專利名稱：抑制sars冠狀病毒n蛋白表達(dá)的小干擾rna分子及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子及其編碼基因。
背景技術(shù)：
引起嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)的病原體SARS-CoV為一種新型的冠狀病毒，具有棘突蛋白S(spike)，基質(zhì)蛋白M(matrix)，包膜蛋白E(Envelope)和核蛋白N(Nuclear protein)等數(shù)種主要結(jié)構(gòu)蛋白(HolmesKV.SARS-associated coronavirus.N Engl J Med，2003，348(20)1948-51.)。研究表明，S蛋白是該病毒的主要保護(hù)性抗原，N蛋白和M蛋白也可以誘導(dǎo)免疫效應(yīng)，特別是N蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性。SARS-CoV N蛋白由422個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量48KD，其編碼基因的長(zhǎng)度為1268bp，是SARS-CoV主要的結(jié)構(gòu)蛋白，在冠狀病毒顆粒中，N蛋白位于病毒顆粒的核心部分和基因組RNA結(jié)合(Marra MA，JonesSJ，Astell CR，et al.The genome sequence of the SARS-associatedcoronavirus.Science，2003，300(5624)1399-1404.；Wang J，Ji J，Ye J，et al.The structure analysis and antigenicity study of the N protein of SARS-CoV.Genomics Proteomics Bioinformatics，2003，1(2)145-154.)。以往對(duì)動(dòng)物冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的研究表明，N蛋白在病毒復(fù)制和產(chǎn)生的病理反應(yīng)中起重要作用(HiscoxJA，Wurm T，Wilson L，et al.The coronavirus infectious bronchitis virusnucleoprotein localizes to the nucleolus.J Virol，2001，75(1)506-512.)。但目前，尚未有直接而有效的抑制SARS-CoV的方法。
RNA干擾技術(shù)(RNAi)是在小雙鏈RNA(dsRNA)分子的介導(dǎo)下特異性降解靶基因的生物技術(shù)，能使基因表達(dá)沉默，達(dá)到拮抗靶基因和實(shí)現(xiàn)生物(基因)治療目的。長(zhǎng)度為21到22個(gè)堿基的所謂小干擾RNA(siRNA，small interfering RNA)介導(dǎo)特異性干擾反應(yīng)，只降解與其高度互補(bǔ)的特定基因的mRNA(Elbashir，S.M.，Harborth，J.，Lendeckel，W.et al.，Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNAinterference in cultured mammalian cells，Nature，2001，411(6836)494)。RNAi技術(shù)因其在疾病治療方面具有巨大潛力而備受關(guān)注。迄今為止，有關(guān)siRNA可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)SARS病毒基因RNA的干擾效應(yīng)，從而使該病毒的復(fù)制和蛋白表達(dá)受到抑制對(duì)細(xì)胞形成保護(hù)作用，在ncbi上已有一些報(bào)道，但針對(duì)SARS-CoV N蛋白設(shè)計(jì)的siRNA未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供可抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子，是下述1)和2)中的至少一個(gè)雙鏈RNA序列1)正義鏈具有序列表中序列1的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列2的核苷酸序列；2)正義鏈具有序列表中序列3的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列4的核苷酸序列。
將具有1)的雙鏈RNA序列命名為siRNA1，其反義鏈與SARS-CoV N mRNA(序列表中的序列9)的213-233位置序列5’GGGCGUUCCAAUCAACACCAA 3’互補(bǔ)。序列表中序列1由21個(gè)堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端；序列表中序列2由21個(gè)堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端。
將具有2)的雙鏈RNA序列命名為siRNA2，其反義鏈與SARS-CoV N mRNA的862-883位置序列5’GGGGACCAAGACCUAAUCAGAC 3’互補(bǔ)。序列表中序列3由22個(gè)堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端；序列表中序列4由22個(gè)堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端。
上述抑制SARS-CoV N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子的編碼基因可具有下述1)和2)中至少一個(gè)雙鏈核苷酸序列1)有義鏈(正義鏈)(不做模板的DNA鏈)具有序列表中序列5的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈(做模板的DNA鏈)具有序列表中序列6的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列6限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；2)有義鏈(正義鏈)(不做模板的DNA鏈)具有序列表中序列7的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列7限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈(做模板的DNA鏈)具有序列表中序列8的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列8限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
將具有1)的雙鏈寡核苷酸序列編碼基因命名為siDNA1，編碼siRNA1。序列表中序列5由58個(gè)堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端；序列表中序列6由54個(gè)堿基組成，序列的方向從左至右為3′端→5′端。
將具有2)的雙鏈寡核苷酸序列編碼基因命名為siDNA2，編碼siRNA2。序列表中序列7由60個(gè)堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端；序列表中序列8由56個(gè)堿基組成，序列的方向從左至右為3′端→5′端。
含有上述抑制SARS-CoV N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子的編碼基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明提供的siRNA1和siRNA2小干擾RNA分子均可對(duì)SARS冠狀病毒N蛋白的表達(dá)產(chǎn)生干擾效應(yīng)，且隨著含有siRNA1編碼基因的RNAi干擾載體的轉(zhuǎn)染量的增加，SARS-CoV N蛋白的表達(dá)量逐漸下降，表明針對(duì)SARS-CoV N蛋白設(shè)計(jì)的siRNA的有效性和其抑制SARS-CoV N蛋白表達(dá)的劑量效應(yīng)，為SARS冠狀病毒N蛋白的功能研究奠定了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究SARS-CoV N蛋白在SARS-CoV的致病機(jī)制中的作用提供了新的平臺(tái)，對(duì)于揭示SARS的致病機(jī)制具有重要意義，同時(shí)也為預(yù)防和治療SARS提供了新的思路和方法。本發(fā)明將在SARS的特異性預(yù)防和治療方法中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，特別是在制備以抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子或攜帶所述抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子編碼基因的表達(dá)載體為活性成分的藥物中將發(fā)揮重要作用。
圖1為SARS-CoV N蛋白的RNAi載體pBS/U6+1abcd和pBS/U6+2abcd的酶切鑒定結(jié)果圖1b為抑制SARS-CoV N蛋白表達(dá)的RNAi干擾載體的工作原理示意2為含SARS-CoV N蛋白的全基因序列的真核重組表達(dá)載體pcMyc+N的酶切鑒定結(jié)果圖3為重組SARS-CoV N蛋白表達(dá)的westernblot檢測(cè)結(jié)果圖4為RNAi干擾載體對(duì)SARS-CoV N蛋白表達(dá)的干擾效應(yīng)的westernblot檢測(cè)結(jié)果圖5為上樣與圖4完全對(duì)應(yīng)的對(duì)照(內(nèi)參)β-actin的Western blot檢測(cè)結(jié)果圖6為RNAi干擾載體對(duì)SARS-CoV N蛋白干擾效應(yīng)的定量分析結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所用DNA序列均由上海生工合成。
實(shí)施例1、抑制SARS-CoV N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子的設(shè)計(jì)、RNAi干擾載體的構(gòu)建及其酶切鑒定一、抑制SARS-CoV N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子的設(shè)計(jì)按下述方法設(shè)計(jì)抑制SARS-CoV N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子1、在SARS-CoV N的mRNA序列(序列表中序列9)中篩選連續(xù)的“GGG”序列，該序列通常應(yīng)選擇在AUG下游至少100bp后；2、截取GGG后18-19bp的序列，以使加上GGG后序列總長(zhǎng)度為21-22bp；3、對(duì)經(jīng)步驟1和2獲得的siRNA序列進(jìn)行篩選，具體篩選要求為1)21-22bp siRNA的G/C％為45-65％；2)在ncbi上對(duì)siRNA序列進(jìn)行序列同源性比對(duì)，以確保所篩選的抑制SARS-CoVN蛋白表達(dá)的siRNA序列經(jīng)檢測(cè)和除SARS-CoV外的其它種屬序列無(wú)同源性。
經(jīng)上述步驟獲得了兩對(duì)抑制SARS-CoV N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子，分別命名為siRNA1(序列表中序列1和序列2)和siRNA2(序列表中序列3和序列4)，siRNA1作用于SARS-CoV N mRNA(序列表中的序列9)的213-233位置序列5’GGGCGUUCCAAUCAACACCAA 3’，siRNA2作用于SARS-CoV N mRNA的862-883位置序列5’GGGGACCAAGACCUAAUCAGAC 3’。
二、抑制SARS-CoV N蛋白表達(dá)的RNAi干擾載體的構(gòu)建及其酶切鑒定1、根據(jù)siRNA1和siRNA2所作用的靶序列以及載體pBS/U6(Sui GC etal.PNAS.2002 April；99(8)5515-5520)的使用要求，設(shè)計(jì)siRNA1和siRNA2的siDNA序列，分別命名為siDNA1和siDNA2，具體序列如下(下劃線堿基序列為針對(duì)SARS-CoV NmRNA的靶序列)siDNA1正義鏈5’-gggcgttccaatcaacaccaaa agcttttggtgttgattggaacgccctttttctgca -3(序列5)siDNA1反義鏈3’-cccgcaaggttagttgtggttttcga aaaccacaactaaccttgcgggaaaaag -5’(序列6)siDNA2正義鏈5’-ggggaccaagacctaatcaggaca agcttgtctgattaggtcttggtcccctttttctgca-3(序列7)siDNA2反義鏈3’-cccctggttctggattagtctgttcga acagactaatccagaaccaggggaaaaag-5’(序列8)2、根據(jù)所設(shè)計(jì)的siDNA1和siDNA2序列合成8條寡核苷酸，序列如下1a5’-ggcgttccaatcaacaccaaa-3’1b3’-ccgcaaggttagttgtggttttcga-5’1c5’-agcttttggtgttgattggaacgccctttttctgca-3’1d3’-aaaccacaactaaccttgcgggaaaaag-5’
2a5’-gggaccaagacctaatcagaca-3’2b3’-ccctggttctggattagtctgttcga-5’2c5’-agcttgtctgattaggtcttggtcccctttttctgca-3’2d3’-acagactaatccagaaccaggggaaaaag-5’將上述8條兩兩互補(bǔ)的寡核苷酸片斷經(jīng)煮沸后緩慢退火得到1ab、1cd、2ab、2cd四條雙鏈dsRNA，對(duì)1ab和2ab分別進(jìn)行以下操作用限制性內(nèi)切酶Apa I和HindIII進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物克隆入經(jīng)同樣酶酶切的含有U6啟動(dòng)子的載體pBS/U6中，將含有1ab的載體命名為pBS/U6+1ab，將含有2ab的載體命名為pBS/U6+2ab。再將1cd分別用限制性內(nèi)切酶Hind III和Pst I進(jìn)行雙酶切后克隆入經(jīng)同樣酶酶切的載體pBS/U6+1ab中，得到以5’GGGCGUUCCAAUCAACACCAA 3’為靶序列的SARS-CoV N蛋白的RNAi載體，將其命名為pBS/U6+1abcd；將2cd用同樣方法克隆入載體pBS/U6+2ab中，得到以5’GGGACCAAGACCUAAUCAGACA 3’為靶序列的SARS-CoV N蛋白的RNAi載體，將其命名為pBS/U6+2abcd。對(duì)pBS/U6+1abcd和pBS/U6+2abcd用EcoRI &Kpn I、SalI & Kpn I分別進(jìn)行雙酶切鑒定(以空載體pBS/U6為對(duì)照)，結(jié)果如圖1所示(泳道M為Marker，泳道1為pBS/U6+2abcd的EcoRI和Kpn I雙酶切產(chǎn)物，泳道2為pBSU6+1abcd的EcoRI和Kpn I的雙酶切產(chǎn)物，泳道3為pBS/U6的EcoRI和Kpn I的雙酶切產(chǎn)物，泳道4為pBS/U6+2ab的Sal I和Kpn I的雙酶切產(chǎn)物，泳道5為pBS/U6+1ab的Sal I和Kpn I的雙酶切產(chǎn)物，泳道6為pBS/U6的Sal I和Kpn I的雙酶切產(chǎn)物)，空載體pBS/U6經(jīng)雙酶切可以釋放長(zhǎng)度約為500bp左右的DNA片段，而構(gòu)建的載體pBS/U6+1ab、pBS/U6+2ab、pBS/U6+1abcd和pBS/U6+2abcd因插入dsRNA使限制酶切位點(diǎn)缺失而不能釋放該長(zhǎng)度約為500bp左右的DNA片段，表明正確構(gòu)建了分別含有siDNA1和siDNA2抑制SARS-CoV N蛋白表達(dá)的RNAi干擾載體，其工作原理示意圖如圖1b所示。
實(shí)施例2、SARS-CoV N蛋白的真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)以及用western blot法檢測(cè)RNAi干擾載體對(duì)SARS-CoV N蛋白表達(dá)的干擾效應(yīng)及定量分析一、SARS-CoV N蛋白的真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建及該蛋白的表達(dá)1、SARS-CoV N蛋白的真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)SARS-CoV N蛋白的CDS區(qū)設(shè)計(jì)引物，引物序列如下引物1(上游引物)5’-TATAGAATTCTGTCTGATAATGGACCCCAAT-3’；(劃線部分堿基為EcoRI識(shí)別位點(diǎn))引物2(下游引物)5，-TATAGGTACCTTATGCCTGAGTTGAATCAG-3’(劃線部分堿基為Kpn I識(shí)別位點(diǎn))
以經(jīng)SARS-CoV HKU-39849株(Zeng FW et al Exp Biol Med(Maywood).2003Jul；228(7)866-73)感染的vero E6細(xì)胞(ATCC)的RNA提取物為模板，在引物1和引物2的引導(dǎo)下，用RT-PCR法擴(kuò)增SARS-CoV N蛋白的全基因序列并在其兩端分別添加限制性內(nèi)切酶EcoRI和Kpn I識(shí)別位點(diǎn)，然后將SARS-CoV N蛋白的全基因序列克隆入質(zhì)粒載體pGEM-T easy(promega公司)中，再利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI將SARS-CoV N蛋白的全基因序列亞克隆入真核表達(dá)載體pCMV-Myc(美國(guó)Clontech公司)中，將重組載體命名為pcMyc+N，并對(duì)其進(jìn)行酶切鑒定(以空載體pCMV-Myc為對(duì)照)，結(jié)果如圖2所示(泳道M為Marker，泳道1為pcmyc+N的BamHI單酶切產(chǎn)物，泳道2為pCMV-Myc的Apa I和Kpn I雙酶切產(chǎn)物，泳道3為pcmyc+N的ApaI和Kpn I雙酶切產(chǎn)物，泳道4為pCMV-Myc的BamHI單酶切產(chǎn)物)，表明重組載體pcMyc+N比空白載體pCMV-Myc多釋放一條1200bp左右的DNA片段，該片段大小與SARS-CoV N蛋白的全基因序列的大小相符，證明獲得了正確的含有SARS-CoV N蛋白全基因序列的真核重組表達(dá)載體pcMyc+N。
2、SARS-CoV N蛋白的表達(dá)將pcMyc+N用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染(所用轉(zhuǎn)染試劑TfxTM-20購(gòu)自promega公司)293細(xì)胞(ATCC，用購(gòu)自美國(guó)Gibco公司的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng))，以pCMV-Myc空白載體為對(duì)照，48小時(shí)后收獲細(xì)胞，將細(xì)胞裂解后進(jìn)行westernblot檢測(cè)SARS-CoV N蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示(泳道1為用pcMyc+N轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解物，泳道2為用pCMV-Myc轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解物)，表明用pcMyc+N轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞表達(dá)有分子量大小約為48kD的蛋白，與SARS-CoV N蛋白的分子量大小一致，而對(duì)照空白載體pCMV-Myc沒有蛋白表達(dá)。
二、用western blot法檢測(cè)RNAi干擾載體對(duì)SARS-CoV N蛋白表達(dá)的干擾效應(yīng)將步驟一構(gòu)建的SARS-CoV N蛋白的真核表達(dá)載體pcmyc+N、RNAi干擾載體pBS/U6+1abcd和pBS/U6+2abcd分別用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)293細(xì)胞檢測(cè)其對(duì)SARS-CoV N蛋白表達(dá)的干擾效應(yīng)，同時(shí)設(shè)定不同劑量關(guān)系測(cè)定RNAi干擾載體pBS/U6+1abcd及pBS/U6+2abcd干擾SARS-CoV N蛋白表達(dá)的劑量效應(yīng)，具體方法為在保證總轉(zhuǎn)染量和pcmyc+N轉(zhuǎn)染量相同的情況下，改變RNAi干擾載體pBS/U6+1abcd或pBS/U6+2abcd的轉(zhuǎn)染量，即分別以pcmyc+NRNAi干擾載體為1∶1、1∶3和1∶6的比例(質(zhì)量比)共轉(zhuǎn)293細(xì)胞，48小時(shí)后收獲細(xì)胞，將細(xì)胞裂解后進(jìn)行westernblot檢測(cè)SARS-CoV N蛋白的表達(dá)情況(選擇購(gòu)自Santa Cruz公司的小鼠anti-Myc單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG及ECL試劑)，結(jié)果如圖4所示(泳道1為pcMyc & pBS/U6+2abcd，泳道2為pcmyc+N&pBS/U6+2abcd(1∶6)，泳道3為pcmyc+N&pBS/U6+2abcd(1∶3)，泳道4為pcmyc+N&pBS/U6+2abcd(1∶1)，泳道5為pcmyc+N&pBS/U6，泳道6為pcmyc+N&pBS/U6+1abcd(1∶1)，泳道7為pcmyc+N&pBS/U6+1abcd(1∶3)，泳道8為pcmyc+N&pBS/U6+1abcd(1∶6)，泳道9為pcmyc&pBS/U6+1abcd，泳道M為蛋白Marker)，表明SARS-CoV N蛋白的表達(dá)隨著siRNA劑量的增加被明顯的抑制，然后相對(duì)應(yīng)于上述的劑量和條件下以293細(xì)胞自身表達(dá)的β-actin作內(nèi)參，用Western blot法作鑒定(選擇購(gòu)自Santa Cruz公司的山羊anti-β-actin單克隆抗體和HRP標(biāo)記的鼠抗羊IgG及ECL試劑)，結(jié)果如圖5所示，可按下述方法對(duì)SARS-CoVN蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。
三、RNAi干擾載體對(duì)SARS-CoV N蛋白干擾效應(yīng)的定量分析通過(guò)UVISoft UVIBand Application V97.04軟件對(duì)圖5中的SARS-CoV N蛋白和β-actin進(jìn)行定量測(cè)定，通過(guò)計(jì)算統(tǒng)一β-actin內(nèi)參為固定值并設(shè)定只轉(zhuǎn)染pcmyc+N的SARS-CoV N蛋白表達(dá)量為1(100％)，分析RNAi干擾載體和SARS-CoV N蛋白表達(dá)載體共轉(zhuǎn)后SARS-CoV N蛋白表達(dá)下降的百分比，結(jié)果如圖6所示，縱坐標(biāo)為SARS-CoV N蛋白表達(dá)量，橫坐標(biāo)為pcmyc+N與RNAi干擾載體pBS/U6+1abcd或pBS/U6+2abcd的質(zhì)量比。圖6結(jié)果表明隨著RNAi干擾載體轉(zhuǎn)染量的增加(從1∶0增加到1∶6)，SARS-CoV N蛋白的表達(dá)百分比下降顯著，1∶6時(shí)表達(dá)百分比僅為只轉(zhuǎn)染pcmyc+N時(shí)的20％，說(shuō)明RNAi對(duì)SARS-CoV N蛋白的表達(dá)具有明顯抑制作用。
序列表<160>9<210>1<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gggcguucca aucaacacca a21<210>2<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2uugguguuga uuggaacgcc c 21<210>3<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3ggggaccaag accuaaucag ac22<210>4<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4gucugauuag gucuuggucc cc22<210>5<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5gggcgttcca atcaacacca aaagcttttg gtgttgattg gaacgccctt tttctgca 58<210>6<211>54<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6gaaaaagggc gttccaatca acaccaaaag cttttggtgt tgattggaac gccc54<210>7<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>7ggggaccaag acctaatcag acaagcttgt ctgattaggt cttggtcccc tttttctgca 60<210>8<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>8gaaaaagggg accaagacct aatcagacaa gcttgtctga ttaggtcttg gtcccc 56<210>9<211>1269<212>mRNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>9augucugaua auggacccca aucaaaccaa cguagugccc cccgcauuac auuuggugga60cccacagauu caacugacaa uaaccagaau ggaggacgca auggggcaag gccaaaacag120cgccgacccc aagguuuacc caauaauacu gcgucuuggu ucacagcucu cacucagcau180ggcaaggagg aacuuagauu cccucgaggc cagggcguuc caaucaacac caauaguggu240ccagaugacc aaauuggcua cuaccgaaga gcuacccgac gaguucgugg uggugacggc300aaaaugaaag agcucagccc cagaugguac uucuauuacc uaggaacugg cccagaagcu360ucacuucccu acggcgcuaa caaagaaggc aucguauggg uugcaacuga gggagccuug420aauacaccca aagaccacau uggcacccgc aauccuaaua acaaugcugc caccgugcua480caacuuccuc aaggaacaac auugccaaaa ggcuucuacg cagagggaag cagaggcggc540agucaagccu cuucucgcuc cucaucacgu agucgcggua auucaagaaa uucaacuccu600ggcagcagua ggggaaauuc uccugcucga auggcuagcg gaggugguga aacugcccuc660gcgcuauugc ugcuagacag auugaaccag cuugagagca aaguuucugg uaaaggccaa720caacaacaag gccaaacugu cacuaagaaa ucugcugcug aggcaucuaa aaagccucgc780caaaaacgua cugccacaaa acaguacaac gucacucaag cauuugggag acguggucca840gaacaaaccc aaggaaauuu cggggaccaa gaccuaauca gacaaggaac ugauuacaaa900cauuggccgc aaauugcaca auuugcucca agugccucug cauucuuugg aaugucacgc960auuggcaugg aagucacacc uucgggaaca uggcugacuu aucauggagc cauuaaauug1020gaugacaaag auccacaauu caaagacaac gucauacugc ugaacaagca cauugacgca1080uacaaaacau ucccaccaac agagccuaaa aaggacaaaa agaaaaagac ugaugaagcu1140cagccuuugc cgcagagaca aaagaagcag cccacuguga cucuucuucc ugcggcugac1200auggaugauu ucuccagaca acuucaaaau uccaugagug gagcuucugc ugauucaacu1260caggcauaa1269
權(quán)利要求
1.抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子，是下述1)和2)中的至少一個(gè)雙鏈RNA序列1)正義鏈具有序列表中序列1的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列2的核苷酸序列；2)正義鏈具有序列表中序列3的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列4的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小干擾RNA分子，其特征在于所述小干擾RNA分子是一個(gè)正義鏈具有序列表中序列1的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列2的核苷酸序列的雙鏈RNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小干擾RNA分子，其特征在于所述小干擾RNA分子是一個(gè)正義鏈具有序列表中序列3的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列4的核苷酸序列的雙鏈RNA序列。
4.權(quán)利要求1-3任一所述的抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子的編碼基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子的編碼基因具有下述1)和2)中至少一個(gè)雙鏈核苷酸序列1)有義鏈具有序列表中序列5的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQID №5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中序列6的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №6限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；2)有義鏈具有序列表中序列7的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQID №7限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中序列8的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №8限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于所述抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子的編碼基因?yàn)橐粋€(gè)雙鏈核苷酸序列，其有義鏈具有序列表中序列5的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中序列6的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于所述抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子的編碼基因?yàn)橐粋€(gè)雙鏈核苷酸序列，其有義鏈具有序列表中序列7的核苷酸序列的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中序列8的核苷酸序列的核苷酸序列。
8.含有權(quán)利要求4-7任一所述的抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子編碼基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
9.以權(quán)利要求1所述的抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子或攜帶所述抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子編碼基因的表達(dá)載體為活性成分的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子及其編碼基因與應(yīng)用。該抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子，是下述1)和2)中的至少一個(gè)雙鏈RNA序列1)正義鏈具有序列表中序列1的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列2的核苷酸序列；2)正義鏈具有序列表中序列3的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列4的核苷酸序列。本發(fā)明將在制備以抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子或攜帶所述抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子編碼基因的表達(dá)載體為活性成分的藥物中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)A61P11/00GK1837362SQ200510057000
公開日2006年9月27日 申請(qǐng)日期2005年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月25日
發(fā)明者曹穎莉, 劉力, 張?jiān)? 王樹惠 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所