知母皂苷bⅱ在制備用于防治腦卒中藥物或產品中的用途的制作方法

專利名稱：知母皂苷bⅱ在制備用于防治腦卒中藥物或產品中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及知母皂苷BII的用途，具體涉及知母皂苷BII在制備防治腦卒中(腦中風)藥物或產品中的用途。
背景技術：
腦中風是由于顱內外血管阻塞或破裂而造成的急性腦功能損傷，嚴重危害中老年人的生命健康，也是造成中老年人致死、致殘的主要原因之一。腦卒中患者約有1/3在發病不久后死亡，幸存者由于偏癱、失語等后遺癥致殘喪失工作甚至生活自理能力。目前通常治療腦中風有兩種方法一種是通過增加血流量改善動脈中氧和葡萄糖不足；另一種是保護神經元，減少腦組織缺血可能性，降低神經元的興奮毒性死亡。用于臨床治療的神經元保護劑有鈣離子通道阻斷劑，谷氨酸受體拮抗劑，NMDA拮抗劑等。與腦卒中的高發病率、高致死率及高致殘率相比，目前用于預防治療腦卒中的藥物品種較少，遠遠不能滿足臨床需要。
中藥知母為百合科(Liliaceae)知母屬多年生草本植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的根莖，主產于河北、內蒙古、山西及東北等地，中醫用作苦寒清熱藥，有清熱瀉火，滋陰潤燥的功效，主要治療外感熱病、高熱煩渴、肺熱燥咳、骨蒸潮熱、內熱消渴和腸燥便秘等。知母的主要成分是甾體皂苷(steroidal saponins)，到目前為止，文獻報道從知母中分離得到32種甾體皂苷及皂苷元；其次還有黃酮、寡糖、多糖及脂肪酸等。1963年川崎敏男等首次分出知母皂苷BII，但并未闡明其結構結構。1991年南云清二等首次闡明了知母皂苷BII的化學結構(Seiji NAGUMO et al，藥學雜志(日)，1991；111(1)306-310)。以后Noboru Nakashima (NOBORU NAKASHIMA et al，Journal ofNatural Products，1993；56(3)345-350)、馬百平(馬百平等，藥學學報，1996；31(4)271-277)、Masayasu Kimula(Masayasu KIMURAet al，Biol.Pharm.Bull，1996；19(7)926-931)和 Jianying Zhang(Jianying ZHANG et al，Clinica Chimica Acta，1999；28979-88)等先后報道了知母皂苷BII的分離及活性。
知母皂苷BII(Timosaponin BII)，又名原知母皂苷AIII(Prototimosaponin AIII)等，是中藥知母中的主要成分，結構為(25S)-26-O-β-D-葡萄吡喃糖基-22-羥基-5β-呋甾-3β、26-二醇-3-O-β-D-葡萄吡喃糖基(1→2)-β-D-半乳吡喃糖苷[(25S)-26-0-β-D-glucopyranosyl-22-hydroxy-5β-furostane-3β，26-diol-3-0-β-D-glncopyranosyl(1→2)-β-D-galactopyranoside]。結構如下 已報道的知母皂苷BII的藥理活性主要有1.降血糖作用。知母皂苷BII可以降低鏈尿霉素糖尿病小鼠的血糖水平，但并不促進葡萄糖的吸收和胰島素的釋放，推測降血糖機制是抑制肝糖元的分解。(NOBORU NAKASHIMA et al，Journal of NaturalProducts，1993；56(3)345-350)2.抑制血小板聚集。知母皂苷BII具有顯著的抗人血小板聚集及延長凝血時間的活性。(Jianying ZHANG et al，Clinica Chimica Acta，1999；28979-88)3.清除自由基活性。利用順磁方法，觀察到知母皂苷BII(5mg/ml)對Fenton反應體系產生的羥自由基的清除率為57％。(馬百平等，藥學學報，1996；31(4)271-277)4.抗癡呆活性。馬百平等報道了知母皂苷BII具有一定的防治老年性癡呆的作用。(發明專利申請公開書，公開號CN1212966，申請號97119680.X)。
陳萬生等報道了知母總皂苷用于制備防治腦卒中藥物的用途(發明專利申請公開書，公開號CN1451384A，申請號03116824.8)。該申請中公開的知母總皂苷的特征為知母皂苷BII、E、B、AIII的含量之和≥50％。

發明內容
本發明的發明人通過多年潛心研究，首次發現和證實了單體化合物知母皂苷BII防治腦卒中的活性，其特征為知母皂苷BII可明顯改善局灶性腦缺血大鼠神經癥狀，縮小腦梗塞范圍，減輕腦水腫程度；明顯改善模型動物的血液流變性、減輕腦缺血所致炎性損傷等。
因此，本發明涉及知母皂苷BII在制備用于預防或治療腦卒中藥物或產品中的用途。
本發明還涉及用于預防或治療腦卒中的藥物組合物或產品，其包括作為活性成分的知母皂苷BII和藥用載體或賦形劑。
根據本發明，本發明的知母皂苷BII是以基本純的形式使用，如知母皂苷BII的純度≥90％。
根據本發明，本發明含知母皂苷BII的藥物組合物或產品可以各種途徑使用，并配制成各種劑型，如口服制劑，如片劑，膠囊，溶液，懸浮液，非腸道給予劑型，如注射劑，軟膏，貼劑等。
根據本發明，知母皂苷BII(20mg/kg、40mg/kg)各組連續給藥7天后，能顯著降低大腦中動脈血栓形成大鼠的神經癥狀評分；可以明顯縮小模型大鼠的腦梗塞范圍；40mg/kg組能明顯降低腦含水量，與模型組相比有顯著差異(P＜0.05，P＜0.01)。
根據本發明，皮下注射腎上腺素加冰水浸泡法可致急性血瘀大鼠模型，知母皂苷BII(10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg)可明顯降低模型大鼠高、中、低切變率下的全血粘度以及血漿粘度，與模型組相比有明顯差異(P＜0.05，P＜0.01)；知母皂苷BII 40mg/kg組可明顯提高模型大鼠的紅細胞變形能力，降低紅細胞聚集指數，與模型組相比有顯著差異(P＜0.05，P＜0.01)。
以插線法制備腦缺血再灌注模型，通過ELISA法測定各組大鼠的IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β含量，結果表明知母皂苷BII對腦缺血再灌大鼠的炎癥反應具有明顯的保護作用。
綜上所述，知母皂苷BII具有防治腦卒中的作用。
具體實施例方式
下面的實施例用于進一步說明本發明，但其不意味著對本發明的任何限制。
實施例1.
知母皂苷BII對三氯化鐵誘導大腦中動脈血栓形成(MCAT)大鼠缺血性腦損傷的影響一、方法1.知母皂苷BII對大腦中動脈血栓形成大鼠神經癥狀及腦梗塞范圍的影響1.1.分組及給藥實驗動物隨機分為6組，即MCAT模型組、假手術組、喜得鎮0.6mg/kg組、知母皂苷BII 10mg/kg組、20mg/kg組、40mg/kg組，動物連續灌胃給藥七天，每日給藥容積為5mL/kg。第七天給藥60分鐘后施行手術。假手術組和MCAT模型組灌服等容積的0.5％CMC溶液。
1.2.大腦中動脈血栓栓塞性大鼠缺血性腦損傷模型的制備按Tamura及劉氏[7-8]等的方法，稍加改進。大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液(0.35g/kg)麻醉，右側臥位固定，在眼外眥和外耳道連線中點作一弧形切口，長約1.5cm，夾斷顳肌并切除，暴露顳骨，于實體顯微鏡下，用牙科鉆在顴骨與顳鱗骨接合處靠近口側1mm處作一直徑2.5mm的骨窗，清理殘渣，暴露大腦中動脈(位于嗅束及大腦下靜脈之間)。置一小片塑料薄膜保護血管周圍組織。將吸有50％氯化鐵溶液10μL的小片定量濾紙敷在此段大腦中動脈上，30min后取下濾紙，用生理鹽水沖洗局部組織，逐層縫合，回籠飼養。室溫控制在24℃。假手術組除不滴加氯化鐵溶液外，其余手術步驟同模型組。
1.3.神經癥狀評分方法對試驗動物在術后6h和24h，按Bederson[9]等的方法稍加改進，進行行為檢測。評分標準①提鼠尾觀察前肢屈曲情況，如雙前肢對稱前伸，記為0分；如手術對側前肢出現肩屈曲、肘屈曲、肩內旋或兼具，記為1分。②將動物置于平面上，分別推雙肩向對側移動，檢查阻力。如雙側阻力對等且有力記為0分；如手術對側阻力下降，記為1分。③將動物兩前肢置一金屬網上，觀察肌張力。雙側肌張力對等且有力為0分；手術對側前肢肌張力下降記為1分。④提鼠尾，動物有不停地向手術對側旋轉者，記為1分。根據以上標準評分，滿分為4分，分數越高，動物的行為障礙越嚴重。
1.4.腦梗塞范圍的評定方法動物經行為評分后，斷頭取腦。去掉嗅球、小腦和低位腦干，剩余部分在4℃以下冠狀切成5片。迅速將腦片置于TTC染液中(每5ml染液中含4％TTC 1.5ml，1M K2HPO40.1ml，其余加水至刻度)，37℃避光溫孵30分鐘，取出后置于10％甲醛液中避光保存24h。經染色后非缺血區為玫瑰紅色，梗塞區為白色。將白色組織仔細挖下稱重，以梗塞組織重量占全腦重量及患側腦重量的百分比作為腦梗塞范圍(％)。
2.知母皂苷BII對大腦中動脈血栓形成大鼠腦組織含水量的影響
2.1.分組、給藥及造模方法。同1。
2.2.腦組織含水量的測定方法術后24h斷頭取腦，左右半腦分開，用濾紙吸干表面水分，分別稱量左右腦濕重，105℃烘烤48h至恒重，精確稱量干重，依據下式計算腦水含量。
腦水含量＝(濕重-干重)/濕重×100％3.統計學處理實驗數值以x±s表示，結果用SPSS軟件統計，組間比較，進行t檢驗。
二、結果1.知母皂苷BII對大腦中動脈血栓形成大鼠神經癥狀和腦梗塞范圍的影響結果見表4-1。
表4-1知母皂苷BII對大腦中動脈血栓栓塞性大鼠神經癥狀及腦梗塞范圍的影響(x±s)

注與空白組相比，ΔΔP＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01結果表明，除假手術組外，MCAT模型組及各給藥組動物均有不同程度的梗塞灶及偏癱樣癥狀。知母皂苷BII 20mg/kg、40mg/kg組能顯著縮小模型動物的腦梗塞范圍，改善神經癥狀(P＜0.05，P＜0.01)。
2.知母皂苷BII對大腦中動脈血栓形成大鼠腦組織含水量的影響結果見表4-2。
表4-2知母皂苷BII對大腦中動脈血栓形成大鼠腦組織含水量的影響(x±s)

注與空白組相比，ΔΔP＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05從上表可以看出，知母皂苷BII 40mg/kg可以明顯降低模型大鼠患側腦水含量，改善腦水腫(P＜0.05)。
討論與小結大腦中動脈血栓模型是局灶性腦缺血的常用動物模型，它可以比較客觀地模擬臨床腦梗塞多發于大腦中動脈這一事實，易控制局部條件，復制成功率高，且與臨床腦卒中發病過程類似，血栓部位固定。結果顯示，術后6h、24h動物出現偏癱樣癥狀，腦血栓形成側腦含水量明顯增加，TTC染色可見明顯的腦梗塞灶。知母皂苷BII 20mg/kg、40mg/kg組可以明顯改善大鼠神經癥狀，縮小腦梗塞范圍，與模型組相比有顯著差異(P＜0.05，P＜0.01)；知母皂苷BII 40mg/kg組可以明顯減輕腦水腫程度，與模型組相比有顯著差異(P＜0.05)。這一結果提示該藥物具有保護缺血性腦損傷的作用。
實施例2.
知母皂苷BII對急性血瘀模型大鼠血液流變學的影響一、方法1.分組及給藥實驗動物按體重隨機分為6組，即模型對照組、正常對照組、尼莫地平12mg/kg組、知母皂苷BII 10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg組。動物連續灌胃給藥五天，每日給藥容積為5ml/kg。正常對照組和模型對照組灌服等容積的0.5％CMC溶液。
2.造模方法根據毛騰敏[14]的方法，稍加改進。第五日給藥后1小時，予以大鼠皮下注射腎上腺素0.8mg/kg兩次，間隔4小時。并于首次注射腎上腺素后2小時，將大鼠浸泡于4℃冰水中5分鐘后，取出。
3.全血粘度及血漿粘度測定末次給藥后1小時，大鼠腹腔注射10％水合氯醛(0.35g/kg)麻醉，頸總動脈采血，以1％肝素抗凝。取肝素抗凝血0.8ml用血液粘度儀進行檢測，以高切(200S-1)、中切(30S-1)、低切(5S-1)及低切(1S-1)狀態時測定的血液粘度表示全血粘度；另取抗凝血以3000rpm離心8分鐘，其上清液為血漿，取0.8ml血漿用血液粘度儀測試100S-1時的血漿粘度。
4.紅細胞聚集性和變形性測定取肝素抗凝血40μl加紅細胞變形液1ml混勻，取樣0.8ml，用紅細胞變形/聚集測試儀測試，以紅細胞最大變形指數(MAXDI)和曲線下面積(SSS)表示紅細胞變形性；另取抗凝血0.8ml，用紅細胞變形/聚集測試儀測試，以紅細胞最大聚集指數(MAXD)和曲線下面積(SS)表示紅細胞聚集性。
5.統計學處理實驗數值以x±s表示，結果用SPSS軟件統計，組間比較，進行t檢驗。
二、結果1.知母皂苷BII對急性血瘀模型大鼠全血粘度、血漿粘度的影響結果見表10-1。
表10-1知母皂苷BII對急性血瘀模型大鼠全血粘度及血漿粘度的影響(x±s)

注與空白組相比，ΔΔP＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01結果顯示，造模后24h，血瘀模型大鼠的全血粘度、血漿粘度明顯升高，與正常對照組相比有明顯差異(P＜0.01)；知母皂苷BII 10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg組均可以明顯降低模型大鼠高、中、低切變率下的全血粘度及血漿粘度(P＜0.05，P＜0.01)。
2.知母皂苷BII對急性血瘀模型大鼠紅細胞聚集性和變形性的影響結果見表10-2。
表10-2知母皂苷BII對急性血瘀模型大鼠紅細胞聚集性和變形性的影響(x±s)

注與空白組相比，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01結果顯示，造模后24h，與空白組相比，血瘀模型大鼠紅細胞聚集指數明顯增加，變形指數明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)；與模型大鼠相比，知母皂苷BII 40mg/kg組能明顯升高模型大鼠的紅細胞變形指數，降低紅細胞聚集指數(P＜0.05，P＜0.01)。
三、討論與小結血液流變學是研究血液的流動性、聚集性、凝固性和血細胞變形性的一門科學。缺血性腦血管病患者存在全血比粘度、血漿比粘度、紅細胞聚集指數及纖維蛋白原等多項血液流變學指標的改變。因而改善血液流變學，降低血液粘度、降低紅細胞聚集性、提高紅細胞變形性等對缺血性腦血管病的防治具有非常重要的作用。研究中采用大鼠皮下注射大劑量腎上腺素，模擬暴怒時機體狀態，以冰水浸泡模擬寒邪侵襲，迅速復制出血液呈粘、濃、凝、聚狀態的急性血瘀模型。從本實驗結果來看，知母皂苷BII能明顯抑制急性血瘀模型大鼠紅細胞聚集性、提高紅細胞變形性，明顯降低急性血瘀大鼠高、中、低切變率下的全血粘度和血漿粘度，說明藥物具有明顯的改善血液流變學作用。
實施例3.
知母皂苷BII對腦缺血再灌注大鼠腦組織炎癥因子的影響以插線法制備腦缺血再灌注模型，通過ELISA法測定各組大鼠的IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β含量，從而研究知母皂苷BII對腦缺血再灌模型大鼠炎癥因子的保護作用。
一、方法1.分組及給藥將大鼠按體重隨機分為六組，即假手術組、模型組、尼莫地平組(12mg/kg)、知母皂苷BII.10mg/kg、40mg/kg組，藥物均用0.5％CMC配制。各組動物在觀察飼養兩日后用于實驗。先連續給藥五天，每日給藥容積為10ml/kg，其中假手術組和模型組灌服等量0.5％CMC，每日給藥一次，于第五日晨給藥一小時后進行手術造模。
2.造模方法根據Koizum and Nagasawa的方法制備大腦中動脈阻塞(MCAO)模型。將大鼠以10％水合氯醛按0.35g/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定，局部皮毛消毒后手術。分離右頸總動脈(CCA)、右頸內動脈(ICA)及頸外動脈(ECA)并埋線備用，結扎ECA與CCA，用動脈夾夾閉ICA遠心端后，迅速于ECA與ICA分叉處作一切口，從切口處插入一端加熱成光滑球形尼龍線(直徑為0.25mm，距球端2cm處作標記，栓線前端經石蠟處理后備用)。線插入ICA后，于入口處稍稍結扎尼龍線與入口處ICA段，然后松開夾閉ICA的動脈夾，繼續插入尼龍線至稍有阻力后略回撤，至線插入深度為18.5±0.5mm左右，實現大腦中動脈阻塞而致腦缺血。再次結扎入口處，尼龍線外留約1cm，縫合肌肉皮膚，腹腔注射硫酸慶大霉素0.4ml/只。3h后輕輕提拉所留線頭至有阻力，實現大腦中動脈再灌，則造模型完成。假手術組僅結扎右側頸總動脈，不作切口，不插線。動物入選的標準動物于缺血3h后出現對側前肢倦曲或行走轉圈或行走向對側傾倒體征則納入，動物無此體征或于3h后仍不清醒者剔除。
3.組織勻漿的制備動物于缺血3h再灌21h后斷頭取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，然后將剩余的右側大腦半球在4℃下以生理鹽水制成10％組織勻漿。
4.IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β定量ELISA測定(1)建立標準曲線設標準孔8孔，每孔中各加入樣品稀釋液100ul，第一孔加標準品100ul，混勻后用加樣器吸出100ul，移至第二孔。如此反復作對倍稀釋至第七孔，最后，從第七孔中吸出100ul棄去，使之體積均為100ul。第八孔為空白對照。
(2)加樣待測品孔每孔各加入待測樣品150ul。
(3)將反應板充分混勻后置37℃120分鐘。
(4)洗板用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。
(5)每孔中加入第一抗體工作液50ul，置37℃60分鐘。
(6)洗板同前。
(7)每孔加酶標抗體工作液100ul，將反應板置37℃60分鐘。
(8)洗板同前。
(9)每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗處反應5-10分鐘。
(10)每孔加入1滴終止液混勻。
(11)在492nm處測吸光值。
5.結果計算將所有OD值都減除空白值后再行計算，以標準品1000、500、250、125、62、31、16、0PG/ml之OD值在半對數紙上作圖，畫出標準曲線，再根據樣品OD值在該曲線圖上查出相應炎癥因子的含量。
6.統計學處理實驗數值以x±s表示，結果用SPSS軟件統計，組間比較，進行t檢驗。
二、結果知母皂苷BII對腦缺血再灌注大鼠炎癥因子的影響表 知母皂苷BII對缺血再灌大鼠IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β含量的影響(x±s)

注與假手術組相比，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01實驗結果表明，與假手術組相比，腦缺血再灌模型組大鼠腦組織中前炎癥因子IL-1β、TNF-α的含量明顯增高，保護性炎癥因子IL-10、TGF-β的含量亦明顯增高，且差別具有顯著性意義；陽性藥尼莫地平及知母皂苷BII 40mg/kg組均能明顯降低諸炎癥因子的含量，對腦缺血再灌大鼠的炎癥反應具有明顯的保護作用。
權利要求
1.知母皂苷BII在制備用于預防或治療腦卒中(腦中風)的藥物或產品中的用途。
2.權利要求1所述的知母皂苷BII的用途，其特征在于所述知母皂苷BII的純度為≥90％。
全文摘要
本發明涉及知母皂苷BII在制備用于防治腦卒中(腦中風)藥物或產品中的用途。實驗證明，知母皂苷BII可明顯改善局灶性腦缺血大鼠神經癥狀，縮小腦梗塞范圍，減輕腦水腫程度；明顯改善模型動物的血液流變性、減輕腦缺血所致炎性損傷等。
文檔編號A61K31/704GK1692908SQ20051005946
公開日2005年11月9日 申請日期2005年3月25日 優先權日2004年4月29日
發明者馬百平, 徐秋萍, 趙陽, 熊呈琦, 譚大維 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射醫學研究所