專利名稱：細胞因子聯合降血糖藥物治療糖尿病的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種制備治療糖尿病藥物的應用，具體地說是細胞因子聯合降血糖藥物在治療糖尿病臨床上的應用和制備治療糖尿病藥物方面的應用。
2、背景技術糖尿病是難以治愈的自身免疫性疾病，臨床上通常采用皮下注射胰島素類降血糖藥物來治療，但其治療效果并不理想，且很難阻止糖尿病進展和并發癥的發生，患者需終生服藥。
根據2000年第17屆國際糖尿病大會調查的結果顯示，全世界的糖尿病患者數已超過1.51億，近幾年來，各國糖尿病發病率大有不斷上升的趨勢。目前臨床上治療糖尿病主要有三種方式，第一種是最常用的皮下注射胰島素來治療I型及部分II型糖尿病，但是實踐證明其治療效果并不理想，很難阻止糖尿病并發癥的發生及發展。第二種方法是在人體內植入胰島β細胞或其替代物，這對于已經喪失胰島細胞功能的糖尿病患者來說，是一個很吸引人的方法，但供者細胞來源不足及免疫排斥反應等限制了這種方法的應用。第三種方法是利用干細胞這一類具有多向分化潛能的細胞體外誘導分化為胰島β細胞，并已經逐漸成為人們尋找胰島β細胞替代物的新資源。
根據干細胞發育的階段，可將其劃分為胚胎干細胞(embryonic stem cell)和成體組織干細胞(adult stem cell)。由于胚胎干細胞來源于胚胎，倫理、道德約束甚至法律方面的限制是其研究和應用的最大障礙。因此，另一類干細胞---成體組織干細胞的研究受到了重視。成體組織干細胞是指存在于人和哺乳動物組織中，具有自我更新和一定分化潛能的不成熟細胞，其作用是更新生理性衰老死亡的細胞或組織受損時代償性增生。
成體組織干細胞研究最多的是骨髓干細胞，骨髓干細胞(bone marrow stemcells)包括造血干細胞(hematopoietic stem cell)和間充質干細胞(mesenchymalstem cell)。造血干細胞可以分化為各種非造血組織，如骨骼肌、心肌、肝臟導管和血管內皮組織等。間充質細胞可以向骨、軟骨、肌肉等分化。理論上推斷，骨髓干細胞隨血液在體內循環，遇有組織更新或再生的需求，便停留下來，本地化為組織干細胞，以補充或更新內源組織干細胞庫，隨后進入增殖和分化程序，成為成熟的組織細胞，表現出“橫向分化”或可塑性。
已有研究表明移植的骨髓干細胞可以參與完好胰島的自我更新，并增殖、轉分化為有功能的胰島β細胞，而且排除了發生細胞融合的可能，骨髓可能是成體胰腺干細胞的另一個隱居所，骨髓干細胞參與成體胰腺的再生，有望成為治療I型和II型糖尿病的新舉措。
應用干細胞移植對糖尿病進行細胞替代治療首先要在體外將干細胞大量擴增，待細胞達到足夠數量后，再誘導其分化為胰島β細胞，但是包括胰腺多能干細胞在內的成體組織干細胞存在數量稀少、分離困難的問題；胰腺多能干細胞來源于胰腺導管上皮細胞，取材較為困難，對機體打擊和損傷較大；另外，在糖尿病時，胰島β細胞大量破壞而得不到足夠補充，提示糖尿病自體來源的胰腺多能干細胞存在一定損害；同種異體胰腺多能干細胞同樣面臨著來源有限、獲取困難的限制。因此，用胰腺多能干細胞體外擴增后進行誘導分化和移植來治療糖尿病具有相當大的難度。而且干細胞移植的許多基本理論目前尚未解決，其臨床研究應用仍面臨重大挑戰，首先通常成體組織干細胞含量極少，缺乏特異標志，選擇哪種類型的細胞移植的獲益最大，其次干細胞體外定向分化技術仍有很大的缺陷，再次干細胞移植過程中的細胞滲漏，移植細胞的純度和數量，移植的位置和時機以及移植的安全性及免疫系統排斥等問題上仍受到一定的限制。
綜上所述，采用自體骨髓干細胞動員治療糖尿病，將能克服干細胞移植糖尿病治療中存在的許多難以解決的問題。
3、發明內容本發明的目的是在使用常規降血糖藥物治療小鼠糖尿病的基礎上，聯合骨髓造血干細胞動員劑-重組人粒細胞集落刺激因子(以下簡稱G-CSF)，為機體創造最佳生理條件下通過動員自身的骨髓干細胞體內胰島部位原位移植實現對病損胰島組織的修復，達到治療糖尿病的目的。
細胞因子聯合降血糖藥物治療糖尿病的應用。
細胞因子聯合降血糖藥物治療糖尿病的應用，與降血糖藥物聯合應用的細胞因子包括下列一種或幾種重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、重組長效人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、糖基化重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、糖基化重組長效人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、干細胞因子(SCF)、血管內皮生長因子(VEGF)和白細胞介素(IL-11)等其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
與細胞因子聯合應用的降血糖藥物包括下列一種或幾種人胰島素、重組人胰島素、動物胰島素、人胰島素類似物、胰島素樣生長因子的各類制劑(包括速效、中效及長效)等其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
細胞因子和降血糖藥物在制備治療糖尿病藥物的應用時可同時、先后或單獨給予這兩類藥物。
細胞因子和降血糖藥物在制備治療糖尿病藥物的應用時可任意組合這兩類藥物。
細胞因子包括其藥學上可接受的賦形劑、緩釋劑或載體。
降血糖藥物包括其藥學上可接受的賦形劑、緩釋劑或載體。
本發明的研究采用G-CSF聯合胰島素治療糖尿病，通過試驗證明采用G-CSF聯合胰島素治療糖尿病治療效果明顯優于單獨使用胰島素治療和單獨使用G-CSF治療。
所產生的積極效果是(1)G-CSF具有促進胰島修復、提高糖尿病小鼠生存質量及生存率的作用；(2)G-CSF與胰島素聯合應用療效具有相互補償作用，療效更佳，不僅可以更好地降血糖，而且有利于胰島的修復和再生，提高小鼠的生存率和生存質量。提示G-CSF和胰島素聯合應用將是一種值得關注的治療方案，對于根治糖尿病新藥的研制開發將有重要價值。
本發明的研究表明單純使用G-CSF動員的自體骨髓干細胞在高血糖環境的影響下，不利于向胰島β細胞分化，而與胰島素聯合則有利于干細胞向胰島β細胞的分化及再生。G-CSF能夠動員骨髓干細胞，刺激中性粒細胞的增殖及促進其發揮功能活性，具有免疫調節作用，與胰島素聯合治療小鼠糖尿病，其修復作用是全面的，而且該種治療是利用現有藥物，以皮下注射的簡便治療途徑即可實現動員骨髓干細胞的“自我移植”，方法簡單易行，安全有效，且無創傷性，無須對干細胞進行分離、采集與再輸注，亦無異體造血干細胞移植所面臨的干細胞來源困難，和存在免疫排斥反應等諸多問題，其臨床應用前景更優。
本發明優先采用G-CSF與胰島素聯合治療小鼠糖尿病，連續治療60天，取得較好的效果。國內外文獻尚未見G-CSF與胰島素合用治療糖尿病的報道，此方法有望成為一種根治糖尿病的新方法。
4、實施方式本發明的試驗中優選使用的細胞因子是重組人粒細胞集落刺激因子G-CSF，優選使用的降血糖藥物是中效重組人胰島素。
取雌性BALB/C小鼠，體重22-24g，隨機分為(1)正常對照組(健康小鼠)；(2)糖尿病模型組(腹腔注射鏈脲菌素250-300mg/kg)；(3)胰島素治療組(每日上午皮下注射中效胰島素2IU/kg)；(4)G-CSF治療組(每日下午皮下注射G-CSF 20ug/kg)；(5)胰島素加G-CSF治療組，每日上午皮下注射中效胰島素2IU/kg，每日下午皮下注射G-CSF 20ug/kg，每組9支小鼠，連續治療60天。
試驗結果1.糖尿病模型正常小鼠注射鏈脲佐菌素后，第6-9天起，血糖和尿糖持續升高，小鼠一般狀況較差，體質瘦弱，不活潑，皮毛稀疏，尿多，成模后40天時已全部死亡。病理切片結果顯示糖尿病模型組小鼠胰島細胞損傷情況嚴重，出現胰島細胞離散現象，胰島內有較大空虛區域，胰島結構受到破壞；脾臟較小，造模后30天其大小約為正常對照組小鼠的1/2。
2.使用胰島素單獨治療糖尿病鼠的療效觀察胰島素是I型糖尿病的常規用藥，我們在觀察G-CSF對糖尿病的治療之前，首先觀察了胰島素對所建糖尿病鼠的治療療效果，并以此作為對照。糖尿病小鼠每天用胰島素治療后，尿量減少，體重增加，尿糖明顯下降，空腹血糖有所下降，成活率較模型組明顯提高，治療60后天成活率為67％，但是一般狀況較差，與正常組比較小鼠不夠活潑，餐后血糖下降不明顯。病理切片結果顯示小鼠胰島細胞損傷情況與模型組比較沒有明顯改善，CD34+細胞及胰島素免疫組織化學實驗顯色結果為陰性，脾臟較小。說明胰島素單獨治療盡管可以降血糖，對生存率有所提高，但對胰島的修復沒有明顯作用，生存質量較差。
3.使用G-CSF單獨治療糖尿病鼠的療效觀察糖尿病小鼠每天應用G-CSF治療后，一般狀況良好，活潑好動，皮毛光澤，空腹血糖有明顯下降，體重增加，治療60后天成活率達100％，脾臟形態基本正常。病理切片結果顯示小鼠胰島細胞損傷情況有所修復。但是小鼠尿量仍然較多，尿糖、餐后血糖下降不明顯。說明盡管細胞因子G-CSF在降血糖方面不如胰島素，但它可促進胰島修復，小鼠的生存質量和長期生存率大大提高，顯示細胞因子G-CSF在糖尿病治療方面的潛能。
4.G-CSF和胰島素聯合治療糖尿病鼠的療效觀察G-CSF和胰島素治療聯合治療糖尿病鼠后，發現二者有互補作用，小鼠不僅血糖、尿糖明顯降低，而且小鼠健康活潑，皮毛光澤，尿少，體重增加，治療60天后成活率100％，脾臟形態基本正常。更加可喜的是病理切片結果顯示小鼠胰島細胞損傷明顯修復，免疫組織化學顯色結果表明胰島內有CD34+細胞侵潤并且分化為胰島素分泌陽性細胞。提示細胞因子G-CSF和胰島素聯合治療糖尿病，不僅可以降血糖，而且有利于胰島的修復，將是一種值得關注的治療方案。
實施例可采用的治療方案可以是一、細胞因子和降血糖藥物在制備治療糖尿病藥物的應用時，可同時、先后或單獨給予這兩類藥物，治療劑量及時間可根據治療效果調整。
1、每日同時注射中效人胰島素2IU/kg與重組長效人粒細胞集落刺激因子G-CSF 20ug/kg。
2、每日上午注射重組長效人粒細胞集落刺激因子G-CSF 20ug/kg，下午注射胰島素樣生長因子2IU/kg。
3、第一天注射長效重組人胰島素2IU/kg，第二天注射長效重組長效人粒細胞集落刺激因子G-CSF 20ug/kg。
4、第一天注射重組長效人粒細胞集落刺激因子G-CSF 20ug/kg，第二天注射中效動物胰島素2IU/kg。
二、細胞因子和降血糖藥物在制備治療糖尿病藥物的應用時可任意組合這兩類藥物，治療劑量及時間可根據治療效果調整。
1、每日上午注射中效人胰島素2IU/kg，下午注射重組人粒細胞集落刺激因子G-CSF 20ug/kg加干細胞因子SCF20ug/kg。
2、每日三餐前注射速效胰島素1IU/kg，每日上午注射糖基化重組人粒細胞集落刺激因子G-CSF20ug/kg。
3、第一天注射長效胰島素2IU/kg，第二天注射重組長效人粒細胞集落刺激因子G-CSF20ug/kg。
4、每日上午注射中效人胰島素2IU/kg，下午注射糖基化重組人粒細胞集落刺激因子G-CSF 20ug/kg加SCF20ug/kg。
5、每日上午注射中效重組人胰島素2IU/kg，下午注射重組長效人粒細胞集落刺激因子G-CSF 20ug/kg加白細胞介素IL-11 20ug/kg。
6、每日上午注射中效動物胰島素2IU/kg，下午注射重組人粒細胞集落刺激因子G-CSF 20ug/kg加血管內皮生長因子VEGF5ug/kg。
7、每日上午注射胰島素樣生長因子2IU/kg，每日下午注射糖基化重組人粒細胞集落刺激因子G-CSF 20ug/kg。
8、第一天注射速效人胰島素類似物1IU/kg加長效胰島素2IU/kg，第二天注射重組長效人粒細胞集落刺激因子G-CSF 20ug/kg。
通過上述研究證明1.各種細胞因子均具有促進胰島修復、提高糖尿病小鼠生存質量及生存率的作用。
2.各種細胞因子與不同種類胰島素聯合應用在治療過程鐘均具有相互補償作用和提高治療效果。不僅可以更好地降血糖，而且有利于胰島的修復和再生，提高小鼠的生存率和生存質量。提示細胞因子F和胰島素聯合應用將是一種值得關注的治療方案，對糖尿病的治療有重要價值，同時是研究制備根治糖尿病新藥的基礎。
權利要求
1.細胞因子聯合降血糖藥物治療糖尿病的應用。
2.根據權利要求1所述的細胞因子聯合降血糖藥物治療糖尿病藥物的應用，其特征在于與降血糖藥物聯合應用的細胞因子包括下列一種或幾種重組人粒細胞集落刺激因子、重組長效人粒細胞集落刺激因子、糖基化重組人粒細胞集落刺激因子、糖基化重組長效人粒細胞集落刺激因子、干細胞因子、血管內皮生長因子和白細胞介素等其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
3.根據權利要求1所述的細胞因子聯合降血糖藥物治療糖尿病的應用，其特征在于與細胞因子聯合應用的降血糖藥物包括下列一種或幾種人胰島素、重組人胰島素、動物胰島素、人胰島素類似物、胰島素樣生長因子的各類制劑等其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
4.根據權利要求1所述的細胞因子聯合降血糖藥物治療糖尿病的應用，其特征在于細胞因子和降血糖藥物在制備治療糖尿病藥物的應用時可同時、先后或單獨給予這兩類藥物。
5.根據權利要求1所述的細胞因子聯合降血糖藥物治療糖尿病的應用，其特征在于細胞因子和降血糖藥物在制備治療糖尿病藥物的應用時可任意組合這兩類藥物。
6.根據權利要求1所述的細胞因子聯合降血糖藥物治療糖尿病的應用，其特征在于細胞因子包括權利要求2所述細胞因子及其藥學上可接受的賦形劑、緩釋劑或載體。
7.根據權利要求1所述的細胞因子聯合降血糖藥物治療糖尿病的應用，其特征在于降血糖藥物包括權利要求3所述降血糖藥物及其藥學上可接受的賦形劑、緩釋劑或載體。
全文摘要
本發明提供一種細胞因子聯合降血糖藥物治療糖尿病的應用，是在使用常規降血糖藥物治療糖尿病的基礎上，聯合骨髓造血干細胞動員劑－重組人粒細胞集落刺激因子(以下簡稱G－CSF)，為機體創造最佳生理條件下通過動員自身的骨髓干細胞體內胰島部位原位移植實現對病損胰島組織的修復，達到治療糖尿病的目的。G－CSF與胰島素聯合應用療效具有相互補償作用，療效更佳，不僅可以更好地降血糖，而且有利于胰島的修復和再生，提高生存率和生存質量。
文檔編號A61P3/00GK1736477SQ20051004406
公開日2006年2月22日 申請日期2005年7月11日 優先權日2005年7月11日
發明者張利寧, 于萍 申請人:張利寧