專利名稱：一種高分子抗腫瘤順鉑藥物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種藥品，特別涉及一種以雙臂聚乙二醇為載體的高分子抗腫瘤順鉑藥物及其制備方法，即以雙臂RPEG2Y-(簡稱雙臂聚乙二醇)為載體，通過官能團化反應對小分子抗腫瘤藥物順鉑進行改性。
背景技術：
自從1969年B.Rosenberg和V.Camp首次報道順式-二氯二氨合鉑(簡稱順鉑)具有廣譜的抗癌活性以來，順鉑在癌癥治療中的應用和研究得到了迅速的發展，目前已經成為各國普遍臨床使用的抗腫瘤藥物。然而，該藥物存在毒副作用大、在體內代謝速度快、易被快速清除等缺點，因而限制了順鉑治療指數的進一步提高。因此，降低順鉑的毒副作用，延長其在體內的代謝半衰期已經成為提高順鉑療效的當務之急。而把其載體化則無疑為此提供了一條有效的途徑。
聚乙二醇(PEG)是一種水溶性的兩親聚合物，具有良好的生物相容性、非免疫原性、無毒等特點，因此，它是順鉑改性的理想的大分子載體。與相同分子量的線型PEG相比，雙臂及多臂PEG由于其有較大的流體力學體積，較小的靜態黏度，預計對藥物會產生更為有效的生理作用。目前尚未見到類似報導。
發明內容
本發明的目的是獲得一種以雙臂聚乙二醇為載體的高分子抗腫瘤順鉑藥物及其制備方法。
本發明以雙臂聚乙二醇(RPEG2Y-)作為載體，通過其官能端基二酸的螯合作用對小分子抗腫瘤藥物順鉑進行改性，化學通式為RPEG2Y-B-C，其中RPEG2Y-簡稱為雙臂聚乙二醇，B為螯合順鉑的帶有兩個羧酸基團的結構，C為被修飾的小分子藥物順鉑，其結構式如下 或 其中R為10個碳以下的直鏈烷烴、異丙基或芐基；R1為CH或苯基；R2為1～9個碳原子的烴基；a、b、c為0～9的整數；k為0～6的整數；s、t、為10～2000的整數；
W為O、S、 之一，同一分子中W可為不同基團； 上述雙臂聚乙二醇(RPEG2Y-)載體結構中，R為甲基尤為優選。
上述高分子抗腫瘤藥物的分子量為2000-160000。
上述高分子抗腫瘤藥物的制備方法，是將用常規方法制備的官能化雙臂聚乙二醇(RPEG2Y-X)和含有丙二酸酯結構的化合物反應，然后水解得到含丙二酸結構的化合物RPEG2Y-B，最后RPEG2Y-B和氯原子被硝酸根取代的順鉑反應得到目標產物RPEG2Y-B-C。
該化學反應利用了現有技術中現有反應條件而得。
上述高分子抗腫瘤藥物中的載體雙臂RPEG是以線性RPEG為原料，通過合成RPEG活性酯，利用多步反應分別在水相以及油相中與例如賴氨酸的ω及α位的胺基偶合得到的。雙臂樹杈狀PEG的合成方法在本領域中已有描述，例如Yamsuki等，Agric.Bio.Chem.1988，52，2185-2196；Monfardidi等，BioconjugateChem.1995，6，62-69。
上述高分子抗腫瘤藥物制備是將雙臂RPEG上的羧酸官能團與帶丙二酸酯結構的化合物如氨基丙二酸二乙酯連接，然后水解得到丙二酸結構，最后與氯原子被取代為硝酸根的順鉑偶合。以單甲氧基聚乙二醇(mPEG)和賴氨酸(lysine)制備的雙臂聚乙二醇為例，該高分子抗癌藥物的合成路線如下
關于線形PEG連接順鉑的方法在本領域中已有描述，例如Yuichi等，Macromol.Biosci.2001，1，No.8，355-363。
上述高分子抗腫瘤藥物中小分子藥物的接藥率在90％-99％之間。
上述的高分子抗腫瘤藥物RPEG2Y-B-C及制備方法，所述的RPEG2-的結構是
其中R為10個碳以下的直鏈烷烴、異丙基或芐基；R1為CH或苯基；a、b、c為0～9的整數；k為0～6的整數；s、t、為10～2000的整數；W為O、S、NH 之一，同一分子中W可為不同基團。
例如 等。
上述雙臂聚乙二醇RPEG2Y-的結構中R是甲基尤為優選。
上述的高分子抗腫瘤藥物及制備方法中，Y可以為 NH、S、O、 CH＝、N＝之一；
上述的高分子抗腫瘤藥物及制備方法中，官能化的雙臂聚乙二醇為RPEG2CO-X時，其中的X可以為下述結構之一-H -OH -NH2 上述的高分子抗腫瘤藥物RPEG2Y-B-C及制備方法中，B的結構可以是下述之一 其中R2為1～9個碳原子的烴基；V為 NH、S、O、 ＝HC、＝N之一。
例如
等。
上述的高分子抗腫瘤藥物及制備方法中，C的結構是兩個氯原子被取代的順鉑。
上述高分子抗腫瘤藥物以雙臂RPEG為載體，通過化學反應，將小分子抗腫瘤藥物順鉑與載體偶合。和相同分子量的線性RPEG比較，雙臂RPEG具有更大的流體力學體積，這樣就更有效的減少了藥物在生物體內失活或被酶水解的速度。同時通過丙二酸的螯合作用與順鉑連接生成的穩定的六元環，使藥物的釋放更加緩慢，增加了藥物在體內的半衰期。
上述具有通式RPEG2CO-B-C的雙臂mPEG順鉑偶合物(DImPEG-Pt)經體外細胞毒性實驗表明，該藥物保留了相當程度的抗腫瘤活性；同時，與相同分子量的線性mPEG順鉑偶和物相比，具有通式RPEG2CO-B-C的高分子抗腫瘤藥物具有更高的體外細胞毒活性，這也說明了雙臂mPEG比線性mPEG更適合于對小分子藥物的改性，可以更大限度的減少藥物失活的程度。
圖1是雙臂聚乙二醇改性的順鉑(DImPEG-Pt)系列的劑量反應曲線2是單臂聚乙二醇改性的順鉑(mPEG-Pt)系列的劑量反應曲線圖具體實施方式
實施例一RPEG2CO-B-C的合成方法(以單甲氧基聚乙二醇(mPEG)分子量2000為例)1.將10g mPEG(Mn＝2000，5mmol)溶于約150mL甲苯，在氮氣保護下常壓蒸除絕大部分甲苯，以除去mPEG中所含的微量水分。冷至室溫后，向其中加入約200mL無水THF，加熱微沸至mPEG完全溶解。隨后向mPEG溶液中滴加0.2mol/L的萘鈉溶液直至溶液呈灰綠色。取5.24mL氯乙酸乙酯(6.03g，50mmol)用50mL THF稀釋后加入反應溶液中，室溫下攪拌反應4h。反應液經濃縮后用無水乙醚沉淀，所得粗產物加到300mL 0.1mol/L NaOH溶液中，50℃攪拌12h。然后用1mol/L HCl調節pH＝3，用CH2Cl2萃取三次，合并萃取液濃縮后用無水乙醚沉淀。再經兩次溶解-過濾-沉淀后，真空干燥，得mPEG-CH2COOH 9.5g，產率92％。經核磁共振測定，產物中mPEG-CH2COOH摩爾含量為95％。(1HNMR(CDCl3)mPEG-CH2COOH，δ＝4.15)
2.將上述9.5g mPEG-CH2COOH(Mn＝2058，4.6mmol)溶于約150mL甲苯，在氮氣保護下常壓蒸除絕大部分甲苯，以除去其中所含的微量水分。冷至室溫后，向其中加入約120mL無水二氯甲烷溶解mPEG-CH2COOH。隨后向溶液中分別加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)1.06g(9.2mmol)，二環己基碳二亞胺(DCC)2.86g(13.8mmol)，于冰水浴下攪拌反應12h。反應液經濃縮后用無水乙醚沉淀，所得粗產物在加熱下溶于約40mL干燥甲苯，過濾，除去其中的不溶物后用無水乙醚沉淀。再經兩次溶解-過濾-沉淀后，真空干燥，得mPEG-CH2COOSu(mPEG-琥珀酰亞胺碳酸酯)9.0g，產率90％。經紫外光譜法來測定，產物中琥珀酰亞胺碳酸酯的摩爾含量為94％。
3.稱取賴氨酸(Lysine)1.46g(10mmol)溶于80mL pH＝8的硼酸、硼砂緩沖溶液中。將第2步中制得的mPEG-CH2COOSu4.3g(2mmol)在1h內分批逐步加入，期間通過滴加0.2mol/L的NaOH溶液保持溶液的pH值為8(用pH計監控)。室溫繼續攪拌反應12h后，在冰水浴下將溶液的pH值用鹽酸調至2-3，用二氯甲烷萃取產物。反復萃取三次，將萃取液合并，濃縮，于無水乙醚中沉淀。再溶解-過濾-沉淀二次后，真空干燥，得到產物mPEG-CH2CO-Lysine，用于下一步反應。
4.將上步反應所得產物mPEG-CH2CO-Lysine溶于約80mL無水二氯甲烷中，滴加三乙胺調節溶液pH值至8-9(將溶液滴至濕潤的精密pH試紙測得)。在3小時內分批逐步加入第2步中制得的mPEG-CH2COOSu 4.7g(2.2mmol)，并不斷滴加三乙胺，保持溶液的pH值為8-9。然后將反應液升溫至40℃，回流攪拌48小時后，過濾、濃縮，于無水乙醚中沉淀。所得產物再溶解-過濾-沉淀二次后，真空干燥，得產物8.0g。經GPC測定，其中雙臂mPEG2-CHCO-Lysine的含量約為80％。
將上述產物配成10％的水溶液，選擇合適孔徑的超濾膜，在1.5個大氣壓下，超濾分離，即可提純雙臂mPEG，最終得產物mPEG2-CHCO-Lysine 5.0g。
5.第4步中制得的將5.0gmPEG2-CHCO-Lysine(Mn＝4226，1.2mmol)溶于約100mL甲苯溶液，在氮氣保護下常壓蒸除絕大部分甲苯，以除去其中所含的微量水分。冷至室溫后，向其中加入約120mL無水二氯甲烷溶解mPEG2-CHCO-Lysine。隨后向溶液中分別加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)0.28g(2.4mmol)，二環己基碳二亞胺(DCC)0.75g(3.6mmol)，于冰水浴下攪拌反應12h。反應液經濃縮后用無水乙醚沉淀，所得粗產物在加熱下溶于約40mL干燥甲苯，過濾，除去其中的不溶物。再經兩次溶解-過濾-沉淀后，真空干燥，得mPEG2-CHCO-Lysine-OSu 4.5g，產率90％。經紫外光譜法來測定，產物中琥珀酰亞胺碳酸酯的摩爾含量為98％。
6.稱取0.7g氨基丙二酸二乙酯(DEAM)(3.3mmol)，溶于50mL無水二氯甲烷中，加入三乙胺1mL，冰水浴下攪拌2小時。將4.5g第5步中制得的mPEG2-CHCO-Lysine-OSu(1.1mmol)溶于約80mL無水二氯甲烷中，滴加三乙胺調節溶液pH值至8-9(將溶液滴至濕潤的精密pH試紙測得)。冰水浴下將前面反應的氨基丙二酸二乙酯溶液加入到mPEG2-CHCO-Lysine-OSu溶液中。0℃下反應12小時后，過濾、濃縮，于無水乙醚中沉淀。所得產物再溶解-過濾-沉淀二次后，真空干燥，得產物4.3g。經核磁共振測定，其中mPEG2-CHCO-Lysine-DEAM的含量約為80％。(1H NMR(CDCl3)COOCH2CH3，δ＝1.30)7.冰水浴下將第6步中制得的4.3g mPEG2-lysine-DEAM(0.98mmol)溶于NaOH甲醇溶液(甲醇92mL，1mol/LNaOH 13.5mL)中，攪拌2h。用1mol/L HCl調節pH＝6，40℃旋轉蒸發溶劑，然后加入二氯甲烷溶解，加入無水硫酸鎂干燥。過濾，將濾液濃縮，于無水乙醚中沉淀。再溶解沉淀兩次后，真空干燥，得產物(mPEG2-CHCO-Lysine-DA)4.0g，產率95％。經核磁共振測定，其中mPEG2-CHCO-Lysine-DA含量為75％。(核磁中1.30處的峰消失)8.將順鉑1.35g(4.5mmol) 溶于約200mL去離子水，加熱至60℃使之完全溶解。再加入硝酸銀1.52g(9mmol)，于60℃避光攪拌反應6h后濾掉生成的氯化銀沉淀。向濾液中加入4.0gmPEG2-CHCO-Lysine-DA(0.92mmol)，繼續于60℃避光攪拌反應24h后，用二氯甲烷萃取產物。反復萃取三次，將萃取液合并，濃縮，于無水乙醚中沉淀。再溶解-過濾-沉淀二次后，真空干燥，得產物mPEG2-CHCO-Lysine-Pt產率82％。經原子吸收光譜法測定，產物中順鉑的摩爾含量為87.1％。
實施例二RPEGCO-B-C-Pt的制備(以mPEG分子量4000為例)稱取10g mPEG(Mn＝4000，2.5mmol)，以實施例一相同的方法制備端基為羧基的mPEG-CH2COOH，連接氨基丙二酸二乙酯，水解，最后合成mPEG-CH2CO-Lysine-Pt。產率為81％，最終產物中順鉑的摩爾含量為85.2％。
實施例三RPEG2CO-B-C的合成方法(以單甲氧基聚乙二醇(mPEG)分子量80000為例)將16g mPEG(Mn＝80000，0.2mmol)，以實施例一相同的方法，得mPEG-CH2CO-Lysine-Pt 4.5g，總產率28％。最終產物中順鉑的摩爾含量為80.4％。
按照以上實施例的步驟，本發明合成了三種分子量的高分子藥物，用于體外細胞毒性實驗。合成了載體分子量為4000、6000和9400的三種雙臂mPEG(簡稱DImPEG)順鉑偶合物DImPEG-4000-Pt、DImPEG-6000-Pt、DImPEG-9400-Pt以及三種線性mPEG順鉑偶合物mPEG-4000-Pt、mPEG-6000-Pt、mPEG-9400-Pt。以上各種藥物中順鉑的摩爾含量列于下表1表.1大分子藥物中鉑的摩爾含量
上述藥物的體外細胞毒性實驗過程及結果見實施例四。
上述藥物的急性毒性實驗過程及結果見實施例五。
實施例四將C6人乳腺癌細胞株用含10％胎牛血清的DMEM培養液在37℃，5％CO2條件下培養，傳代。將生長旺盛的C6細胞經0.25％胰蛋白酶消化后，配成終濃度為70000個細胞/mL的細胞懸液，將該懸液按100uL/孔均勻加入96孔平底培養板中。每孔細胞數為7000個。在37℃，5％CO2，濕度100％的條件下孵育24h。將上述各大分子藥物溶于DMEM培養液，用0.22um微孔濾膜過濾。所得藥物溶液以大分子藥物中順鉑的含量為基準，稀釋成不同濃度，折算成小分子順鉑分別為0.02ug/mL，0.2ug/mL，2ug/mL，20ug/mL，200ug/mL，2mg/mL。向上述96孔平底培養板中加入不同濃度的藥物100uL/孔，培養2天， 換液，培養一天。每孔加入20uL 0.5％四氮唑(MTT)溶液，4小時后，吸出上清液，加入150uL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10min。用酶標儀檢測各孔570nm處的吸光值(OD值)，記錄結果，按下列公式計算細胞存活率細胞存活率＝實驗組OD值/對照組OD值×100％從附圖中可求出各藥物對癌細胞的半數抑制濃度(IC50)，根據大分子藥物不同的接藥率，以順鉑的含量為基準，各藥物的IC50值列于表.2。
表.2 DImPEG-Pt與mPEG-Pt系列藥品的IC50值
從表中可以看出，在同系列藥物中，載體PEG的分子量未對藥物的體外細胞毒性產生規律性的影響，但DImPEG-Pt系列藥物的IC50值卻均低于相同分子量的mPEG-Pt系列藥物。這說明了相同分子量的DImPEG-Pt藥物比mPEG-Pt藥物體現出了更好的體外抗腫瘤活性。
圖1是雙臂聚乙二醇改性的順鉑(DImPEG-Pt)系列的劑量反應曲線圖，圖2是單臂聚乙二醇改性的順鉑(mPEG-Pt)系列的劑量反應曲線圖，本發明以細胞存活分數對藥物的劑量作圖，得到了上述幾個藥物的劑量反應曲線。同期本發明也測得了對照樣品順鉑的劑量反應曲線。從圖中可以看出，不同分子量的DImPEG-Pt和mPEG-Pt在體外對C6細胞都有較好的抗腫瘤活性。
實施例五為了檢驗順鉑經PEG修飾后的急性毒性變化，測定了上述高分子藥物的LD50。
TA1小白鼠隨機分成5組，每組20只，雌雄各半，分別用順鉑，接了線型和兩臂PEG的順鉑給藥，用ip×1治療方案，設五個計量組，給藥后觀察即時反應。記錄二周內小鼠的死亡分布。以24小時為死亡高峰。死亡動物尸檢未發現肉眼可見的，明顯的實質性的病變。二周后存活動物一般情況良好。實驗結果用Bliss方法計算，如表3所示。
表.3 DImPEG-Pt與mPEG-Pt系列藥品的LD50值
從表中可以看出，順鉑通過PEG修飾后，其急性毒性明顯降低。
權利要求
1.一種高分子抗腫瘤藥物，其特征在于，化學通式為RPEG2Y-B-C，其結構式如下 或 其中R為10個碳以下的直鏈烷烴、異丙基或芐基；R1為CH或苯基；R2為1～9個碳原子的烴基；a、b、c為0～9的整數；k為0～6的整數；s、t、為10～2000的整數；W為O、S、NH、 之一，同一分子中W可為不同基團；Y為 NH、S、O、 CH＝、N＝之一；V為 NH、S、O、 ＝HC、＝N之一。
2.如權利要求1所述的高分子抗腫瘤藥物，其特征在于R為甲基。
3.如權利要求1所述的高分子抗腫瘤藥物，其特征在于該藥物的分子量是2000～160000。
4.如權利要求1至3任一所述的高分子抗腫瘤藥物，其特征在于，是按照以下步驟制備的官能化雙臂聚乙二醇RPEG2Y-X和含有丙二酸酯結構的化合物反應，然后水解得到含丙二酸結構的化合物RPEG2Y-B，最后RPEG2Y-B和氯原子被硝酸根取代的順鉑反應得到目標產物RPEG2Y-B-C。
5.如權利要求4所述的高分子抗腫瘤藥物，其特征在于，所述的RPEG2-的結構式如下 其中R為10個碳以下的直鏈烷烴、異丙基或芐基；R1為CH或苯基；a、b、c為0～9的整數；k為0～6的整數；s、t、為10～2000的整數；W為O、S、NH、 之一，同一分子中W可為不同基團。所述Y為 NH、S、O、 CH＝、N＝之一；所述的B的結構是下述之一 其中R2為1～9個碳原子的烴基；V為 NH、S、O、 ＝HC、＝N之一。所述C的結構是兩個氯原子被取代的順鉑。
6.如權利要求4所述的高分子抗腫瘤藥物，其特征在于R為甲基。
7.如權利要求4所述的高分子抗腫瘤藥物，其特征在于當官能化的雙臂聚乙二醇為RPEG2CO-X時，其中的X為下述結構之一-H -OH -NH2
8.如權利要求1至7任一所述的高分子抗腫瘤藥物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟官能化雙臂聚乙二醇RPEG2Y-X和含有丙二酸酯結構的化合物反應，然后水解得到含丙二酸結構的化合物RPEG2Y-B，最后RPEG2Y-B和氯原子被硝酸根取代的順鉑反應得到目標產物RPEG2Y-B-C。
9.如權利要求8所述的高分子抗腫瘤藥物的制備方法，其特征在于，其中，所述的RPEG2-的結構式如下 其中R為10個碳以下的直鏈烷烴、異丙基或芐基；R1為CH或苯基；a、b、c為0～9的整數；k為0～6的整數；s、t、為10～2000的整數；W為O、S、NH、 之一，同一分子中W可為不同基團。所述Y為 NH、S、O、 CH＝、N＝之一；所述的B的結構是下述之一 其中R2為1～9個碳原子的烴基；V為 NH、S、O、 ＝HC、＝N之一；C的結構是兩個氯原子被取代的順鉑，結構式如下
10.如權利要求9所述的高分子抗腫瘤藥物的制備方法，其特征在于，當官能化的雙臂聚乙二醇為RPEG2CO-X時，其中的X為下述結構之一-H -OH -NH全文摘要
本發明以雙臂RPEG
文檔編號A61K47/48GK1698903SQ20051007215
公開日2005年11月23日 申請日期2005年5月25日 優先權日2005年5月25日
發明者黃駿廉 申請人:北京市海格里斯科技有限公司