利用丁香假單胞菌制備假單胞霉素的制作方法

專利名稱：利用丁香假單胞菌制備假單胞霉素的制作方法
本申請是申請日為2000年4月14日，申請號為00806262.5，發明名稱為“利用丁香假單胞菌制備假單胞霉素”的發明專利申請的分案申請。
發明領域 本發明涉及生產一或多種假單胞霉素的方法，以及培養可生產一或多種假單胞霉素的丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的方法。

背景技術：
真菌感染是引起人類，尤其是在患有免疫缺陷的人中引起疾病、生活質量降低以及死亡重要原因。在過去的20年里真菌感染的發生有很大的增加。這部分要歸因于患有由器官移植、癌癥的化學治療、AIDS、年齡以及其他的類似紊亂或病情引起的免疫系統削弱或毀壞的病人的增加。這些病人易于受真菌病原的攻擊，而這些病原是通過數量眾多的菌體來作用，而這些菌體又是在正常發揮功能的免疫體系的監控之下的。這些病原是很難控制的，原因在于現存的抗真菌藥物不是高毒性的就是僅僅抑制真菌的活性。例如，多烯烴是殺真菌的，但卻是有毒性的；而吡咯類毒性很小但卻是僅僅抑制真菌的。更重要的，最近有報道出現假絲酵母的抗多烯烴和吡咯類的菌株，這就嚴重限制了對這些菌株的治療方案的選擇。
一類新的抗真菌藥物—假單胞霉素(psendomycin)在治療多種患有真菌感染的病人上展示出了希望。(見如Harrison，L.，et al.，″Pseudomycins，a family of novel peptidcs from丁香假單胞菌possessing broad-spectrum antifungal activity，.″J.Gen.Microbiology，137(12)，2857-65(1991)and US Patent Nos.5,576,298and5,837,685)。假單胞霉素是從丁香假單胞菌分離株中得到的天然產物。丁香假單胞菌是一大族與植物相聯系的細菌，它們是多種具有生物活性的物質如桿菌肽和丁香霉素的來源物質。丁香假單胞菌的天然菌株及由轉座子突變產生的突變體可產生具有生物活性的化合物。P.syringae MSU174的野生型菌株的一株由轉座子突變產生的突變株MSU16H(ATCC 67028)可產生多種假單胞霉素。已經對假單胞霉素A、B、C及C′進行了分離和化學特性鑒定，結果表明它有廣譜抗真菌活性，這包括抵抗人體內和植物體內的重要真菌抗原的活性。假單胞霉素在結構上與從丁香假單胞菌中分離到的丁香霉素和其他的抗真菌物質相關連，但它與他們相比卻是截然不同的物質。假單胞霉素A、B、C及C′肽段與L-Ser-D-Dab-L-Asp-L-Lys-L-Dab-L-aThr-Z-Dhb-L-Asp(3-OH)-LThr(4-Cl)相對應的部分與羧基末端在N-末端Ser的-OH上閉合成大環。這些類似物以N-酰基側鏈來區分，例如假單胞霉素A是由3，4-二羥基十四烷酸鹽進行N-酰基化；假單胞霉素B是由3-羥基十四烷酸鹽進行酰基化的；假單胞霉素C是由3，4-二羥基十六烷酸鹽進行酰基化的，而假單胞霉素C’是通過3-羥基十六烷酸鹽來進行酰基化的。(見如Ballio，A.，et al.，″Novel bioactive lipodepsipeptides ftom丁香假單胞菌the pseudomycins，″FEBS Letters，355(1)，15 96-100，(1994)and Coiro，V.M.，et al.，″Solution conformation of the丁香假單胞菌MSU 16H phytotoxic lipodepsipeptide pseudomycin Adetermined by computer simulations using distance geometryand molecular dynamics from NMR data，″Eur.J.Biochem.，257(2)，449-456 (1998).) 盡管真菌感染流行和利用假單胞霉素進行治療的希望都在增加，但商業規模的假單胞霉素生產存在著很多的問題。已經出版的那些生產假單胞霉素的方法是在以昂貴的馬鈴薯葡萄糖為培養基、在不用搖動和攪拌的情況下培養的。一般來講，這些培養方法可生產少量的、可用于實驗室研究的假單胞霉素，而其濃度是不適合于大規模或商業規模的生產。現有的方法也不適合于大約1升以上規模的生產，在這樣的規模生產中對營養物質、氣體尤其是氧氣進行擴散以保證細胞的充分生長是一個問題。
現在需求的是一種可以利用P.Syringae來生產商業規模的、可進行商業應用的假單胞霉素，從而將其作為抗真菌藥物來抵抗動物、人類及植物的真菌感染。
發明概述 本發明提供了利用微生物來生產抗真菌藥物如一或多種假單胞霉素的方法。這些方法包括利用含有三種或少于三種氨基酸的培養基培養丁香假單胞菌，以及從培養物中回收一或多種假單胞霉素。這三種或少于三種的氨基酸包括谷氨酸、甘氨酸、組胺酸以及他們的組合。在一種實施方案中，丁香假單胞菌是在含有甘氨酸及任選脂質、馬鈴薯產品或其組合之一的培養基中、在pH大約4到6.5的條件下進行培養，直至一或多種假單胞霉素的濃度至少為大約10μg/ml.，優選大于大約40μg/mL。這種培養方法尤其對在一定規模條件下生產一或多種假單胞霉素有用，而這樣的規模是可充分用于回收作為動物、人類或植物抗真菌藥物的假單胞霉素的。此外，本發明也提供了利用上述方法制備的假單胞霉素。
本發明還涉及丁香假單胞菌菌株的生物純化培養物，這些培養物對于生產假單胞霉素非常有用。丁香假單胞菌菌株可以是從環境資源，包括植物，如大麥類植物、柑橘類植物、丁香類植物等等中分離到的的野生型菌株；也可以是從環境分離物中篩選的菌株，以及這些菌株的突變株。優選的環境分離物是植物。優選的丁香假單胞菌的特征包括能在不含馬鈴薯產品的培養基上或基本培養基上生長并產生一或多種假單胞霉素的能力；可產生明顯量的假單胞霉素；至少大約是10μg/ml，產生所需的分布(distribution)的假單胞菌素和/或抑制一或多種真菌。
按照本發明，丁香假單胞菌能夠在含有三種或少于三種氨基酸及從油脂、馬鈴薯產品和他們的組合中任選一種的培養基上生長，直至產生的一或多種假單胞霉素的濃度至少約有10μg/mL優選的是丁香假單胞菌菌株產生的一或多種假單胞霉素的濃度約為40μg/mL-700μg/mL，而最優選的是大約200μg/mL的假單胞霉素A或至少大約100μg/mL的假單胞霉素B。
在本方法的一種優選實施方案中，通過分批培養或連續培養丁香假單胞菌生產了一或多種假單胞霉素。丁香假單胞菌要有足夠的生長時間和濃度來提高假單胞霉素的產量。優選的是培養物的pH保持在約為4-6.5，更優選的是4.5-5.5，這樣可以保持假單胞霉素的穩定性。
定義 此處所用到的名詞“假單胞霉素”指含有式I的化合物
其中R是親脂性基團。假單胞霉素化合物A，A′，B，B′，C，C′是由上式I來代表的，其中的R定義如下。
假單胞霉素AR＝3，4-二羥基十四烷酰 假單胞霉素A’R＝3，4-二羥基十五烷酸鹽 假單胞霉素BR＝3-羥基十四烷酰 假單胞霉素B’R＝3-羥基十二烷酸鹽 假單胞霉素CR＝3，4-二羥基十六烷酰 假單胞霉素C’R＝3-羥基十六烷酰 圖表簡述

圖1圖解通過在N21SM或馬鈴薯珍珠培養基中培養幾株丁香假單胞菌菌株約67小時而生產的假單胞霉素A，B，C，C′水平。
圖2圖解通過在裝有N21SM的瓶中培養幾株丁香假單胞菌菌株約67小時而生產的假單胞霉素A，B，C，C′水平。
圖3圖解利用丁香假單胞菌菌株MSU16H，在裝有含有馬鈴薯葡萄糖肉湯的培養基和這種培養基加成鹽、甘氨酸、肉豆蔻酸甲酯、和/或可溶性淀粉的培養基的不搖動搖瓶中生產假單胞霉素。
圖4圖解在圖3的情況下假單胞霉素的生產水平，不同的只是搖動搖瓶。
圖5圖解利用含有甘氨酸培養基和圖4中的搖瓶來生產假單胞霉素。這些結果表明甘氨酸和肉豆蔻酸甲酯在刺激假單胞霉素生產方面有協同作用。
圖6圖解利用丁香假單胞菌MSU16H菌株，在添加有多種濃度為0.1％v/v的多種脂肪酸甲基酯，并且含有馬鈴薯葡萄糖肉湯、甘氨酸、鹽及可溶性淀粉的培養基中生產假單胞霉素A，B和/或C。脂肪酸都是飽和的，方塊下的數字表示其碳鏈的長度。
圖7圖解在150升發酵條件下的假單胞霉素因素測定。通過計算機控制的攪拌和空氣流動調節來將溶解氧控制在30％。從18小時開始以200ml/h的速度補加葡萄糖，而從20小時開始以20ml/h的速度開始補加氫氧化氨。在此類發酵中沒有檢測到假單胞霉素C。
圖8圖解在圖7中的發酵產生假單胞菌素條件下的氧的吸收和溶解氧變化。
圖9圖解在利用不含添加的馬鈴薯產品及含有或不含肉豆蔻酸甲酯的搖瓶中，發酵培養多種丁香假單胞菌生產假單胞霉素A，B和/或C。
發明詳述 丁香假單胞菌 丁香假單胞菌(pseudomonas syringae)包括一系列的一般與植物相關聯的細菌。一些丁香假單胞菌是植物病原，而另一些僅僅是弱病原或是腐生物。丁香假單胞菌的多種不同分離物可產生一或多種細胞毒素物質，而這些細胞毒素物質可幫助他們在必須與真菌和其他細菌競爭的野生環境中存活下去。丁香假單胞菌產生的細胞毒素物質包括抗真菌物質如假單胞霉素、丁香霉素、丁香假單孢菌毒素(syringotoxin)及syringostatin。
可產生一或多種假單胞霉素的丁香假單胞菌分離株在本領域中是已知的。例如，野生型菌株MSU174(從Montana的大麥田中分離到)及其利用Tn905進行的轉座子突變產生的突變株在美國專利No.5,576,298中有描述，而這項專利是在1996年11月發布給G.Strobel等的；在Harrison等在J.Gen.Microbioloev 137，2857-2865(1991)上的文章″pseudomycin，a family of novelpeptides from丁香假單胞菌possessing broad-spectrumantifungal activity，″中以及在Lamb等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，6447-645上的文章″Transposon mutagenesis and taggingof fluorescent pseudomonas；and Antimycotic production isnecessary for control of Dutch elmdisease；’中也有討論。MSU174和MSU 16H的培養物存放在Montana State University(Bozeman，Montana，USA)，也可從the American Type CultureCollection(Parklawn Drive，Rockville，MD，USA)獲得。本段引用的已公開的文獻在此處引用作為參考。
本發明包括一株菌株、一種分離物及丁香假單胞菌的一種生物純化培養物，而此培養物可產生一或多種產量大于10μg/mL假單胞霉素，優選至少約10μg/mL-900μg/mL假單胞霉素，更優選的是800μg/mL-900μg/mL假單胞霉素。優選的是微生物的生物純化分離物是由丁香假單胞菌菌株MSU 16H、25-B1、67H1，、7H9-1，或7D11-6或假單胞霉素生產突變株、變體分離物或這些菌株的重組體。已經如上述文獻所述得到了MSU 174和MSU 16H培養物。
適于生產一或多種假單胞霉素的丁香假單胞菌可從包括植物如大麥類植物、柑橘類植物、丁香類植物等等的環境資源中分離得到，也可從如土壤、水、空氣、塵埃等資源中分離得到。正如此處所用的，“野生型”指在丁香假單胞菌自然存在的正常群體的顯性基因型(如在自然中發現的、而不是通過實驗室操作產生的丁香假單胞菌分離物或菌株)。如其他的生物體一樣，應用于本發明的假單胞霉素產生培養物的特性，丁香假單胞菌菌株如MSU 174，MSU 16H，MSU 206，25-B1及7H9-1也是變化的。因此，這些菌株的子代如重組體、變異菌株或變體可通過本領域中的技術人員熟知的方法來獲得。
丁香假單胞菌的變異菌株也適于生產一或多種假單胞霉素。此處所用的“突變”指顯性菌株發生的意外的可遺傳變化，它可自發的產生或通過包括輻射及多種化學物質在內的誘變物質誘導產生。本發明中的丁香假單胞菌突變株可通過包括輻射如紫外線或X-射線在內的多種誘變物質來獲得，也可通過化學誘變劑、定點誘變以及轉座子介導的誘變來獲得。化學誘變劑的例子有甲基磺酸乙酯(EMS)、二環氧辛二酸酯、N-甲基-N-亞硝基-N’-亞硝基胍(NTG)以及亞硝酸。
通過利用可有效產生突變株的量的誘變物質處理丁香假單胞菌就可得到本發明中的丁香假單胞菌的假單胞霉素生產突變株，這些突變株可超量生產一或多種假單胞霉素，可產生一種假單胞菌素如假單胞霉素B，其產量超過其他的假單胞霉素，或在有利的生長條件下生產一或多種假單胞霉素。雖然所用誘變劑的種類和量可變化，但優選的方法是將NTG系列稀釋到1-100μg/ml的水平。本發明中優選的誘變劑是那些可超量生產1-100μg/ml假單胞霉素B，而又可在極限培養基(minimal defined medium)上生長的物質。這些突變株超量生產一或多種假單胞霉素，優選的是產量從至少大約10μg/ml到大約900μg/ml，更優選的是從大約800μg/ml到900μg/ml。
可通過生長特征、生長介質、營養源、碳源、生長條件以及氨基酸需求對環境分離物、突變菌株以及丁香假單胞菌的其他有用菌株進行篩選。優選的是篩選那些不僅可在極限培養基如N21培養基生長，而且和/或能生產一或多種最低水平大約大于10μg/ml假單胞霉素的丁香假單胞菌假單胞霉素生產菌株。在含有三種或少于三種氨基酸及油脂、馬鈴薯產品或他們的一種組合中的任一種的培養基上生長時，優選的菌株表現出了可產生一或多種假單胞霉素的特征。
利用本領域中的技術人員熟知的方法轉化丁香假單胞菌菌株，這樣就可以得到其重組菌株。利用重組DNA技術就可將丁香假單胞菌轉化為可表達這些菌株產生的抗生素以外的多種基因產物。例如，利用一種重組載體轉化這些菌株，從而可給予這些菌株對未轉化前通常對其敏感的抗生素的抗性。因而，得到的轉化體不僅可產生多種假單胞霉素，而且可產生給予其抗性的酶，而又可通過這種酶從野生型細胞中篩選轉化后的菌株。此外，利用相似的技術，可將現有的菌株進行修飾從而引入內源假單胞霉素生物合成基因的多拷貝，這樣就可以獲得更高的假單胞霉素產量。后代如保留有假單胞霉素超量生產特性的丁香假單胞菌菌株25-B1、67H1和7H9-1的天然或誘導變體、突變菌株和重組體，他們是本發明的組成部分。
假單胞霉素 正如此處所用到的，假單胞霉素指從丁香假單胞菌中分離到的一族抗真菌物質中的一或多個成員。假單胞霉素是lipodepsipeptide，也即含有一或多種不常見氨基酸和一或多種附加有疏水或脂肪酸側鏈的環狀多肽。明確的講，假單胞霉素是脂縮酚九肽(lipodepsinonapeptide)，而此脂縮酚九肽不僅含有通過內酯鍵閉和的環狀肽部分，而且含有不常見氨基酸4-氯蘇氨酸、3-羥基天冬氨酸、去水-2-氨基丁酸、2，4-二氨基丁酸。我們認為這些不常見氨基酸參與了假單胞霉素的生物特性，如在血清中的穩定性和他們的殺傷作用。假單胞霉素包括假單胞霉素A、假單胞霉素A’、假單胞霉素B、假單胞霉素B’、假單胞霉素C和假單胞霉素C’。這些假單胞霉素含有相同的環狀多肽核，但他們那些粘連到環狀多肽核上的側鏈不同。
已經純化分離到假單胞霉素A、A’、B、B’、C和C’，并且應用包括氨基酸測序、NMR和質譜在內的方法確定其結構特性。假單胞霉素A、A’、B、B’、C和C’在1996年11月19日授予G-Strobel等的、美國專利號為NO.5，576，298的專利中；在Harrison等在J. Gen.Microbioloev 137， 2857-2865 (1991)上的文章″Pseudomycins，a family of novel peptides from丁香假單胞菌possessing broad-specwm antifungal activity，″以及Ballio等在FEBS Lett.355，96-100(1994)上的文章″Novel bioactivelipodepsipeptides from丁香假單胞菌the pseudomycins中有討論。假單胞霉素A’和B’在Palaniappan Kulanthaivel等與本專利同時提交的、美國專利申請序列號為No.PCT/USOO/08727的專利中有描述，這項專利的名稱為假單胞霉素天然產物，在實施例部分有其例示。由這幾種假單胞霉素產生的抗真菌活性可追因于含有轉座子Tn 903的丁香假單胞菌，而此轉座子可編碼包括卡那霉素抗性在內的多種因子。Tn 903序列和對其進行基因操作的方法是已知的。Okaet al.，″Nucleotide sequence of the kanamycin resistancetransposon Tn 903；’J.Mol.Biol.147，217-226(1981)。本段別引用的每一篇文獻在此處明確指出在本發明中引用作為參考。
這些假單胞霉素在結構和性質上有所不同。優選的假單胞霉素A、B、C和C’表現出可抗廣譜范圍的真菌的活性，也表現了普遍可接受的毒性。相對于其他的優選假單胞霉素，假單胞霉素B表現出對特定真菌的更強的抗性和更低的毒性。因此，對本發明中的方法來講，優選的是假單胞霉素B。每一種假單胞霉素含有一種環狀的九肽環，此九肽環含有Ser-Dab-Asp-Lys-Dab-aThr-Dhb-HOAsp-ClThr(絲氨酸；2，4-二氨基天冬氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、2，4-二氨基丁酸、別蘇氨酸(allo Threonine)、脫氫-2-氨基丁酸、3-羥基天冬氨酸、4-氯蘇氨酸)，更特別的是L-Ser-D-Dab-L-Asp-L-Lys-L-Dab-L-aThr-Z-Dhb-L Asp(3-OH)-L-Thr(4-Cl)，ClThr的羧基和絲氨酸的羥基形成內酯鍵以閉和此環。這些假單胞霉素在親脂基團的性質上有所不同，而這些親脂基團是結合到絲氨酸的N-末端氨基上的。絲氨酸的N-末端氨基在假單胞霉素A中與3，4-二羥基十四烷酰殘基、在假單胞霉素B中與3-單羥基十四烷酰殘基、在假單胞霉素C中與3，4-二羥基十六烷酰殘基、在假單胞霉素C’中與3-羥基十六烷酰殘基分別形成肽鍵。絲氨酸的羧基在環中的Dab形成肽鍵。
假單胞霉素的生物活性 一種假單胞霉素可表現多種生物活性，包括殺傷多種真菌，如植物和動物的真菌病原。尤其是假單胞霉素是活性的抗真菌藥物，他可抗引起免疫損傷個體偶然感染的真菌。這些真菌包括念珠菌屬的多個種，這些種包括近平滑念珠菌、白色念珠菌、C.Glabrata、C.tropicalis和C.Krusei。他們也包括其他的屬如新型隱球菌、煙曲霉及夾膜組織胞漿菌。殺傷而不是抑制真菌，尤其是真菌抗原的生長是假單胞霉素渴望的生物活性，也是優選的生物活性。
也已證明假單胞霉素對較廣范圍的植物病原真菌有毒力，這些植物病原真菌包括Rynchosporium secalis、Ceratocystis ulmi、Rhizocronia solani、Sclerotinia scleroriorum、Verticillliumalbo-atrum、Verticillium dahliae、Thielaviopis basicola、Fusarium oxysporum及Fusarium culmorum. (見Harrison，L.，etal.，″假單胞霉素s，a family of novel peptides from丁香假單胞菌possessing broad-spectrum antifungal activity，″J.ofGeneral Microbiology，7，2857-2865(1991).)。此外，已經證明P.syringae MSU 16H在感染有Cerarocystic ulmi的榆樹中更具有保護性，而Cerarocystic ulmi感染正是Dutch榆樹病的原因所在。(見如Lam et al，Proc.Natl.Sci.USA，84，6447-6451(1987)). 丁香假單胞菌的生長 正如本發明所描述的，“水性營養介質”指基于水的組合物，這些組合物包括本發明中的微生物生長所必須的礦物和有機化合物以及他們的鹽。優選的營養介質含有有效劑量的三種或少于三種的氨基酸，優選的是谷氨酸、甘氨酸、組胺酸或其組合。在一種實施方案中，其介質含有有效劑量的甘氨酸以及從一或多種馬鈴薯產品和油脂中任選的一種物質。甘氨酸可以是單獨的氨基酸或以氨基酸混合物如水解蛋白質的組分方式提供的。合適的油脂包括大豆油、含有14或16個碳的脂肪族碳鏈的脂肪酸以及含有14或16個碳的脂肪族碳鏈的脂肪酸酯。優選的脂肪酸酯包括棕櫚酸甲酯和肉豆蔻酸甲酯，優選的是肉豆蔻酸甲酯。合適的馬鈴薯產品包括馬鈴薯葡萄糖肉湯、馬鈴薯糊精、馬鈴薯蛋白以及商業流通的馬鈴薯泥混合食品。營養介質中優選的礦質包括普遍用于細胞培養和發酵的鹽混合物，如含有KCI、MgSO4和FeSO4的.Czapek礦物鹽。營養介質中優選的有機化合物包括葡萄糖、蔗糖以及可隨意的包含可溶性淀粉；其他類似的有機化合物也可包括在內。培養基的pH優選約為4-6.5更優選的為大約4.5-5.7，最優選的為大約5.2。
雖然營養肉湯中每一種成分的量一般來講對細菌的生長或一或多種假單胞霉素的生產并不很關鍵，但特定水平的營養物是有利的。甘氨酸的優選量為大約0.1 g/L-10g/L，更優選的大約為0.3g/L-3g/L，最優選的大約為Ig/L。油脂的優選量為大約1g/L-10g/L的油制品，如大豆油，更優選的大約為0.5g/L-2g/L的大豆油。優選的脂肪酸或脂肪酸酯的量大約為0.5g/L-5g/L。一種優選的脂肪酸酯為肉豆蔻酸甲酯，用量為大約0.1-10g/L，優選的為大約0.3g/L-3g/L，更優選的為大約1g/L。馬鈴薯產品的優選量包括大約12g/L-36g/L，更優選的為大約24g/L的馬鈴薯葡萄糖肉湯；大約5g/L-50g/L，更優選的大約為30g/L的商業上流通的馬鈴薯泥混合物；大約1g/L-30g/L，的馬鈴薯糊精，優選為大約20g/L；和/或大約1g/L-10g/L的馬鈴薯蛋白，優選的為大約4g/L的馬鈴薯蛋白。優選的營養介質含有礦質質，這些礦質質包括如大約0.02-2g/L的KCL，優選的為大約0.2g/L；MgSO4，優選MgSO4·7H2O，濃度大約為0.02-2g/L，更優選大約為0.2g/L；FeSO4，優選FeSO4·7H2O，濃度大約為0.4-40mg/L，更優選大約4mg/L，等等。如果有培養基中含有可溶性淀粉，優選量為大約0.5-50g/L，更優選的大約為5g/L。含有的葡萄糖的優選量為大約2-80g/L，更優選的大約為20g/L。含有的蔗糖的優選量為大約2-80g/L，更優選的大約為30g/L。
丁香假單胞菌一般在本發明所描述的培養基中生長，這些培養基又有可控制或可調節的pH、溫度等等。丁香假單胞菌可在大約15℃-35℃的溫度下生長并產生一或多種假單胞霉素，優選的溫度為大約20-30℃，更優選的大約為22-27℃，最優選的大約為25℃。丁香假單胞菌可在大約為4-7的pH下生長并產生一或多種假單胞霉素，優選的pH為大約4-6，更優選的大約為4.5-5.5。一般來講，在溫度高于37℃或低于10℃時、或在pH大于9或小于4時丁香假單胞菌一般不能生長。
假單胞霉素的生產方法 為了利用丁香假單胞菌的野生型或突變菌株生產一或多種假單胞霉素，則就得在含有有效劑量的三種或少于三種氨基酸的水合營養介質中攪拌培養這些微生物。這三種或少于三種的氨基酸優選谷氨酸、甘氨酸及組胺酸或他們的組合。在一優選的實施方案中，氨基酸包括甘氨酸以及從一或多種馬鈴薯產品和油脂中任選的一種物質。在最有利于丁香假單胞菌生長和產生所要的假單胞霉素或多種假單胞霉素的條件下培養丁香假單胞菌。有效的條件包括溫度為大約22-27℃，培養時間大約為36-96小時。當在如本發明所述的介質培養時，丁香假單胞菌可生長至細胞密度為10-15g/L干重，并且產生的假單胞霉素總量至少為大約10μg/mL，優選的至少為大約40μg/mL，更優選的大約為500μg/mL或更多。
在丁香假單胞菌的培養中控制培養基中氧的濃度有利于生產假單胞霉素。優選的是氧水平在大約5％-50％的飽和濃度，更優選的是30％的飽和濃度。噴射空氣、純氧氣或含有氧氣的混合氣體可調節培養基中氧氣的濃度。此外，調節震蕩頻率也可調節氧氣的轉移速率。
在丁香假單胞菌的培養中控制培養基的pH有利于生產假單胞霉素。假單胞霉素在堿性pH下不穩定，并且如果培養基在pH大約大于6的條件下持續超過12個小時，假單胞霉素就會有顯著的降解。優選的培養基pH應保持在至少6以下，更優選的是在5.5以下，最優選的是大于4。pH優選的保持在大約5-5.4，更優選的是大約5.0-5.2。雖然這并不限于本發明，但我們認為假單胞霉素在堿性pH下的降解要歸因于內酯環的打開以及Cl-的去除。
丁香假單胞菌在分批培養的條件下能產生一或多種假單胞霉素。然而，補料分批培養或半連續補加葡萄糖和酸或堿如氫氧化氨中的任一種來控制pH就可以提高假單胞霉素的產量。通過利用連續補料培養的方法就可以進一步提高利用丁香假單胞菌生產假單胞霉素的產量，在這樣的條件下，葡萄糖和酸或堿如氫氧化氨的任一種物質是自動添加以便控制其pH的。
利用丁香假單胞菌可生產具有相當產量的一或多種假單胞霉素。也就是說，這一或多種假單胞霉素的總產量至少為大約200μg/mL-900μg/mL，優選的是大約600μg/mL-900μg/mL，更優選的是大約800μg/mL-900μg/mL。對于生產假單胞霉素A來講，優選的總產量至少為大約10μg/mL-400μg/mL，更優選的是大約300μg/mL-400μg/mL，最優選的大約為350μg/mL-400μg/mL。對于生產假單胞霉素B來講，優選的總產量至少為大約10μg/mL-300μg/mL，更優選的是大約200μg/mL-300μg/mL，最優選的大約為250μg/mL-300μg/mL。對于生產假單胞霉素C來講，優選的總產量至少為大約5μg/mL-100μg/mL，更優選的是大約5μg/mL-50μg/mL，最優選的大約為10μg/mL-50μg/mL。對于生產假單胞霉素C’來講，優選的總產量至少為大約1μg/mL-50μg/mL，更優選的是大約10μg/mL-50μg/mL，最優選的大約為30μg/mL-50μg/mL。
在本發明所述的培養條件下，丁香假單胞菌菌株的選擇能影響特定假單胞霉素的產量分配以及這些假單胞霉素的生產。例如MSU16H菌株、67H1菌株及其他類似菌株不僅主要生產假單胞霉素A，而且產生假單胞霉素B和C，其比率一般為4∶2∶1。然而，67H1菌株及其類似菌株生產的假單胞霉素一般要比MSU16H菌株生產的多大約3-5倍。與MSU16H菌株和67H1菌株相比，25-B1及其類似菌株能生產較多的假單胞霉素B，而生產較少的假單胞霉素C。7H9-1菌株及其類似菌株的特色在于主要生產假單胞霉素B，并且產量較其他菌株高。例如這株菌株生產的假單胞霉素B較其生產的假單胞霉素A或C高出10倍。
利用任何本領域中的技術人員熟知的方法就可對假單胞霉素或假單胞霉素混合物進行檢測、分離和/或純化。例如，利用抗真菌如抗念珠菌的抗真菌作用就可以對肉湯中的假單胞霉素活性水平、或分離到的、或純化到的組合物的活性水平進行確定。已有多種已知的制備和分析假單胞霉素的方法。例如，可利用色譜如HPLC對一或多種假單胞霉素進行分離和純化。
可將利用本發明中的方法制備的假單胞霉素以藥物上可接受的鹽的形式分離出來。此處所用的名詞‘藥物上可接受的鹽’指上文所述的那些對活體基本無毒性的化合物的鹽。典型的藥物上可接受的鹽包括通過本發明中的化合物與無機或有機酸或無機堿反應制備得到的鹽。這些樣叫做酸加成鹽和堿加成鹽。
通常用于形成酸加成鹽的酸是無機酸如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸和磷酸，以及有機酸如p-甲苯磺酸、甲基磺酸、草酸、對溴苯磺酸、碳酸、丁二酸、檸檬酸、安息香酸和乙酸。著牙膏內的藥物學上可接受的鹽的實施例有硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、重亞硫酸鹽、磷酸鹽、一氫磷酸鹽、二氫磷酸鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、醋酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、 己酸鹽、庚酮酸鹽、propiolate，草酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、癸二酸鹽、延胡索酸鹽、馬來酸鹽、丁基-1，4-二元醇酸、己基-1，6-二元醇酸、安息香酸鹽、氯代安息香酸鹽、甲基安息香酸鹽、二硝基安息香酸鹽、羥基安息香酸鹽、甲氧基安息香酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、苯乙酸鹽、phenylpropionate、苯丁酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、γ羥基丁酸鹽、乙醇酸鹽、酒石酸鹽、甲基磺酸鹽、丙基磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽和扁桃酸鹽。優選的藥物學上可接受的酸加成鹽是那些與礦物酸如鹽酸和氫溴酸形成的鹽，以及那些與有機酸如馬來酸和甲基磺酸形成的鹽。
堿加成鹽包括那些源于無機堿的鹽，如銨或堿或堿土金屬的氫氧化物、碳酸鹽及重碳酸鹽。這些堿在制備本發明中的鹽時非常有用，這些堿包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化氨、碳酸鉀、碳酸鈉、重碳酸鈉、重碳酸鉀、氫氧化鈣及碳酸鈣。形成的鉀和鈉鹽尤其優選。
應該認識到作為本發明中的鹽的組成部分的平衡離子不必具有什么重要的性質，只要這種鹽整體上是藥物學上可接受的、并且只要平衡離子并不給予整體上的鹽以不需要的性質就可以了。
在下面的實施例幫助下會更好的理解本發明。這些實施例是打算用來代表本發明中特定的實施方案的，但他們并沒有限制發明的范圍。
實施例 保藏的生物材料 丁香假單胞菌MSU16H菌株可以從the American Type CultureCollection，Parklawn Drive，Rockville，MD，USA獲得，其保藏號為No.ATCC 67028。P.syringae菌株25-B1、7H9-1和67 H1于2000年3月23日保存在the Ametican Type CultureCollection，其保藏號如下 25-BI 保藏號No.PTA-1622 7H9-1 保藏號No.PTA-1623 67 H1 保藏號No.PTA-1621 實施例1假單胞霉素的確定和和純化 通過抗真菌活性對假單胞霉素進行檢測定和定量 通過測定制劑的抗真菌活性就可以確定假單胞霉素的存在及其量。可在體內通過標準的瓊脂稀釋測定法或杯碟擴散檢測法來確定制劑的最低抑菌濃度(MIC)，進而確定抗真菌活性。一或多種假單胞霉素的制劑可以是細胞培養物的提取物或更純的混合物。應用于檢測抗真菌活性的典型真菌是白色念珠菌。當待檢測制劑能在接種有白色念珠菌x657的瓊脂盤上產生直徑為10-12mm抑菌圈時，我們就認為抗真菌活性顯著的。
通過HPLC對假單胞霉素進行檢測和定量 首先將含有一或多種假單胞霉素的樣品利用等體積的乙腈或1.5體積的甲醇/磷酸(0.1％v/v)進行提取，然后通過過濾或離心將其澄清。然后將此澄清的混合物通過Zorbax 300SB-C8色譜柱(3.5μm顆粒，5.0×0.46cm，MacMod catalog no.865973-906)，流速2ml/min，柱溫60℃。用流動相A梯度(25mM磷酸鈉、7.74g/L磺酸辛烷及10％乙腈的水溶液，pH6.5)和流動相B梯度(25mM磷酸鈉、7.74g/L磺酸辛烷和60％乙腈的水溶液，pH6.5)對柱子進行洗脫。利用28％-38％的流動相B對假單胞霉素進行分離和定量，時間為10分鐘。一般來講，假單胞霉素A在10.2分鐘(612秒)時洗脫出，假單胞霉素B在10.98分鐘(659秒)，假單胞霉素C在11.5分鐘(691秒)，假單胞霉素B’在9.6分鐘(576秒)，而假單胞霉素C’在12.17分鐘(730秒)洗脫出來。假單胞霉素通過在240nm處的吸收進行檢測，結合紫外吸收峰進行定量。每種假單胞霉素的已知標準可作為鑒定和定量的標準。
從攪拌式發酵罐中純化假單胞霉素 將150升、1000升或其他發酵罐中的肉湯過濾以除去細胞。將濾出液通過HP-20SS柱以獲得假單胞霉素因子。在用含有0.1％三氯乙酸的15％-30％乙腈沖洗柱子時收集各部分洗脫液。將含有假單胞霉素的洗脫液通過Amberchrom CG300-sd柱。因子A選用用0.2％乙酸鈉配制的22％-30％乙腈(pH4.8)洗脫。因子B、C和C’用在用0.2％乙酸鈉配制的25％-35％乙腈(pH4.8)洗脫。因子A純度為85％(紫外吸收法)。將A通過C18反相HPLC柱，用含有0.2％三氟乙酸的30％-60％乙腈進行洗脫。洗脫后的材料純度大于95％(UV/NMR)。
實施例2-對丁香假單胞菌進行分離、鑒定和誘變 作為作向大批量生產假單胞霉素的第一步，就要對丁香假單胞菌的環境分離物進行篩選，產生突變株。然后以可提高假單胞霉素的生產和培養基的因素為標準對這些突變株和分離物進行研究。
材料與方法 如在1996年11月19日頒發的、專利申請人為G.Strobel等的美國專利號為NO.5,576,298的專利中；及Harrison等在J.Gen.Microbioloey 137，2857-2865(1991)上的文章‘假單胞霉素，從丁香假單胞菌得到一族具有廣譜抗真菌活性的新穎肽段’的文章中；以及Lamb等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，6447-6451(1987)上的文章‘轉座子誘變和熒光假單胞菌標記抗真菌劑的生產對于控制Dutch榆樹疾病是必要的’中所描述的對MSU174菌株和MSU16-H菌株進行分離和鑒定。本段引用的文獻的已公開內容在本文中引用以做參考。
其他的菌株源自這樣的野生型和通過化學誘變得到的轉座子突變株。經過誘變的菌株包括MSU174，MSU16H及25-B1。進行誘變之前的菌株生長在含有馬鈴薯產品的培養基中，然后將此培養基分為含有0、1、2、4、16或32μg/ml的化學誘變劑1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(NTG或MNNG)的培養基。然后將這些細胞冷凍保存，以備進一步的篩選和選擇。
通過所需的生長條件和/或假單胞霉素產量對誘變的細胞進行選擇。將丁香假單胞菌經化學誘變的細胞如誘變后的25-B1細胞解凍，然后將其加到N21SM培養基中稀釋到6個細胞/ml(表1)。有時這些培養基中含有一或多個待選擇的成分，例如不同濃度的磷酸。將50μl誘變后的細胞分散到96孔微量滴定板的一個孔中，以此來傳遞靶細胞使其平均濃度為0.3個細胞/孔。一般來講，向每一個孔添加硅樹脂油可最大限度的減少蒸發。將此滴定板置于25℃下震蕩培養6-12天。
表1 N21SM培養基組成成分g/L葡萄糖20硫酸銨0.5谷氨酸單鈉或L-谷氨酸2L-組氨酸2甘氨酸0.5可溶性淀粉5KH2PO40.2Czapek礦物鹽溶液2mLMES緩沖液9.8調pH為5.0 培育結束后，從每孔中取出部分，一般是5ul進行系列稀釋(如1∶56，1∶196，1∶320，1∶686，和/或1∶1715)，并且利用液體滴定板生物測定法來評估其抗白色念珠菌的活力。將滴定板在37℃下培育過夜，然后對白色念珠菌生長點抑制進行評價。將在最大稀釋(如1∶320，1∶686，和/或1∶1715)時能產生抑制的菌株挑選出來，培育在CSM培養基(標)中，25℃下生長1-3天。
表2鏈霉素完全培養基(CSM) 成分濃度(g/L) 葡萄糖5 麥芽糖4 Difco Tryptic Soy Broth30 Difco酵母浸膏3 MgSO4·7H2O2 不調pH 保存選出的菌株，并且將其接種到含有13ml N21SM培養基的發酵瓶中，在25℃下生長大約66個小時。將其一部分從發酵瓶中取出，然后用與這些取出部分相同體積的乙腈抽提1小時，離心，并且將其輕輕倒入其他容器，按照實施例1中所述對假單胞霉素進行HPLC分析。將可產生合適水平的假單胞霉素，一般是大于10μg/ml的菌株進行重新篩選、重新發酵，為大規模的生長作好準備。
按照他們對假單胞霉素生產和分配的影響也對培養基和培養條件進行篩選。在利用統計分析方法設計的系列實驗中，培養基的幾種組分同時變化。這些實驗是為了選擇對化學成分進行限定的培養基，這些培養基缺乏一種馬鈴薯產品、含有限定水平的磷酸鹽、含有提高的透明度以及有高水平的丁香假單胞菌生長。
結果 通過上述的方法可得到多株表現高水平的假單胞霉素產量、主要產生單獨的一種假單胞霉素、和/或可在最少量的培養基上生長等特點。可產生高水平的假單胞霉素的菌株以及從13ml發酵液中獲得的假單胞霉素的分配在表3中有示。對特定突變株來講，利用馬鈴薯培養基和N21SM培養基獲得的假單胞霉素的分布及水平在圖2和3中有示。
表3對生產假單胞霉素的和/或在極限培養基上生長的菌株的選擇菌株假單胞霉素(μg/mL)AB C C’細胞密度(OD600)PSA+PSBOD60PSBPSA30E3109 690.7592340.6440G1181 660.8181790.82 菌株 假單胞霉素(μg/mL)A B C C′ 細胞密度 (OD600) PSA+PSB OD600 PSB PSA 7H9-13.360.4 0.7448618.58 75F86557 0.8841370.88 18E611157 0.8551960.51 8E338.4755.07 0.8301131.43 305H8165.048397 0.7622800.29 17H99646 0.7691850.48 67H1-1216.944.239.95.8 0.8173200.20 49C511043 0.8041900.39 67H119742 0.8172930.21 67H1-6225.942.140.24.8 0.7913390.19 67H1-6216.441.538.65 0.7973240.19 67H1-1232.738.341.74.7 0.8193310.16 160G8123.538277 0.7382190.31 96C8175.138446 0.7192960.21 52G116836 0.8221270.53 11G311033 0.6752120.30 7D1177.1332.73 0.7061560.42 8B672.132.3 0.7061480.45 16E1246.430105 0.6721130.64 11B114129 0.779890.71 49G56129 0.7441210.47 288E1187.028206 0.7361570.33 224H876.926205 0.5701810.34 19D34024 0.804800.60 37E93323 0.776720.68 40B25623 0.4201870.40 菌株 假單胞霉素(μg/mL)A B C C′ 細胞密度 (OD600) PSA+PSBOD600 PSBPSA 13B838.121.159.60.676880.56 7D1050.9520.414.050.898790.40 51D245200.817800.45 49D141200.826730.48 6B734.3518.38.550.698750.53 17G130170.848550.58 159D430.6157 20.699650.50 1F1247.714.90.756830.31 12E964.7l4.30.7691030.22 41G848140.850730.30 37F843140.935600.32 218F1066.01318 10.6l9l280.20 45E1027130.698580.50 7G550.2l2.70.703890.25 3C1144.412.50.895640.28 18C229.4512.457.80.474880.42 8D619.4311.630.783400.60 6D52.511.50.230614.60 3C336.010.40.622750.29 4E1227.610.30.695540.27 25B-126.610.20.38 25B-126.510.10.38 40G226100.489730.39 18G13190.699580.30 8H3160.453.20.843290.53 42F22280.754400.37 菌株 假單胞霉素(μg/mL)A B C C′ 細胞密度 (OD600) PSA+PSBOD600 PSB PSA 25B-122.637.9 6.23 0.35 7A1021.87.70.73140 0.35 102D5980.79121 0.81 11E924.857.2 5.250.56157 0.29 101E416.07 3 00.85027 0.44 18C72870.73748 0.25 25B-118.96.7 0.36 15E613.056.2 3.80.39149 0.48 263H1213.86 4 00.83223 0.40 40D23250.86642 0.14 25B-113.534.27 0.32 10A428.14.20.190170 0.15 6B28.554.1 2.90.53524 0.48 41G61440.79823 0.29 6C114.74.10.72626 0.28 6A425.74.00.68543 0.16 7G317.23.80.210100 0.22 17G1043.03.70.341137 0.09 7C515.13.60.83622 0.24 11E19.553.5 1.60.87315 0.37 97D1112.43 4 00.68523 0.26 16F9730.83312 0.45 40G61130.24357 0.27 19H12530.70311 0.59 6F48.02.80.655l6 0.35 024E514.52.5 3.4 00.69724 0.17 菌株 假單胞霉素(μg/mL)A B CC′ 細胞密度 (OD600)PSA+PSBOD600 PSBPSA 52A31720.1881020.13 6H46.21.20.307240.19 37B28810.749120.15 5H88.21.20.725130.14 97C34.912 00.74080.20 9D719.070.000.626300.00 7C115.3000.70970.00 18H81003.10.760130.00 11B32.75000.35180.00 7H106.40.00.205310.00 7B55.80.00.286200.00 6F12.60.00.7l940.00 6B124.40.00.46790.00 4C48.80.00.744120.00 3H74.20.00.77750.00 3H64.70.00.72760.00 3G57.10.00.636110.00 3C123.10.00.71140.00 13G115.40.00.88760.00 50G10900.526180.00 50F21200.65118 48F31100.58519 47C3200.12313 46H5800.37520 38E5500.8036 12A3600.65810 菌株 假單胞霉素(μg/mL)A B C C′ 細胞密度 (OD600) PSA+PSBOD600 PSB PSA 37B112.200 00.15814 215B12.200 00.5004 25B-18.403.1 25B-17.603.1 269A74.600 00.0858 7G30000.7290 17C10000.1710 13B100000.1030 10C40000.6820 9B60.00.00.3380 7A90.00.00.5090 52H7000.8280 41A6000.5830 16E5000.2240 277H40.000 00.1230 結論 此處公開的篩選方法和標準，對篩選不僅可在極限培養基上生長而且又能產生高水平的一或多種假單胞霉素的丁香假單胞菌是有效的。已經發現特定的菌株和生長環境可改變產生的假單胞霉素的分配。在這些極限培養基中，較少的固含物和增加的透明度使得培養基過濾加快，以及可更好的確定細胞濃度。
實施例3----利用已知的培養條件嘗試增加假單胞霉素生產規模 在搖瓶中靜置或攪拌培養生產假單胞霉素 作為大規模生產假單胞霉素的第一步，有必要重復已知實驗室規模的丁香假單胞菌生長和假單胞霉素生產方法。
材料和方法 利用表4所述的營養溶液，在25℃下，在含有250ml搖瓶中不攪拌(靜置的或靜置的培養)或攪拌培養丁香假單胞菌的MSU16H菌株。這種營養溶液與上文提及的Harrison等在J.Gen.Microbiol.上的文章中所用的溶液相似。將丁香假單胞菌接種體添加到含有表4中的營養物質、但缺少馬鈴薯葡萄糖的肉湯中，以此作為對照。在對源自馬鈴薯的營養物的附加檢測中，就以葡萄糖(20g/l)和馬鈴薯蛋白(Alburex)(4g/L)培養基或葡萄糖(20g/I.)和馬鈴薯糊精(Avebe)(20g/L)培養基代替馬鈴薯葡萄糖肉湯。如實施例1中所述進行抗真菌活力測定。
表4加添加劑的馬鈴薯右旋糖肉湯培養基(PDB培養基) 組分 濃度 Difco馬鈴薯右旋糖肉湯24g/L 可溶性淀粉 5g/L 古氨酸 1g/L Czapek礦物鹽溶液 2mL/L MES緩沖液9.8g/L 調pH至5.0 表5 Czapek礦物鹽溶液 成分量 A部分 KCl 100g MgSO4·7H2O 100g Deionized H2O 900mL B部分 FeSO4·7H2O 2g HCl(1N) 2mL 去離子水98mL 將B部分緩慢加入A部分中，濃合至溶液澄清 結果 當在表4所示的馬鈴薯右旋糖(potato dextrose)肉湯培養基中培養丁香假單胞菌時，所產生的抗真菌活力以假單胞霉素濃度表示為大約10.5-29μg/mL。在以葡萄糖和馬鈴薯蛋白(Alburex)培養基或葡萄糖和馬鈴薯糊精培養基(Avebe)代替馬鈴薯右旋糖培養基時，靜置搖瓶培養條件下產生的抗真菌活力為大約30μg/mL。在上述的培養條件下，在缺少馬鈴薯產品的營養溶液中靜置培養時沒有觀察到抗真菌活性。
對于在馬鈴薯右旋糖肉湯培養基(PDB)中培養來講，假單胞霉素生長的時間過程表明靜置搖瓶中的培養(表6)和在轉速為250rpm的攪拌搖瓶中的培養(表7)都有假單胞霉素產生。在培育過程中，攪拌搖瓶中產生假單胞霉素較早，但在培養環境的pH升到7.5或更大時假單胞霉素因子就消失了。在靜置培養的假單胞霉素總產量最高點，假單胞霉素的分配為77％A、11％B和12％C。在攪拌培養的假單胞霉素總產量最高點，假單胞霉素的分配為67％A、24％B和9％C。
表6在含有PDB培養基的靜置搖瓶中假單胞霉素生產的各時間段 培育時間(小時) 培養物pH假單胞素霉A+B+C(μg/mL)05.1085.90245.50485.54725.67965.714.51205.519.51684.921.51924.6233124.929 表7在含有PDB培養基的攪拌搖瓶中假單胞霉素生產的各時間段 培育時間(小時) 培養物pH 假單胞素霉A+B+C(μg/mL)05.1085.30245.04.5324.69.0404.910.5487.56.5567.90.5728.30.5808.30.5 對于在馬鈴薯糊精培養基中培養來講，假單胞霉素生長的時間過程表明靜置搖瓶中的培養和在轉速為250rpm的攪拌搖瓶中的培養(表8)都有假單胞霉素產生。將pH調節到5.0，并且將MSU16H菌株接種到50ml無菌培養基中來啟動其生長。在這些攪拌搖瓶培養基中，只有某些培養基的pH在6.0以下，只有一小部分的假單胞霉素損失是顯著的。在靜置培養的假單胞霉素總產量最高點，假單胞霉素的分配為70％A、16％B和14％C。在攪拌培養的假單胞霉素總產量最高點，假單胞霉素的分配為62％A、19％B和19％C。
表8在含有馬鈴薯糊精培養基的攪拌搖瓶中生產假單胞霉素的各時間段變化培養時間(小時) 靜置搖瓶中的假單胞霉素 (A+B+Cin μg/mL) 振蕩搖瓶中的假單胞霉素 (A+B+Cin μg/mL)000800241113.54822.51557228.5119628.510 結論 將已知的在實驗室規模中應用的方法用于生產假單胞霉素。馬鈴薯產品對于重復這些已知的實驗室生產方法是必需的。含有馬鈴薯蛋白和馬鈴薯糊精的培養基可替代馬鈴薯右旋糖培養基。
在發酵罐中靜置或攪拌培養生產假單胞霉素 作為邁向大規模生產假單胞霉素的第二步，對已知的實驗室規模培養丁香假單胞菌及生產假單胞霉素的方法在150升發酵罐中做了嘗試。
材料和方法 調節表4所示的營養溶液至pH5.2，在攪動或不攪動的情況下，在150升發酵罐中25℃下培養丁香假單胞菌菌株MSU16H 10天。150升發酵罐攪動包括在75-150rpm轉速下攪拌及以0.5SCFM的流速噴射空氣。在一個對馬鈴薯衍生的營養物質進行的實驗中，用葡萄糖和馬鈴薯蛋白(Alburex)培養基或葡萄糖和馬鈴薯糊精(Avebe)培養基代替馬鈴薯右旋糖肉湯培養基。抗真菌活性測定如實施例1中所述。
結果 在不攪動條件下的發酵罐培養中有很少的丁香假單胞菌生長，并且檢測不到抗真菌活性或假單胞霉素的水平。在這樣的條件下，對150升發酵罐進行低速攪拌以及低速噴射空氣流時只有很少量的丁香假單胞菌生長，并且也沒有檢測到抗真菌活性或假單胞霉素的水平。用葡萄糖和馬鈴薯蛋白(Alburex)培養基或葡萄糖和馬鈴薯糊精(Avebe)培養基代替馬鈴薯肉湯培養基，結果也是只有很少量的丁香假單胞菌生長的檢測不到的抗真菌活性水平或假單胞霉素水平。
結論 已知的利用丁香假單胞菌靜置培養生產假單胞霉素的方法不適用于150升的規模。
實施例4-利用對已有培養條件和培養基更改過的培養條件和培養基成功的實現了假單胞霉素的擴大生產 對改變已有的丁香假單胞菌培養條件在假單胞霉素生產上產生的影響進行了檢測。
控制氧濃度 材料和方法 應用馬鈴薯右旋糖肉湯(PDB)培養基，在實施例3所述的條件下，在150升發酵罐中控制氧的濃度來培養丁香假單胞菌。在另外一個對馬鈴薯產品的替代實驗中， 用表9的馬鈴薯珍珠培養基(PPM)代替了表4的培養基，并且對氧氣的濃度進行了控制。此處所用的馬鈴薯珍珠是從Basic American Foods購得的Classic Country StylePotato Pearls。
在培養的前24個小時將溶解氧的濃度控制在30％，然后在特定時期將其降低到5％并保持72小時。通過降低噴射速度或在噴射入罐體的空氣中混合入氮氣來將溶解氧的濃度保持在5％。通過MSU16菌株和25-B1突變株的生長來評價這些條件。如實施例1中所描述的那樣對抗真菌活性和假單胞霉素A水平進行測定。
表9馬鈴薯珍珠培養基(PPM) 成分 量 葡萄糖 20g/L 馬鈴薯珍珠 30g/L 可溶性淀粉 5g/L 甘氨酸 1g/L Czapek礦物鹽溶液 2mL/L 調節pH為5.2 在利用改性的馬鈴薯珍珠培養基來確定假單胞霉素產生時段的實驗中，發酵罐中裝入了右旋糖(2.3kg)、可溶性淀粉(575g)、Basic American Foods Country Style Potato Pearls I速溶馬鈴薯泥(3.45kg)、甘氨酸(115g)、MgSO4·7H2O(23g)、KCI(23g)，FeSO4·7H2O(0.46g)，以及115L水。PH調節為5.0。在蒸汽滅菌且冷卻后將25-B1菌株的種子培養物(1.8升)接種到發酵罐中。發酵罐的攪動速度設定在150rpm，空氣流速設定在0.5SCFM(0.14vvm)。在保持溶解氧濃度為30％飽和濃度的過程中攪動速度和空氣流速是自動調節的。培養溫度控制在25℃，通過添加30％的硫酸保持pH在5.5以下。
對于更大規模的培養，1000升發酵罐中裝有Difco PDB(24.0kg)、可溶性淀粉(5.0kg)、甘氨酸(1.0kg)、MgSO4·7H2O(200g)、KCI(200g)，FeSO4·7H2O(4g)，以及1000L水。PH調節為5.0。將50升MSU16H菌株的種子培養物接種到發酵罐中。培養溫度控制在25℃，通過攪拌和噴射空氣將溶解氧濃度保持在30％的飽和濃度或更高。通過添加30％的硫酸控制pH以使其不超過5.5。
結果 在對氧氣的濃度進行了控制后(表10)，在150升發酵罐的培養物中產生了抗真菌活性。通過在噴射的空氣中添加氮氣來控制氧濃度導致可高水平的假單胞霉素產生。用丁香假單胞菌25-B1突變株替代MSU16H使微生物的生長和抗真菌活性幾乎提高了一倍(表10)。用表9中的培養基替代表4的培養基進一步幾乎將微生物的生長和假單胞霉素產量提高了一倍。
表10利用兩種馬鈴薯培養基，在控制氧濃度的情況下生產假單胞霉素 菌株以μg/mL表示的A1總滴定度和假單胞霉素 MSU 16H 25-B1噴射N2的PDB21(8)49(27)不噴射N2的PDB12(ND)220(13)噴射N2的PPMNT387(37)不噴射N2的PPMNT75(44) 1假單胞霉素A滴定度為括號中所示 2ND表示不確定 3NT表示未檢測 假單胞霉素產生的時段在表1中有示。在50升發酵罐發酵的時段中，所產生的假單胞霉素因子的分配為79％A、10％B和11％C。
表11在含有馬鈴薯珍珠培養基的150L發酵罐中生產的假單胞霉素的各時間段已完成的發酵時間(小時)假單胞霉素A+B+C(μg/mL)00801617243532454041 在1000升發酵罐培養過程中也得到了相似的假單胞霉素產生時段(表12)。
表12在含有已變化的馬鈴署右旋糖培養基的1000L發酵罐中生產假單胞霉素的各時間段已完成的發酵時間(小時)假單胞霉素A+B+C(μg/mL)0040165.2285.6405.9525.8766.01006.3 結論 通過對一些因素如溶解氧濃度、菌株選擇、及培養基組成的進一步改變可顯著提高假單胞霉素的產量。
添加油脂及額外成分 向表9中的馬鈴薯珍珠培養基中添加額外成分來確定他們對假單胞霉素生產的影響。
材料和方法 向表9的馬鈴薯珍珠培養基中添加額外成分如油脂(如肉豆蔻酸甲酯或大豆油)、磷酸鹽、較高濃度的甘氨酸、補加氫氧化氨和補加葡萄糖(表13)。細胞生長的測定如上述。按照實施例1中所述對抗真菌活性進行測定。
結果 這些實驗的結果如下表13所示。
表13在對馬鈴薯珍珠培養基進行添加的情況下的假單胞霉素產量增加補加物 假單胞霉素產量 A+B+C(μg/mL)無80甲基肉豆蔻酸鹽(1g/L)150甘氨酸(2g/L)110補加NH4OH(10mL/hr)1102g/L甘氨酸和1g/L甲基肉豆蔻酸鹽160甘氨酸(4g/L)240補加葡萄糖(200mL/hr)80甘氨酸(4g/L)，甲基肉豆蔻酸鹽至1g/L和補加葡萄糖287大豆油(1g/L)150KH2PO4(0.5g/L)60 結論 向培養基中添加甘氨酸和肉豆蔻酸甲酯可顯著增加丁香假單胞菌的假單胞霉素產量。
實施例5-甘氨酸和肉豆蔻酸甲酯刺激假單胞霉素的生產 確定了甘氨酸、肉豆蔻酸甲酯以及其他幾種成分對假單胞霉素產生的影響，看他們是否會提高假單胞霉素的水平。
材料與方法 在裝有50毫升培養基的250毫升搖瓶中培養丁香假單胞菌。這種培養是以接種丁香假單胞菌MSU16H到培養基中為開端的，然后保持溫度25℃、濕度70％，在培養箱中不振動的情況下培養7天。在培養的最后階段，從搖瓶中取出4毫升肉湯與6毫升含有0.1％磷酸的甲醇混合。我們認為低pH可穩定假單胞霉素。通過過濾或離心將顆粒狀物質除掉，通過實施例1中所述的HPLC法確定假單胞霉素。
本研究中所用的培養基為用無菌水配制的24克/升馬鈴薯右旋糖肉湯培養基(PDB，Difco)(對照培養基)；對照培養基中添加2ml/LCzapek礦物鹽溶液；對照培養基添加1g/L甘氨酸；對照培養基添加1mI/L肉豆蔻酸甲酯(Sigma)；對照培養基添加5g/L可溶性淀粉(Difco)；對照培養基添加2mL/L Czapek礦物鹽溶液、，1g/L甘氨酸和5g/L可溶性淀粉；對照培養基添加2ml/L Czapek礦物鹽溶液、1g/L甘氨酸、1mI/L肉豆蔻酸甲酯和5g/L可溶性淀粉。
在與上一批搖瓶相同的時間培養上另外一批丁香假單胞菌，培養時間為30小時，其他條件與上述的相同，只是沒有進行攪拌培養，轉速為250rpm。
在另一攪拌搖瓶實驗中，上述的對照培養基生長情況與含有甘氨酸和另外幾種添加劑的對照培養基相對比。如上所述對細胞進行攪拌培養。應用的培養基是對照培養基；對照培養基添加1g/L甘氨酸；對照培養基添加1g/L甘氨酸和2mI/l Czapek礦物鹽溶液；對照培養基添加1g/L甘氨酸和5g/L可溶性淀粉；對照培養基添加1g/l.甘氨酸和1mL/L肉豆蔻酸甲酯；對照培養基添加1g/L甘氨酸、2mL/L Czapek礦物鹽溶液及5g/L可溶性淀粉；以及對照培養基添加1g/L甘氨酸、2mL/L Czapek礦物鹽溶液、1ml/L肉豆蔻酸甲酯和5g/L可溶性淀粉。
結果 通過非震蕩搖瓶獲得的結果如圖3所示。對照培養基是選用Montana State的G.Strobel等培養丁香假單胞菌時所用的培養基，這在上文Harrison等在J.Gen.Microbiol.上的文章中有描述。本實驗中假單胞霉素的檢測限為1μg/mL。圖3說明了G.Strobel所用的培養基和培養條件，G.Strobel的培養生產出了大約5μg/ml的假單胞霉素A，但檢測不到假單胞霉素B和C的水平。向對照培養基中添加Czapek礦物鹽使得假單胞霉素A產量微增到6.5μg/ml，但假單胞霉素B和C仍檢測不到。向對照培養基中添加1g/l甘氨酸使得假單胞霉素A產量顯著增到10.5μg/ml，可檢測到假單胞霉素B(2.5μg/ml)，但檢測不到假單胞霉素C。向對照培養基中添加肉豆蔻酸甲酯使得假單胞霉素A產量顯著增到8μg/ml，可檢測到1μg/ml的假單胞霉素B和C。向對照培養基中添加可溶性淀粉使得假單胞霉素A產量輕微衰退，假單胞霉素B和C檢測不到。應用對照培養基添加Czapek礦物鹽溶液、甘氨酸和可溶性淀粉使得假單胞霉素A、B和C產量的增加比在對照培養基中添加任何單獨的添加劑都顯著和巨大(圖3)。當肉豆蔻酸甲酯添加到已添加有Czapek礦物鹽溶液、甘氨酸和可溶性淀粉的對照培養基中時收到了進一步的提高(圖3)。對于非攪拌搖瓶來講，每一結果都是3個搖瓶培養基的平均值。
正如圖4所示，在震蕩搖瓶培養中獲得了相似的結果。然而，在震蕩搖瓶培養中，添加甘氨酸和肉豆蔻酸甲酯是獲得高于最低產量的假單胞霉素A所必需的，甘氨酸和肉豆蔻酸甲酯的結合可大幅度的、并且較單獨添加劑在假單胞霉素A、B和C產量增加方面更大的產量增加。對各種結合和各個成分的實驗也收到了相似的結果，如圖6所示。
結論 在非震蕩搖瓶培養實驗中，甘氨酸和/或肉豆蔻酸甲酯各引起了假單胞霉素A、B和C產量的顯著增加。肉豆蔻酸甲酯刺激了假單胞霉素C的產生。在攪拌搖瓶培養中，甘氨酸和肉豆蔻酸甲酯是顯著提高假單胞霉素A的產量產量所必需的。此外，甘氨酸和肉豆蔻酸甲酯在刺激假單胞霉素A、B和C的生產方面具有協同作用。
實施例6-脂肪酸甲酯之中，肉豆蔻酸甲酯和棕櫚酸甲酯對假單胞霉素生產的刺激 在有不同鏈長的脂肪酸甲酯存在下培養丁香假單胞菌，它們表現出了在依賴碳鏈長度基礎上的對假單胞霉素生產的提高。
材料與方法 丁香假單胞菌如實施例5所述而培養，在一種包含濃度為0.1％v/v，濃度的脂肪酸甲酯的對照馬鈴薯右旋糖肉湯培養物中，補充了1g/L甘氦酸，2mL/L Czapek無機鹽溶液，5g/L可溶性淀粉，pH5.0的培養基中攪拌培養。如實施例1所述由HPLC測定假單胞菌素。
結果 圖6表明在含有從6到12的偶數碳原子的脂肪酸甲酯存在下對丁香假單胞菌培養的結果。各種假單胞霉素的水平與實施例5中在不含肉豆蔻酸甲酯的情況下的結果相似，而肉豆蔻酸甲酯是通過在其碳鏈上含有6-12或18-22個碳原子的脂肪酸甲酯制備得到的。在含有14和16碳的脂肪酸甲酯存在下假單胞霉素產量有顯著增加。肉豆蔻酸甲酯是含有14個碳原子的脂肪酸甲酯。含有14和16個碳原子的脂肪酸甲酯都可顯著增加假單胞霉素A、B和C的產量。
結論 在對脂肪酸甲酯進行的檢測實驗中，應用MSU16H菌株時肉豆蔻酸甲酯產生了最大量的各種假單胞霉素。值得注意的是結合到假單胞霉素肽環上的脂肪鏈含有14個碳原子。這表明添加的肉豆蔻酸甲酯可用做假單胞霉素的前體。
實施例7-利用含有馬鈴薯產品的培養基在發酵罐規模下生產假單胞霉素的方法 對于通過丁香假單胞菌的生長來產生假單胞霉素，實施例4和實施例5中完善的培養基可用于在含有馬鈴薯產品的培養基中進行的150升和5000升規模的發酵。
應用150升發酵罐進行生產 材料與方法 營養體階段的搖瓶裝有完全的鏈霉素培養基(CSM，表2)，向其中接種經冷藏的丁香假單胞菌培養物，在25℃、250rpm下攪拌24小時。在24小時的營養體搖瓶培養之后，搖瓶培養物用于接種bump-stage搖瓶。bump-stage搖瓶中含有CSM培養基，并且在25℃、250rpm下攪拌。從匯聚了3或4個營養體階段搖瓶培養物的混合培養物中取0.45毫升接種bump-stage搖瓶。bump-stage搖瓶一般是含有900毫升CSM培養基且沒有遮流板的2.5升TunairTM搖瓶。兩個2.5升TunairTM搖瓶培養物用于一個發酵罐的接種。bump-stage搖瓶要培養16小時。
隨后，將兩瓶bump-stage搖瓶培養物(總共1.8升)在一個接種用火箭筒中結合。這些混合過的培養物用于接種115升如表5所述的、添加有額外的3g/L(總共4gJL)甘氨酸和1g/L大豆油的培養基。這些大規模的培養物要在25℃下生長4天。在這段生長時間內，通過控制攪拌和空氣流速將溶解氧控制在30％飽和空氣濃度。通過添加硫酸或氫氧化鈉將pH控制在5.2±0.2。大規模培養開始后18個小時，以200ml/h的速度流加葡萄糖。大規模培養開始后20個小時以20ml/h的速度流加氫氧化氨。在培養期間，壓力是5psig。攪拌的起始設定是250rpm，空氣流速的起始設定是0.5scfm。如果需要，也可添加抗泡沫劑。在完成了4天培養中的3天大規模培養之后就可以收取丁香假單胞菌。如實施例1所述進行抗真菌活性檢測。
結果 在利用這種方法進行的同一批發酵中的幾個發酵因子情況如圖8和9所示。
結論 通過這種方法可以制得產量顯著的和商業上可行的假單胞霉素。
利用5000升發酵罐進行生產 將成功進行了150升規模發酵的方法進一步擴大到5000升規模發酵。
材料與方法 丁香假單胞菌接種物的制備如上文在150升發酵罐規模中相同。5000升發酵條件與上文150升發酵罐規模的發酵條件相似，所做的改動如表14中所示。進行的4次嘗試，前3次通過無菌轉移已接種的肉湯到150升無菌發酵罐中而作為了附屬部分。好些附屬物用于在150升發酵罐和5000升發酵罐間進行對比時消除營養物組成因素和滅菌因素。如實施例1所述進行抗真菌活性測定。
結果 表14總結了從5000升發酵的結果，以及怎樣與附屬發酵進行比較。除了第一次嘗試外，對5000升發酵的濃度測定基本上與150升發酵相似，在第一次嘗試中，5000升發酵罐的攪拌轉速開始設定在150rpm，隨后在36小時時降低到50rpm。細胞生長水平是附屬150升發酵的三分之一，假單胞霉素A濃度是附屬150升發酵的四分之一。在隨后的嘗試中將5000升發酵的攪拌轉速降低到25rpm(起始設定)，造成了與附屬發酵和單獨的150升發酵具可比性的細胞生長水平和假單胞霉素A濃度。數據表明丁香假單胞菌菌株25-B1對攪拌敏感。
表14擴大規模到5000L發酵罐(PPM)的生產結果試驗號5000L Lot 滴定度 附屬罐 滴定度 備注1 005CE7 12 313CA7 45 4g/L甘氨酸0.1％甲基肉豆蔻酸鹽、不控制pH，不補加；在5000L罐；DO2高，在36hr時將攪拌從150rpm降至50rpm2 060CE7 89 318CA7 77除了培養基含有1g/L甲基肉豆蔻酸鹽外與1相同；5000L罐；攪拌25rpm；DO2控制在30％3 063CE7 50 332CA7 44培養基如1，只是含有馬鈴薯珍珠(10g/L)和已糖化的肉湯，在pH迅速下降后，在24小時用NH4OH將其調至5.5。4 068CE7 120來進行135用補加的NaOH和NH4OH將pH控制在5.2，也添加葡萄糖；培養基如1，只是在其中含有大豆油而不是甲基肉豆蔻酸酯 1滴定度指以μg/mL計量的假單胞霉素 采用80％w/v的葡萄糖溶液進行葡萄糖進料，采用58％w/w氫氧化氨溶液進行氨進料 結論 通過5000升發酵罐發酵可以制得產量顯著的和商業上可行的假單胞霉素。
實施例8-丁香假單胞菌的大規模生長和應用缺乏馬鈴薯產品的培養基進行假單胞霉素生產 利用不含上述實施例中的培養基所含的馬鈴薯產品的N21培養基來發酵丁香假單胞菌，這樣的條件下產生的假單胞霉素水平適于對以克計的數量的分離。
在振動搖瓶和N21培養基中生產假單胞霉素 材料與方法 在實施例5中所述的條件下培養丁香假單胞菌，只是其培養基不含馬鈴薯產品。這種培養基叫做N21培養基，含有表15中所示的組合物。為了確定肉豆蔻酸甲酯對假單胞霉素生產的影響，肉豆蔻酸甲酯是以0.2％的濃度添加的。
表15 N21培養基的組成成分g/L蔗糖35硫酸銨0.5谷氨酸單鈉2L-組氨酸2甘氨酸0.5可溶性淀粉5KH2PO40.2Czapek礦物鹽濃液2mL酵母浸膏1MES緩沖液9.8調節pH為5.2 利用含有和不含肉豆蔻酸甲酯的N21培養基來評價幾株丁香假單胞菌的假單胞霉素生產。接受評價的菌株是MSU 16H、25-B1、67H1和7H9-1。
結果 利用多種丁香假單胞菌菌株，在含有和不含肉豆蔻酸甲酯情況下的假單胞霉素生產研究結果如表6和圖9所示。這些結果表明不管在含有還是在不含有肉豆蔻酸甲酯的情況下，67H1菌株產生的每一種假單胞霉素都較高。7H9-1菌株因為產生的假單胞霉素B要比假單胞霉素B或C高得多而與眾不同。對每一株菌株來講，肉豆蔻酸甲酯可刺激假單胞霉素的產生。
表16在含有或不含甲基肉豆蔻酸鹽的條件下利用幾株p.syringae菌株生產假單胞霉素 菌株 肉豆蔻酸甲 酯 假單胞霉 素A 假單胞霉素 B 假單胞霉 素CMSU 16H-59191225-B1-66501567H1-334173837H9-1-31100MSU 16H+126452725-B1+1541233667H1+390207957H9-1+8.52224.5 結論 在缺乏馬鈴薯產品的培養基中，不同的丁香假單胞菌菌株產生了具有在商業應用上具有顯著水平的假單胞霉素，并且這些產物是由肉豆蔻酸甲酯刺激產生的。
利用N21培養基在5000升發酵罐規模下生產假單胞霉素 將應用不添加馬鈴薯產品的培養基生產假單胞霉素的方法放大到5000升水平。
材料與方法 在5000升發酵罐中的假單胞霉素生產如實施例7中所示進行，不同發只是培養基是應用N21F培養基(表15)。這種N21培養基中添加有1g/1的酵母浸膏。菌株選用丁香假單胞菌67H1。
結果 從10次5000升發酵罐嘗試得到的平均值如表7所示。
表17在10次5000升發酵罐試驗中獲得的假單胞霉素的平均量 假單胞霉素μg/mL at Harvest A243 B203 C71 C’ 40 結論 應用不含額外的馬鈴薯產品的培養基，在5000升發酵罐規模上可生產在商業應用上具有顯著數量的假單胞霉素A、B、C和C′。
實施例9--進一步簡化假單胞霉素生產用培養基 在不含馬鈴薯產品的情況下，應用培養基N21SM可成功的發酵丁香假單胞菌生產假單胞霉素。基于N21SM培養基、但又缺乏某些組分的培養基也能生產顯著水平的假單胞霉素。
材料與方法 在實施例5所示的條件下，在搖瓶中培養丁香假單胞菌，只是選用的培養基如下所述。基礎培養基，叫做CNP培養基，含有表18所示的組合物成分。對添加劑的濃度和其結合進行的檢測，如下表所列(表18)。
表18CNP培養基組成成分量葡萄糖20g/LKH2PO40.41g/LCzapek礦物鹽溶液2mLMES緩沖液9.8g/L硫酸銨1g/L調節pH到5.2向CNP培養基中添加以添加劑谷氨酸鹽2g/L甘氨酸0.5g/LL-組氨酸2g/L可溶性淀粉5g/L酵母浸膏1g/L 利用含有和不含一或多種添加劑的CNP培養基對幾株丁香假單胞菌的假單胞霉素生產進行了評價。
結果 在含有或不含添加劑的情況下，對幾株丁香假單胞菌生產假單胞霉素的情況的研究如表19中所示。
表19在含或不含添加劑的CNP培養基中利用P.syringae生產假單胞霉素假單胞霉素(μg/L)添加劑 OD600ABCC’無 0.2210000 0.2220000谷氨酸鹽 0.94382.616.324.55.9 0.948716.725.76甘氨鹽 0.6280000 0.5670000組氨酸 0.3310000 0.3540000谷氨酸鹽，甘氨酸和組氨酸 0.984153414412 0.98149404212谷氨酸鹽、甘氨酸、組氨酸和可溶性淀粉 0.98513429349 0.996125343511可溶性淀粉 0.280000 0.2890000酵母浸出膏 0.441406112 0.449396112谷氨酸鹽、甘氨酸、組氨酸、可溶性淀粉和酵母浸出膏 0.998215525517 1.001197525619 結論 多種最少量的培養基可用于丁香假單胞菌的生長和產生在商業應用上具有顯著水平的假單胞霉素。
實施例10-假單胞霉素A′和B′的制備 發展了從丁香假單胞菌菌株的發酵肉湯中制備假單胞霉素A′和/或B′的方法。
材料與方法 接種體的制備將保存在液氮的氣相中的部分細胞解凍，并且利用他們去接種各為900毫升的兩部分CSM肉湯。CSM肉湯組成為(g/l)右旋糖(5)、麥芽糖(4)、Difco酪氨酸大豆肉湯(30)、Difco酵母浸膏(3)、以及MgSO4·7H2O(2)。大約0.5毫升細胞用于接種盛在2升搖瓶中的900毫升培養基。在25℃下搖瓶攪拌培養24小時。將兩搖瓶的培養物混合后接種到盛在150升發酵罐中的115升無菌發酵肉湯中。
發酵階段發酵肉湯組成為(g/l)右旋糖(20)、可溶性淀粉(5)、Basic American Foods Country Style Potato Pearls速溶馬鈴薯泥(30)、甘氨酸(1)、MgSO4·7H2O (0.2)、KCl(0.2)和FeSO4·7H2O(0.004)，溶于自來水中。在滅菌前將pH調節為5.2。在25℃下發酵培養68小時。通過連續調節空氣流速和推進攪拌速率來將溶解氧控制在30％或高于30％空氣飽和度。通過添加硫酸和氫氧化鈉將pH保持在4.0和5.4之間。
批量發酵方法的變化簡單批量發酵有幾種變化也能用來生產假單胞霉素A′和/或B′。在發酵開始后24小時以60毫升/小時的速度向發酵罐中添加右旋糖。這樣的添加可在整個發酵過程中都持續進行。另外，有一種方法可用于將從接種后24小時開始將溶解氧控制在5％的空氣飽和度，這樣的溶解氧濃度一直持續到發酵結束。通過向輸送到發酵罐的空氣中添加惰性氣體來將溶解氧控制在5％。一般情況下，氣體一般是通過在底部攪拌窩輪下面帶有開口的簡單沉沒式噴射管來傳輸的。
結果和結論 利用著幾種發酵方法讀從丁香假單胞菌制得了假單胞霉素A′和/或B′。
分離和純化假單胞霉素A′和B′ 發明了一些方法來從丁香假單胞菌菌株發酵肉湯中分離和純化假單胞霉素A′和B′。
材料與方法 將發酵完成后的全部發酵肉湯(4×100升)通過Membralox瓷過濾器(0.45um)，得到了濾過液(A部分)和固體泥漿B部分)。將B部分(135升)用含有0.1％TFA的等體積丙酮抽提120分鐘使其澄清。將清澈的丙酮抽提液通過過濾進行分離，然后在真空中使其蒸發為水溶液從而產生C部分(88毫升)。首先，將A部分倒入一HP2Oss樹脂柱(10L)中，用水壓實，并且用含有0.1％TFA的15％乙腈(20升)溶液沖洗柱子。隨后將C部分倒入同一個柱子中，如前述用20升0.1％TFA的15％乙腈溶液沖洗柱子。
然后用含有0.1％TFA的15-20％乙腈溶液梯度洗脫柱子30分鐘，以及用含有0.1％TFA的20-35％乙腈溶液梯度洗脫60分鐘，流速為1升/分鐘。收集各部分的餾分收集物。將6-9部分(4升)合并為組分D(24克)。將D部分的一部分(大約為1克)通過裝有反相柱(Dynamax C18 41.4×250mm)的色譜柱，此色譜柱是利用三乙胺磷酸緩沖液(pH3)-乙腈-甲醇做流動相(65∶17∶18-30∶35∶35梯度洗脫45分鐘，流速為40ml/min)將合適的餾分合并，體積便減少為75毫升，并且如前述將其重新過C18色譜柱，通過80∶10∶10-46∶27∶27的梯度洗脫得到組分E(113mg)和組分F(116mg).。進一步將組分E和F通過C18色譜柱(Dynamax C18 41.4×250mm)，分別得到45mg假單胞霉素A′和62mg假單胞霉素B′。
結果和結論 HPLC法在從發酵肉湯中分離假單胞霉素A′和B′上與那些用于純化其他假單胞霉素的方法相似。
已經對本發明中與多種特別的和優選的實施方案及技術有關的方面進行了描述。然而，我們應該明白，在本發明的精神和范圍內可以有不同的變化和修正。在這方面，所有的出版物和專利申請都是本專利所屬領域中的一般技術水平的指示物。
權利要求
1.生產一或多種假單胞霉素的方法，該方法包括以下步驟
在基本上由三種或少于三種氨基酸組成的營養培養基中，在pH大約為4.0-6.5的條件下，培養丁香假單胞菌的生物學上的純培養物，直至產生的一或多種假單胞霉素的濃度達到至少大約10μg/ml；并且從培養物中回收一或多種假單胞霉素。
2.權利要求1中的方法，其中的氨基酸基本上是由谷氨酸、甘氨酸、組氨酸或它們的組合組成的。
3.權利要求2中的方法，其中營養培養基進一步基本上由可溶性淀粉組成。
4.權利要求1中的方法，其中氨基酸基本上由甘氨酸組成。
5.權利要求4中的方法，其中營養培養基進一步基本上由脂類、馬鈴薯糊精或其組合組成。
6.權利要求5中的方法，其中的脂類為大豆油、含有16碳碳鏈的脂肪酸、含有16碳碳鏈脂肪酸酯、含有14碳碳鏈的脂肪酸或含有14碳碳鏈脂肪酸酯。
7.權利要求6中的方法，其中脂類為肉豆蔻酸甲酯或棕櫚酸甲酯。
8.權利要求1中的方法，其中的pH大約小于6.0。
9.權利要求8中的方法，其中的pH大約為5.5。
10.權利要求1中的方法，其中在培養階段溶解氧的濃度控制在大約5％-30％。
11.權利要求1中的方法，其中在培養階段進一步包括流加葡萄糖、氫氧化銨或它們的組合。
12.權利要求11中的方法，其中流加氫氧化銨是為了保持pH在大約5.0-5.7。
13.權利要求1中的方法，其中的營養培養基進一步基本上由糖、硫酸銨、磷酸鹽、Czapek礦物鹽以及MSE緩沖液組成，pH為大約5.2。
14.權利要求1中的方法，其中的一或多種假單胞霉素包括假單胞霉素A、假單胞霉素A′、假單胞霉素B、假單胞霉素B′、假單胞霉素C、假單胞霉素C′或它們的組合。
15.權利要求1中的方法，其中一或多種假單胞霉素包括假單胞霉素B。
16.權利要求1中的方法，其中丁香假單胞菌含有野生型菌株、轉座子突變菌株或化學突變菌株。
17.權利要求1中的方法，其中丁香假單胞菌包括從大麥類植物、柑橘類植物、丁香類植物的環境分離物中得到的菌株。
18.權利要求1中的方法，其中丁香假單胞菌包括MSU16H、MSU174、MSU206或從它們衍生的菌株。
19.權利要求1中的方法，其中丁香假單胞菌包括25-B1菌株(ATCC PTA-1622)、67H1菌株(ATCC PTA-1621)或7H9-1菌株(ATCCPTA-1623).。
20.權利要求1中的方法，其中丁香假單胞菌包括從25-B1菌株(ATCC PTA-1622)衍生的菌株。
21.權利要求20中的方法，其中25-B1菌株(ATCC PTA-1622)是經化學誘變后從突變菌株中篩選得到的。
22.權利要求1中的方法，其中產生的一或多種假單胞霉素的濃度至少大約為300μg/ml。
23.通過權利要求1-22中的任一方法制備的假單胞霉素。
全文摘要
描述了制備一或多種假單胞霉素的方法，包括培養可生產一或多種假單胞霉素的丁香假單胞菌的方法，而這些假單胞霉素都含有通式(I)，其中的R指親脂性基團。
文檔編號A61P31/10GK1680566SQ200510065718
公開日2005年10月12日 申請日期2000年4月14日 優先權日1999年4月15日
發明者M·D·希爾頓, 小R·J·斯特羅貝爾, P·J·B·米勒, D·N·托馬斯, A·R·科克肖特, B·G·格特曼, J·R·伊斯特里德格, C·A·坎特維爾 申請人:伊萊利利公司