的這些主要化學成分，包括青藤堿、芍藥苷、芍藥酚、姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素等，以及它們的作用都是已知的，但是像本發明所提供的范例，即從本發明中的草藥組合進行提取而對他們進行使用這一點而言，對于本領域的技術人員卻并不是顯而易見的。本發明的提取物可能包括許多尚未被鑒定或量化的其它成分。然而，迄今為止尚未有其它報導將已知主要活性成分青藤堿、芍藥苷、芍藥酚、姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素組合在一個制劑中進行使用。因此，任何一種口服組合物，只要包括上述這些在本發明內得到鑒定的主要組分，不管他們是從上述名單的草藥中純化得到的，還是通過人工合成得到的，均屬于本發明所包括的范圍。
在以上實例教導本發明如何實施的同時，有一點是很清楚的，就是各組分的比例比各組分具體的重量單位更重要。因此，在實踐本發明時，本領域的熟練人員能按比例增加或減少各組分的重量，但保持各組分的比例不變，這些也均屬于本發明所包括的范圍。
這里就配方指定重量單位，本發明可理解成不受使用的重量單位的限制。
4.7本發明可適于其它人用口服制劑除了膠囊之外，提取物可用于制備片劑，水劑或油懸浮液劑，分散性粉劑或顆粒劑，乳劑，硬或軟膠囊，糖漿劑，酊劑或飲料。上述口服制劑可按照本領域現有的任何用于制備這種藥學上可接受的制劑的已知方法制備，該制劑包含一種或多種以下添加劑增甜劑，矯臭劑，著色劑和防腐劑。增甜劑和矯臭劑會增加制劑的可口性。提取物與無毒的藥學上可接受的片劑用賦形劑混合后制成片劑也是可接受的。藥學上可接受意指在和制劑的其它組分相容的意義上，這種試劑應當是可接受的(以及對病人是無害的)。這樣的賦形劑包括惰性稀釋劑，例如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；成粒和崩解劑，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合劑例如淀粉、明膠或阿拉伯膠；還有潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。片劑可以是未包衣的，或者采用已知技術進行包衣，以遲延其在胃腸道的崩解和吸收，從而在較長時間內產生持續的作用。例如，單獨或與蠟一起，或采用延時材料如單硬脂酸甘油酯和二硬脂酸甘油酯。
口服使用制劑還可以是硬明膠膠囊劑，其中活性組分與惰性固體稀釋劑混合，例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土，或者是軟膠囊膠囊劑，其中活性組分與水或油介質混合，例如花生油、液體石蠟或橄欖油。某些實施方案中，水懸浮液可包含和適于水懸浮液制備的賦形劑混合的本發明的提取物。這樣的賦形劑包括懸浮劑、分散或潤濕劑、一種或多種防腐劑，一種或多種著色劑，一種或多種矯臭劑和一種或多種甜味劑，例如蔗糖或糖精。油懸浮液可通過在例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油植物油中，或者在如液體石蠟的礦物油中，懸浮活性組分配制。油懸浮液包含增稠劑，例如蜂蠟、固體石蠟或鯨蠟醇。可加入甜味劑，例如以上闡明的那些，和矯臭劑，以提供可口的口服制劑。這些制劑可通過加入抗氧化劑例如抗壞血酸保存。這些制劑還可以是分散性粉劑或粒劑提供和分散或潤濕劑、懸浮劑及一種或多種防腐劑混合的一種或多種提取物，這些制劑適于通過加入水制備成水懸浮液。這些制劑還可包括額外的賦形劑，例如甜味、矯臭和著色劑。
糖漿劑和酏劑可以甜味劑配制，例如甘油、脫水山梨糖醇或蔗糖。這樣的制劑還包含緩和劑、防腐劑、矯味或著色劑。
非腸道給藥用提取制劑可以是無菌的可注射制劑，例如無菌可注射的水或油懸浮液。這種懸浮液可按照本領域公知的方法采用適當的分散或潤濕劑和懸浮劑配制。這種無菌注射制劑還可以是無菌可注射的無毒非腸道可接受的稀釋劑或溶劑的溶液或懸浮液，例如1，3-丁二醇溶液。適當的稀釋劑包括，例如，水、林格氏溶液和等張氯化鈉溶液。此外，按照慣例采用無菌不揮發性油作為溶劑或懸浮介質。為了這種目的，可以采用任何溫和的不揮發性油，包括合成的單或二脂酸甘油酯。此外，例如油酸的脂肪酸同樣也用于該注射制劑的制備。
藥物制劑還可以是水包油乳劑。油相可以是植物油，例如橄欖油或花生油，例如液體石蠟的礦物油，或者它們的混合物。適當的乳化劑包括天然形成的樹膠例如阿拉伯膠和西黃蓍膠，天然形成的磷脂，例如大豆卵磷脂，源自脂肪酸和己糖醇酸酐的酯類或偏酯類，例如山梨糖醇酐單油酸酯，和這些偏酯和環氧乙烷的縮合產品，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。乳劑還可含有甜味劑和矯臭劑。
可以與載體物質混合以產生單一劑型的提取物的數量將取決于治療的宿主和具體給藥方式變化。
雖然本發明可以是藥品，它還可以作為保健品消費，換言之，為了任何特定的臨床目的設計成營養或健康補充劑。因而，作為營養或健康補充劑它適于一般消費。
本發明范圍內的變化按照中醫實踐和中華人民共和國藥典的約束，為了使用方便，通常優選干燥植物原料。因此，以上說明書所有涉及草藥的重量是那些草藥的干重。雖然傳統使用和優選干燥原料，必須認識到干燥的植物原料有利于它們的貯藏、運輸和隨后的加工。干燥并不是這些草藥發揮藥效等優點所必需的。因而，采用新鮮植物原料也可實施本發明。當新鮮植物原料的使用足以符合使用的提取物的必須的質量和比例時，皆屬于本發明所包括的范圍內。
藥典個別植物條目下在一個植物屬內給出了幾個種，這是可以理解的。同一屬的這些種可由藥典給出的同一屬的其它成員自由代替，或者一起使用。
此外，人們認識到某一植物部位可含有更高濃度的感興趣的活性成分，本發明在藥典的標準命名法下教導使用特定的植物部位。然而這些成分還可以位于同一植物的其它部位。因而，在當前權利要求書的范圍內感興趣的成分可從同一植物的其它部位提取。本領域熟練人員會理解，借助于植物細胞和組織培養技術，體外培養這些草藥的細胞和組織并從這些細胞作組織提取感興趣的活性成分是可行的。
提取方法需要減小藥材的尺寸。這里，可通過許多方式，包括，但不限于，切割、剁碎、切碎、搗碎、粉碎、碾磨和研磨，完成尺寸的減小。雖然教導了一種方式，還可以使用完成藥材尺寸減小的其它方法和手段。
盡管本說明書已經透過了實施例詳細地描述了前面的發明，所列舉的實施例僅為優選的實施方案。本領域的技術人員可在不背離本發明所描述和要求保護的精神和范圍之內進行變化和修正。利用以上說明，屬于中草藥的制備和使用領域的技術人員應能夠容易地實施本發明。
權利要求
1.一種制劑，包括植物原料草藥青藤屬(Sinomenium spp.)、草藥烏頭(Aconitumcarmichaeli Debx.)、草藥芍藥(Paeonia lactiflora Pall.)、草藥牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)和草藥姜黃(Curcuma longa L.)的提取物。
2.如權利要求1所述的制劑，基本上由植物原料草藥青藤屬、草藥烏頭、草藥芍藥、草藥牡丹和草藥姜黃的提取物組成。
3.如權利要求1所述的制劑，由植物原料草藥青藤屬、草藥烏頭、草藥芍藥、草藥牡丹和草藥姜黃的提取物組成。
4.如權利要求1所述的制劑，其中所述草藥青藤屬來自于由草藥青風藤(Sinomeniumacutum(Thunb.)Rehd.et Wils.)和草藥毛青藤(Sinomenium acutum(Thunb.)Rehd.et Wils.var.cinereum Rehd.et Wils.)組成的組。
5.如權利要求1所述的制劑，其中所述植物原料為青風藤(Caulis Sinomenii)、制附子(RadixAconitii Lateralis Preparata)、白芍(Radix Paeoniae Alba)、牡丹皮(Cortex Moutan)和姜黃(Rhizoma Curcumae Longae)。
6.如權利要求5所述的制劑，其中所述植物原料的重量比例為青風藤2-10份、制附子1-6份、白芍3-15份、牡丹皮1-8份和姜黃1-8份。
7.如權利要求5所述的制劑，其中所述植物原料的重量比例為青風藤5份、制附子3份、白芍6份、牡丹皮3份和姜黃3份。
8.如權利要求7所述的制劑，其基本上由所述植物原料的提取物組成，該植物原料的重量比例為5份青風藤提取物、3份制附子提取物、6份白芍提取物、3份牡丹皮提取物和3份姜黃。
9.如權利要求5所述的制劑，其中所述植物原料的重量比例為青風藤4份、制附子3份、白芍5份、牡丹皮3份和姜黃2份。
10.如權利要求6所述的制劑，進一步包括藥學上可接受的載體、稀釋劑或添加劑。
11.如權利要求6所述的制劑，其中制劑是適于口服給藥的劑型。
12.如權利要求11所述的制劑，其中劑型選自膠囊、粉劑、片劑、液體和囊片。
13.如權利要求1所述的制劑，包括治療有效量的青藤堿、芍藥苷、芍藥酚和姜黃素，其重量比例為青藤堿1-5份，芍藥苷5-28份，芍藥酚1-10份和姜黃素1-8份。
14.如權利要求13所述的制劑，其進一步包括治療有效量的去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素。
15.一種制備如權利要求5所述制劑的方法，其包括以下步驟a.減小植物原料青風藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黃的尺寸；b.以適當的液體不止一次提取從步驟a獲得的尺寸減少的植物原料以得到提取物；c.濃縮由步驟b獲得的提取物；和d.混合以上濃縮的提取物。
16.如權利要求15所述的方法，其進一步包括至少一種從所述步驟b中獲得的提取物經受純化工藝，其中純化工藝是通過聚合吸附樹脂。
17.如權利要求15所述的方法，其中所述植物原料的重量比例為青風藤4份、制附子3份、白芍5份、牡丹皮3份和姜黃2份；以及步驟b進一步包括(i)用水提取青風藤得到它的水提取物作為提取物1.1；及用乙醇提取制附子和白芍得到的它們的乙醇提取物作為提取物1.2；(ii)以超臨界二氧化碳萃取牡丹皮以得到它的超臨界流體萃取物作為提取物2.1；和用乙醇提取通過上述超臨界二氧化碳萃取步驟得到的牡丹皮殘渣以得到牡丹皮的乙醇提取物作為提取物2.2；及(iii)以超臨界二氧化碳萃取姜黃以得到它的超臨界流體萃取物作為提取物3.1；和用乙醇提取通過上述超臨界二氧化碳萃取步驟得到的姜黃殘渣以得到姜黃的乙醇提取物作為提取物3.2，其中步驟c進一步包括濃縮每個通過步驟b得到的提取物以得到濃縮的提取物；其中步驟d進一步包括用適當的賦形劑混合上述濃縮的提取物以得到制劑。
18.如權利要求17所述的方法，其中步驟b中水和乙醇的提取不止一次，將多次提取的提取物混合并過濾以得到過濾的提取物；以及步驟c進一步包括(1)濃縮每個通過步驟b得到的過濾的提取物以達到適合的相對密度；(2)干燥制附子和白芍的濃縮過濾提取物以得到它們的粉末提取物；(3)在濃縮的過濾青風藤和牡丹皮提取物中分別加入蛋清以形成蛋清混合物；煮沸并且離心蛋清混合物；除去蛋清混合物的上清液并且濃縮到合適的相對密度以得到濃縮的濾液；在濃縮的濾液中加入乙醇以形成具有液體部分和固體部分的乙醇混合物；濃縮液體部分；在濃縮的液體部分中加入β-環糊精；干燥上述濃縮的液體部分以形成青風藤的粉末提取物和牡丹皮的粉末提取物；以及；(4)在姜黃的濃縮過濾提取物中加入賦形劑并且干燥所述的提取物以形成姜黃粉末提取物；進一步其中步驟d進一步包括(1)用適當的賦形劑混合上述粉末提取物以形成粉末混合物；(2)粒化粉末混合物以形成顆粒混合物；以顆粒混合物和適當的賦形劑填充膠囊。
19.如權利要求15所述的方法，所述步驟b包括(i)用乙醇提取青風藤、制附子、白芍加以制備提取物1；(ii)以超臨界二氧化碳萃取牡丹皮以制備提取物2；和(iii)以超臨界二氧化碳萃取姜黃以制備提取物3。
20.如權利要求19所述的方法，其中所述提取牡丹皮的步驟進一步包括用乙醇提取牡丹皮殘渣以制備另一提取物。
21.如權利要求19所述的方法，其中所述提取姜黃的步驟進一步包括用乙醇提取姜黃殘渣以制備另一提取物。
22.如權利要求19所述的方法，其中所述植物原料的重量比例為青風藤2-10份、制附子1-6份、白芍3-15份、牡丹皮1-8份和姜黃1-8份。
23.如權利要求22所述的方法，其中所述植物原料的重量比例為青風藤5份、制附子3份、白芍6份、牡丹皮3份和姜黃3份。
24.如權利要求22所述的方法，其中步驟(i)進一步包括(1)用乙醇不止一次提取青風藤、制附子和白芍得到乙醇提取物1；及(2)混合和過濾乙醇提取物1以得到過濾的提取物；步驟(ii)進一步包括(1)以超臨界二氧化碳萃取牡丹皮以得到提取物2；(2)用乙醇不止一次提取通過上述超臨界二氧化碳萃取步驟得到的牡丹皮殘渣以得到牡丹皮的乙醇提取物；及(3)混合和過濾所述牡丹皮提取物以得到過濾的牡丹皮提取物；步驟(iii)進一步包括(1)以超臨界二氧化碳萃取姜黃以得到提取物3；(2)用乙醇不止一次提取通過上述超臨界二氧化碳萃取步驟得到的姜黃殘渣以得到姜黃的乙醇提取物；和(3)混合和過濾所述姜黃提取物以得到過濾的姜黃提取物其中步驟c進一步包括濃縮從步驟(i)-(iii)得到的過濾提取物以分別獲得濃縮的提取物1a、2a和3a；及其中步驟d進一步包括將濃縮提取物1a、2a、3a和提取物2及提取物3混合以得到制劑。
25.用下述方法得到如權利要求6所述的制劑a.減小植物原料青風藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黃的尺寸；b.以適當的液體不止一次提取從步驟a獲得的尺寸減少的植物原料以得到提取物；c.濃縮由步驟b獲得的提取物；和d.混合以上濃縮的提取物。
26.如權利要求25所述的制劑，其中該方法的提取步驟b進一步包括(i)用乙醇提取青風藤、制附子、白芍加以制備提取物1；(ii)以超臨界二氧化碳萃取牡丹皮以制備提取物2；和(iii)以超臨界二氧化碳萃取姜黃以制備提取物3。
27.如權利要求26所述的制劑，其中所述提取牡丹皮的步驟進一步包括以乙醇提取牡丹皮殘渣以制備另一提取物。
28.如權利要求27的制劑，其進一步包括至少一種從所述步驟b中獲得的提取物經受純化工藝，其中純化工藝是通過聚合吸附樹脂。
29.如權利要求6所述的制劑在治療哺乳動物關節炎或與關節炎相關的炎癥及疼痛藥物方面的用途。
30.如權利要求29所述的用途，其中所述關節炎是類風濕性關節炎。
31.如權利要求29所述的用途，其中所述關節炎是強直性脊柱炎。
32.如權利要求29所述的通途，其中所述哺乳動物是人。
33.如權利要求5在治療性關節炎及類似癥狀的藥物方面的用途。
34.一種包括如權利要求1所述的制劑的保健品。
35.一種確定權利要求1所述制劑的質量的方法，該方法包括(a)提供該制劑的提取物；(b)提取物在某些參數下經受至少一種分離技術；(c)至少一種已知的標志物在如上同樣的參數下經受同樣的分離技術；(d)比較至少一種已知標志物和提取物中的相應標志物以確定該制劑的質量。
36.如權利要求35所述的方法，其中所述分離技術選自由薄層色譜、高效液相色譜和其組合所組成的組。
37.如權利要求35所述的方法，其中所述比較步驟包括定性比較和定量比較。
全文摘要
本發明提供一種包括從青風藤、制附子、白芍、牡丹皮和姜黃提取的組分的口服制劑。這種制劑具有抗關節炎、抗炎和鎮痛的性質，并且適用于關節炎、與關節炎有關的癥狀和其它類似癥狀的治療。
文檔編號A61K9/14GK1778383SQ200510099220
公開日2006年5月31日 申請日期2005年9月9日 優先權日2004年11月24日
發明者劉良, 周華, 黃遠帆 申請人:香港賽馬會中藥研究院有限公司