專利名稱：吲哚－3－甲醇及其二聚體在制備防治增殖性血管疾病藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種已知食物中所含的化學物質吲哚-3-甲醇(indole-3-carbinol，I3C)及其在胃內的主要代謝產物3，3’-二吲哚甲烷(3，3’-Diindolylmethane，DIM)作為制備防治增殖性血管疾病如動脈粥樣硬化、血管介入治療后再狹窄的藥物中的應用。
背景技術：
A.吲哚-3-甲醇(I3C)是存在于十字花科(如花椰菜、卷心菜、蘿卜等)及其他的蕓苔科和蕓苔屬蔬菜中的一種天然活性成分，由葡糖蕓苔素水解產生，是異硫氰酸鹽代謝產物(Food Chem Toxicol，1984，22(12)977～982)，易于化學合成，分子量147，分子式如下 吲哚-3-甲醇(I3C)在胃酸環境中發生一系列縮合反應，產生二聚體3，3’-二吲哚甲烷(DIM)、三聚體、四聚體等低聚物，其中DIM為主要代謝產物。藥代動力學研究發現口服I3C后，I3C主要存在于肝臟中，I3C在血漿和組織中清除速率較快；而其二聚體(DIM)在服用I3C 24小時后在肝臟中仍可檢測到，且不同時間檢測到的DIM在組織的濃度與血漿濃度相似。已知I3C及其主要酸性縮合物DIM均具有抗腫瘤發生等生物學活性。其二聚體(DIM)分子量246，分子式如下 B.經過大量的分子水平、細胞水平、活體動物實驗，I3C其二聚體(DIM)已進入臨床試驗，主要用于一些腫瘤的預防和治療，目前已有市售的I3C產品。
I3C的部分藥理作用按life extension公司產品說明如下■幫助調控雌激素代謝■一定程度上抑制細胞異常增殖并促進細胞凋亡■促進第一相和第二相的解毒作用■保護機體抵抗一些常見的致癌毒素如二氧雜芑(dioxin)損害■修復p21抑制基因■提供抗氧化保護最近發表的一些臨床研究結果表明I3C能夠明顯減輕、控制，甚至逆轉腫瘤的發生發展。在活檢證實的CIN病人中，使用I3C 200-400mg口服約50％的病人病檢結果減輕，而使用安慰劑者無一例減輕(GynecologicOncology 2000，78(2)123-129)。利用I3C處理復發性呼吸道乳頭狀瘤，39例復發性呼吸道乳頭狀瘤病人外科切除術后給予I3C處理，劑量200mg每日兩次口服，三分之二的病人腫瘤得到控制或減輕(J Voice2004，18(2)248-253)。在絕經后的早期乳癌患者給予DIM 108mg/d，可使尿中2-羥雌酮增加(Nutr Cancer.2004；50(2)161-167)。
C.I3C使用的安全性問題作為源于天然的食品補充劑，絕大多數研究表明使用是安全的(Altern Med Rev 2003，8(2)156-170；CancerEpidemiolBiomarkers Prev 1994，3(7)591-595)。雖然早年的一些動物模型研究表明，在使用致癌物質誘導的動物腫瘤模型中，I3C可促進結腸(Cancer Lett 1987，35(1)71-77)、肝臟(Cancer Lett 1997，118(1)87-94；Carcinogenesis 1999，20(3)453-458)等腫瘤發生或增長；應用黃曲霉菌毒素B1后再應用I3C可促進肝癌發生(J Natl Cancer Inst1987，78(5)931-934.)，但應用I3C預處理則明顯抑制黃曲霉菌毒素B1誘導的肝癌。應用I3C進行動物毒性實驗，以50mg/kg/day(10倍于人類服用劑量)喂養3~12月，結果動物體重，肝功能(ALT，AST，totalprotein，albumin，caicium，glucose，BUN，globulins，GGT，cholesterol，amylase淀粉酶，bilirubin膽紅素，creatinine肌苷)，肝組織病理檢查，骨密度均沒有變化(Toxicological Sciences 2003，74(1)10-21)。最近發表的幾項臨床研究則表明，每日使用300-400mg I3C能夠取得良好的生物學效應，較短期(4周)和長期(平均4.8年)用于腫瘤的預防和治療，沒有發現與I3C相關的急性及長期應用副作用，證實I3C的安全性，并可以長期應用。美國FDA通過I3C作為天然的補充劑，已有市場銷售的膠囊劑。
D.十字花科蔬菜(如花椰菜、卷心菜)中的活性成分3-吲哚甲基蕓苔葡糖硫苷可在一些內源性的酶作用下水解為吲哚衍生物，其中最重要的化合物為吲哚-3-甲醇。已有在分子、細胞及活體動物大量的實驗證明I3C及其二聚體(DIM)具有抗細胞增殖、抑制某些酶的活性，保護機體免于損傷性增殖從而表現出抗癌活性；已有很多實驗及臨床研究表明，I3C及其二聚體(DIM)通過抑制AKt和NF-kB活性抑制細胞增殖并促進其凋亡(NutrCancer.2004，48(1)84-94；Cancer Res.2005 Jan 1；65(1)364-71)；抑制直腸癌細胞株增殖，且呈劑量依賴關系(corectal Disease 2002，4(3)205-207)；誘導G1期細胞停滯，下調CDK6基因表達，并刺激干擾素γ受體1基因表達，刺激p21Waf1/Cip1表達，增強乳腺癌細胞中干擾素活性(Carcinogenesis 2004，25(7)1119-1128；Carcinogenesis.2002Aug；23(8)1297-305)；抑制前列腺LNCaP腫瘤細胞增殖，調控細胞周期，使G1期細胞靜止(Cancer 2003，98(11)2511-2520)。因此，已有臨床實驗證明作為食物成分的I3C，能夠安全有效地防止惡性腫瘤的發生。
E.增殖性血管疾病如動脈粥樣硬化、介入治療后血管再狹窄等是當今世界威脅人類健康的常見疾病，為導致人口死亡的主要原因之一，因此，防治增殖性血管疾病成為近年研究的熱點。人們使用血管緊張素轉換酶抑制劑、試用皮質激素等口服藥物未能取得滿意療效，目前，尚無任何經臨床實踐證實能有效預防增殖性血管疾病的口服藥物；在支架上涂布肝素、皮質激素、碳化硅等方法也未取得滿意效果；晚近臨床開始應用的藥物涂層支架，主要由醫用316L不銹鋼經過激光雕刻而成，藥物(如雷帕霉素、紫衫醇等)滲入非侵蝕性聚合物中，5um厚的藥物-聚合物基質再涂布于支架表面，即為快速釋放型支架(FR)，它在植入后15天內幾乎完全洗脫，如在聚合物基質表面再涂一層藥物釋放聚合物，作為彌散屏障，即成為緩慢釋放型支架(SR)，它可使藥物釋放時間延長至28天以上。合適的表面涂層材料對藥物支架的應用十分重要，作為支架表面涂層材料要求其無毒，與人體有良好的相容性和一定的機械性，降解周期為60d到90d之間，如目前采用的多聚乳酸、多聚羥基乙酸、聚甲基丙烯酸丁酯等；雖然藥物涂層支架在臨床上取得了較好的效果，但仍存在著支架內血栓形成、血管脆弱、血管瘤形成、遠期效果不明朗、對不宜進行支架植入的部位治療困難、藥物支架價格昂貴等問題。
目前尚未見國內外有將I3C及其二聚體(DIM)用于抗血管平滑肌細胞增殖而防治增殖性血管疾病如動脈粥樣硬化、血管介入治療后再狹窄的實驗及臨床研究報告。
發明目的本發明的目的是給出吲哚-3-甲醇及其二聚體在藥學上的新用途，即將吲哚-3-甲醇或/和其二聚體通過口服給藥(或局部給藥)的方式，用于防治增殖性血管疾病，如用于不能進行介入手術的動脈粥樣硬化患者的治療；或用于經皮動脈球囊成形術和支架植入術后，降低血管介入治療后新生內膜和動脈中層的厚度，預防血管再狹窄，進一步改善介入治療的臨床效果，降低血管介入治療的費用等。
研究發現，血管平滑肌細胞的異常增殖是增殖性血管疾病如動脈粥樣硬化、血管(如冠狀動脈、腦動脈、腎動脈等)介入治療后再狹窄的重要原因，因此，抑制血管平滑肌細胞過度增殖是防治增殖性血管疾病的主要靶點。I3C及其二聚體(DIM)可通過影響細胞信號傳遞、調節細胞周期、誘導細胞凋亡，影響酶的活性等方式對異常增殖細胞進行抑制，而對胰腺、乳腺等非腫瘤細胞則沒有明顯的抑制作用，表明其作用有腫瘤細胞的特異性(Nutr Cancer 2003，45(1)101-112)。增殖性血管疾病有大量的原癌基因激活(J Virol 1999，73(9)7745-7751)，一定程度、一定階段類似于腫瘤細胞生長，所以使用I3C及其二聚體(DIM)可望對過度增殖的血管平滑肌細胞產生一定程度的抑制。
本發明首次將I3C及其二聚體(DIM)引入制備治療增殖性血管疾病的藥物中，通過全身用藥的方法可使損傷血管避免過度增生，使某些增殖性血管疾病的治療可不需介入手術；而對以前放置支架的病變可能只需要行球囊擴張術；此外本發明涉及的所述藥物的使用非常方便，具有較低的治療價格，可能對目前增殖性血管疾病如動脈粥樣硬化、介入治療后血管再狹窄的治療格局產生重要影響。
所述I3C及其二聚體(DIM)還是天然的食品添加劑，已通過FDA認證，劑量與用法和預防腫瘤相同，故安全性是其重要優勢。
具體技術方式A.實施實驗1細胞實驗目的觀察不同濃度的吲哚-3-甲醇(Indole-3-caibinol I3C)對培養的血管平滑肌細胞(VSMCs)增殖和凋亡的影響，為利用I3C防治增殖性血管疾病如動脈粥樣硬化、血管介入治療后再狹窄(restenosis RS)提供基礎實驗依據。
方法實驗共分8個組，對照組(無藥組)常規培養；DMSO組培養基中加入與藥物組等體積的DMSO；實驗組在各組加入I3C使培養液中終濃度分別為25、50、100、200、400、800μM(細胞克隆試驗增加10μM組)。用MTT比色法描述不同濃度I3C作用VSMCs 120小時的生長情況；通過平板克隆實驗觀察I3C作用3周對細胞增殖的影響；PCNA細胞免疫化學法和TUNEL法(400倍光鏡下)分別用于檢測I3C作用72小時后對VSMCs增殖和凋亡的影響。實驗組與對照組比較用Dunnett t檢驗(q′檢驗)，p＜0.05為有顯著性差異。
結果1.MTT法測定VSMCs的生長曲線各濃度的I3C對細胞的生長都產生了不同程度的抑制效應。加藥120小時后，50μM組O.D值較對照組明顯降低(0.733±0.029vs 0.821±0.014 p＜0.05)，而且I3C濃度越高，相應O.D值降低越顯著(p＜0.01)。同時120小時內I3C使VSMCs的生長曲線平坦，其中以400μM組最明顯。
2.平板克隆實驗I3C作用于VSMCs 3周可明顯抑制細胞克隆的形成。25μM組形成克隆比對照組少(25±2，69±1，143±4vs 35±1，81±1，173±2 p＜0.05)；I3C濃度越高，形成的克隆數就越少；3.PCNA陽性率的測定I3C作用72小時后，50-400μM組中VSCMs的PCNA陽性率與對照組比較出現明顯降低75.3±2.5％，46.5±3.3％，37.6±1.8％，25.2±2.3％vs 96.8±1.7％，(p＜0.05或0.01)。
4.TUNEL法發現I3C作用72小時后，50-400μM組VSMCs凋亡率較對照組顯著增加(24.7±3.3％，40.5±1.5％，61.6±2.1％，80.5±2.3％vs6.5±0.9％，p＜0.05或0.01)。
5.DMSO對VSMCs的生長動力學無明顯影響，800μM時各試驗中細胞36h內全部死亡。
結論在72小時的觀察期內，50-400μM的I3C可顯著抑制VSMCs的增殖并誘導其出現明顯的凋亡；而更低濃度(25μM)的I3C在較長(3周)的觀察期內，可明顯減少細胞克隆的形成。當濃度達到800μM時，I3C對細胞有明顯的毒性作用。本實驗表明一定劑量范圍的I3C對VSMCs生長有顯著抑制且呈濃度依賴關系，提示I3C是一種潛在的防治增殖性血管疾病如動脈粥樣硬化、血管介入治療后再狹窄的藥物。
B.實施實驗2動物實驗目的觀察不同劑量的吲哚-3-甲醇(Indole-3-carbinol)對大鼠頸總動脈球囊擴張過后內膜增殖及平滑肌細胞凋亡的影響，探討I3C用于防治防治增殖性血管疾病如動脈粥樣硬化、血管介入治療后再狹窄(restenosis RS)的可能性。
方法35只雄性SD大鼠，體重300±50g，隨機分為2組，單純球囊損傷組(對照組，n＝5)，球囊損傷+I3C治療組(治療組，n＝30)。其中，治療組又分為6個亞組(n＝5)，在球囊損傷后灌胃給予I3C，劑量分別為12.5mg/d，25mg/d，50mg/d；給藥時間分別為4天，7天。喂養2周后取材，然后分別進行HE染色及彈力纖維染色，采用計算機圖像分析系統分別檢測新生內膜厚度(H)、新生內膜面積(NIA)、中膜面積(MA)、內彈力板圍繞面積(IEM)、外彈力板圍繞面積(EEM)并計算新生內膜面積/中膜面積(NIA/MA)、管腔狹窄指數(NIA/IEM)。PCNA及TUNEL標記法(400倍光鏡下)分別檢測增殖及凋亡細胞百分率的改變，以觀察I3C對血管平滑肌細胞增殖及凋亡的影響。
結果1.病理形態學檢測球囊擴張術后2周，各組標本均見不同程度的平滑肌細胞增殖遷移。治療組與對照組比較，新生內膜厚度、新生內膜面積、NIA/MA之比均有不同程度減少，管腔狹窄程度有所減輕，以50mg/d，7d組最為明顯(73.628±21.689vs92.455±39.092，0.086±0.018vs0.102±0.033，0.539±0.132vs0.605±0.192，P＞0.05)；與對照組比較給予小劑量I3C(12.5mg/d，4d)治療后新生內膜厚度、新生內膜面積、內膜/中膜面積比(NIA/MA)，經統計學分析無顯著差異(P＞0.05)，而其它五組均有明顯降低趨勢，與對照組比較差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)。
2.PCNA陽性率的測定PCNA陽性細胞率在對照組高于治療組，除12.5mg/d，4d組外(P＞0.05)，其余五組的PCNA陽性率與對照組比較出現明顯降低(37.9±3.9)％，(35.9±1.4)％，(34.0±1.9)％，(27.6±1.7)％，(21.5±1.8)％vs(55.6±1.9)％，P＜0.01。
3.TUNEL％I3C誘導VSMCs凋亡與藥物劑量及作用時間呈依賴性。12.5mg/d，4d組細胞凋亡率(24.6±1.9)％較對照組高(23.4±1.6)％，但無顯著差異(p＞0.05)，其余各組與對照組比較均出現顯著差異(P＜0.01)。結論
I3C能顯著抑制血管內膜增生并呈明顯的劑量依賴關系，可能與其抑制平滑肌細胞增殖并誘導其凋亡有關。本研究初步結果顯示，口服適宜劑量的I3C在動物實驗中可以預防再狹窄，提示口服I3C可能成為一種潛在的防治防治增殖性血管疾病如動脈粥樣硬化、血管介入治療后再狹窄手段。
C.實施實驗3人體實驗本方案的適應癥由于增殖性血管疾病如動脈粥樣硬化的高發病率、血管介入治療后較高的再狹窄率及I3C很少的副作用，本方案適用于無禁忌癥的一般增殖性血管疾病如動脈粥樣硬化、血管介入治療后再狹窄病例，本方案的禁忌癥有各類腫瘤患者肝腎功能損害者血液系統疾病患者妊娠及哺乳婦女接觸強致癌劑人群治療方案用通過美國FDA認證的Designed Nutritional Products.Inc口服膠囊劑產品，200mg每天兩次，從實施介入治療手術前兩天開始，至術后四周結束。
局部治療為使用載I3C多聚物雙涂層支架由醫用316L不銹鋼經過激光雕刻而成的支架表面包被I3C-多聚乳酸基質，在聚合物基質表面再涂一層藥物釋放聚合物多聚羥基乙酸，作為彌散屏障，即成為緩慢釋放型支架(SR)。支架采用多聚乳酸/多聚羥基乙酸(PLGA)涂層包埋I3C藥物劑量為1mg(小劑量)或3mg(大劑量)，藥物完全釋放時間為60-90天。
本發明的優點A.作為一種食物活性成分，I3C及其二聚體(DIM)在表現出諸多有益的生物學效應的同時，其一般治療劑量的安全性得到動物實驗和臨床試驗的廣泛認同，主要用于腫瘤預防、調節激素平衡、促進機體解毒等方面。作為食品添加劑I3C已通過美國FDA認證。I3C在胃內的主要代謝產物為DIM，故使用該藥物及其二聚體(DIM)對病患者幾乎無副作用，安全性高。
B.申請者的系列實驗研究首次表明，處于增殖狀態的血管平滑肌細胞對I3C敏感，能顯著抑制血管平滑肌細胞增殖，同時促進其凋亡；很低濃度(50uM)即可起作用，且藥物效力呈明顯的劑量依賴關系，抑制作用隨用藥劑量增加及時間延長而逐漸增高。對大鼠頸動脈損傷模型使用I3C的短期活體實驗表明，每天使用12.5mg I3C灌胃7天即可非常有效地降低損傷血管新生內膜的厚度，降低血管內膜/中層比值，減輕管腔的狹窄程度，與對照組比較均有顯著差異，且隨劑量的增加差異越顯著。申請者的初步動物實驗研究表明I3C對血管損傷后內膜增殖有明顯的抑制和獨特的優勢。由于I3C在胃內的主要代謝產物為DIM，DIM的血漿半衰期較I3C明顯延長，且大量實驗研究發現I3C及其二聚體(DIM)可通過許多共同的途徑影響細胞信號傳遞、調節細胞周期、誘導細胞凋亡，影響酶的活性，從而對異常增殖細胞進行抑制，因此我們從細胞及動物實驗的結果推測DIM可對過度增殖的血管平滑肌細胞產生一定程度的抑制，并促進其凋亡，兩者合用也無疑可產生相同的藥理作用。故本發明中的I3C及其二聚體(DIM)可望用于人類增殖性血管疾病治療如動脈粥樣硬化的治療或在血管介入治療后，減少新生內膜和動脈中層的增生，減少經皮球囊擴張術和支架植入術后有效血管腔徑的丟失，最終減少血管介入治療的再狹窄率，改善其臨床預后，大大減少需要再血管化手術治療的病例。
C.于本方案對損傷血管修復的有益作用，可能將改進介入血管治療的方式。由于再狹窄的減少，對于一些單純病變，使用I3C及其二聚體(DIM)后，可只進行單純球囊擴張治療，而無須放置支架；對于一些較小血管的增殖性病變，原來既不適于單純球囊擴張，也不適于支架植入的病變，可考慮使用I3C及其二聚體(DIM)治療。
D.方案使用實施非常方便。只需使用膠囊劑口服即可，甚至像使用維生素丸一樣方便，用藥療程短，只需一個月即可。
E.使用本方案非常經濟，整個療程只需數十美元，比普通支架和藥物支架植入等治療方法有極強的價格優勢。
權利要求
1.吲哚-3-甲醇或/和其二聚體3，3`-二吲哚甲烷在制備用于防治增殖性血管疾病如動脈粥樣硬化、血管介入治療后再狹窄的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及的是吲哚－3－甲醇或/和其二聚體3，3′－二吲哚甲烷在制備用于防治增殖性血管疾病如動脈粥樣硬化、血管介入治療后再狹窄的藥物中的應用。所述吲哚－3－甲醇及其二聚體3，3′－二吲哚甲烷的一般治療劑量的安全性得到動物實驗和臨床試驗的廣泛認同，主要用于腫瘤預防、調節激素平衡、促進機體解毒等方面。作為食品添加劑吲哚－3－甲醇已通過美國FDA認證。3，3′－二吲哚甲烷是吲哚－3－甲醇在胃內的主要代謝產物，故使用該吲哚－3－甲醇或/和其二聚體3，3′－二吲哚甲烷對病患者幾乎無副作用，安全性高。
文檔編號A61K31/403GK1686115SQ20051005700
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月6日 優先權日2005年4月6日
發明者黃晶, 江永紅, 鄧昌明, 張俊霞, 胡懷東, 李進嵩, 袁僑英 申請人:黃晶