專利名稱：利用電穿孔途徑輸送藥物和基因的裝置和方法
技術領域：
本發明總的來說涉及利用電脈沖增大細胞的滲透性，更確切地說涉及利用可控制的電場通過電穿孔療法(EPT)在活體內將藥物化合物和基因輸送到細胞中，所述的電穿孔療法亦可稱作細胞穿孔療法(CPT)或電化療法(ECT)。
背景技術：
在70年代，人們發現可以利用電場在細胞上產生一些孔隙不引起細胞永久性損傷的下。這一發現使得將大分子送入到細胞質中成為可能。人們知道，基因以及其它諸如藥物化合物一類的其它分子可以通過一種被稱作電穿孔的途徑進入到活體細胞中。將這些基因或其它分子與活體細胞混合在一種緩沖介質中，然后向它們施加短脈沖式的高電場。這些細胞膜上會暫時性地產生一些小孔，基因或者分子進入到這些細胞中，在細胞中改變細胞的基因組。
體內電穿孔一般只局限于應用到靠近生物體的皮膚的組織或細胞上，在這些部位上能夠放置電極。因此，用于電穿孔的電極一般不能接近如腫瘤一類的能夠以全身性藥物輸送方式或化療方式進行治療的組織。在用化療方法治療某些類型的癌癥時，需要在不殺死太多的正常細胞的前提下采用足夠大劑量的藥物來殺死癌細胞。如果能夠將化療藥物直接注入到癌細胞中，則可以達到這一目的。有些抗癌藥，如博萊霉素，通常不能有效地穿透某些類型的癌細胞的細胞膜。但是，采用電穿孔方法就能夠將博萊霉素注入到細胞中。
進行治療的方法通常是，將一種抗癌藥直接注射到腫瘤中，然后向處于一對電極之間的腫瘤施加一個電場。必須以適當的精確度對電場強度進行調節，以便能夠在不損傷、或者至少是最小程度地損傷正常的或健康的細胞的前提下對腫瘤細胞進行電穿孔。對于體表的腫瘤，通常可以在腫瘤的兩側施加一對電極，使電場產生于這對電極之間，由此很方便地實施電穿孔。在電場是均強電場的情況下，可以先測出電極間的距離，然后按照公式E＝V/d(E＝電場強度，單位是伏/厘米；V＝電壓，單位是伏；d＝距離，單位是厘米)將大小合適的電壓加到電極上。當要治療大的或身體內部的腫瘤時，就很難合適地放置電極并測量電極間的距離。在前面提到的專利申請中公開了一種用于體內電穿孔的電極系統，其中的電極能夠被插入到腫瘤中。在相關的美國專利US5273525中，在一個用于在電穿孔過程中注射分子和大分子的注射器中采用了一些注射針頭，這些針頭同時還起著電極的作用。這種結構使得將電極放置到體表之下成為可能。
利用細胞穿孔療法進行治療提供了一種避免產生通常與服用抗癌藥或細胞毒制劑相伴隨的副作用的方法。這種療法使得人們可以引入這些制劑來選擇性地殺傷或殺死所不需要的細胞，同時避免殺傷或殺死周圍的健康細胞或組織。
發明內容
本發明的主要目的是提供一種改進的裝置，該裝置能夠被方便地并且有效地放置到預先選定的組織中以便在所述的組織中產生預定的電場。
按照本發明的一個主要方面，向病人身體的一部分實施電穿孔的電極裝置包括一個支持件，一些安裝在所述的支持件上的用于從選定的部位插入到組織中的彼此相隔一定距離的針電極，以及包括信號發生器在內的裝置，所述的信號發生器響應于所述的距離信號，向所述的這些電極施加一個與所述的電極間的距離成正比的電信號，從而產生具有預定強度的電場。
本發明包括一些針，這些針既起著向組織中注入治療物質的作用，又充當為一部分組織細胞產生電場的電極。
本發明的一個實施例包括一個用于臨床電穿孔治療的系統，所述的系統包括一個針陣列電極，這個針陣列電極具有一個“鍵控”元件，例如一個電阻器或一個有源電路，由該“鍵控”元件確定治療電壓脈沖的給定值以及可選擇的陣列切換模式(具有這種系統的裝置被稱作MedPulseTM)。有幾種電極施加器的結構可用來導入并治療各種組織部位。
本發明的另一個實施例提供了一種腹腔鏡型的針施加器，這種施加器最好是與一個內窺鏡相結合以實現損傷性最小的電穿孔治療。
本發明提供了一種利用針陣列裝置治療細胞，特別是腫瘤細胞的治療方法。
圖1是本發明的一個實施例的橫剖視形式的組裝圖。
圖2a-2g是本發明的幾種可供選擇的電極實施例的示意圖。
圖3是本發明的治療裝置的方塊圖。
圖4是圖3中的治療裝置的電路的示意性方塊圖。
圖5是圖4中的電路的選擇器開關元件的示意圖。
圖6示意性地表示了根據本發明的一個實施例，一種優選的形成9個治療區的針的4×4布局陣列。
圖7a表示根據本發明的一個實施例用于一種2×2治療區的脈沖序列。
圖7b-7d根據本發明的一個實施例用于一種6針陣列的脈沖序列。
圖8是已有技術中的內窺鏡檢查裝置的示意圖。
圖9a-9b更詳細地示出了本發明的一種伸/縮式針陣列。
圖10表示對于各種對照組(D+E-，D-E-，D-E+)和受治療組，在用博萊霉素對Panc-3異種移植裸鼠進行EPT治療后直到120天時的腫瘤體積(D＝藥物；E＝電穿孔)。
圖11a和11b分別表示在加脈沖之前注射藥物和加脈沖之后注射藥物這兩種方式下，用新制癌菌素對Panc-3進行EPT治療時直到第24天時的效果。
圖12表示在用博萊霉素對非小細胞肺癌細胞(NSCLC)異種移植裸鼠，進行EPT治療34天后的腫瘤體積。箭頭表示在第27天時對一只小鼠進行了再次治療(D＝藥物；E＝電穿孔)。
圖13a-13d表示在用EPT治療異種移植的腫瘤(a)的過程中的治療進展順序。治療導致疤痕的形成(b)，疤痕干枯并且最終脫落(c)，在皮膚上留下一個沒有腫瘤的清楚的愈合區(d)。
圖14a-14c表示在治療35天后腫瘤樣本的組織學圖像。在D+E+組中只顯示出壞死的腫瘤與D+E-組中則是有活細胞和壞死細胞混相比在一起(a)，細胞的空胞(b)。在120天后對腫瘤部位的樣本所進行的組織學研究表明，已完全不存在腫瘤細胞(c)。
圖15a和15b分別表示曝露在低電壓EPT下和高電壓EPT下，MCF-7(乳腺癌)細胞的存活率。
圖16a和16b分別表示在加博萊霉素的情況下，曝露在低電壓EPT下和高電壓EPT下的MCF-7(乳腺癌)細胞的存活率。
圖17表示在不加脈沖的情況下和加脈沖的情況下，不同的博萊霉素濃度以及MedPulserTM對MCF-7細胞所產生的效果。
相同的參考數字和標記在不同的圖中代表相同的元件。
總述本發明提供了用于實施電穿孔治療的裝置和方法。所述的方法包括注射化療制劑或分子以及用電穿孔法將所述的制劑或分子引入到腫瘤中的步驟。具體地說，先將制劑或分子注射到組織中，再在設置在組織中的“針”電極之間施加電壓脈沖，由此向該組織的細胞施加電場。下面將要描述的針電極組件使得人們可以在活體內或者在活體外將電極放置到處于體表之下的腫瘤或其它組織內部或者近旁。這種治療方法被稱作電穿孔療法(EPT)，也稱作電化學療法。盡管下面的說明是著重介紹EPT的，但本發明也可應用于其它治療技術，例如對身體的某些器官的基因療法。
有關EPT的一般性討論，可以參見與本申請共同未決的第08/537265號申請，其申請日為1995年9月29日，它是1995年6月6日遞交的第08/467566號申請的接續申請，而后者又是1993年4月1日遞交的、現在已經放棄了的第08/042039號申請的接續申請，此處將所有這些申請引入作為參考。
電極組件圖1是根據本發明的一個實施例的針組件100的橫剖視組裝圖。針組件100包括一個細長的管狀支持體或針桿112，它既可以是由空心的不銹鋼制成的，也可以是由醫用級的塑料(例如尼龍)制成的。如果針桿是由導體材料制成的，則應當為外部設備配備電絕緣，以保護病人和醫生。針桿112包括在針桿的末端的一些電極針114，這些電極針分別與多導線電纜116中的不同導線相連。電極針114既可以是尖的，也可以是鈍的，既可以是空心的，也可以是實心的，并且可以具有任何一種需要的長度。電極針114的材料必須是導電的，但不一定非得是金屬的或同一種材料的(即，可以采用復合的或層狀的結構，例如可以采用金屬鍍膜的塑料針或者陶瓷針)。可以用一個或多個空心的電極針114來注射治療物質。在不同的實施例中，電極針114可以組成方形、六角形或圓形的陣列。但是，也可以采用其它形狀。
在使用中，多導線電纜116與一個高壓發生器相連。在圖示的實施例中，在針桿的末端有一個受磨擦型的環形墊圈120約束的可抽回的保護罩118，所述的保護罩118能夠沿著針桿112前后滑動，以便遮蓋或者曝露出電極針114。
圖2a-2e是本發明的幾種可供選擇的電極實施例的示意圖。圖2a和2b表示兩種帶有針200的直體型電極，在這兩種電極上的針200的距離不同。例如，圖2a中的針構成一個直徑為0.5厘米的直徑陣列，而圖2b中的針構成一個直徑為1.4厘米的陣列。電極主體的尺寸也可以不同。例如，圖2a中的電極具有一種臺階型的主體結構，其前部202的直徑較小，后部204的直徑較大。圖2b中的電極具有一個直徑均勻的主體206。圖2a和圖2b中的電極特別適合用于治療小的表面腫瘤。
圖2c和2d表示兩種斜頭電極，它們各有一組與電極的主體206成一角度的針尖200。圖2c示出針尖與主體206成大約45度角。圖2d示出針尖與主體206成大約90度角。圖2c和圖2d中的電極特別適合用于治療頭頸部的腫瘤。
圖2e表示一種雙角電極，它具有一組與直徑較小的前部202成一角度的針尖200。直徑較大的后部204也成一角度。圖2e中的電極特別適合用于治療喉部的腫瘤，但也可以用于其它體腔中的腫瘤。
圖2f示出了一種特別適合用于治療大腫瘤的電極。針208之間的間隔可以是例如大約0.65厘米。圖2g示出了一種特別適合用于治療內部腫瘤的電極。針208之間的間隔可以是例如大約1.0厘米。
可以根據需要來組合圖2a-2g所示的任何一種獨立的結構元件(例如，主體的尺寸和結構，頭部和主體的角度，等等)。也可以采用其它結構的電極組件以滿足特定的尺寸和入口的要求。
EPT裝置圖3是實現本發明的一種EPT治療裝置300的示意圖。一個電極施加器312以可拆卸的方式連接在裝置300上，裝置300選擇性地向電極施加器312上的已選定的電極針314施加電壓脈沖。脈沖持續時間、電壓的大小、電極針的尋址或者由裝置300輸出的開關模式都可由程序來控制。
顯示器316顯示出治療電壓的給定值。配備了一個遠距離治療啟動接頭318以接納一個腳踏開關320，所述的腳踏開關320用于啟動傳至電極施加器312的脈沖。腳踏開關320使醫生能夠在可騰出雙手將電極施加器312放置在病人的組織中的同時開啟裝置300。
為方便起見，配備了指示燈322來指示故障檢測、電源接通以及治療階段的結束。還配備了其它的指示燈324來明確地指示有一個電極施加器312與裝置300相連，以及指示出陣列的類型(下面將要討論)。設置了一個備用/復位按鍵326，用于使裝置“暫停”以及將裝置的所有功能復位至一個默認狀態。配備了一個就緒接鍵328，用于使裝置300做好進入治療階段的準備。由一個比較顯著的“治療進行中”指示燈330來指示電壓脈沖已被施加到了電極針314。此外，裝置300上還可以帶有聲音指示器，用于指示例如按鍵、故障狀態、治療階段的開始或結束，以及指出治療正在進行中，等等。
在一個可供選擇的實施例中，裝置300可以與一個檢測心率的反饋傳感器相連。在心臟附近施加脈沖有可能會受到正常的心臟節律的干擾。通過在兩次心搏之間的安全期內同步施加脈沖，可以降低這種干擾的可能性。
圖4是圖3中的治療裝置300的電路400的示意性方塊圖。交流電源輸入模塊以電隔離的方式為整個裝置300提供能量。直流電源輸入模塊402為裝置300的控制電路提供合適的能量。高壓電源406提供進行EPT治療所需要的合適的高電壓(例如高達幾千伏)。高壓電源406的輸出與脈沖能量組件408相連，脈沖能量組件408在控制組件410的控制下產生寬度和電壓可變的脈沖。脈沖能量組件408的輸出通過一個高壓開關陣列412與一個針陣列連接器414相連。遠距離治療啟動腳踏板連接器416能夠與腳踏板開關320相接。
高壓開關陣列412使得實施EPT所需要的高電壓能夠被施加到針組件100的眾多電極中的一些選定的亞組上。在已前的EPT裝置中，施加這種電壓時通常要采用一種手動旋轉式“配電器”開美，或者電動模式的這類開關。但是，在本發明中，所有開關操作都是由電控繼電器完成，能夠實現更快速、噪聲更低的切換，并且壽命更長，能夠對開關模式進行更好的以及更靈活的控制。
圖5是圖4所示的電路的高壓開關陣列412的一個選擇器開關元件500的示意圖。這種開關元件500的數量應當至少所安裝的任何一種針組件100中的電極的最大數量相匹配。每個開關元件500控制施加到針組件100的一個電極上的高電壓，并且能夠向有關的電極提供任何一種極性的電壓。
具體地說，當將一個“負”控制電壓施加到一個倒相輸入放大器502a上時，一個相關的常開繼電器504a則被關閉，從而為施加到通過電極連接器506連接的一對電極上的脈沖建立起一個負的返回通道。同樣，當將一個“正”控制電壓施加到一個第二倒相輸入放大器502b上時，一個相關的常開繼電器504b則被關閉，從而為施加到通過電極連接器506連接的一對電極上的正脈沖建立起一個通道。
針陣列尋址圖3所示的裝置300適合于用來與具有不同數量的電極針314的電極施加器312配套使用。因此，在這個優選實施例中，設計出了一個尋址方案，最多能夠對16個電極針進行尋址，這些電極針標號從A到P，最多能夠形成9個方形治療區以及幾種類型的擴大治療區。一個治療區至少包括4根針，這4根針組成兩對相對的針，在一個特定的脈沖過程中被尋址。在一個特定的脈沖中，一個治療區中的兩根針的極性為正，兩根針的極性為負。
圖6示意性地表示了一種形成9個正方形治療區的針優選4×4布局(mapping)陣列，這9個治療區從中心開始以順時針方向順序編號。在這個優選實施例中，這種布局陣列確定了4針、6針、8針、9針以及16針的電極結構。一種4針電極由處在位置F，G，K和J(治療區1)上的鐘組成。一種9針電極由處在構成治療區1-4的位置上的針組成。一種16針陣列由處在構成治療區1-9的位置上的針組成。
圖7a表示根據本發明的一個實施例，施加在一種2×2治療區上的脈沖序列。如圖所示，在構成一個周期的四個脈沖中的任意一個脈沖期間，兩對電極分別被充以正電和負電。這種電極對也可以具有其它模式，例如以順時針或者逆時針的方式行進。對于9針電極構型而言，一個比較可取的周期包括16個脈沖(4個治療區，每個治療區4個脈沖)。對于16針構型電極而言，一個比較可取的周期包括36個脈沖(9個治療區，每個治療區4個脈沖)。
如圖7b-7d所示，6針電極可以構成圓形的或者六角形的陣列。或者，如圖6所示，6針電極也可以是一個大陣列中的一個小組。例如，參照圖6，6針電極既可以是由處在構成治療區1-2(或者其它任何一對沿直線排列的治療區)的位置上的針組成的一種2×3矩形陣列，也可以是由圍成一個擴大了的治療區(圖6中的虛線所示)的針B，G，K，N，I，E(或者其它任何一組圍成一個六角形的位置上的針)組成的六角形結構。同樣，8針電極既可以構成一個八角形，也可以由圖6所示的更大的陣列中的一個小組組成。例如，參照圖6，8針電極既可以是由處在構成治療區1，2和6(或者其它任何三個沿直線排列的治療區)的位置上的針組成的一種2×4陣列，也可以是由圍成一個擴大了的治療區的針B，C，H，L，O，N，I，E(或者其它任何一組圍成一個八角形的位置上的針)組成的八角形結構。
圖6b-6d示出了一種六角形的排列以及一種可能的激活順序。圖6b表示第一種序列，在該序列中，在第一個脈沖期間，針G和K的極性為正，針I和E的極性為負，而在下一個脈沖期間，這些針的極性顛倒過來；針B和N用虛線表示處于非激活狀態。圖6c表示第二種序列，在該序列中，在第一個脈沖期間，針K和N的極性為正，針E和B的極性為負，而在下一個脈沖期間，這些針的極性顛倒過來；針G和I處于非激活狀態。圖6e表示第三種序列，在該序列中，在第一個脈沖期間，針N和I的極性為正，針B和G的極性為負，而在下一個脈沖期間，這些針的極性顛倒過來；針K和E處于非激活狀態。在一個周期的序列中總共施加6個脈沖。相似的激活序列可用在八角形排列的鐘中。
無論采用哪一種物理結構，本發明的優選實施例通常采用至少兩對互相切換的電極(例如，圖7a所示的結構)，以便在接受EPT的組織中形成一種比較均勻的電場。電場的強度應當足夠大，要足以使治療制劑能夠進入，從而有效地實現電穿孔。
電極施加器的自動識別上面描述的布局方案使得不同的電極施加器312能夠與同一個裝置300相連接。由于電極針314的數目可以改變，所以本發明包括一個用于自動對裝置300進行配置以便對適當數目的電極針314進行尋址的部件。在一個實施例中，每個電極施加器312包括一個內置型的識別元件，例如一個“鍵控”電阻器，它使裝置300能夠確定電極針314的數目，并由此對其自身進行設置，以便與尋址方案相匹配。當電極施加器312連接到裝置300上時，裝置300對類型識別元件進行讀操作。可以將類型識別元件安裝到用于連接電極施加器12的一個連接器中，并通過共享的或者指定的電連接來讀取。
作為一個示范性的實施例，下表給出了與電極針314的數目對應的電阻值。
一種與此相似的技術可以用來自動設定裝置300的治療電壓。即，每個電極施加器312包括一個內置式的電壓識別元件，例如一個“鍵控”電阻器，它使裝置300能夠針對具體的電極施加器312來確定治療脈沖的合適的電壓水平。當電極施加器312連接到裝置300上時，裝置300對電壓識別元件進行讀操作。
作為一個示范性的實施例，下表給出了與給定的電壓值相關的電阻值。
對于類型識別和電壓識別，可以采用相同的或者不同的識別元件。識別元件的性質也可以有所不同。例如，可以在每個電極施加器312中裝入一個存有各種變量的數字值或模擬值的電子電路。舉例來說，可以以編碼形式存儲到電極施加器312中的信息實例有針陣列類型參數，如針的數目，針間距，針陣列的幾何圖形，以及/或者針的開關順序；電脈沖參數，如電壓的給定值，脈沖長度以及/或者脈沖形狀；擱置壽命；以及使用期限。如果電極施加器312采用了一種能夠貯存數據的可寫的活化電路(例如NVRAM)，那么另外一些能夠以編碼的形式寫入到一個電極施加器312中的信息包括；擱置壽命鎖定(即，在擱置壽命屆滿時使電極施加器312禁止使用的一個編碼)；使用計數及鎖定(即，在達到允許的使用次數時使電極施加器312禁止使用的一個編碼；當將一個電極施加器312設計成可置換的，能夠防止由重復使用造成的污染)；使用歷史記錄(例如，記錄了已施加脈沖的數量，施加日期和時間等參數的記錄)；以及錯誤碼的捕獲(例如，使一個電極施加器312能夠被返回給制造商，并對施加器的故障形式或者裝置300的故障形式進行分析)。
可以利用從最初開始使用施加器到當前為止的時間長短，以及用同一個裝置進行治療的次數來決定鎖定。其實現方式可以是，在剛與裝置300連上時就往施加器的“鍵控”元件的可置換的啟動電路中寫入一個時間標記，等到超過了一定的時間后便中止使用。這個時間長度的限度可以根據一次外科手術的實際最長時間來決定。
此外，這個“鍵控”元件的用途可以包括生產和質量控制信息。這類信息的一個例子是儀器的生產批號。并且，可以通過禁止使用未經測試的材料來幫助進行質量控制，例如，將儀器設定成只有在成功地完成了生產檢驗之后才能使用。
腹腔鏡針施加器本發明的一個對于治療身體內部腫瘤特別有用的實施例將腹腔鏡針陣列與內窺鏡檢查系統結合在一起，用于進行使損傷最小化的EPT。圖8是已有技術中的內窺鏡檢查系統800的示意圖。按照公知的方式，從光源840發出的光經過一個纖維光導842傳送到內窺鏡844。從內窺鏡844的末端射出來的光照射在組織上。反射光被內窺鏡844的末端收集并傳送到目鏡846，或者通過一個光耦合器850傳送到攝像機848。來自攝像機848的信號可以被記錄在一個錄像帶記錄器852上并且/或者在一個視頻監視器854上顯示出來。
圖9a-9b是圖8中的內窺鏡844的末端經過了改進以后的局部剖視的側視圖，圖中詳細示出了根據本發明的一種伸/縮式針陣列960。一個可移動的外套962中包裹著一個內窺鏡944和針陣列960。圖9a表示外套962處于伸開的狀態，完全罩住了內窺鏡944和針陣列960。圖9b表示外套962處于縮回狀態，曝露出了內窺鏡944和針陣列960的末端。(盡管這個優選實施例采用了一個可移動的外套962，但所需要的是外套962和內窺鏡944之間的相對移動；因此，可以將內窺鏡944看作是可移動元件。)在這個優選實施例中，針陣列960包括至少兩個針電極964，每個針電極964與一個電壓源(未示出)相連，并且這兩個電極中至少有一個可以是空心的，并且通過管道966與一個藥物供源(未示出)相連。最好是使電極針964的尖端伸到內窺鏡944的末端之外，以便在將電極針964插入組織的同時，操作人員能夠通過內窺鏡944看到組織部位。
每個電極針964與一個可壓縮的機構968相連。在圖示的實施例中，對于每個電極針964，可壓縮的機構968包括一個支持臂970，該支持臂970以可旋轉的方式與一個可滑動的底座972和一個第一延伸臂974相連，可滑動的底座972能夠沿著內窺鏡944自由滑動。每個第一延伸臂974以可旋轉的方式與一個安裝在內窺鏡上的固定的底座976相連，同時還與相應的電極針964相連。第二延伸臂977在結構上與第一延伸974臂相似(但沒有支持臂970)，它的作用是，當處于下面將要描述的一種展開結構時，增加電極針964的穩定性。
當外套962處于伸展狀態時，電極針964彼此之間相對比較接近。盡管在某些使用場合下，這種接近程度對于一些特定電壓而言可能比較合適，但在另一些應用場合下，電極針964之間需要具有更大一些的間距。
因此，在這個優選實施例中，當把外套962移到縮回位置時，壓縮元件978(例如一個彈簧)將每個可滑動的底座972朝著遠離固定底座976的方向壓，使得備支持臂970曳拉著與之相連的第一延伸臂974。這個回縮力使得延伸臂974，977以一定角度與內窺鏡944分開，形成一種展開的構形，從而如圖9b所示加大了電極針964之間的距離。
當外套962移動到伸展位置時，外套962將電極針964壓到一起，迫使延伸臂974，977折疊起來。這樣便使得每個第一延伸臂974曳拉著與之相連的支持臂970。這種作用在各個支持臂970上的回縮力引起每個可滑動的底座972朝著固定底座976的方向移動，進入到一個套型結構中，壓縮著壓縮元件978，如圖9a所示。
可以采用其它的可壓縮機構968來將電極針964分開，例如把用可壓縮的彈性材料(例如泡沫或橡膠)制成的楔塊(或者空心的型心錐)放到內窺鏡944和電極針964之間，使楔塊的最寬部分處在內窺鏡944的末端。當外套962處在縮回狀態時，處在楔塊末端的彈性材料比處在楔塊基端的彈性材料膨脹得更多，從而增大了電極針964之間的距離。此外，并不需要使所有的電極針964都能夠被可壓縮的機構968移動。例如，如果將兩個電極針964中的一個相對于內窺鏡944保持在一個固定的位置上，使另一個電極針964能夠在一個壓縮位置和一個伸展位置之間移動，也能使兩個電極針964之間具有足夠的間距；當處在展開狀態時，兩個電極針964相對于內窺鏡944是不對稱地設置的。
在任何一種情況下，可壓縮的機構968都必須在各個電極針964之間提供電絕緣，因此，可壓縮的機構968最好全部或者部分地由一種絕緣體制成，例如由不導電的塑料制成。
盡管這個腹腔鏡針陣列的優選實施例包括一個內窺鏡，但在有些實施例中，將腹腔鏡針陣列與一個獨立的內窺鏡一同使用可能比較合適。在這樣的結構中，可以用一個支持桿代替圖15a和15b中的內窺鏡944。
電場參數所要產生的電場的性質由組織的特點、所選擇的組織的大小以及它所處在的位置決定。電場應當盡可能地均勻，并且應當具有合適的強度。電場強度過大會導致細胞溶解，而電場強度過低則會導致功效降低。安裝和操作電極的方式可以有很多種，包括但不限于在前面的專利申請中所描述的那些方式。可以很方便地操作電極，以及利用鑷子將它們放到體內的部位上。
由脈沖發生器提供的電信號的波形可以是指數衰減脈沖，方脈沖，單極振蕩脈沖串，雙極振蕩脈沖串，或這些波形的任何一種組合。額定電場強度可以為大約10伏/厘米至大約20千伏/厘米(額定電場強度是通過用電極針之間的電壓除以所述的針之間的距離計算出來的)。脈沖的長度可以為大約10微秒至大約100毫秒。脈沖的數量可以根據需要任意設定，一般情況下是每秒1～100個脈沖。脈沖組之間的等候時間也可以根據需要任意確定，例如1秒。也可以根據細胞的類型和將要通過電穿孔的方式進入到細胞中的分子的類型來決定波形、電場強度和脈沖持續時間。
通常可以從報導這一主題的許多研究論文中，或者從由本申請的受讓人----加利福尼亞州圣地亞哥的GENETRONICS公司所保存的一個數據庫中獲得各種參數，所述的參數包括對任何一種已知的細胞進行電穿孔所需要的電場強度。在體內進行如EPT一類的細胞電穿孔所需要的電場，在強度上通常與在體外進行細胞電穿孔所需要的電場相近。發明人的最新研究表明，優選的強度在10伏/厘米至大約1300伏/厘米的范圍內。在一些科學出版物上報導的其他人所做的在體實驗已經證實，這一范圍的上限超過了600伏/厘米。
既可以將額定電場指定為“高”，也可以將額定電場指定為“低”。比較可取的是，當采用高電場時，額定電場強度可以為大約700伏/厘米至1300伏/厘米，最好是大約1000伏/厘米至1300伏/厘米。比較可取的是，當采用低電場時，額定電場強度可以為大約10伏/厘米至100伏/厘米，更為可取的是大約25伏/厘米至75伏/厘米。在一個具體的實施例中，當電場為低時，脈沖長度最好是較長。例如，當額定電場為大約25-75伏/厘米時，脈沖長度最好是大約10毫秒。
本發明的方法最好是利用本發明的裝置來實施，本發明的裝置提供了一個用于向病人身體的一個部分施行電穿孔的電極裝置，該電極裝置包括一個支持部件，一些安裝在所述的支持部件上、用于在選定的部位上插入到組織中的彼此相隔一定距離的針電極，以及包括一個信號發生器在內的部件，所述的信號發生器響應于所述的距離信號，向所述的電極提供與所述電極之間的距離成正比的電信號，以便產生具有預定的強度的電場。
不難理解，其它的系統也可用于本發明的治療方法中(例如，在低電壓、長脈沖治療)，例如，可采用一種方波脈沖電穿孔系統。例如，可以采用能夠從美國加利福尼亞州的圣地亞哥的GENETRONICS公司購得的ElectroSquarePorator(T820)。方波電穿孔系統可發出可控制的電脈沖，這些脈沖能夠迅速上升到所設定的電壓，在這個電壓水平上持續一段設定時間(脈沖長度)，然后迅速降至零。在植物原生質體和哺乳類動物細胞系的電穿孔方面，這類系統比指數衰減系統產生更好的轉化效率。
ElectroSquarePorator(T820)是第一臺市售的能夠產生高達3000伏的電壓的方波電穿孔系統。脈沖長度可以在5微秒至99毫秒之間調節。方波電穿孔脈沖對細胞產生的作用更為溫和，使得細胞的成活力更高。
T820ElectroSquarePorator在高電壓模式(HVM)(100-3000伏)和低電壓模式(LVM)(10-500伏)這兩種模式下都能起動。在LVM下的脈沖長度為大約0.3至99毫秒，在HVM下的脈沖長度為大約5至99微秒。T820具有產生多重脈沖的能力，能夠產生大約1至99個脈沖。
治療方法本發明的治療方法包括電療，此處也稱作電穿孔療法(EPT)，它利用本發明的裝置將大分子輸送到細胞或組織中。如前面所述，此處的術語“大分子”或“分子”表示藥物(例如化療制劑)，核酸(例如多核苷酸)，肽及多肽，包括抗體。多核苷酸包括DNA，cDNA以及RNA序列。
打算用于本發明的方法中的藥物一般是具有抗腫瘤作用或細胞毒作用的化療制劑。這些藥物或制劑包括博萊霉素，新制癌菌素，蘇拉明，阿霉素，碳鉑，紫杉酚，絲裂霉素C以及順氯氨鉑。其它化療制劑是本領域的技術人員公知的(例如，參見The Merck Index)。此外，“作用于膜的”制劑也可用于本發明的方法中。這些制劑也可以是上面提到過的制劑，或者，是那些主要以損壞細胞膜的方式發生作用的制劑。作用于膜的藥制劑的例子包括N-烷基三聚氰胺和對氯汞苯甲酸。制劑的化學成分將決定與施加電脈沖相關的最佳施加制劑時機。例如，當不想受到具體理論的限制時，據信，如果為了避免電場中的充有大量電荷的藥物之間的靜電作用而在電穿孔之后施加藥物，則具有比較低的等電位點的藥物(如新制癌菌素，IEP＝3.78)將產生更好的效果。并且，如博萊霉素一類具有比較大的負log P值(P為辛醛與水之間的分配系數)的藥物的分子量很大(MW＝1400)，并且是親水性的，因此與脂質的膜結合得很緊密，向腫瘤細胞中擴散得非常緩慢，并且通常是在電脈沖之前或者幾乎與電脈沖同時施加。此外，為了使藥物能夠更有效地進入到細胞中，可能需要對某些制劑進行修飾。例如，可以對紫杉酚一類制劑進行修飾，以增大它們在水中的溶解度，這將使它們更有效地進入到細胞中。電穿孔療法在細胞膜上打孔，從而促進了博萊霉素或其它類似藥物進入到腫瘤細胞中。
在一個實施例中，本發明提供了一種用于向受試者的組織施行電穿孔治療以便將分子引入到所述組織的細胞內的方法，該方法包括以下步驟提供一個電極陣列，這些電極中至少有一個電極具有針的結構，用于穿入組織；將針電極插入到所選定的組織中以便將分子引入到組織中；將電極陣列中的第二個電極以與所選定的組織電導通的方式放置；向電極施加高幅度的電信號脈沖，以便對組織進行電穿孔，所述的信號幅度與電極間的距離成正比。應當理解，對組織的電穿孔可以在體外或者體內或者離體進行。還可以利用單細胞施行電穿孔，例如利用單細胞懸浮液或者體外或離體細胞培養物進行電穿孔。
有可能需要利用本發明的方法導入分子，調節細胞中的基因表達。“調節”一詞預示的是，當基因表達過度時則抑制基因表達，而在基因表達得不夠時則加強表達。當細胞增殖性的紊亂與基因的表達有關時，可以來用在翻譯水乎上干擾基因表達的核酸系列。這一方法利用例如反義的核酸，核酶或三鏈螺旋試劑來阻斷特異的mRNA的轉錄或轉譯，既可以利用一種反義的核酸或三鏈螺旋試劑來掩蓋那種mRNA，或用核酶降解。
反義核酸是的至少一部分與特異的mRNA分子互補的DNA或RNA分子(Weintraub，科學美國人，26240，1990)。在細胞中，反義核酸與相應的mRNA雜交，形成雙鏈的分子。反義核酸干擾了mRNA的轉譯，因為細胞不會去轉譯雙鏈的mRNA。最好采用大約15個核苷酸的寡聚物，因為它們容易合成在引入到靶細胞中時，比較的大分子更不容易引發問題。采用反義方法來抑制基因的體外轉譯這一技術在本領域中是眾所周知的(Marcus-Sakura，分析生物化學，172289，1988)。
利用寡聚核苷酸來阻止轉錄這一技術被稱作三鏈螺旋策略，因為寡聚物纏繞在雙螺旋的DNA上，形成一種三鏈的螺旋。因此，這種三鏈螺旋的組合物可以被指定用來識別在一個選定的基因上的一個獨特的點(Maher，et al.，Antisense Res.and Dev.，l(3)227，1991；Helence，C.，抗癌藥物設計，6(6)569，1991)核酶是這樣一些RNA分子，它們具有以與DNA限制性核酸內切酶類似的方式，特異性地降解其它單鏈RNA的能力。通過對編碼這些RNA的核苷酸順序的修飾，能夠設計出這樣一些分子，這些分子能夠識別出在RNA分子上的特定的核苷酸順序并且將其降解(Cech，J.Amer.Med.Assn.，2603030，1988)。這種方案的一個主要優點是，由于它們是對順序特異性的，因此，只是使具有特定順序的mRNA失活。
有兩種基本類型的核酶，即四膜蟲屬型(Hasselhoff，自然(Nature，)334585，1988)以及“錘頭”型。四膜蟲屬型的核酶識別長度為四個堿基的序列，而“錘頭”型的核酶識別長度為11-18堿基序列。識別序列越長，序列排它性地出現在靶mRNA種類中的可能性越大。因此，對于失活特異性的mRNA種類來說，錘頭型的核酶比四膜蟲屬型的核酶更為優選，18堿基的識別序列比較短的識別序列更為優選。
本發明還提供了用于治療由某種特定的基因，或者由于缺少某種特定的基因引起的細胞增生性病癥或免疫學病癥的基因療法。這類療法通過將特定意義的或反義的多核苷酸引入到具有病癥的細胞中來達到其療效。可以利用如嵌合體病毒一類的重組表達載體來實現多核苷酸的傳送，也可以例如將多核苷酸以“裸露的”DNA的形式傳送。
此處所介紹的可用于基因療法的多種病毒載體包括腺病毒，皰疹病毒，痘苗病毒，或者，最好是如逆轉錄病毒類的RNA病毒。逆轉錄病毒的載體最好是鼠或鳥類逆轉錄病毒的衍生物。單個的外源基因能夠插入的逆轉錄病毒載體的實施例包括，但不限于Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV)，Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)，鼠乳腺腫瘤病毒(MuMTV)，以及Rose肉瘤病毒(RSV)。當受試者是人時，可以采用如長臂猿白血病病毒(GaLV)一類的載體。許多附加的逆轉錄病毒載體能夠插入到多重基因中。所有這些載體都能夠轉移或者整合可選擇的標記的基因，從而轉導細胞能被鑒別和產生。
治療用的肽或者多肽也可用于本發明的治療方法中。例如，可以施加免疫調節劑以及其它的生物反應調節物以便供細胞摻入。術語“生物反應調節物”包括這樣一些物質，這些物質參與了對免疫反應的調節。免疫反應調節物的實例包括如淋巴活素一類的化合物。淋巴活素包括腫瘤壞死因子，白細胞介素1，2和3，淋巴毒素，巨噬細胞活化因子，遷移抑制因子，集落刺激因子，以及α-干擾素，β-干擾素，和γ-干擾素以及它們的亞型。
還包括編碼代謝酶和蛋白質的多核苷酸，其中包括抗血管發生化合物，如第八因子或第九因子。本發明的大分子還包括抗體分子。此處的“抗體”包括完整的分子以及它們的片段，如Fab和F(ab′)2。
本發明的方法中的藥物、多核苷酸或多肽可以通過例如注射、快速輸注、鼻咽吸收、皮膚吸收一類不經消化道的途徑給入，還可以口服。例如，在腫瘤的情況下，可以將化療制劑或其它制劑局部性給入或全身性給入，或者直接注射到腫瘤中。例如，當將藥物直接注入到腫瘤中時，最好是以一種“扇型”(“fanning”)的方式注射藥物。“扇型”的含意是，在注射藥物時通過改變針的方向來給藥，或者通過在象一個張開的手掌那樣的多個方向上多次注射藥物，而不是以團塊的形式注入藥物，來達到使藥物在整個腫瘤中分布更廣的目的。與本領域中通常采用的量相比，當在腫瘤內給入(例如注射)藥物時，最好增加含有藥物的溶液的量，以確保藥物在整個腫瘤中的適當分布。例如，在本文的利用小鼠舉的實施例中，本領域的技術人員通常注射50微升含藥的溶液，但是，將含藥溶液的量增大到了150微升，結果在為改善。在人臨床研究中，注射了大約20毫升溶液以確保充分地灌注腫瘤。最好是圍繞著底部以扇型的方式非常緩慢地進行注射。盡管在腫瘤中央的間隙壓力非常高，但這個部位常常也是腫瘤壞死區。
最好是基本上在進行電穿孔治療的同時給入分子。“基本上同時”表示給入分子的時間和進行電穿孔治療的時間非常接近。可以在任何一個時間段內給入分子或治療藥劑，這個時間段取決于這類因素，例如腫瘤的性質，病人的情況，分子的大小和化學特性以及分子的半衰期。
胃腸外給藥的制品包括水溶液或非水溶液，懸浮液，以及乳濁液。非水溶性溶劑的例子有丙二醇，聚乙二醇，諸如橄欖油一類的植物油，以及諸如油酸乙酯一類的可注射的有機酯。除了情性的稀釋液之外，這類組合物還可以包括佐劑，潤濕劑，乳化劑和懸浮劑。此外，可以用血管收縮劑來使治療藥物在加脈沖之前保留在一個部位上。
可以用本發明的方法來治療任何細胞。本文所列舉的幾個例子表明了本發明的方法在治療腫瘤細胞，如胰腺癌，肺癌，頭頸部的癌，皮膚癌以及皮下癌方面的應用。也可以用本發明的電穿孔方法治療其它細胞增生性病癥。“細胞增生性病癥”指的是惡性的以及非惡性的細胞群，這些細胞群從形態學和遺傳型兩個方面都與周圍的組織有所不同。惡性細胞(即腫瘤或癌癥)是由多個階段演變而來的。本發明的方法可用于治療各種器官體系的惡性的或其它類型的病癥。特別是可以用于治療例如胰腺，頭頸部(例如喉部、鼻咽部、口咽部、喉咽部、嘴唇、咽喉)以及肺部的細胞，還包括心臟、腎臟、肌肉、乳房、結腸、前列腺、胸腺、睪丸和卵巢的細胞。此外，還可以用本發明的方法治療皮膚的惡性病變，如基底細胞癌或黑色素瘤(參見例2)。接受治療者最好是人，但是，應當理解，本發明也可用于獸醫領域，用于對非人類的動物或哺乳動物進行治療。
在另一個實施例中，本發明提供了將電穿孔療法應用于受試者組織以損傷或殺死所述組織中的細胞的方法。
所述的方法包括提供一個電極陣列；將該電極陣列中的一個第二電極以可導電的關系放置到所選擇的組織上；向電極施加與電極間的距離成正比的高幅度電信號脈沖，從而對組織進行電穿孔。在這個方法中最好是采用低電壓、長脈沖，排除了對額外的細胞毒制劑或化療制劑的需求。例如，額定電場強度最好是從大約25伏/厘米至75伏/厘米，脈沖長度從大約5微秒至99毫秒。
下面的例子將用于說明本發明，但不是對本發明的限定。盡管它們是可能采用的多種方法中的比較典型的方法，但本領域的技術人員公知的其它療法也同樣可以采用。
幾個實施例下面的幾個實施例描述了EPT在細胞系、動物和人類中的應用。實施例1說明了在以皮下異種移植的方式移植到裸鼠的側腹上的分化不良的人胰腺腫瘤(Panc-3)中施行EPT的情況。實施例2描述了利用EPT治療人類的基底細胞癌和黑素瘤的臨床試驗結果。實施例3描述了利用EPT治療人類的頭頸部腫瘤的臨床試驗結果。實施例4提供了采用低電壓(電場)及長脈沖進行EPT的體外數據。在這些實施例中描述了進行EPT所用的參數；對于實施例1以及對于頭頸部腫瘤的臨床試驗，額定電場強度為1300伏/厘米，6個99-100微秒的脈沖，間隔為1秒。(實施例2的)臨床試驗采用相近似的參數，但電場強度為1130伏/厘米。(額定電場強度(伏/厘米)是施加在一對針上的電壓(伏)除以這時針之間的距離(厘米)所得出的結果。)這些例子表明了利用EPT在活體外以及活體內可以有效地殺滅不需要的細胞群(例如腫瘤)。
實施例1--利用EPT在活體內治療腫瘤一個治療過程包括以下步驟利用本文所描述的扇型方式將博萊霉素(0.15毫升的鹽水中含0.5個單位)注射到腫瘤內，10分鐘后，利用如本申請所描述的針陣列電極施加6個方波電脈沖，這些電極是沿著一個直徑為1厘米的圓周放置的。還采用了直徑可以改變(例如0.5厘米，0.75厘米和1.5厘米)的針陣列以適應不同尺寸的腫瘤。可以將高度不同的擋塊插入到陣列的中心，以使這些針在腫瘤中的穿入深度是可以改變的。有一個內置的機構能夠對電極進行切換，以使脈沖場能夠最大程度地覆蓋腫瘤。電學參數是中央電場強度為780伏/厘米，6×99微秒的脈沖，間隔為1秒。
結果顯示，在幾乎所有小鼠的治療部位上都出現嚴重的壞死和浮腫。在被治療組(D+E+；D＝藥物，E＝電場)中的小鼠身上的腫瘤的體積明顯減小(在剛開始時因浮腫而稍有增大)，而對照組(D+E-)中的小鼠身上的腫瘤的體積明顯增大。對腫瘤樣本所進行的組織學分析顯示，在D+E+組中只有壞死的腫瘤細胞的空胞，而在D+E-組中則是有活性的細胞和壞死的細胞混在一起。對異種移植到裸鼠身上的人非小細胞性癌(NSCLS)瘤的初步研究也表明，用EPT加博萊霉素進行治療取得了鼓舞人心的結果。
腫瘤細胞系Panc-3，即胰腺的分化不良的腺癌細胞系是由圣地亞哥的AntiCancer公司提供的。對于EPT實驗，從維持有腫瘤細胞系的荷瘤的小鼠身上取下組織，將該組織解凍，并切成非常小的片，每片大約1毫米，用外科手段將8-10片這樣的小片異種移植到在裸鼠的左側腹上切出的一個皮下小囊中，然后用6.0的外科縫合線將小囊縫合。在腫瘤的平均尺寸達到大約5毫米之后，將長有可觸知的腫瘤的小鼠隨機地分組，10個小鼠分入對照組(D+E-；D＝藥物，E＝電場)，10個小鼠用于進行EPT治療，即，先注射博萊霉素，然后用BTX方波T820發生器施加脈沖(D+E+)。測量腫瘤的尺寸，用下面的公式計算腫瘤的體積(II/6)×a×b×c其中，a，b和c分別是腫瘤的長、寬和厚度。將0.5單位的博萊霉素(由Sigma Chemicals提供)溶解到0.15毫升0.9％的氯化鈉中，然后將這種溶液以扇型方式注射到對照組(D+E-)和治療組(D+E+)中的每個小鼠的腫瘤中。注射之后過10分鐘，利用本發明中描述的針陣列電極向D+E+組中的每個小鼠施加由BTX T820方波電穿孔器發出的脈沖。所采用的電學參數如下電場強度1300伏/厘米，6個各為99微秒的脈沖，脈沖間隔為1秒。
每天監測小鼠的死亡率，并注意小鼠的任何一種病態跡象。以固定的時間間隔測定腫瘤的尺寸，并對腫瘤的消退/發展進行監測。
圖10表示在對對照組和治療組荷Panc-3腫瘤的動物進行治療時，用和不用藥物以及/或者在用博萊霉素時用或不用脈沖得到的EPT結果。未治療組和治療組的動物在腫瘤的體積方面存在明顯的差異。在大約24天的治療之后，基本上沒有了能夠檢測到的腫瘤。下面的表1也總結了從第0天至43天的圖10中的結果。圖13a-13d按順序顯示了腫瘤的實際消退過程，圖14a-14d則顯示出了相應的組織學圖象。
表1對裸鼠身上的PANC-3腫瘤進行的電化治療
細胞系分化不良的人胰腺腫瘤(Panc-3)小鼠模型裸鼠移植皮下異種移植對照小鼠C1和C2治療組的小鼠T1和T2利用非小細胞性肺癌細胞系(NSCLC)，177(由加利福尼亞圣地亞哥的AntiCancer)重復進行Panc-3實驗。所得到的結果與圖10所示的利用博萊霉素和Panc-3得出的結果相似。在一個實施例中，在第27天時對一個復發的腫瘤進行了再次治療(圖12)，又過了7天之后，沒有見到腫瘤的痕跡。
按照與上面相同的步驟，利用Panc-3和NSCLC模型，用藥物新制癌菌素(NCS)進行試驗。如圖11a所示，當采用與研究博萊霉素時相同的方法，在加脈沖之前給入NSC時，根本達不到減小腫瘤尺寸的效果。據信這是由于NSC具有較低的等電點，靜電作用阻止了藥物進入到腫瘤細胞中。因此，這個實驗的做法是先加脈沖，在加了脈沖之后再注射NSC，如此反復進行。
圖11b表示在第13天時對治療組中的7個小鼠(小鼠編號為1-7)的初始腫瘤體積(I)和最終腫瘤體積(F)進行比較的結果。在其中的幾個小鼠(編號為1，2，4，和7)上觀察到腫瘤體積有所增大，但明顯是由于浮腫造成的。但是，如圖20d所示，當在第23天時對由5個小鼠組成的一個獨立的小組進行測試時，所有的小鼠都表現出腫瘤體積的明顯減小。
圖11a和11b的比較表明，在脈沖之后加入NSC比在脈沖之前加入NSC的效果要好得多。
本實驗例表明，通過本發明的EPT方法，利用博萊霉素或NSC以及針陣列電極，能夠有效地治療異種移植到裸鼠皮下的分化不良的胰腺癌(Panc-3)和非小細胞性肺癌(NSCLC)。其它類似的化療藥物也可以利用本發明的方法取得好的療效-表2列出了Panc-3對EPT加博萊霉素的反應。在治療了28天之后，有68％(17/25)的被治療小鼠的腫瘤完全消退，20％(5/25)部分(＞80％)消退，8％(2/25)沒有反應，4％(1/25)在治療了20天后死亡。甚至在治療后120天時，在64％(16/25)的小鼠身上都沒有觀察到可觸知的腫瘤。這個組中的具有典型意義的動物(2/17)在觀測了243天之后都沒有觀察到腫瘤，在這之后，實驗人員以仁慈的方式對這些動物施行了安樂死。但是，在這些小鼠中有8％的小鼠在治療了35天之后出現了腫瘤的再生長，但生長速度明顯緩慢。
組織學研究清楚地表明，在接受EPT治療的組中，腫瘤區出現了急劇的壞死，而在對照組中則沒有明顯的壞死。與在加脈沖之前注射藥的的進行常規模式相比，用更大劑量的博萊霉素以扇型方式進行藥物注射以使藥物最大程度地均勻分布到整個腫瘤中，這種方法是非常有效的。
表2用博萊霉素對Panc-3進行電化學治療
a，c小鼠因腫瘤負擔加重而死亡b1只小鼠在治療后死亡；1只小鼠在存活64天之后在沒有可觸知的腫瘤的情況下死亡d繼發轉移性瘤e纖維組織利用MedPulserTM的體內實驗結果利用MedPulserTM(本發明的裝置)，治療以皮下異種移植的方式生長到裸鼠身上的腫瘤的初步研究取得了令人鼓舞的結果。當用MedPulserTM和博萊霉素對人胰腺異種移植腫瘤(Panc-4)進行EPT治療時，觀察到39天時，接受治療的小鼠中有大約75％的小鼠的腫瘤完全消退。對人前列腺異種移植腫瘤(PC-3)的治療也表明，大約有66％的腫瘤完全消退。(在治療后60天時仍未觀察到腫瘤)。4針陣列和6針陣列對于用EPT治療腫瘤均有效。
通過在活體外對PC-3進行的實驗來比較MedPulserTM4針和6針陣列用MedPulserTM在活體外對PC-3(人前列腺細胞系)進行實驗，以比較4針陣列和6針陣列的效果。將細胞懸浮在RPMI培養基中，并以200,000個細胞/毫升的濃度均勻接種這些細胞。將2×10-5M的博萊霉素加入到孔(well)中(僅針對D+E-和D+E+)。用與MedPulser相連的6針陣列電極和4針陣列電極對放在24個孔板(well plate)中的細胞進行電穿孔。采用6針電極時的電脈沖參數為6×99微秒，1129伏采用4針電極時的電脈沖參數為4×99微秒，848伏。將這些細胞轉移到96個孔板中，并在37℃下培養20小時。利用XTT測定法測定細胞的存活率，所述的XTT測定法是以XTT代謝轉換為甲為基礎，然后是以450nm的波長進行分光光度分析測定的。只有活的細胞能將XTT轉換為甲。細胞存活率的百分比數值是根據樣本的O.D.值，與100％細胞存活率(D-E-)的對照和與0％細胞存活率(D-E-加上SDS，能溶解所有的細胞)的對照計算出來的一些相對值。細胞存活率的數據如下表3
根據從實驗中得到的初步數據可以得出這樣的結論；從統計意義上來講，4針和6針對于在活體外殺死腫瘤細胞具有相同的效果。
實施例2--針對基底細胞癌和黑素瘤的臨床試驗在8個星期末利用與實施例1中同樣的腫瘤反應標準來評估博萊霉素-EPT對腫瘤的療效。
給入的博萊霉素的濃度為5U/1ml。博萊霉素的劑量如下
表4
下面的表5表示對治療的反應結果NE＝無效；腫瘤體積的縮小程度小于50％。
PR＝部分反應；腫瘤體積的縮小程度等于或大于50％。
CR＝完全反應；當以體檢的方式和/或活檢的方式檢查時都確定腫瘤已消失。
實施例3--用EPT治療頭頸部癌癥采用腫瘤內注射博萊霉素的方式并利用由6根針組成的不同直徑的針陣列對下面所有病人進行治療。通過對電壓進行設定以達到1300伏/厘米的額定電場強度(將針陣列的直徑乘以1300來給出發生器的設定電壓。)脈沖的長度為100微秒。
研究方法這項研究被稱作單中心可行性臨床研究，在該項研究中，將由EPT技術與損害性的博萊霉素結合起來所產生的效果，與常規的手術治療、放療以及/或者全身性化療的效果進行了比較。在該項研究中招收了50名研究受試者。在治療前通過查體和活檢的方式對所有研究受試者進行了評定。在4-6周內每周對研究對象進行一次術后評定，在此之后則每月對他們進行一次評定，總共堅持12個月。在治療后大約8至12周時，對腫瘤部位進行了一次活檢。按照對HNC受試者的標準醫學隨訪跟綜評估方法，利用了CT或核磁共振成像技術。
對腫瘤的評估包括測定腫瘤的直徑(以厘米為單位)以及估計其體積(以立方厘米為單位)。在向腫瘤內注入硫酸博萊霉素之前，用1％的利多卡因(昔羅卡因)和1∶100,000的腎上腺素對腫瘤部位進行麻醉。所注射的硫酸博萊霉素的濃度是每毫升4個單位，每個腫瘤的最高劑量可達到5個單位。如果每位受試者有多于一個的腫瘤需要治療，則每位受試者的總劑量不應超過20單位。所給入的博萊霉素的劑量應當是每立方厘米的計算腫瘤體積1個單位。在注射硫酸博萊霉素之后大約10分鐘時，將施加器放置到腫瘤上，并起動電脈沖。每施加一次或起動一次電脈沖被稱作是一個序列。使用EPT對于受試者所需要的任何一種后續的緩解性治療并不禁忌。
在這項研究中，成功的定義是在16周或更短的時間內，在不出現傳統療法中的一些主要副作用的前提下，腫瘤明顯消退。有三種可能出現的反應結果·完全反應(CR)當以體檢的方式和/或活檢的方式檢查時都確定腫瘤已消失。
·部分反應(PR)腫瘤體積的縮小程度等于或大于50％。
·無反應(NR)腫瘤體積的縮小程度小于50％。
如果腫瘤的大小增大(腫瘤體積的25％)的話，在必要時可根據每位受試者的需求制定其它治療方案。
受試者對治療的反應表6顯示了受試者對治療的反應。三位受試者具有完全反應(1，3和4號受試者)；四位受試者具有部分反應(2，6，8和9號受試者)；兩位受試者對治療沒有反應(5號和7號受試者)。三位受試者在到達第12周之前由于與研究性治療無關的進行性疾病或并發癥而死亡(2，5和7號受試者)。這三位受試者中有一位在第4周時達到PR(2號受試者)。兩位受試者在被招收到研究項目中來之前沒有接受過早期的臨床癌癥治療(4號和8號受試者)。三位受試者所患的腫瘤是儀器的施加器部件不能完全達到的，因此只接受了分段的治療(5，7和9號受試者)。
表7對采用硫酸博萊霉素和利用本發明的裝置MedPulsTM施行EPT的臨床研究進行了總結。
表6對硫酸博萊霉素/EPT的反應
(S)手術，(R)放療，(C)化療；PR-部分反應；CR-完全反應；NR-無反應；**分段治療實施例4-低電壓長脈沖長度(LVLP)的EPT常規的電化學療法采用高電壓短脈沖來治療腫瘤。業已發現，1200-1300伏/厘米及100微秒的電場條件與博萊霉素，順氯氨鉑，匹萊霉素，絲裂霉素C以及carboplatin一類抗癌藥相結合，在體外和體內都非常有效。這些結果涉及到體外和體內的工作。盡管在臨床狀態下病人對這類電學條件完全能夠忍受，但這類治療通常會引起病人的肌肉顫搐和偶然不適。經常能夠發現，不適的感覺與個別病人的痛覺有關。在同樣的實驗條件下，病人們常常會有究全不同的反應。這些問題中的某一些可以通過采用低電壓長脈沖進行電化學治療的方式來有效地解決。曾經報導過的用于體內基因轉移的最低電場強度是600伏/厘米(T.Nishi等人的《癌癥研究》561050-1055，1996)。表8中示出了用于體外EPT實驗的最大電場強度，其中，殺死50％的細胞所需要的電場強度≤50伏/厘米。
以下對各種腫瘤細胞系，如MCF-7(人乳腺癌)，PC-3(人前列腺癌)和C6(大鼠神經膠質瘤)所做的體外實驗表明，就殺死腫瘤細胞而言，低電壓長脈沖比高電壓短脈沖具有相同的或者更好的效果。這些結果是以MCF-7為例做出的。脈沖長度的滴定表明，它的范圍可以是4-15毫秒。在70小時之后，利用XTT化驗分析法在高電壓/短脈沖長度(HVSP)和低電壓/長脈沖長度(LVLP)兩種條件下都進行了MCF-7的電脈沖反應檢測，所述的XTT測定法是以XTT代謝轉換為甲為基礎并且是以450nm的波長進行分光光度分析測定的。(M.W.Roehm等人的文章一種改進的利用的四唑鹽XTT代謝細胞增殖和活性的比色法(An Improved Colorimetric Assay for CellProliferation and Viabilitt Utilizing the Tetrazolium Salt XTT，)免疫學方法雜志1422，257-265，1991。)XTT是一種四唑試劑，即2，3-二(2-甲氧-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯胺)羰基]-2H-四唑基氫氧化物(XTT)，它是在活的細胞中代謝還原成的一種水溶性甲產物。因此，只有活的細胞能將XTT轉換為甲。細胞存活率的百分比數值是根據樣本的O.D.值利用一個公式計算出來的相對值。(與100％細胞存活率(D-E-)的對照和與0％細胞存活率(D-E-加上SDS)的對照)。為了直接與新近研究出來的LVLP模式的EPT相比較，利用HVSP進行了一些實驗。
表8
(LD50是殺死50％的細胞所需要的緩沖致死劑量)象25伏/厘米這樣低的電壓對于細胞引發了很大的細胞毒性。電場強度的增大導致細胞的完全殺死。某些細胞系，如C6神經膠質瘤，沒有受到高電壓脈沖的明顯影響，卻被20-30伏/厘米的低電壓完全殺死了。這些體外試驗的結果，清楚地證明了采用低電壓長脈沖模式的EPT療法的潛力。
藥物和EPT在體外的細胞毒性下面描述利用MCF-7在高電壓和低電壓兩種條件下在活體外用不同的藥物所做的EPT實驗的結果。從ATCC(American Type TissueCollection，Rockville，MD，USA)獲得細胞，并按照ATCC所建議的方法培養這些細胞。使細胞懸浮在合適的培養基中，并將它們均勻地接種到24/96孔板中。將下面這些藥物中的一種以大約1×10-4(1E-4)至1.3×10-9(1.3E-9)的最終濃度，直接加入到細胞懸浮液中這些藥物是博萊霉素，順氯氨鉑，絲裂霉素C，阿霉素以及紫杉酚。利用本文所描述的BTX鐘陣列電極將由BTX T820電方波穿孔機產生的電脈沖施加到位于微型板中的細胞懸浮液中。根據所做的實驗，利用EPT-196針陣列開關，將6個100微秒或者10毫秒的脈沖以不同的高電壓額定電場或低電壓額定電場，施加到6針陣列中的兩個相對的電極對之間。將微型板培養20小時或者70小時，利用XTT測定法測定細胞的存活率。其中一些結果顯示在圖15(a)，15(b)，16(a)，16(b)和17中。
利用MedPulserTM得到與圖17相應的曲線。
對于LVLP模式，本方法表明，即使是在沒有藥物的情況下對細胞施加脈沖，細胞的存活率也遠遠低于50％；當與藥物相結合時，這一百分比進一步減小。更理想的是能表明藥物而不是脈沖產生的效果，因此需要將只有脈沖時的初始存活率選擇在大約80％。圖15(a)表示LVLP模式下的典型的細胞殺死曲線。
盡管已經參照這個優選實施例對本發明進行了描述，但應當理解，在不背離本發明的構思的前提下還可以進行各種改進。因此，本發明的保護范圍僅由下列的其權利要求書限定。
權利要求
1.一種電穿孔裝置，包括a.具有設置形成陣列的至少兩對相對的間隔針電極的可拆卸電極施加器；b.施加器把手，所述把手具有可拆卸地與電極施加器連接的第一端和用于電連接到電源的第二端，其中該施加器設計為使電極施加器的電極與電源電連接；和c.通過施加器把手電連接到電極施加器的電極的電穿孔電源。
2.如權利要求1所述的電穿孔裝置，其進一步包括確定電極施加器的相對電極對間的距離和向電極施加與電極間的距離成比例的電信號以產生預定強度的電場的裝置。
3.如權利要求1所述的電穿孔裝置，其中，至少一個針電極也允許治療物質被注射進入組織中。
4.如權利要求1所述的電穿孔裝置，其是腹腔鏡裝置。
5.如權利要求4所述的電穿孔裝置，其進一步包括內窺鏡。
6.如權利要求1所述的電穿孔裝置，其進一步包括控制器，所述控制器用于指導向電極施加器的選擇針電極選擇性施加電脈沖。
7.如權利要求6所述的電穿孔裝置，其中所述控制器是可編程的。
8.如權利要求7所述的電穿孔裝置，其中，所述控制器可關于下面至少一項編程每個電脈沖的持續時間；每個電脈沖的電壓水平；每個電脈沖的極性；和相對的間隔針電極對用給定的電脈沖尋址。
9.如權利要求1所述的電穿孔裝置，其與傳感器結合以檢測患者的心搏。
10.如權利要求9所述的電穿孔裝置，其中，電脈沖的施加是與心搏間的間隔同步進行以避免干擾正常的心跳節奏。
11.如權利要求1所述的電穿孔裝置，其進一步包括開關陣列以允許向電極施加器的針電極的亞組施加一個或多個電脈沖。
12.如權利要求1所述的電穿孔裝置，其可以適用于多種不同電極施加器類型中的任意一種，其中每個電極施加器類型關于至少下面一項與其它電極施加器類型不同設置在電極施加器上的相對的間隔針電極對的數目；相對的間隔針電極對的幾何構型；電極施加器的形狀。
13.如權利要求12所述的電穿孔裝置，其進一步包括控制器，所述控制器用于指導向電極施加器的選擇針電極選擇性施加電脈沖，其中每個電極施加器類型具有識別元件，該識別元件允許控制器確定電極施加器的類型和其針電極陣列構型。
14.如權利要求1所述的電穿孔裝置，其中電穿孔電源包括電連接到脈沖能量組件的高壓電源以產生不同寬度和電壓的電脈沖，并且該電穿孔裝置進一步包括控制來自脈沖能量組件的電脈沖的寬度和電壓的控制器。
15.如權利要求14所述的電穿孔裝置，其中由電穿孔電源提供的電脈沖具有如下的波形指數衰減脈沖、方脈沖、單極振蕩脈沖串、雙極振蕩脈沖串、或任何上述脈沖或脈沖串的組合。
16.如權利要求1所述的電穿孔裝置，其中來自電穿孔電源的電脈沖可以產生約10V/cm-約20kV/cm的電場。
17.如權利要求1所述的電穿孔裝置，其中來自電穿孔電源的電脈沖的持續時間為約10微秒-約100毫秒。
18.如權利要求3所述的電穿孔裝置，其中治療物質選自化療制劑、多核苷酸、肽和多肽。
全文摘要
本發明涉及在體內進行電穿孔治療的方法和裝置(100)。利用本發明中描述的電穿孔療法(EPT)，將利用本發明的裝置(100)實施的電穿孔與化療藥物結合起來治療腫瘤，使活體內的腫瘤消退。在一個實施例中，本發明提供了一種用低電壓長脈沖促使細胞死亡的EPT方法。本發明的一個實施例包括一種用于進行臨床電穿孔的系統，該系統包括一個具有“鍵控”元件的針陣列電極(114)，由該“鍵控”元件確定治療電壓脈沖的給定值，以及/或者選擇陣列的開關模式。有多種電極施加器的設計方案，從而能夠進入并治療多種組織部位。另外一個實施例提供了一種腹腔鏡針施加器，最好是將它與一個內窺鏡結合起來以實現損傷性最小的EPT。
文檔編號A61K31/7088GK1768873SQ20051008473
公開日2006年5月10日 申請日期1998年7月31日 優先權日1997年8月1日
發明者G·A·霍夫曼, S·B·德弗, S·C·迪姆默, J·I·勒瓦特, G·S·南達 申請人:基因特朗尼克斯公司