多價細菌莢膜多糖－蛋白質結合物聯合疫苗的制作方法

專利名稱：多價細菌莢膜多糖－蛋白質結合物聯合疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種多價細菌莢膜多糖與蛋白質共價結合物的聯合疫苗制劑，特別是一種含A群、C群、Y群、W135群流行性腦脊髓膜炎球菌莢膜多糖-蛋白質結合物和b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-蛋白質結合物的聯合疫苗。
背景技術：
流行性腦脊髓膜炎是一種具有悠久歷史的人類傳染性疾病，流行地域極廣，遍及全球各大洲，至今仍未得到有效的控制。該病的病原體——腦膜炎奈瑟氏球菌只感染人類，人與人之間通過飛沫或分泌物直接傳染，通常情況下，這種接觸使對方成為一個健康帶菌者，根據年齡和環境的不同，10-50％的人可成為帶菌者。在人體抵抗力下降及特定環境影響下，腦膜炎奈瑟氏菌可以侵入血流，繼而發病，通常發生在接觸該菌后的一周內。該病來勢非常兇猛，伴有嚴重腦膜感染的綜合癥狀；嚴重的全身癥狀主要有敗血癥、休克、出血、紫癜、彌散性血管內凝血或內臟出血，病死率較高，盡管抗生素有較好的治療效果，病死率仍維持在5～10％之間。
腦膜炎奈瑟氏菌是引起流行性腦脊髓膜炎(以下簡稱腦膜炎球菌)的病原菌，根據其莢膜多糖的特異性可將腦膜炎球菌分成A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y和Z13個血清群，所有血清群的細菌均可致病，但A、B、C、Y和W135毒力最強，上述5個血清群占病例數的95％以上，其中A群、C群傳染性最強，是引起腦膜炎流行最常見的菌株。
A群流行性腦脊髓膜炎球菌莢膜多糖疫苗是第一個用于預防A群流行性腦脊髓膜炎球菌感染的疫苗，應用以后使A群流行性腦脊髓膜炎的發病率及病死率得以大幅度的降低。
A群腦膜炎球菌莢膜多糖疫苗研制成功之后，相繼研制出了A/C群腦膜炎球菌莢膜多糖雙價疫苗以及含A、C、Y、W135群四價腦膜炎球菌莢膜多糖成分的聯合疫苗。由于各國均以A群腦膜炎球菌、C群腦膜炎球菌流行為主，因此，目前各國使用的疫苗主要為A群腦膜炎球菌莢膜多糖疫苗、或A/C群腦膜炎球菌莢膜多糖疫苗等。
b型嗜血流感桿菌(Hib)是引起兒童細菌性腦炎、肺炎、蜂窩組織炎等疾病的主要病原體。在使用有效的疫苗前，美國每年有1.6～2.5萬多名兒童因Hib引起感染；其中60％的兒童患上最嚴重的Hib感染并發癥——細菌性腦炎。其中10％因腦炎致死，許多幸存者則造成嚴重的永久性功能喪失。其他感染包括菌血癥、肺炎、膿胸、心包炎、蜂窩組織炎、膿毒性關節炎及會咽炎等。1988～1991年期間，最初獲準對大嬰幼兒進行Hib結合疫苗接種，以后又獲準對小嬰幼兒進行接種，使Hib侵襲性疾病及相關的發病率及死亡率明顯減少。過去幾年里，Hib疾病患病人數降低了95％，美國疾病控制及預防中心將5歲以下兒童的Hib疾病作為一種可采用疫苗加以控制的疾病，并計劃1996年消除；到1997年7月，該目標已接近實現但尚未完全達到。值得說明的是，在對18個月齡以下兒童廣泛使用疫苗前，Hib疾病發病率已開始下降。其可能是由于接種Hib結合疫苗降低了較大兒童的無癥狀攜帶率，而導致了18個月齡以下兒童的感染風險降低。這種“群體免疫”作用所達到的效果是使用疫苗前未預料到的，Hib結合疫苗的成功免疫，為研究及預防由其他含多糖莢膜的細菌引起的感染提供了可借鑒的經驗。
作為結合疫苗的載體，必須選擇安全有效的蛋白質。這種蛋白質必須對人體沒有毒性，也不會引起變態反應，同時又能增強多糖的免疫原性，因此可供選擇的種類并不多。目前使用的載體主要為微生物來源的蛋白質，例如現成的白喉和破傷風類毒素，經基因突變發生減毒的白喉毒素(CRM-197)以及細菌的外膜蛋白質等，而且已經用于臨床。蛋白質載體也可以源于與多糖同一菌種的致病菌，例如b型嗜血流感桿菌莢膜多糖偶聯疫苗可以用該菌的外膜蛋白質作為載體；肺炎球菌莢膜多糖偶聯疫苗可以用肺炎球菌的溶血素蛋白質作為載體，其優點是能具有對不同型別的肺炎球菌感染有交叉免疫保護效果。還有一些細菌的毒素蛋白質也可作為載體，例如霍亂毒素、霍亂毒素的B亞單位和大腸桿菌的不耐熱腸毒素，因為它們同時還具有佐劑的效應。另外還有綠膿桿菌的外毒素A、P6和一些高分子外膜蛋白質，以及不相關的蛋白質如人血清蛋白等，但是這些蛋白質載體仍處于動物實驗階段，尚未用于臨床。
至今已經研制成功多種不同的單價細菌莢膜多糖-蛋白結合疫苗及7價肺炎球菌莢膜多糖-CRM197白喉類毒素結合疫苗。結合疫苗具有以下一些特點(1)能增強嬰幼兒對細菌莢膜多糖的免疫反應，這主要是由于結合疫苗能激活T輔助性淋巴細胞和形成T記憶細胞，重復接種能產生記憶性免疫增強作用，使主要為IgG的抗細菌莢膜多糖抗原的抗體水平劇增，對嬰幼兒接種后能產生較為持久的免疫保護力。(2)細菌的多糖-蛋白質結合疫苗可成為二價疫苗。這是因為結合疫苗可同時產生針對多糖和蛋白質載體的抗體反應。(3)能增強老年人和某些免疫功能低下或有缺陷的病人對細菌莢膜多糖抗原的免疫反應。例如肺炎是老年人的常見病，肺炎球菌莢膜多糖和蛋白質的結合疫苗可以增強疫苗對老年人的免疫保護力。結合疫苗也可使一些缺乏對細菌莢膜多糖抗原產生免疫反應的個體產生高效價的抗多糖抗原的抗體。(4)結合疫苗具有載體蛋白質的效應。事先或同時接種蛋白質載體會刺激T淋巴細胞的增殖，因而能增強結合疫苗的免疫原性。
中國專利ZL 02159032.X公開了一種多糖-蛋白結合疫苗的制備方法，主要涉及A、C群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖與多種蛋白質載體的偶聯與純化方法及疫苗的配制方法，該專利所述的多糖-蛋白結合疫苗的價數為3價多糖，不含Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-蛋白結合疫苗。

發明內容
本發明提供了一種含A群，C群，Y群和W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-蛋白結合物以及b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-蛋白結合物的聯合疫苗制劑。
本發明的聯合疫苗制劑，由上述5種多糖-蛋白結合物混合制備的，其中5種結合物混合的重量比例在1∶0.5～2.5之間，優選的為1∶1-2之間，更優選的為1∶1，其中，重量比例是按多糖計算的，每一單位給藥劑量的制劑中含有A群，C群，Y群和W135群腦膜炎球菌莢膜多糖以及b型嗜血流感桿菌莢膜多糖的量在5-25μg之間，所述每一單位給藥劑量是指每次用量的制劑量，或每一制劑單位如注射劑1支中內容物的量。而本發明的制劑優選的為注射用的制劑，如粉針劑或水針劑。可皮下或肌肉注射。
本發明的聯合疫苗制劑，其中的蛋白載體選自破傷風類毒素、白喉類毒素、人血清免疫球蛋白、B群流行性腦脊髓膜炎球菌外膜蛋白等。
本發明的聯合疫苗制劑，其中多糖與蛋白載體的結合是以多糖用溴化氰或硼氰酸鈉活化，然后與己二酰肼或其他同功能的化合物反應，在碳二亞胺的作用下與蛋白載體共價結合。
本發明的聯合疫苗制劑，其特征在于，還可含有氫氧化鋁或磷酸鋁作為佐劑，加入量為0.10～1.5mg鋁佐劑/每劑。其中每劑指每一單位給藥劑量的制劑。
本發明的聯合疫苗制劑，其特征在于，制劑中還可含有其他已知的可提高機體免疫的人細胞因子如GM-CSF、IL-2、IL-12、或單磷脂A、或胞壁酰二肽或其衍生物等，或與它們結合使用可提高機體免疫力。
本發明也可以用人血清IgG作為載體蛋白制備結合疫苗，其所含的蛋白載體——IgG的Fc片段可與人體內抗原呈遞細胞表面的Fc受體結合，使其主動吞噬并處理抗原，增強多糖抗原的免疫原性。
本發明的聯合疫苗可以和目前市售的多種含鋁佐劑疫苗如氫氧化鋁/磷酸鋁吸附白喉-百日咳-破傷風疫苗、基因重組乙型肝炎疫苗、破傷風類毒素疫苗等混合使用。
本發明的聯合疫苗制劑，可通過以下制備工藝制備多糖原料選用A、C、Y、W135群腦膜炎球菌菌種、b型嗜血流感桿菌菌種經過發酵培養生產出A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖，其純化步驟可以為目前通用的常規步驟，也可以采用本發明所述的大孔合成樹脂精制細菌莢膜多糖的方法，該方法是，用聚苯乙烯/聚甲基丙烯酸酯大孔合成樹脂吸附粗制多糖溶液中的色素、蛋白質及核酸類污染物，再以蛋白變性劑苯酚除去多糖溶液中殘留的不能被大孔樹脂吸附的微量蛋白，其中苯酚的用量為目前世界衛生組織推薦工藝的1/4至1/10。
載體蛋白原料精制破傷風類毒素系用破傷風梭狀芽孢桿菌菌種，在適宜的培養基中培養產生的毒素經甲醛脫毒、精制而成；其方法為常規制備方法。
精制白喉類毒素系用白喉桿菌菌種，在適宜的培養基中培養產生的毒素經甲醛脫毒、精制而成。其方法為常規制備方法。
人血清IgG系市售的靜脈注射用生物制品，可以從市場上買到。
制備方法經過活化的多糖原料和載體蛋白原料在碳二亞胺的作用下，通過共價鍵結合，形成多糖-蛋白結合物。具體是A群流行性腦膜炎球菌莢膜多糖、C群流行性腦膜炎球菌莢膜多糖、Y群流行性腦膜炎球菌莢膜多糖、W135群流行性腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖分別與蛋白結合，制備各自的多糖-蛋白結合物原液，其方法為常規制備方法。然后，再按本發明規定的比例混合，制備多糖-蛋白結合疫苗。根據需要，可以加入氫氧化鋁或磷酸鋁佐劑后即成為含鋁佐劑的疫苗。
本發明的聯合疫苗制劑，以破傷風類毒素、白喉類毒素、B群腦膜炎球菌外膜蛋白(OMP)作為腦膜炎球菌莢膜多糖的載體蛋白免疫兒童，可喚起免疫系統對破傷風類毒素、白喉類毒素、OMP(先前感染B群腦膜炎球菌)的回憶反應，從而得到較好的對腦膜炎球菌莢膜多糖的免疫反應。
本發明的疫苗可用于免疫2月齡以上各年齡段的兒童，預防兒童罹患A、C、Y、W135群流行性腦脊髓膜炎球菌、b型嗜血流感桿菌引起的感染性疾病。它的特點是既能增強多糖抗原的免疫原性，又能減少嬰幼兒接種疫苗的次數，減輕嬰幼兒的痛苦和家長的精神負擔。降低免疫接種成本，提高免疫覆蓋率。
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發明。
實施例一A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖的提取生產多糖疫苗可選用適宜培養基。生產用的液體培養基不含能與十六烷基三甲基溴化銨形成沉淀的成分。培養基中不含對人體有害或其它過敏原物質。
在適宜的培養基中接種菌種后，于對數生產期后或靜止期前期收獲。將培養物加入甲醛溶液殺菌或加熱殺菌，以確保殺菌安全并不損傷菌體多糖為宜。將已殺菌的單一收獲物(或合并收獲物)離心去菌體，收集上清液，用50～100KD截留分子量的超濾膜濃縮已收獲的上清液至原體積的1/8，加入十六烷基三甲基溴化銨混勻，室溫攪拌60分鐘，1-5℃靜置6～12小時，15000×g高速離心收集沉淀物。沉淀物中加入氯化鈣溶液，終濃度為1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，過濾除去不溶物，加入乙醇至最終濃度為25-35％(v/v)。1～10℃靜置3小時以上，離心去除核酸沉淀物，收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷乙醇至最終濃度為70～80％(v/v)，充分振搖。離心收集沉淀，然后用無水乙醇及丙酮各洗2次以上，將沉淀物(多糖粗制品)保存在-20℃以下待進行一步提取。
將粗制品溶解于中性醋酸鈉緩沖液中，使其濃度達10～20mg/ml，然后流經用中性乙酸鈉緩沖液預平衡的聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸酯大孔樹脂層析柱，收集流出液，超濾濃縮，按1∶2體積用冷酚提取，離心收集上層水相清液，并用0.1mol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析48～72小時或用3～100KD超濾膜超濾5次(1∶4～10)除去苯酚，加乙醇至最終濃度為75％～80％(v/v)。離心收集沉淀物，用無水乙醇及丙酮各洗2次以上。離心后傾去上清液，用旋轉蒸發器真空抽干殘存的有機溶劑，獲得多糖干粉，保存于-20℃以下。
用注射用水溶解多糖，所得溶液即為提取的多糖原液。原液經除菌過濾后，取樣進行無菌試驗、血清學試驗及各項生化測定。除菌后的液體多糖應保存在-20℃或以下，待下一步與蛋白偶聯。
采用本方法精制的莢膜多糖為白色粉末狀物質，不含色素及脂類雜質，各項鑒定指標均符合現行世界衛生組織《腦膜炎球菌莢膜多糖疫苗制造及檢定規程》(No.23，1986)的要求，精制過程中苯酚的用量僅為世界衛生組織推薦方法的1/4～1/10，極大地減輕了對環境的污染。
實施例二莢膜多糖的裂解及純化將5克A群(或C、Y、W135群)奈瑟氏腦膜炎球菌莢膜多糖(或b型嗜血流感桿菌莢膜多糖，Hib)溶于10升1/10飽和度的乙酸鈉緩沖液中(pH5.5～6.0，用乙酸調節酸堿度，室溫)，室溫下攪拌，充分溶解8～12小時，至溶液澄清透明，補加60℃預熱的50mM乙酸鈉緩沖液(pH 5.5～6.0)38.33升，不銹鋼反應罐夾套內循環水加熱，維持罐內多糖溶液溫度在55-56℃，攪拌0.5小時，向罐內加入30％的過氧化氫1670ml，裂解多糖，裂解過程中維持攪拌速度100轉/分鐘。
多糖裂解過程通過跟蹤多糖分子量的變化來監控，分子量的測定用島津20AT HPLC TSK3000W液相色譜測定，每20分鐘取樣1次，檢測反應罐內多糖分子量的大小。當多糖的分子大小主要分布在3～100KDa之間時，關閉自動加熱裝置，放掉反應罐夾套內的循環水，向夾套內通入-10℃乙二醇/水冷卻液，至罐內液體溫度達到4℃后，將乙二醇/水冷卻液的溫度調整為2℃，由溫度自控系統依據罐內液體的溫度控制夾套內冷媒循環系統的開閉。
將反應罐與裝有3KDa聚醚砜超濾膜的超濾系統連接，啟動超濾系統，濃縮至罐內液體量為5升。加入20升0.15mol/L無菌氯化鈉溶液(4℃)，啟動超濾系統，繼續超濾至罐內液體為5升，重復此過程5次。在整個超濾過程中，始終控制罐內液體溫度在2～4℃。超濾結束后，將超濾后的多糖溶液放置在2～4℃，備用。
實施例三多糖與破傷風類毒素偶聯及純化1.活化多糖取A群(或C群、Y群、W135群)腦膜炎球菌莢膜多糖(或Hib)多糖400mg(4mg/ml，100ml)，用0.5M NaOH調pH至10.8，加200mg溴化氰，用0.5MNaOH維持pH在10.8±0.5左右1小時(22℃)。然后用0.5M HCl調pH至8.8，加入1450mg己二酰肼(ADH)，反應6分鐘；用0.5M NaOH調pH至8.5，維持pH在8.5±0.5的范圍內15分鐘；4～8℃輕輕攪拌12小時。用預冷0.05MNaCl溶液透析48小時(4～8℃)，在此期間換液5次(或用3KD的聚醚砜超濾膜超濾)。用0.45μm濾膜過濾活化多糖-AH衍生物。
2.活化多糖與破傷風類毒素(TT)偶聯(4～8℃冰水浴下操作)將破傷風類毒素溶液的蛋白濃度調整為4mg/ml，分別取100ml加入到已活化的多糖-AH衍生物溶液中，充分混勻后，用0.5mol/L HCl調pH至5.7。加碳二亞胺(EDAC)4000mg，滴加鹽酸維持溶液的pH在5.7±0.2范圍內90分鐘；用0.5mol/L NaOH調pH至6.8，用預冷0.2mol/L NaCl溶液透析12小時(4～8℃，或用截流分子量為100KD的聚醚砜濾膜超濾)，除去碳二亞胺(EDAC)及低分子物質。
3.多糖-蛋白結合物純化及檢定(4～8℃條件)將多糖-TT結合物溶液超濾濃縮為40ml，經Sephacryl S-400HR(或Sephacryl S-1000、Sepharose CL-4B、Sepharose 4FF、TSK Toyopearl-65等)層析柱(3.5×100cm)純化，以0.2mol/L NaCl流洗，流速為2.5ml/分鐘，以206nm/280nm波長的在線式紫外檢測器檢測流出液的吸光值變化，收集含多糖-蛋白偶聯物的洗脫峰，經0.22μm無菌無熱原濾膜過濾后即為多糖-蛋白結合疫苗原液。
A群腦膜炎球菌莢膜多糖含量的測定按Bartlet，GR.J.，Journal of BiologicalChemistry 1959234，466-468頁刊載的方法，唾液酸含量的測定按Svennerholm，L.，Biochemica Biophysica Acta.195524，604-611頁刊載的方法；O-乙酰基含量的測定采用Hesterin，S.Journal of Biological Chemistry，1949，180249頁刊載的方法。蛋白含量的測定采用Lowry，O.H.，et al.，Journal ofBiological Chemistry，1951，193265-275頁刊載的方法，內毒素含量測定采用《中華人民共和國藥典》第三部附錄XIIE方法。
采用上述多糖、TT反應比例制備的A群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結合物及Hib多糖-TT結合物中多糖與TT的重量比為0.2∶1～0.8∶1；C群腦膜炎球菌莢膜多糖與TT的重量比為0.6∶1～1.5∶1。Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖與TT的重量比為0.3∶1～1.0∶1；游離多糖含量小于20％。LAL(內毒素)含量不超過5EU/μg多糖。
實施例四、氫氧化鋁佐劑吸附A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖結合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結合疫苗原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結合疫苗原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結合疫苗原液、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結合疫苗原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-TT結合疫苗原液分別稀釋至200μg/ml(按多糖計算)，將以上5種稀釋后的疫苗液各取等量放于一無菌容器內，充分混合后，加入氫氧化鋁佐劑，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～10μg的氫氧化鋁吸附多糖-TT結合疫苗。
實施例五磷酸鋁佐劑吸附A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖結合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結合疫苗原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結合疫苗原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結合疫苗原液、W群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結合疫苗原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-TT結合疫苗原液分別稀釋至200μg/ml(按多糖計算)，將以上5種稀釋后的疫苗液各取等量放于一無菌容器內，充分混合后，加入磷酸鋁佐劑，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～10μg的磷酸鋁吸附多糖-TT結合疫苗。
實施例六A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖結合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結合疫苗原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結合疫苗原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結合疫苗原液、W群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結合疫苗原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-TT結合疫苗原液分別稀釋至200μg/ml(按多糖計算)，將以上5種稀釋后的疫苗液各取等量放于一無菌容器內，加入氯化鈉溶液，充分混合后，4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～20μg的結合疫苗。
實施例七A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-TT結合疫苗動物免疫試驗按上述實施例三、四、五方法制備的A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-TT結合疫苗，每毫升疫苗含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各20μg。加三倍體積的鋁稀釋劑或生理鹽水稀釋后，即為動物實驗用疫苗，分別于0、14天免疫SPF級BALB/C小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，免疫劑量為0.5ml(含每種多糖2.5μg)。分別于0、14、28天采集血液，分離血清，測定抗體滴度前將血清放置于-20℃。免疫動物的同時設生理鹽水對照組及同劑量多糖疫苗對照組，以酶聯免疫法(ELISA用酶標板以各群或型莢膜多糖-HAS結合物包被)測定血清IgG抗體滴度。結果見表1。結合疫苗第1次免后2周小鼠血清抗體滴度顯著高于免前(p＜0.01)；第2次免后2周的抗體滴度顯著高于第1次免后2周的抗體滴度(p＜0.05)。結合疫苗免后產生的抗體效價顯著高于多糖疫苗免疫后產生的抗體效價。多糖疫苗1、2次免疫后產生的抗體效價無顯著性差異。
實施例八A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合疫苗(一)B群腦膜炎球菌外膜蛋白的提取B群腦膜炎球菌外膜蛋白(OMP)的提取方法按照孫銀燕、胡緒敬報道的方法[見中華微生物學和免疫學雜志，1998，18(6)423-427]，蛋白含量的測定采用Lowry法。
(二)多糖與B群腦膜炎球菌外膜蛋白的偶聯1.活化多糖取按實施例二制備的A群(或C、Y、W135)腦膜炎球菌(或Hib)多糖400mg(4mg/ml)，用0.5mol/LNaOH調pH至10.8，加入200mg溴化氰，用0.5mol/L NaOH維持pH在10.8±0.5左右1小時(22℃)。然后用0.5mol/L HCl調pH至8.8，加入1450mg己二酰肼(ADH)，反應6分鐘；用0.5mol/L NaOH調pH至8.5，維持pH在8.5±0.5的范圍內15分鐘；4～8℃輕輕攪拌12小時。用預冷0.05mol/L NaCl溶液透析48小時(4～8℃)，在此期間換液5次(或用3KD的超濾膜超濾)。用0.2μm濾膜過濾活化多糖-AH衍生物。
2.活化多糖與B群腦膜炎球菌外膜蛋白偶聯(4～8℃冰水浴下操作)將B群腦膜炎球菌外膜蛋白溶液的蛋白濃度調整為4mg/ml，取100ml加入到已活化的多糖-AH衍生物溶液中，充分混勻后，用0.5mol/L HCl調pH至5.7。加碳二亞胺(EDAC)4000mg，滴加鹽酸維持溶液的pH在5.7±0.2范圍內90分鐘；用0.5mol/L NaOH調pH至6.8，用預冷0.2mol/L NaCl溶液透析12小時(4～8℃，或用截流分子量為100KD的濾膜超濾)，除去碳二亞胺(EDAC)及低分子物質。
(三)多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合物純化(4～8℃條件)將多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合物溶液超濾濃縮為40ml，經SephacrylS-400HR(或Sephacryl S-1000、Sepharose CL-4B、Sepharose 4 FF、TSKToyopearl-65等)層析柱(柱長5×100cm)純化，以0.2mol/L NaCl流洗，流速為1.5ml/分鐘，以206nm/280nm波長的在線式紫外檢測器檢測流出液的吸光值變化，收集V0附近的洗脫峰，經0.2μm濾膜過濾后即為多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合疫苗原液。
(四)A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合物原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合物原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合物原液、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合物原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合物原液分別稀釋至250μg/ml(按多糖計算)，將以上5種稀釋后的疫苗液各取等量放于一容器內，充分混合后，加入不同量的生理鹽水，即可制成含各型多糖10～50μg/ml的疫苗，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～25μg的多糖-結合疫苗。
(五)氫氧化鋁佐劑吸附A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合物原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合物原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合物原液、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合物原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合物原液分別稀釋至200μg/ml(按多糖計算)，取相同體積的以上5種稀釋后的疫苗液放于一滅菌后的容器內，充分混合后，加入氫氧化鋁佐劑，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～10μg的氫氧化鋁吸附多糖結合疫苗。
(六)磷酸鋁佐劑吸附A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合物原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合物原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合物原液、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合物原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合物原液分別稀釋至200μg/ml(按多糖計算)，取相同體積的以上5種稀釋后的疫苗液放于一滅菌后的容器內，充分混合后，加入等體積的磷酸鋁佐劑，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～10μg的磷酸鋁吸附多糖結合疫苗。
實施例九A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合疫苗動物免疫試驗按實施例八制備的A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖結合疫苗，每毫升含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各20μg。加三倍體積的鋁稀釋劑或生理鹽水稀釋，即為動物實驗用疫苗，分別于0、14天免疫SPF級BALB/C小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)10只，免疫劑量為0.5ml(含每種多糖2.5μg)。分別于0、14、28天采集血液，分離血清，測定抗體滴度前將血清放置于-20℃。免疫時設生理鹽水對照組及同劑量多糖疫苗對照組，以酶聯免疫法(ELISA用酶標板以各群或型莢膜多糖-HAS結合物包被)測定血清IgG抗體滴度。結果見表2。結合疫苗第1次免后2周小鼠血清抗體滴度顯著高于免前(p＜0.01)；第2次免后2周的抗體滴度顯著高于第1次免后2周的抗體滴度(p＜0.05)。
實施例十A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-鼠IgG結合疫苗(動物試驗用)(一)多糖與鼠IgG的偶聯1.活化多糖取A群(或C、Y、W135)腦膜炎球菌(或Hib)多糖400mg(4mg/ml)，用0.5mol/L NaOH調pH至10.8，加入200mg溴化氰，用0.5mol/L NaOH維持pH在10.8±0.5左右1小時(22℃)。然后用0.5mol/L HCl調pH至8.8，加入1450mg己二酰肼(ADH)，反應6分鐘；用0.5mol/L NaOH調pH至8.5，維持pH在8.5±0.5的范圍內15分鐘；4～8℃輕輕攪拌12小時。用預冷0.05mol/L NaCl溶液透析48小時(4～8℃)，在此期間換液5次(或用3KD的超濾膜超濾)。用0.2μm濾膜過濾活化多糖-AH衍生物。
2.活化多糖與鼠IgG偶聯(4～8℃冰水浴下操作)將鼠IgG的蛋白濃度調整為4mg/ml，取100ml加入到已活化的多糖-AH衍生物溶液中，充分混勻后，用0.5mol/L HCl調pH至5.7。加碳二亞胺(EDAC)4000mg，滴加鹽酸維持溶液的pH在5.7±0.2范圍內90分鐘；用0.5mol/L NaOH調pH至6.8，用預冷0.2mol/L NaCl溶液透析12小時(4～8℃，或用截流分子量為100KD的濾膜超濾)，除去碳二亞胺(EDAC)及低分子物質。
(二)多糖-蛋白結合物純化(4～8℃條件)將多糖-蛋白結合物溶液超濾濃縮為40ml，經Sephacryl S-400HR(或Sephacryl S-1000、Sepharose CL-4B、Sepharose 4FF、TSK Toyopearl-65等)層析柱(柱長5×100cm)純化，以0.2mol/L NaCl流洗，流速為1.5ml/分鐘，以206nm/280nm波長的在線式紫外檢測器檢測流出液的吸光值變化，收集V0附近的洗脫峰，經0.2μm濾膜過濾后即為多糖-鼠IgG結合疫苗原液。
(三)A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-鼠IgG結合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物原液、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-鼠IgG結合物原液分別稀釋至250μg/ml(按多糖計算)，將以上5種稀釋后的疫苗液各取等量放于一容器內，充分混合后，加入不同量的生理鹽水，即可制成含各型多糖10～50μg/ml的疫苗，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～25μg的多糖-鼠IgG結合疫苗。
(四)氫氧化鋁佐劑吸附A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-鼠IgG結合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物原液、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖鼠IgG結合物原液-分別稀釋至200μg/ml(按多糖計算)，取相同體積的以上5種稀釋后的疫苗液放于一滅菌后的容器內，充分混合后，加入氫氧化鋁佐劑，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～10μg的氫氧化鋁吸附多糖結合疫苗。
(五)磷酸鋁佐劑吸附A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-鼠IgG結合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物原液、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-鼠IgG結合物原液分別稀釋至200μg/ml(按多糖計算)，取相同體積的以上5種稀釋后的疫苗液放于一滅菌后的容器內，充分混合后，加入等體積的磷酸鋁佐劑，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～10μg的磷酸鋁吸附多糖結合疫苗。
實施例十一A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-鼠IgG結合疫苗動物試驗(一)多糖-鼠IgG結合疫苗動物免疫試驗按實施例十制備的A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-鼠IgG結合疫苗，每毫升疫苗含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各20μg。加三倍體積的鋁稀釋劑或生理鹽水稀釋后，即為動物實驗用疫苗，分別于0、14天免疫SPF級BALB/C小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)10只，免疫劑量為0.5ml(含每種多糖2.5μg)。分別于0、14、28天采集血液，分離血清，測定抗體滴度前將血清放置于-20℃。免疫動物的同時設生理鹽水對照組及同劑量多糖疫苗對照組，以酶聯免疫法(ELISA用酶標板以各群或型莢膜多糖-HAS結合物包被)測定血清IgG抗體滴度。結果見表3。結合疫苗第1次免后2周小鼠血清抗體滴度顯著高于免前(p＜0.01)；第2次免后2周的抗體滴度顯著高于第1次免后2周的抗體滴度(p＜0.05)。
(二)多糖-鼠IgG結合物急性毒性試驗多糖-鼠IgG結合物類似于小鼠感染后恢復期形成的多糖-鼠IgG抗原-抗體復合物，抗原-抗體復合物有可能對機體的肝臟、脾臟、腎臟等造成一定程度的免疫損傷，本試驗以相當于人擬用劑量500～1000倍的多糖-鼠IgG結合物進行急性毒性試驗，觀察其安全性。由于C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖的主要成分均為唾液酸，本試驗僅以含唾液酸量最高的C群腦膜炎球菌莢膜多糖進行試驗。
1、A群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物急性毒性試驗A群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物類似于小鼠感染A群腦膜炎球菌恢復期形成的多糖-鼠IgG抗原-抗體復合物，抗原-抗體復合物有可能對機體的肝臟、脾臟、腎臟等造成一定程度的免疫損傷，本試驗以相當于人用劑量500～1000倍的多糖-鼠IgG結合物進行急性毒性試驗，觀察其安全性。
試驗動物為SPF級BALB/C小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，每組20只，雌雄各半，體重18-22克。
試驗分組試驗組1，A群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物；試驗組2，氫氧化鋁吸附A群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物；試驗組3，A群腦膜炎球菌莢膜多糖；對照組，生理鹽水。
試驗方法分別于0、14天肌肉注射A群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物2.5mg/kg/0.2ml(按多糖計算，試驗組1)、氫氧化鋁吸附A群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物2.5mg/kg/0.2ml(試驗組2)、A群腦膜炎球菌莢膜多糖2.5mg/kg/0.2ml(試驗組3)，對照組同期注射生理鹽水0.2ml/只。第2次給藥后7天、28天每組各處死半數小鼠，摘取肝、脾、腎，秤重，觀察病變，將臟器用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡檢觀察病理學情況。
試驗結果各組試驗動物在兩次給藥后均未見異常，試驗期間未發生死亡，各試驗組動物體重與對照組相比無顯著性差異。處死動物剖檢時，各組試驗動物主要臟器未見異常，各給藥組動物臟器重量和臟器系數與對照組沒有顯著性差異。肝、脾、腎顯微切片鏡檢無異常改變。證明該試驗劑量的多糖-鼠IgG結合物對小鼠是安全的。
2、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物急性毒性試驗C群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物類似于小鼠感染C群腦膜炎球菌恢復期形成的多糖-鼠IgG抗原-抗體復合物，抗原-抗體復合物有可能對機體的肝臟、脾臟、腎臟等造成一定程度的免疫損傷，本試驗以相當于人擬用劑量500～1000倍的多糖-鼠IgG結合物進行急性毒性試驗，觀察其安全性。
試驗動物為SPF級BALB/C小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，每組20只，雌雄各半，體重18-22克，隨機分組。
試驗分組試驗組1，C群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物；試驗組2，氫氧化鋁吸附C群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物；試驗組3，C群腦膜炎球菌莢膜多糖；對照組，生理鹽水。
試驗方法分別于0、14天肌肉注射C群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物2.5mg/kg/0.2ml(按多糖計算，試驗組1)、氫氧化鋁吸附C群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物2.5mg/kg/0.2ml(試驗組2)、C群腦膜炎球菌莢膜多糖2.5mg/kg/0.2ml(試驗組3)，對照組同期注射生理鹽水0.2ml/只。第2次給藥后7天、28天每組各處死半數小鼠，摘取肝、脾、腎，秤重，觀察病變，將臟器用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡檢觀察病理學情況。
試驗結果各組試驗動物在兩次給藥后均未見異常，試驗期間未發生死亡，各試驗組動物體重與對照組相比無顯著性差異。處死動物剖檢時，各組試驗動物主要臟器未見異常，各給藥組動物臟器重量和臟器系數與對照組沒有顯著性差異。第2次給藥后7、28天處死的動物C群腦膜炎球菌莢膜多糖試驗組肝、腎顯微切片鏡檢異常，出現肝細胞腫脹、變性，腎小管上皮細胞腫脹，腎小球未見異常；其他試驗組顯微鏡下無異常。證明該試驗劑量的C群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結合物對小鼠是安全的。
3、Hib多糖-鼠IgG結合物急性毒性試驗Hib多糖-鼠IgG結合物類似于小鼠感染Hib恢復期形成的多糖-鼠IgG抗原-抗體復合物，抗原-抗體復合物有可能對機體的肝臟、脾臟、腎臟等造成一定程度的免疫損傷，本試驗以相當于人擬用劑量500～1000倍的和Hib多糖-鼠IgG結合物進行急性毒性試驗，觀察其安全性。
試驗動物為SPF級BALB/C小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，每組20只，雌雄各半，體重18-22克，隨機分組。
試驗分組試驗組1，Hib多糖-鼠IgG結合物；試驗組2，氫氧化鋁吸附Hib多糖-鼠IgG結合物；試驗組3，Hib多糖；對照組，生理鹽水。
試驗方法分別于0、14天肌肉注射Hib多糖-鼠IgG結合物2.5mg/kg/0.2ml(按多糖計算，試驗組1)、氫氧化鋁吸附Hib多糖-鼠IgG結合物2.5mg/kg/0.2ml(試驗組2)、Hib多糖2.5mg/kg/0.2ml(試驗組3)，對照組同期注射生理鹽水0.2ml/只。第2次給藥后7天、28天每組各處死半數小鼠，摘取肝、脾、腎，秤重，觀察病變，將臟器用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡檢觀察病理學情況。
試驗結果各組試驗動物在兩次給藥后均未見異常，試驗期間未發生死亡，各試驗組動物體重與對照組相比無顯著性差異。處死動物剖檢時，各組試驗動物主要臟器未見異常，各給藥組動物臟器重量和臟器系數與對照組沒有顯著性差異。第2次給藥后7、28天處死的動物Hib多糖試驗組肝、腎顯微切片鏡檢異常，出現肝細胞腫脹、變性，腎小管上皮細胞腫脹，腎小球未見異常；其他試驗組顯微鏡下無異常。證明該試驗劑量的Hib多糖-鼠IgG結合物對小鼠是安全的。
實施例十二A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-人IgG結合疫苗(一)多糖-人IgG的偶聯1.活化多糖取A群(或C、Y、W135)腦膜炎球菌(或Hib)多糖400mg(4mg/ml)，用0.5mol/LM NaOH調pH至10.8，加入200mg溴化氰，用0.5mol/LNaOH維持pH在10.8±0.5左右1小時(22℃)。然后用0.5mol/L HCl調pH至8.8，加入1450mg己二酰肼(ADH)，反應6分鐘；用0.5mol/L NaOH調pH至8.5，維持pH在8.5±0.5的范圍內15分鐘；4～8℃輕輕攪拌12小時。用預冷0.05mol/L NaCl溶液透析48小時(4～8℃)，在此期間換液5次(或用3KD的超濾膜超濾)。用0.2μm濾膜過濾活化多糖-AH衍生物。
2.活化多糖與人IgG偶聯(4～8℃冰水浴下操作)將人IgG(靜脈注射用人血清免疫球蛋白，武漢生物制品研究所)的蛋白濃度稀釋為4mg/ml，取100ml加入到已活化的多糖-AH衍生物溶液中，充分混勻后，用0.5mol/L HCl調pH至5.7。加碳二亞胺(EDAC)4000mg，滴加鹽酸維持溶液的pH在5.7±0.2范圍內90分鐘；用0.5mol/L NaOH調pH至6.8，用預冷0.2mol/L NaCl溶液透析12小時(4～8℃，或用截流分子量為100KD的濾膜超濾)，除去碳二亞胺(EDAC)及低分子物質。
(二)多糖-人IgG結合物純化(4～8℃條件)將多糖-人IgG結合物溶液超濾濃縮為40ml，經Sephacryl S-400HR(或Sephacryl S-1000、Sepharose CL-4B、Sepharose 4FF、TSK Toyopearl-65等)層析柱(柱長5×100cm)純化，以0.2mol/L NaCl流洗，流速為1.5ml/分鐘，以206nm/280nm波長的在線式紫外檢測器檢測流出液的吸光值變化，收集V0附近的洗脫峰，經0.2μm濾膜過濾后即為多糖-人IgG結合疫苗原液。
(三)A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-人IgG結合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結合物原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結合物原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結合物原液、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結合物原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-人IgG結合物原液分別稀釋至250μg/ml(按多糖計算)，將以上5種稀釋后的疫苗液各取等量放于一容器內，充分混合后，加入不同量的生理鹽水，即可制成含各型多糖10～50μg/ml的疫苗，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～25μg的多糖-結合疫苗。
(四)氫氧化鋁佐劑吸附A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-人IgG結合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結合物原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結合物原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結合物原液、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結合物原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-人IgG結合物原液-分別稀釋至200μg/ml(按多糖計算)，取相同體積的以上5種稀釋后的疫苗液放于一滅菌后的容器內，充分混合后，加入氫氧化鋁佐劑，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～10μg的氫氧化鋁吸附多糖結合疫苗。
(五)磷酸鋁佐劑吸附A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-人IgG結合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結合物原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結合物原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結合物原液、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結合物原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-人IgG結合物原液分別稀釋至200μg/ml(按多糖計算)，取相同體積的以上5種稀釋后的疫苗液放于一滅菌后的容器內，充分混合后，加入磷酸鋁佐劑，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～10μg的磷酸鋁吸附多糖結合疫苗。
表1、A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-TT結合疫苗免疫BALB/C小鼠的血清抗體滴度*

*每組試驗動物10只，血清的起始稀釋度為1∶100，連續2倍稀釋，最高稀釋度為1∶102400。
免前血清、生理鹽水對照組血清的稀釋方法同其他試驗組，1∶100陰性的，血清抗體滴度按1計算。
表2、A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白聯合疫苗免疫BALB/C小鼠的血清抗體滴度*

*每組試驗動物均為SPF BALB/C小鼠10只，血清的起始稀釋度為1∶100，連續2倍稀釋，最高稀釋度為1∶102400。
免前血清、生理鹽水對照組血清的稀釋方法同其他試驗組，1∶100陰性的，血清抗體滴度按1計算。
表3A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-鼠IgG結合疫苗免疫BALB/C小鼠的血清抗體滴度*

*每組試驗動物10只，血清的起始稀釋度為1∶100，連續2倍稀釋，最高稀釋度為1∶102400。
免前血清、生理鹽水對照組血清的稀釋方法同其他試驗組，1∶100陰性的，血清抗體滴度按1計算。
權利要求
1.一種多價細菌多糖-蛋白質結合物聯合疫苗制劑，其特征在于，含有有效量的A群流行性腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖-蛋白結合物，C群流行性腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜莢膜多糖-蛋白結合物，Y群流行性腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖-蛋白結合物，W135群流行性腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖-蛋白結合物和b型流感嗜血桿菌莢膜多糖-蛋白結合物，它們之間的重量比例在1∶0.5～2.5之間。
2.權利要求1的聯合疫苗制劑，其特征在于，重量比例是按多糖計算的，每一單位給藥劑量的制劑中含有A群，C群，Y群和W135群腦膜炎球菌莢膜多糖以及b型嗜血流感桿菌莢膜多糖的量在5-25μg之間。
3.權利要求1的聯合疫苗制劑，其特征在于，其中的蛋白載體選自破傷風類毒素、白喉類毒素、人血清免疫球蛋白或B群流行性腦脊髓膜炎球菌外膜蛋白。
4.權利要求1的聯合疫苗制劑，其中的多糖選自未經降解的莢膜多糖或經化學方法裂解的分子量在3-100KDa之間的多糖。
5.權利要求1的聯合疫苗制劑，其特征在于，莢膜多糖-蛋白結合物的多糖和蛋白是通過共價鍵結合的，其中多糖與蛋白的加入量是等量或有0.5～5倍量的差別。
6.權利要求1的聯合疫苗制劑，其特征在于，還含有氫氧化鋁或磷酸鋁作為鋁佐劑，加入量為0.1～1.5mg鋁佐劑/劑。
7.權力要求1的聯合疫苗制劑，其特征在于，還含有可提高人體免疫反應的人細胞因子、單磷脂A或胞壁酰二肽或其衍生物。
8.權利要求1的聯合疫苗制劑，其特征在于，是注射劑，用于皮下或肌肉注射。
9.權利要求1的聯合疫苗制劑在制備用于預防A群、C群、Y群、W135群流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌、b型流感嗜血桿菌引起的感染的疫苗中的應用。
10.權利要求1的聯合疫苗制劑的制備方法，其特征在于，包括多糖原料的制備，載體蛋白原料的制備，多糖-蛋白結合物的制備，多糖-蛋白結合物按比例混合的步驟其中多糖原料的制備是用A、C、Y、W135群腦膜炎球菌菌種、b型嗜血流感桿菌菌種經過發酵培養生產出A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖和b型嗜血流感桿菌莢膜多糖，這些多糖的純化方法采用大孔合成樹脂精制細菌莢膜多糖的方法，該方法是，用聚苯乙烯/聚甲基丙烯酸酯大孔合成樹脂吸附粗制多糖溶液中的色素、蛋白質及核酸類污染物，再以蛋白變性劑苯酚除去多糖溶液中殘留的不能被大孔樹脂吸附的微量蛋白，其中苯酚的用量為目前世界衛生組織推薦工藝的1/4至1/10。
11.權利要求1的聯合疫苗制劑可以不含b型流感嗜血桿菌莢膜多糖-蛋白結合物，用于預防A群、C群、Y群、W135群流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌引起的感染。
全文摘要
本發明涉及一種多價細菌莢膜多糖－蛋白質結合物聯合疫苗制劑，特別是一種含A群、C群、Y群、W135群流行性腦脊髓膜炎球菌莢膜多糖－蛋白質結合物和b型嗜血流感桿菌莢膜多糖－蛋白質結合物的聯合疫苗。
文檔編號A61K39/02GK1709505SQ20051008304
公開日2005年12月21日 申請日期2005年7月13日 優先權日2005年7月13日
發明者孔健, 蔣先敏, 肖麗君 申請人:北京綠竹生物制藥有限公司