專利名稱：紅花苷a在腦保護方面的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及紅花苷A在神經保護方面的應用，具體地涉及紅花苷A在腦保護方面的應用。
背景技術：
隨著人口老齡化進程的加速，腦血管疾病、老年性神經系統疾病(老年性癡呆、血管性癡呆、帕金森癥等)已成為一個全球性的健康問題，但是目前尚未找到完美的治療藥物以及治療手段，以前對于此類疾病的治療著重于受損腦區的治療，近年研究發現，腦組織繼發性損傷、二次損傷是導致死亡、預后差的更重要因素；因此，如何使損傷區周圍區域的神經元恢復活力，免受損傷尤為重要。神經保護治療是針對腦血管病的病理機制，對腦損傷的生化和代謝紊亂通過藥物或其他等手段阻斷細胞壞死不同環節，增加正常和受損細胞存活能力，促進神經功能恢復。
紅花苷A是從傳統活血化瘀中藥紅花中分離提取得到的單體成分，在CN96109651.9中將其稱為紅花素A，我們通過大量實驗研究發現紅花苷A具有神經保護作用。
紅花苷A結構發明內容本發明提供了紅花苷A在神經保護方面的應用。
本發明提供了紅花苷A在腦保護方面的應用。
本發明提供了紅花苷A在NMDA誘導神經細胞損傷保護方面的應用。
本發明提供了紅花苷A在腦缺血所致大鼠神經細胞損傷保護方面的應用。
本發明提供了紅花苷A在腦缺血再灌注所致小鼠血管性癡呆保護方面的應用。
本發明提供了一種紅花苷A的制備方法。
本發明所述的紅花苷A可單獨使用或以藥物組合物形式使用。藥物組合物包括作為活性成分的紅花苷A及藥用載體。可通過靜脈、口服、舌下、經皮、經肌肉或皮下、皮膚粘膜等途徑給藥，可以以注射劑、片劑、丸劑、顆粒劑、膠囊、懸浮液、溶液、糖漿的形式存在。本發明所提供的各種藥物劑型均可以以藥學常規方法制備而成。
本發明通過下列試驗證實了紅花苷A具有神經保護作用。試驗所用的紅花苷A可以按CN96109651.9的方法制備，優選按本發明提供的方法制備。
本發明提供的紅花苷A的制備方法，包括如下步驟(1)紅花水提一次或多次，合并提取液，過濾，濃縮；(2)上大孔樹脂，有機溶劑洗脫，收集洗脫液；(3)洗脫液上聚酰胺柱，有機溶劑洗脫，收集洗脫液，回收有機溶劑，濃縮液干燥即得。
本發明提供的紅花苷A的制備方法，優選為(1)紅花水提一次或多次，合并提取液，過濾，濃縮；(2)加入醇進行沉淀，濾過，濃縮濾液，回收醇；(3)濾液水稀釋后上大孔樹脂，醇溶液洗脫，收集洗脫液；(4)洗脫液上聚酰胺柱，不同濃度醇溶液洗脫，收集高濃度醇洗脫液，回收醇，濃縮液干燥即得。
本發明提供的紅花苷A的制備方法，更優選為(1)干燥紅花80℃下水提3次，合并提取液；過濾，濾液減壓濃縮至密度為1.05；(2)加乙醇至濃度為80％，4℃下沉淀24小時，濾過；濾液減壓回收醇至無醇味；(3)加至10倍水稀釋后上DM-130大孔樹脂，用5％乙醇洗脫4個柱體積，收集洗脫液；(4)洗脫液上聚酰胺柱，先50％乙醇洗脫3個柱體積，棄去；繼續用95％乙醇洗脫8個柱體積，收集洗脫液于60℃減壓回收乙醇，濃縮液冷凍干燥即得。
具體實施例方式制備例制備紅花苷A取干燥紅花，80℃下水提3次，水量依次為20倍、15倍、15倍，合并提取液；過濾，濾液減壓濃縮至密度為1.05(80℃)，加乙醇至醇濃度為80％，于4℃下沉淀24小時，濾過；濾液于60℃減壓回收乙醇至無醇味，加至10倍水稀釋后上處理好的DM-130大孔吸附樹脂，上樣量(生藥量)與樹脂用量的比例為1∶1(w/v)，用5％乙醇洗脫4個柱體積，收集洗脫液。洗脫液上樣于處理好的聚酰胺柱，上樣量(生藥量)與樹脂用量的比例為3∶1(w/v)，先50％乙醇洗脫3個柱體積，棄去；繼續用95％乙醇洗脫8個柱體積，收集洗脫液于60℃減壓回收乙醇，濃縮液冷凍干燥即得。
試驗例1紅花苷A對N-甲基-D-門冬氨酸所致大鼠神經細胞損傷的保護作用1材料紅花苷A按制備例方法制備，用時以生理鹽水稀釋至合適濃度。
多聚賴氨酸為Sigma公司產品。DMEM培養基為Gibco公司產品；其余試劑均為分析純。
實驗動物普通級Sprague Dawley大鼠18只，♂，體重250g-280g，山東省天然藥物工程技術研究中心實驗動物中心提供，合格證號魯動質字200106005號。
2方法2.1神經細胞原代培養懷孕15d大鼠水合氯醛麻醉，75％乙醇消毒胸腹部，在無菌條件下取出胎鼠，剝出，分離兩側皮層組織，用手術刀切成糜狀，移入含0.125％胰蛋白酶的磷酸緩沖液中消化30min(37℃)后棄去消化液，加入含10％胎牛血清，10％馬血清，100μ/ml青霉素，100μ/ml鏈霉素的DMED培養液，用小口徑吸管反復吹打分散，200目細胞篩過濾后，以DMEM調整細胞濃度至106個/ml，接種至預先涂有0.01％多聚賴氨酸的35mm培養皿中，每皿2ml，置CO2培養箱中37℃孵育，于培養第3天在培養液中加入細胞分裂抑制劑阿糖胞普儲備液(6μl/皿)以抑制非神經元細胞的過度增殖，作用48h后換新鮮培養液，以后每周換液2次，每次更換半量液。
2.2NMDA誘導神經細胞損傷細胞培養至d14后，隨機分正常對照組，NMDA 50μmol·L-1組，紅花苷A組(10、100μmol·L-1)；各組換以含不同藥物的低血清DMEM(5％胎牛血清，5％馬血清，30mmol·L-1HEPES)繼續培養6h，再加50mmol·L-1NMDA，孵育12h后按文獻閻超華，馮亦璞.丁基苯酞對低糖低氧誘導的大鼠皮層神經細胞損傷的保護作用.藥學學報.1998，33(7)486-492.所述方法觀察細胞形態，計算細胞死亡率。
2.3統計學處理數據用x±SD表示，組內給藥前后、組間均以參比差值法(ANOVA)進行統計學處理。
3結果3.1對培養神經細胞形態變化的影響正常神經細胞培養至d14時，生長良好，胞體呈錐形、梭形或三角形，突觸粗而長，呈樹根狀交織成網；當細胞在含50μmol·L-1NMDA的培養基中孵育12h時，細胞出現腫脹、輪廓模糊，神經元突觸斷裂、消失、甚至細胞崩解；如細胞同時與10、100μmol·L-1紅花苷A孵育，則細胞損傷程度明顯減輕，細胞形態基本保持完整，但細胞密度有所降低，仍可見突觸斷裂等現象；表明紅花苷A對NMDA誘導的大鼠神經細胞損傷有顯著的保護作用。
3.2對培養神經細胞死亡率的影響神經細胞在含50μmol·L-1NMDA的培養基中孵育12h后，臺盼藍染色著色細胞明顯增多(NMDA 50μmol·L-1組86％vs正常對照組10％，P＜0.001)，提示細胞死亡率增加；于培養基中同時加入10、100μmol·L-1紅花苷A(分別為38％、24％)可明顯降低細胞死亡率，與NMDA50μmol·L-1組相比有顯著差異。
試驗例2紅花苷A對局部腦缺血所致大鼠神經細胞損傷的保護作用1材料紅花苷A按制備例制備，用時以生理鹽水稀釋至合適濃度。尼莫地平注射液，山東新華制藥股份有限公司產品，規格10mg/50ml，批準文號國藥準字H10950302，批號030602。TUNEL試劑盒南京建成生物工程開發公司。
實驗動物普通級Sprague Dawley大鼠60只，♂，體重250g-280g，山東省天然藥物工程技術研究中心實驗動物中心提供，合格證號魯動質字200106005號。
2方法2.1局部腦缺血模型制作動物隨機分為假手術組(NS)，模型對照組(NS)，尼莫地平組(Nim，1mg/kg)，紅花苷A 5mg/kg組、50mg/kg組、100mg/kg組，每組10只。禁食16小時后，水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，分離右側頸總動脈，夾閉頸內、頸總動脈，頸外動脈近心端及遠心端結扎，中間剪斷。將頸外動脈游離端拉至與頸內動脈成一條直線，將栓線(選用直徑0.24mm尼龍線，長度5.0cm)由頸外動脈插入至顱內，遇輕微阻力時停止，插入深度約為2cm。結扎頸外動脈開口，并打開頸總動脈動脈夾，消毒縫合傷口，造成右側大腦中動脈缺血模型；假手術組僅進行右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈的分離(以上實驗均在23℃～25℃進行)。各組動物手術完成30min后分別給予相應藥物。
2.2神經行為評分24小時后按文獻劉小光等.一種能評價溶栓和抗栓藥的大鼠大腦中動脈血栓模型，藥學學報，1995，30(9)662-667.所述方法觀察并記錄大鼠的行為障礙(1)提鼠尾觀察前肢屈曲情況，如雙前肢對稱伸向地面，計為0分，如手術對側前肢出現腕屈曲計為1分，肘屈曲計為2分，肩內旋計為3分，既有腕屈曲和/或肘屈曲，又有肩內旋者，計為4分。(2)將動物置于平地面上，分別推雙肩向對側移動，檢查阻力。如雙側阻力對等且有力，計為0分，如向手術對側推動時阻力下降者，根據下降程度不同分為輕、中、重三度，分別計為1，2和3分。(3)將動物雙前肢置一金屬網上，觀察雙前肢的肌張力。雙前肢肌張力對等且有力者計為0分。同樣根據手術對側肌張力下降程度不同計為1，2和3分。(4)動物有不停地向一側轉圈者，計為1分。根據標準評分，滿分為11分，分數越高，表示動物行為障礙越嚴重。
2.3TTC染色測定梗死面積行為評分后處死大鼠，取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，冠狀切成5片，腦片用紅四氮唑(TTC)染色，正常組織經染色后呈紅色，梗塞組織呈白色，染色后照相，用中國航空航天大學病理圖像分析軟件求梗塞面積比。
2.4病理觀察經TTC染色后的腦片置10％福爾馬林中固定，經脫水、浸蠟、包埋、切片等步驟后，制成8um厚的組織切片，甲苯胺藍染色，在光學顯微鏡下進行檢查，并進行細胞計數。計數的方法選擇每只大鼠視交叉與漏斗柄連線中點處的病理切片，以固定范圍的皮層下基底節為觀察對象，以細胞核消失、細胞體暗染的壞死神經元為計數對象，用細胞計數器，計算壞死神經元數占總神經元數的百分比。
2.5統計學處理數據用x±SD表示，組內給藥前后、組間均以參比差值法(ANOVA)進行統計學處理。
3結果3.1對神經行為障礙、腦梗死面積的影響結果如表1所示，缺血24小時后，大鼠表現出明顯的行為障礙，大鼠腦組織也出現明顯的灶狀缺血壞死區，達到全腦的25％左右；給予不同劑量的紅花苷A(5mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)，動物行為障礙有不同程度的減輕，大鼠腦缺血區也有明顯縮小。
表1紅花苷A對局部腦缺血大鼠神經行為、腦梗死面積損傷的影響(x±SD，n＝10)
與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.013.2病理檢查結果MCAO后24h，模型對照組的大鼠患側半球MCA供血區蒼白、無光澤，腦病理切片顯示，于MCA閉塞側腦組織有嚴重損傷的壞死中心區和輕中度損傷的半影區及其以外的外周區，其中半影區對缺血性變化較為敏感，在模型對照組大鼠表現為大量神經元周圍間隙擴大，出現散在的暗染神經元，神經細胞出現不同程度的皺縮。對側腦組織未見病理改變。給予紅花苷A組動物有不同程度的減輕。我們以相同切面的腦片半影區來進行細胞計數。由表2可見，紅花苷A治療組皮層、紋狀體神經元壞死百分比明顯減少，與模型對照組比較差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)。
表2紅花苷A對局部腦缺血大鼠神經元壞死百分比的影響(x±SD，n＝10)
與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01試驗例3紅花苷A對血管性癡呆小鼠的神經保護作用1材料紅花苷A按制備例制備，用時以生理鹽水稀釋至合適濃度。跳臺實驗自動記錄儀，中國醫學科學院藥物所儀電室產品；熒光分光光度計，日本HITACHI公司產品；酶標儀，美國Molecula產品。
實驗動物清潔級昆明種小鼠，♂，體重20g-22g，山東省天然藥物工程技術研究中心實驗動物中心提供，合格證號魯動質字200106003號。
2方法2.1紅花苷A對腦缺血再灌注小鼠學習記憶功能障礙的改善作用動物隨機分為假手術組(NS)，模型對照組(NS)，紅花苷A 5mg/kg組、50mg/kg組、100mg/kg組，每組10只。禁食16小時后，按文獻任德成，杜冠華，張均田.總丹酚酸對腦缺血再灌注損傷的保護作用.中國藥理學通報.2002，18(3)275-7.方法建立小鼠缺血再灌注所致癡呆模型，具體操作如下小鼠以戊巴比妥鈉(60mg/kg，ig)麻醉后，仰臥位固定。頸正中切口，分離雙側頸總動脈，并穿以零號絲線。雙側頸總動脈阻斷血流10min，然后恢復血流10min，如此重復3次，縫合皮膚。然后置小鼠于正常飼養條件。假手術組只分離雙側頸總動脈。缺血再灌注后10min，尾靜脈注射藥物，缺血再灌注24h后，第2次給藥。給藥半小時后進行跳臺實驗。將待測小鼠放入跳臺儀中，適應環境3min，然后向底部柵板通電，觀察小鼠跳上高臺時間(反應時間)和5min內小鼠由高臺跳下受到電擊的次數(訓練期錯誤次數)。24h后，再次給藥，然后進行第2次跳臺實驗測定記憶獲得功能。將小鼠放于實驗儀高臺上，底部柵板同時通電，記錄小鼠跳下高臺的時間(潛伏期)和5min內受到電擊次數(重測期錯誤次數)。
2.2紅花苷A對腦缺血再灌注小鼠腦SOD活性、MDA和GSH含量的影響小鼠缺血再灌注方法和給藥方式同上，缺血再灌注完成后，斷頭處死，于0℃下取出大腦用磷酸緩沖液制成勻漿，鄰苯三酚自氧化法測定SOD的活性，TBA法測定MDA的含量，DTNB法測定GSH的含量。考馬斯亮藍定量蛋白質。
3結果3.1紅花苷A對腦缺血再灌注小鼠學習記憶功能障礙的改善作用結果如表3所示，重復腦缺血再灌注可以使小鼠出現明顯的學習記憶障礙，反應時間延長，錯誤次數增加，潛伏期縮短。紅花苷A對缺血再灌注引起的學習記憶障礙有改善作用，減少反應時間，延長潛伏期，減少測試期和重測期錯誤次數，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。
表3紅花苷A對腦缺血再灌注小鼠學習記憶功能障礙的影響(x±SD，n＝10)
與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.013.2紅花苷A對腦缺血再灌注小鼠腦SOD活性、MDA和GSH含量的影響結果如表4所示，重復腦缺血再灌注可以使小鼠腦勻漿SOD活性下降，MDA含量升高，GSH含量降低。給予不同劑量紅花苷A可抑制缺血再灌注小鼠腦組織MDA的升高，增加GSH的含量，提高SOD的活性，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。
表4紅花苷A對腦缺血再灌注小鼠腦SOD活性、MDA和GSH含量的影響(x±SD，n＝10)
與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01試驗例4紅花苷A對小鼠閉合性腦外傷的保護作用1材料紅花苷A按制備例方法制備，用時以生理鹽水稀釋。跳臺實驗自動記錄儀，中國醫學科學院藥物所儀電室；熒光分光光度計，日本HITACHI公司；酶標儀，美國Molecula。
實驗動物清潔級昆明種小鼠，♂，體重20g-22g，山東省天然藥物工程技術研究中心實驗動物中心提供，合格證號魯動質字200106003號。
2方法與結果取小鼠70只，隨機分為正常對照組(NS)，模型對照組(NS)，紅花苷A 5mg/kg組、50mg/kg組、100mg/kg組，每組10只。禁食16小時后，按文獻，王超云，蔣王林，智紅英，等.黃芩苷對腦損傷的保護作用.中草藥，2004，35(2)188~190所述方法造成小鼠閉合性腦外傷模型，各組靜脈給藥，24小時后剝取鼠腦，稱量濕重，70℃烘干24小時，稱干重，計算腦含水量；腦含水量高于正常值表示腦部水腫。
結果如表5所示，閉合性腦外傷造成小鼠腦嚴重水腫，給予不同劑量的紅花苷A，小鼠腦水腫有不同程度的減輕，且呈劑量依賴性。
表5紅花苷A對閉合性腦外傷小鼠腦水腫的影響(x±SD，n＝10)
與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.0權利要求
1.紅花苷A在神經保護方面的應用。
2.根據權利要求1所述應用，紅花苷A在腦保護方面的應用。
3.根據權利要求1或2所述應用，紅花苷A在NMDA誘導神經細胞損傷保護方面的應用。
4.根據權利要求1或2所述應用，紅花苷A在大鼠神經細胞損傷保護方面的應用。
5.根據權利要求1或2所述應用，紅花苷A在腦缺血再灌注所致小鼠血管性癡呆保護方面的應用。
6.根據權利要求1或2所述應用，紅花苷A在小鼠閉合性腦外傷保護方面的應用。
7.一種紅花苷A的制備方法，包括如下步驟(1)紅花水提一次或多次，合并提取液，過濾，濃縮；(2)上大孔樹脂，有機溶劑洗脫，收集洗脫液；(3)洗脫液上聚酰胺柱，有機溶劑洗脫，收集洗脫液，回收有機溶劑，濃縮液干燥即得。
8.根據權利要求7所述的制備方法，其優選為(1)紅花水提一次或多次，合并提取液，過濾，濃縮；(2)加入醇進行沉淀，濾過，濃縮濾液，回收醇；(3)濾液水稀釋后上大孔樹脂，醇溶液洗脫，收集洗脫液；(4)洗脫液上聚酰胺柱，不同濃度醇溶液洗脫，收集高濃度醇洗脫液，回收醇，濃縮液干燥即得。
9.根據權利要求7所述的制備方法，其更優選為(1)干燥紅花80℃下水提3次，合并提取液；過濾，濾液減壓濃縮至密度為1.05(80℃)；(2)加乙醇至濃度為80％，4℃下沉淀24小時，濾過；濾液于60℃減壓回收醇至無醇味；(3)加至10倍水稀釋后上DM-130大孔樹脂，用5％乙醇洗脫4個柱體積，收集洗脫液；(4)洗脫液上聚酰胺柱，先50％乙醇洗脫3個柱體積，棄去；繼續用95％乙醇洗脫8個柱體積，收集洗脫液于60℃減壓回收乙醇，濃縮液冷凍干燥即得。
全文摘要
本發明提供了紅花苷A在神經保護方面的應用，具體地涉及其在腦保護方面的應用，在腦缺血所致大鼠神經細胞損傷保護方面的應用，在腦缺血再灌注所致小鼠血管性癡呆保護方面的應用。本發明還提供了紅花苷A的制備方法。
文檔編號A61P25/00GK1827097SQ20051004215
公開日2006年9月6日 申請日期2005年3月2日 優先權日2005年3月2日
發明者田京偉, 傅風華, 劉珂, 李桂生, 馬成俊, 張達磊 申請人:山東綠葉天然藥物研究開發有限公司