專利名稱：一種注射用人體軟組織填充劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞類組織填充劑，用于人體軟組織的填充和修復，包括除去皺紋和修復凹陷性疤痕。在其組織填充劑中包含了經體外培養、擴增后的自體的成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞和膠原蛋白。其制備過程應用了無血清培養材料，最終制備成組織填充劑的注射懸浮液，注射到皺紋、凹陷性疤痕、創傷性皮膚真皮中、以及嘴唇等部位，以達到填充，修復的目的。
背景技術：
通常應用于人體軟組織填充的方法可分為真皮填充和皮下填充，這些填充劑以往都不是自體組織活體材料，而是生物合成材料或者異性蛋白。最早應用填充材料是在十九世紀末，它以石蠟作為填充劑，出現了許多并發癥，前期效果也不好。六十年代又應用了硅氧烷溶液作為填充劑，也同樣出現了局部和全身性反應。隨后又應用外源性蛋白作為填充材料，尤其是牛的膠原蛋白填充劑，這種填充劑可以立刻得到治療效果，但三到六個月內被組織消化吸收。牛的膠原蛋白制備和利用可見美國專利3,949,073和4,424,208及4,488,911。其規格為35mg/ml及65mg/ml，商品名為ZydermI、ZydermII、ZydermIII，在使用Ryder后，90％受治者有抗體產生，1-3％的受治者產生了明顯的過敏反應而不能令人滿意；因而應用戊二醛交聯，然后用細篩過濾，產生出一種Zyplast的交聯牛膠原蛋白，從而克服過敏的反應，其制備過程見美國專利4,582,640和4,642,117，但其治療效果又出現了不平整的問題，是因為戊二醛交聯后得到的材料粘性太大。對應用過牛膠原蛋白的受試者調查表明，一個處理過程的效果一般只能持續4-6月。
為了消除牛膠原的免疫反應，有人從人的胎盤中提取人膠原，像美國曾經出售過的品牌AUTOLOGEN，見美國專利4,969,912和5,332,802，但也只能維持幾個月的時間。
美國市場上也出現過一種稱為FIBREL的軟組織填充劑，它是明膠粉末和氨基乙酸以及受治者的血漿的混合物，它對部分受治者有效，但易出現注射部位團塊和療效不持久等問題。
肉毒素(BOTOX)是一種近年來應用廣泛的短期注射除皺液，于2004年4月獲得FDA的批準，進行臨床應用。依靠其可以使面部運動肌肉麻醉而達到治療效果。因為該制劑操作簡便，立即見效而聞名，但其治療后出現面部表情僵化，療效短，也有些出現面癱的問題。
愛貝芙(Artecoll)是人工合成顆粒和牛膠原蛋白的復合物，已在加拿大、墨西哥和歐洲應用多年。通過該材料刺激局部真皮而誘導產生自體膠原來達到長期有效的目的，療效上也出現了治療者觸摸有顆粒感等問題，16％的治療者的治療部位出現突出腫塊。
由于異體材料注射后常出現過敏、排異反應和療效短等問題，美國Isolagen公司1995年開始在門診上應用一種培養自體真皮成纖維細胞修復皮膚和軟組織缺損的治療方法(見美國專利5,591,444、5,665,372、5,660,850)，其具體做法是，應用自體取得的皮膚組織，在體外應用含有牛血清的培養液進行培養，最后制備于林格斯液中而得到自體成纖維細胞注射液，它無嚴重的過敏、排斥反應。但是美國FDA從2000年開始對于應用動物血清制備的、用于人的注射液提出了限用和禁用的要求，并且受試者對于牛血清疑帶有瘋牛病等病毒的潛在危險提出了質疑，因而Isolagen公司重新開始了三期臨床試驗。該方法的另一個不足之處是，林格斯液不便于較長時間地保持有效成分的活性，配制成了注射劑后需要很快使用，實際使用中不方便。
北京以嶺生物工程有限公司從2000年開始開發得到的一種除皺祛疤的注射劑(中國專利申請第03155833.X號)中，應用了自體皮膚，經體外分離、培養和擴增，制成于葡萄糖液中的一種注射劑，治療疤痕和祛除皺紋。
按照中國專利申請號03155833.X的注射劑中的有效成分是用部分含血清的培養液對自體皮膚樣品進行組織培養而得到的。在當時的分析技術水平下，其中的有效成分都被表征為成纖維細胞；但經現有分析手段測定，培養和擴增后的有效成分不僅含有成纖維細胞，還含有成纖維干細胞、成纖維前體細胞和少量的膠原蛋白。該技術的不足之處是，注射劑中能立即發揮人體軟組織的填充和修復功能的膠原蛋白含量較低，導致注射到疤痕和皺紋處后見效較慢，一般要4-6個月；另外，受治者對使用動物血清作為培養液的成分也可能存有安全性方面的疑惑。
近來，申請人應用無血清培養液，從自體皮膚組織中培養出了既可包含大量自體的成纖維干細胞、成纖維前體細胞和成纖維細胞、同時又含有豐富的自體膠原蛋白的復合填充劑，在1-3個月就可出現明顯的填充和修復效果，其見效快，療效持久，自然安全。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種新的自體注射用人體軟組織填充劑，它可以用于美容、改善皮膚彈性和光澤、以及其它部位和類型的填充，自然、療效持久。
本發明的另一個目的是提供這種注射用填充劑在美容、改善皮膚彈性和光澤、以及其它部位和類型的填充和修復中的應用。
本發明的另一個目的是提供這種注射用填充劑的制備方法。
為實現上述目的，本發明采用以下技術方案按本發明的注射用人體軟組織填充劑由來源于治療者自體的皮膚經過消化分離，得到的真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞進行體外全程無血清培養和擴增后，再與濃度5％的葡萄糖注射液或其它注射液、以及任選的其它適用成分配成，有效成分由選自培養后收集到的真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞中的至少一種和膠原蛋白組成；在每毫升填充劑中，有效細胞成分的總個數為1000-8000萬個，膠原蛋白的含量為10-100mg/ml，優選20-60mg/ml。
按本發明的組織填充劑的一個優選方案，所述的填充劑中的自體真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞、膠原蛋白是將來源于治療者自體的少量皮膚(1-30平方毫米的皮膚)，在細胞培養室經過消化分離，得到的真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞，在加入了生長因子和營養材料的無血清培養液中進行體外培養和擴增而最終得到的；采用了較長的體外培養和擴增時間，優選6-10周。
按本發明的組織填充劑的一個優選方案，填充劑中的有效成分由所說的自體真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞及膠原蛋白和膠原蛋白共同組成，成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞之間的個數比例范圍為5-20 20-5 30-70；膠原蛋白的重量比例10-100mg/ml，優選20-60mg/ml注射填充劑。
附圖1是成纖維干細胞在100倍光學顯微鏡下形態學照片；附圖2是成纖維前體細胞在100倍光學顯微鏡下形態學照片；附圖3是成纖維細胞在100倍光學顯微鏡下形態學照片。
本發明所采集的皮膚組織包括從耳后，切眼袋，切眉，以及其他部位所取的皮膚，為包括表皮和真皮的皮膚。
成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞和膠原蛋白的鑒定和表征方式為成纖維干細胞采用Brdu抗體測定(黃暉，賴西南，王正國，王麗麗，創傷愈合中物質對表皮干細胞遷移及受體表達的作用；中華創傷雜志2004年；20(3)142-145.利用核標記物)，細胞形態可參見說明書附圖1。
成纖維前體細胞在100倍光學顯微鏡下做形態學觀察，其標準形態為細小長索狀，細胞形態可參見說明書附圖2。
成纖維細胞在100倍光學顯微鏡下做形態學觀察，其標準形態為呈多觸突的長索形細胞，細胞形態可參見說明書附圖3。
膠原蛋白“采用膠原蛋白測定法”，中華人民共和國衛生部藥典委員會，《中華人民共和國藥典》(二部)，北京，化學工業出版社，2000。
按照本發明的注射用人體軟組織填充劑可以用在美容、改善皮膚彈性和光澤、以及其它部位和類型的填充和修復中，包括處理由于真皮缺損而導致的各種癥狀，例如面部皺紋，凹陷性疤痕，妊娠紋，手背皺紋；用于豐唇，增強真皮厚度和改善皮膚基質等。
按照本發明制備注射用人體軟組織填充劑的方法包含自體皮膚取材、組織消化和細胞分離、體外無血清培養組織細胞有效成分、和將有效成分與濃度5％的葡萄糖注射液或其它注射液、以及任選的其它適用成分配成注射填充劑幾個步驟。有效成分由選自培養后收集得到的真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞中的至少一種和膠原蛋白組成；在每毫升填充劑中，有效細胞成分的總個數為1000-8000萬個，膠原蛋白的含量為10-100mg/ml，優選20-60mg/ml。
按照本發明制備注射用人體軟組織填充劑的方法的一個優選方案，在體外全程無血清培養和擴增過程中使用的培養液中還包含生長因子和活性材料，所說生長因子為至少一種選自上皮生長因子、成纖維生長因子的成分；所說活性材料為至少一種選自皮質激素、腦垂體提取液的成分，這些培養液和生長因子及活性材料可以來源于一個公司或者多個公司(如美國的Cascad公司、Sigma公司、Hyclne公司等)的市售產品。所說生長因子在培養液中的含量可以為1-10ng/ml，優選為2-5ng/ml；所說活性材料在培養液中的含量可以為0.1-1％，優選為0.2-0.5％。
按照本發明方法的一個優選方案，在體外全程無血清培養和擴增過程中使用的培養液中包含生長因子和活性材料的情況下，還使用了較長的體外培養和擴增時間，優選為6-10周。
按照本發明方法的一個優選方案，注射填充劑中的有效成分同時包含所說的自體真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞和膠原蛋白；成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞之間的個數比例范圍為5-20 20-50 30-70；膠原蛋白的重量含量范圍10-100mg/ml注射填充劑，優選20-60mg/ml注射填充劑。
按照本發明方法的另一個優選方案，取出多年前凍存于液氮中(196℃)的、經組織消化和細胞分離后得到的自體皮膚活細胞，經重新解凍后，繼續進行培養、擴增和其它后續處理。這樣做的好處是，可以使用多年前保存的、較年輕和生命力較強的自體皮膚活細胞，進行培養、擴增和其它后續處理，對皮膚填充、修復和美容的效果會更好。
自體皮膚取材用酒精消毒取材部位，進行局部表面麻醉。用取皮器或手術刀和手術剪刀將1-30平方毫米的表皮和真皮組織取下，或手術切除眼袋或切眉的皮膚，放入組織保存液中，將創傷部位做一到三針縫合，創可貼覆蓋。
組織消化和細胞分離將皮膚組織塊放置于培養皿中，加入胰酶/EDTA液，DMEM+10％FBS液終止；將消化后的組織塊剪碎并用吸管打散；吹散后的細胞收集至離心管中，離心5分鐘，棄去上清液；細胞體外培養采用組織消化培養法或是組織塊培養法；包括原代細胞培養和傳代細胞培養。
按本發明所采用的細胞培養方法與以往方法不同之處在于，首次采用全程無血清培養方式，在培養液中加入生長因子(如上皮生長因子、成纖維生長因子等)和活性材料(如皮質激素、腦垂體提取液等)，培養6-10周，從而促進細胞的擴增和膠原蛋白的充分分泌。其細胞活性和形態正常，特別是這種培養后收集到的有效成分中除有自體的成纖維細胞、成纖維干細胞、成纖維前體細胞外，還有較大量的膠原蛋白，其濃度能使配制后的注射用填充劑中膠原蛋白的重量含量范圍為10-100mg/ml。
基礎培養液的組成是本領域普通技術人員所熟知的，具體內容請參見《(細胞實驗指南》(2001年，科學出版社出版，主編D.L.斯佩克特，黃培唐翻譯)；在此基礎上再加入上述的生長因子和/或活性材料，即是本發明優選的培養液。
生長因子可以是上皮生長因子(EGF)，它的使用濃度范圍是0.1-5ng/ml，優選濃度范圍是0.5-2ng/ml；活性材料可以是腦垂體提取液(BPE)，它的使用濃度范圍是0.1-1％，優選濃度范圍是0.2-0.5％。
培養過程將從組織塊分離出的真皮細胞(含成纖維干細胞、成纖維前體細胞和成纖維細胞)用上述的無血清培養液在溫度為37℃，5％的CO2細胞培養箱中培養，每三天換上述培養液一次，共培養42-70天。
填充劑制備按照本發明的注射用人體軟組織填充劑的配制方法包括，將按上述方法體外擴增和培養后的有效成分與濃度5％的葡萄糖注射液或其它注射液、以及任選的其它適用成分配制成懸濁液，即是按本發明的注射填充劑，有效成分由選自自體真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞中的至少一種及膠原蛋白組成；每毫升注射液中，有效細胞成分總個數為1000萬-8000萬個，膠原蛋白的含量為10-100mg/ml注射液。
本發明的注射填充劑本身包含了大量的膠原蛋白，在注射部位能很快產生填充皺紋和疤痕的作用；注射填充劑中包含的其它有效成分還能源源不斷地分泌出大量的膠原蛋白，從而使溝紋和疤痕長平，在消除皺紋和疤痕同時，又能改善局部皮膚的環境，起到年輕美顏的作用。
本發明產品適用的范圍為填充修復面部所有皺紋和凹陷性疤痕，如脖頸皺紋、妊娠皺紋、手背皺紋，也用于美容，增強皮膚厚度、皮膚彈性和其它部位的填充修復。
本發明的優點所使用的有效成分來源于受治者自體，無排異反應，不會感染動物源性疾病、無副作用，受治者用過后美容療效顯著，表情自然，見效快、效果作用持久，可維持數年。
下面
具體實施例方式
對本發明作進一步說明。
具體實施方式
實施例1人體軟組織填充劑的制備——用于祛除皺紋治療(20例)一.自體健康皮膚樣品的提取用70％的酒精消毒耳后，然后用10％的利多卡因和十萬分之一的腎上腺素進行局部表面麻醉。用取皮器或手術刀和手術剪刀將接受治療者耳后4平方毫米的表皮和真皮組織取下，放入組織保存液(DMEM細胞保存液，美國Hyclone公司)中，將創傷部位做一針縫合，創可貼覆蓋。
二.細胞懸液的制備(組織消化培養法)1.組織消化(Forma，或Sanyo CO2培養箱)將皮膚組織塊放置于35mm培養皿中，加入1ml濃度為0.05％的胰酶/EDTA液，37℃，10分鐘；DMEM+10％FBS液終止。
2.細胞分離將消化后的組織塊剪碎并用吸管打散。
3.離心吹散后的細胞收集至離心管中，Backman公司控溫離心機，25℃，1000轉/分鐘，離心5分鐘，棄去上清液。
4.原代細胞培養在離心管中加入加1ml真皮細胞培養液(Cascade公司，牌號為106，其中主要成分是基礎培養液，生長因子EGF的濃度為1ng/ml，營養材料BPE的濃度為0.2％，美國)吹懸，接種入35mm培養皿；CO2培養箱，37℃，5％CO2，進行培養；5.傳代細胞培養每隔2～3天換上述培養液1次，當原代細胞達到50-70％匯集后傳代，用胰酶消化、離心，棄去上清液，按1∶3擴增倍數培養。
6.配制注射劑收集在體外傳代至第8周的培養物中的有效成分；向濃度為5％的葡萄糖注射液中加入收集的有效成分，使每毫升混懸液含大約2000-6000萬個有效細胞成分，配制成1-4ml混懸液。
三.產品檢測1.病毒檢測將皮膚組織進行培養6周后，取1ml含有細胞的培養液進行HIV和肝炎病毒的檢驗，確定此為無病毒細胞。
2.免疫反應測試第6周將0.1ml細胞懸浮液對受術者進行皮試(同青霉素皮試方法)，無免疫反應。
3.成品檢測1)外觀本品為淡白色混懸液。
本品中有效成分分類檢定成纖維干細胞采用Brdu抗體測定表明，該填充劑中成纖維干細胞的個數占三種細胞總個數的比例為10-20％。
成纖維前體細胞采用細胞形態學方法觀察，該填充劑中成纖維前體細胞個數占三種細胞總個數的比例為30-40％。
成纖維細胞采用細胞形態學方法觀察，該填充劑中成纖維細胞個數占三種細胞總個數的比例為50-70％。
膠原蛋白采用膠原蛋白測定方法，測定該填充劑中膠原蛋白成分重量含量為20-60mg/ml。
2)無菌試驗按《中國生物制品規程》(2000版)通則《生物制品無菌試驗規程》A/B項進行，結果符合無菌要求。
產品的儲存和運輸在4℃的特殊保存箱中，該箱符合陰涼、干燥、清潔、避免陽光直射、無腐蝕性氣體、無重壓的條件。
四.治療用于額頭皺紋，眼角魚尾紋，脖頸皺紋，妊娠紋等所有面部及其它身體部位的皺紋和細小皺紋；治療25例。
1.治療者術前檢查，各項指標均正常，包括血尿便常規、心電圖、肝腎功能、HIV、HbsAg。
2.將注射部位用70％的酒精消毒，局部注射1％的利多卡因麻醉。
3.將1.5ml細胞懸液吸入3ml的注射器中備用。
4.取2.2cm長的4.5號針頭，采用多點斜面(針頭與皮膚的角度20°～45°)，在注射部位注射時，將注射部位表皮拉緊注射細胞，使其發白，注射時使注射部位留有彌散空間。注射完后用冰袋外敷2小時。
療程注射部位共注射2次，間隔2周。
五、術后觀察、調護1.手術后，用冰袋敷注射處2小時。
2.觀察局部及全身的情況一切正常。
3.每天二次口服維生素C(每次200mg，每天共400mg)，服用6個月。
4.術后3天內防曝曬及慎用刺激性化妝品。
六、效果描述皺紋在注射后三個月后基本消失或明顯變淺，效果良好。
實施例2人體軟組織填充劑的制備——祛除凹陷性疤痕(20例)一.自體健康皮膚樣品的提取用70％的酒精消毒耳后，然后用10％的利多卡因和十萬分之一的腎上腺素進行局部表面麻醉。用取皮器或手術刀和手術剪刀將接受治療者耳后4平方毫米的表皮和真皮組織取下，放入組織保存液(DMEM細胞保存液，美國Hyclone公司)中，將創傷部位做一針縫合，創可貼覆蓋。
二.細胞懸液的制備1.組織塊培養法將組織塊切碎成1×1mm2，平鋪于35mm培養皿中，加入2ml上述真皮細胞培養液(Cascade公司，牌號為106，其中主要成分是基礎培養液，生長因子EGF的濃度為1ng/ml，營養材料BPE的濃度為0.2％，美國)進行原代細胞培養。
2.傳代細胞培養每隔2～3天換上述培養液1次，當原代細胞達到50-70％匯集后傳代，用胰酶消化、離心，棄去上清液，按1∶3擴增倍數培養。
3.配制注射劑收集體外傳代至第8周的培養物中的有效成分；向濃度為5％的葡萄糖注射液中加入收集的有效成分，使每毫升混懸液含大約3000-7000萬個有效細胞成分，配制成1-4ml混懸液。
三.產品檢測1.病毒檢測將皮膚組織進行培養8周后，取1ml含有細胞的培養液進行HIV和肝炎病毒的檢驗，確定此為無病毒細胞。
2.免疫反應測試第8周將0.1ml細胞懸浮液對受術者進行皮試(同青霉素皮試方法)，無免疫反應。
3.成品檢測1)外觀本品為淡白色混懸液。
本品中有效成分分類檢定成纖維干細胞采用Brdu抗體測定表明，該填充劑中成纖維干細胞個數占三種細胞總個數的比例為15-20％。
成纖維前體細胞采用細胞形態學方法觀察，該填充劑中成纖維前體細胞個數占三種細胞總個數的比例為20-50％。
成纖維細胞采用細胞形態學方法觀察，該填充劑中成纖維細胞個數占三種細胞總個數的比例為30-50％。
膠原蛋白采用膠原蛋白測定方法，測定該填充劑中膠原蛋白成分重量含量為30-80mg/ml。
2)無菌試驗按《中國生物制品規程》(2000版)通則《生物制品無菌試驗規程》A/B項進行，結果符合無菌要求。
產品的儲存和運輸在4℃的特殊保存箱中，該箱符合陰涼、干燥、清潔、避免陽光直射、無腐蝕性氣體、無重壓的條件。
四.治療面部痤瘡，天花疤痕，創傷性、凹陷性疤痕，治療20例。
1.治療者術前檢查，各項指標均正常，包括血尿便常規、心電圖、肝腎功能、HIV、HbsAg。
2.將注射部位用70％的酒精消毒，局部注射1％的利多卡因麻醉。
3.將1.5ml細胞懸液吸入3ml的注射器中備用。
4.取2.2cm長的4.5號針頭，采用多點斜面(針頭與皮膚的角度20°～45°)，在注射部位注射細胞懸液。注射時將注射部位表皮拉緊，使其發白，注射時使注射部位留有彌散空間。注射完后用冰袋外敷2小時。
療程上述部位共注射2次，間隔2周。
五、術后觀察、調護同實施例1。
六、效果描述治療一個半月后，其凹陷性的疤痕表現平整，與周圍皮膚基本一致，皮膚有光澤，效果良好。
實施例3人體軟組織填充劑的制備——用于皮膚基質的改善和美容(20例)一.自體健康皮膚樣品的提取用70％的酒精消毒耳后，然后用10％的利多卡因和十萬分之一的腎上腺素進行局部表面麻醉。用取皮器或手術刀和手術剪刀將接受治療者耳后4平方毫米的表皮和真皮組織取下，放入組織保存液(DMEM細胞保存液，美國Hyclone公司)中，將創傷部位做一針縫合，創可貼覆蓋。
二.細胞懸液的制備1.組織塊培養法將組織塊切碎成1×1mm2，平鋪于35mm培養皿中，加入2ml上述真皮細胞培養液(Cascade公司，牌號為106，其中主要成分是基礎培養液，生長因子EGF的濃度為1ng/ml，營養材料BPE的濃度為0.2％，美國)進行原代細胞培養。
2.傳代細胞培養每隔2～3天換上述培養液1次，當原代細胞達到50-70％匯集后傳代，用胰酶消化、離心，棄去上清液，按1∶3擴增倍數培養。
3.配制注射劑收集體外傳代至第8周的培養物中的有效成分；向濃度為5％的葡萄糖注射液中加入收集的有效成分，使每毫升混懸液含大約1500-5500萬個有效細胞成分，配制成1-4ml混懸液。
三.產品檢測1.病毒檢測將皮膚組織進行培養8周后，取1ml含有細胞的培養液進行HIV和肝炎病毒的檢驗，確定此為無病毒細胞。
2.免疫反應測試第8周將0.1ml細胞懸浮液對受術者進行皮試(同青霉素皮試方法)，無免疫反應。
3.成品檢測1)外觀本品為淡白色混懸液。
本品中有效成分分類檢定成纖維干細胞采用Brdu抗體測定表明，該填充劑中成纖維干細胞個數占三種細胞總個數的比例為5-20％。
成纖維前體細胞采用細胞形態學方法觀察，該填充劑中成纖維前體細胞個數占三種細胞總個數的比例為20-50％。
成纖維細胞采用細胞形態學方法觀察，該填充劑中成纖維細胞個數占三種細胞總個數的比例為30-70％。
膠原蛋白采用膠原蛋白測定方法，測定該填充劑中膠原蛋白成分重量含量為15-50mg/ml。
2)無菌試驗按《中國生物制品規程》(2000版)通則《生物制品無菌試驗規程》A/B項進行，結果符合無菌要求。
產品的儲存和運輸在4℃的特殊保存箱中，該箱符合陰涼、干燥、清潔、避免陽光直射、無腐蝕性氣體、無重壓的條件。
四.治療治療皮膚不平整，有皮膚細紋，皮膚光澤暗淡，和用于豐厚嘴唇，填充鼻唇溝等，治療20例。
1.治療者術前檢查，各項指標均正常，包括血尿便常規、心電圖、肝腎功能、HIV、HbsAg。
2.將注射部位用70％的酒精消毒，局部注射1％的利多卡因麻醉。
3.將1.5ml細胞懸液吸入3ml的注射器中備用。
4.取2.2cm長的4.5號針頭，采用多點斜面(針頭與皮膚的角度20°～45°)，在注射部位注射細胞懸液。注射時將注射部位表皮拉緊，使其發白，注射時使注射部位留有彌散空間。注射完后用冰袋外敷2小時。
療程上述部位共注射2次，間隔2周。
五、術后觀察、調護同實施例1。
六、效果描述治療三個月后，皮膚基本平整，細小紋消失，皮膚變得光潔有彈性；嘴唇顯得較豐滿，鼻唇溝明顯變淺。
注射用人體軟組織填充劑治療病例統計報告(病例數60)1.納入標準年齡在60歲以下(包括60歲)；皺紋者為額頭、眼周、口周皺紋；疤痕者為粉刺、創傷疤痕(大小范圍無要求)，皮膚松垂、光澤暗淡等。
2.排除標準年齡在60歲以上治療者；有自身免疫性疾病；有慢性皮膚病者；有傳染病者。
3、經過對60例的病例分析，兩次注射的有48例，持續觀察時間6個月。結果為，從接受注射處理開始3周內，有30例顯示出明顯的填充修復效果，治療者自我感覺滿意的有60例(其滿意率為100％)；到3個月時，治療后的皺紋基本消失，疤痕明顯減小，皮膚基質狀況明顯得到改善。
其中有幾個治療者至今已觀察二年，其皺紋、疤痕已完全消失，皮膚光滑而富有彈性。
對比實施例現有技術除皺祛疤注射劑的制備和應用按照中國專利申請第03155833.X號中記載的方法，制備了現有技術的除皺祛疤注射劑，并對比檢驗了其應用效果，具體做法如下述。
一.自體健康細胞的提取用70％的酒精消毒受試者耳后或胳膊內側，然后用10％的利多卡因和十萬分之一的腎上腺素進行局部表面麻醉。用取皮器將耳后4平方毫米的表皮和真皮組織取下，放入組織保存液(DMEM和10％胎牛血清，美國Hyclone公司)中，將創傷部位做一針縫合，創可貼覆蓋。
二.細胞懸液的制備1.組織消化(Sanyo CO2培養箱)將皮膚組織塊放置于35mm培養皿中加入2ml濃度為0.05％的胰酶/EDTA液，37℃，10分鐘；DMEM+10％FBS培養液終止。
2.細胞分離將消化后的組織塊剪碎并用吸管打散。
3.離心吹散后的細胞收集至離心管中，Backman公司控溫離心機，25℃，1000轉/分鐘，離心5分鐘，棄去上清液。
4.原代細胞培養在離心管中加入1ml含血清真皮細胞培養液(DMEM，D5546，加胎牛血清F2242，Sigma公司，美國)吹懸，接種入1×35mm培養皿；Sony CO2培養箱，37℃，5％CO2，進行培養。
5.傳代細胞培養每隔2～3天換液1次，當細胞達到50-70％匯集細胞后傳代。
6.配制注射劑收集在體外傳代至第5周后的有效成分，向5％葡萄糖注射液中加入收集的有效成分，配制成每毫升混懸液含1000-2000萬個有效細胞成分的1-4ml混懸液。
三.產品檢測1.病毒檢測將皮膚組織進行培養5周后，取1ml含有細胞的培養液送北京傳染病醫院進行HIV和肝炎病毒的檢驗，為無病毒細胞。
2.免疫反應測試第四周將0.1ml細胞懸浮液對受術者進行皮試(同青霉素皮試方法)，無免疫反應。
3.成品檢測1)外觀本品為淡白色混懸液。
本品中有效成分分類檢定成纖維干細胞采用Brdu抗體測定表明，該填充劑中成纖維干細胞個數占三種細胞總個數的比例為5-15％。
成纖維前體細胞采用細胞形態學方法觀察，該填充劑中成纖維前體細胞個數占三種細胞總個數的比例為30-50％。
成纖維細胞采用細胞形態學方法觀察，該填充劑中成纖維細胞個數占三種細胞總個數的比例為40-60％。
膠原蛋白采用膠原蛋白測定方法，測定該填充劑中膠原蛋白成分重量含量為2-5mg/ml。
2)無菌試驗按《中國生物制品規程》(2000版)通則《生物制品無菌試驗規程》A/B項進行，結果符合無菌要求。
產品的儲存和運輸在4℃的特殊保存箱中，該箱符合陰涼、干燥、清潔、避免陽光直射、無腐蝕性氣體、無重壓的條件。
四.治療治療面部皺紋，凹陷性疤痕，28例。
1.患者術前檢查均正常，包括血尿便常規、心電圖、肝腎功能、HIV、HbsAg。
2.將注射部位用70％的酒精消毒，表皮用2.5％利多卡因麻醉。
3.將1.5ml細胞懸液吸入3ml的注射器中備用。
4.取2.2cm長的4.5號針頭，采用多點斜面(針頭與皮膚的角度20°～45°)將細胞懸液注入到皺紋和凹陷性疤痕真皮層的上層與中層，注射時應將注射部位表皮拉緊，使其發白，注射時應使注射部位留有彌散空間。注射完后用冰袋外敷2小時。
術后無其它的局部和全身反應。
療程注射2次，每次注射間隔2周。
五、術后觀察、調護1.手術后，用冰袋敷注射處2小時。
2.觀察局部及全身的情況。
3.每天二次局部搽含有維生素C的面霜，約6個月。
4.術后3天內防曝曬及慎用刺激性化妝品。
六、效果描述治療六個月后，眼角魚尾紋基本消失，額頭皺紋變淺和部分消失，額頭皮膚有光澤，彈性增強。治療者普遍認為，需6-9個月后方出現明顯效果，起效時間嫌慢。
權利要求
1.一種注射用人體軟組織填充劑，其特征在于由來源于治療者自體的皮膚經過消化分離，得到的真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞進行體外全程無血清培養和擴增后，將收集到的有效成分與濃度5％的葡萄糖注射液或其它注射液、以及任選的其它適用成分配成，有效成分由選自培養后收集到的真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞中的至少一種和膠原蛋白組成；每毫升注射用填充劑中，有效細胞成分的總個數為1000-8000萬個，膠原蛋白的含量為10-100mg/ml注射用填充劑。
2.根據權利要求1所述的注射用人體軟組織填充劑，其特征在于注射填充劑中的有效成分由所說的自體真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞和膠原蛋白共同組成，成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞之間的個數比例范圍為5-20∶20-50∶30-70；膠原蛋白的含量為10-100mg/ml注射用填充劑，優選20-60mg/ml注射用填充劑。
3.根據權利要求2所述的注射用人體軟組織填充劑，其特征在于所說有效成分是在體外全程無血清培養和擴增過程中使用了還包含生長因子和活性材料的培養液后得到的。
4.根據權利要求3所述的注射用人體軟組織填充劑，其特征在于所說生長因子為至少一種選自上皮生長因子、成纖維生長因子等的成分，其在培養液中的含量范圍為1-10ng/ml，優選為2-5ng/ml；所說活性材料為至少一種選自皮質激素、腦垂體提取液等的成分，其在培養液中的含量范圍為0.1-1％，優選為0.2-0.5％。
5.根據權利要求1-4中任意一項所述的注射用人體軟組織填充劑的應用，用于真皮缺損而導致的各種癥狀的填充，包括處理面部皺紋，頸部皺紋，凹陷性疤痕，妊娠紋，手背皺紋，豐唇，以及增強真皮厚度和改善皮膚基質。
6.一種制備注射用人體軟組織填充劑的方法，包含自體皮膚取材、組織消化和細胞分離、體外無血清培養組織細胞有效成分、和將有效成分與濃度5％的葡萄糖注射液或其它注射液、以及任選的其它適用成分配成填充劑幾個步驟，有效成分由選自培養后收集到的真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞中的至少一種和膠原蛋白組成；在每毫升填充劑中，有效細胞成分的總個數為1000-8000萬個，膠原蛋白的含量為10-100mg/ml注射用填充劑。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，有效成分由所說的自體真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞和膠原蛋白共同組成；成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞之間的個數比例范圍為5-20∶20-50∶30-70；膠原蛋白的含量10-100mg/ml注射用填充劑，優選20-60mg/ml注射用填充劑。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，在體外全程無血清培養和擴增過程中使用的培養液中還包含生長因子和活性材料，所說生長因子為至少一種選自上皮生長因子、成纖維生長因子的成分；所說活性材料為至少一種選自皮質激素、腦垂體提取液的成分。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，培養液中所說生長因子的含量為0.1-5ng/ml，優選為0.5-2ng/ml；所說活性材料的含量為0.1-1％，優選為0.2-0.5％。
10.根據權利要求6-9中任意一項所述的方法，其特征在于，體外培養時間為6-10周。
11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，取出多年前凍存于液氮中(196℃)的、經組織消化和細胞分離后得到的自體皮膚活細胞，經重新解凍后，繼續進行培養、擴增和其它后續處理。
全文摘要
本發明涉及一種注射用人體軟組織填充劑及其制備方法，系將來源于治療者自體的皮膚經過消化分離，得到的真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞進行體外全程無血清充分培養后，將收集到的有效成分與濃度5％的葡萄糖注射液或其它注射液以及任選項的其它適用成分制成混懸液，有效成分選自真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞中的至少一種及膠原蛋白，每毫升混懸液含有1000－8000萬個有效細胞成分，膠原蛋白的含量為10－100mg/ml注射用填充劑。本發明的優點是使用的材料取自治療者自體，無排斥反應及副作用，治療后見效快，療效顯著，表情自然，效果作用持久，可維持數年。
文檔編號A61P17/00GK1868420SQ200510072288
公開日2006年11月29日 申請日期2005年5月27日 優先權日2005年5月27日
發明者韓斌, 田書彥 申請人:呂偉光