專利名稱：煙曲霉文丙在治療免疫性腸炎及相關免疫性疾病中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物制藥技術領域。
背景技術：
煙曲霉文丙(Fumigaclavine C)自從1977年發(fā)現(xiàn)以來，對該化合物的相關研究非常少，在藥理學方面的報道更是罕見，僅有一篇文章表明該化合物在免疫性肝炎模型中具有良好療效(Zhao et al.J Pharm Pharmcol 2004，56775-84)。另一方面，自身免疫性的腸炎是臨床上的多發(fā)病和難治性疾病，包括克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎。免疫性腸炎經(jīng)常從青少年時就發(fā)病，據(jù)報道發(fā)病率高達每年4～10/100000人。終身難愈，后期會發(fā)展成各種胃腸道疾病包括腸癌，伴隨著較高的死亡率。目前臨床上雖能對疾病進程進行控制，但尚缺乏有效的治愈手段，而且所用的藥物還有強烈的副作用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是研究煙曲霉文丙作為免疫抑制劑在免疫性腸炎及相關免疫性疾病中的應用。
本發(fā)明的技術方案1.煙曲霉文丙的提取分離及其鑒定見專利(申請?zhí)?00310112694.X譚仁祥、徐強、趙穎、劉俊彥、王俊。名稱“煙曲霉文丙在抗炎免疫抑制藥中的應用”。申請日期2003年12月19日)。
2.煙曲霉文丙的藥理試驗1)小鼠腸炎的誘導取6-8周齡的BALB/c雌性小鼠，禁食20小時。然后將3.5F的注射軟管從小鼠肛門插入直腸，深度在4厘米左右。注射軟管與1毫升注射器相連，通過這一設備向小鼠結腸腔內(nèi)注入100微升TNBS(2，4，6-三硝基苯磺酸，2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid)溶液(TNBS以50％乙醇溶液溶解，濃度為5mg/ml)。正常組小鼠給予100微升50％乙醇溶液作為對照。給藥結束后拔出注射軟管并使小鼠繼續(xù)保持垂直體位30秒，以使藥液遍布整個結腸。
2)小鼠炎癥癥狀的觀察和結腸組織病理變化的評分每日觀察并記錄小鼠的體重和存活情況。在注射TNBS后第3日至第8日對小鼠給藥。每日腹腔注射煙曲霉文丙(5，10，20mg/kg)或環(huán)孢素A(CsA，10mg/kg)，對照組腹腔注射相應體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)。所有小鼠均在TNBS注射后9日處死，分別取出sacral lymph nodes，colonic patches和結腸組織。將結腸組織用10％福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，作4-5微米厚的冠狀切片，并用蘇木精-曙紅染色。按照文獻報道對結腸的組織學變化進行評分。評分最高可達8分，此時結腸發(fā)生全面的擴散性的病變。
3)sacral lymph nodes和colonic patches淋巴細胞的制備取TNBS致敏小鼠，無菌分離sacral lymph nodes和colonic patches。將sacral lymphnodes置于5毫升D-Hank’s溶液中，用無菌針芯輕輕碾壓，并用移液管反復吹打，使細胞進入溶液并分散成單個細胞。過濾，離心，用RPMI-1640溶液洗滌兩次，混懸，計數(shù)待用。另將colonic patches用膠原酶IV(0.5mg/ml in RPMI-1640)消化20分鐘，然后加入RPMI-1640溶液吹打成為單個細胞，過濾，離心，洗滌兩遍，計數(shù)待用。
4)sacral lymph nodes，colonic patches和結腸組織中細胞因子mRNA水平的檢測將獲得的細胞調(diào)整為每毫升5×106個置于24孔板中，在37℃，5％ CO2的環(huán)境中進行培養(yǎng)。24小時后，取出細胞進行離心并用TriPure分離試劑提取總RNA。另外，各不同組的小鼠分別取出結腸組織，用TriPure勻漿提取總RNA。最后用260nm處的紫外吸收值確定RNA濃度。其后，將RNA逆轉錄為cDNA，反應體系如下2μg總RNA，2000pmol Oligo dT，1.0mM dNTP，200U M-MLV逆轉錄酶，5×轉錄緩沖液。PCR引物及擴增條件見表1。PCR產(chǎn)物用2.0％瓊脂糖膠電泳并用溴化乙錠顯色。用Labworks 4.0的軟件對電泳條帶亮度半定量分析。
5)白細胞介素2(IL-2)和干擾素γ(IFN-γ)的檢測取出如前培養(yǎng)24小時后的細胞上清，于-70℃保存。然后用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-2和IFN-γ的蛋白水平。檢測限為10pg/ml，標準曲線范圍為0到1000pg/ml。
6)明膠酶譜分析取細胞培養(yǎng)的上清，通過明膠降解的方法檢測其中的金屬基質蛋白酶-9(MMP-9).另取各組小鼠的結腸組織用含有100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的D-Hank’s溶液沖洗，然后置于1ml無血清的RPMI 1640溶液中培養(yǎng)24小時(37℃，5％ CO2)。同樣取上清測定MMP-9活性。取20μl上清與10μl sample buffer(62.5mM Tris-HCl，含有10％甘油，0.00125％溴酚蘭和12％SDS)混合上樣。電泳使用含5％聚丙稀酰胺和2mg/ml明膠的SDS-PAGE膠。電泳1小時后剝離該SDS-PAGE膠，用rinsing buffer(50mM Tris-HCl containing 2.5％ Triton X-100，5mM CaCl2，1μM ZnCl2，0.05％ NaN3)洗滌兩次，每次30分鐘。然后再用incubationbuffer(50mM Tris-HCl containing 5mM CaCl2，1μM ZnCl2，0.05％ NaN3)在37℃溫浴36小時。再以0.1％考馬斯亮蘭R250染色30分鐘，繼而用10％的冰乙酸和10％異丙醇溶液脫色。用藍色背景上的白色亮帶表征MMP-9的活性。
表1各個細胞因子的PCR參數(shù)
S上游序列，AS下游序列
3.煙曲霉文丙的藥理試驗結果及分析1)煙曲霉文丙腹腔注射對TNBS誘導腸炎的影響TNBS結腸內(nèi)給藥誘導腸炎以后，小鼠會產(chǎn)生嚴重的炎癥癥狀，如腹瀉、體重下降等，伴隨著比較高的死亡率。給予TNBS后從第3日至第8日各組動物分別每日腹腔注射煙曲霉文丙(5，10，20mg/kg)或CsA(10mg/kg)。與對照組相比，煙曲霉文丙在以10和20mg/kg的劑量給藥時能夠使小鼠的體重增長恢復到正常水平，同時還能劑量依賴性地提高小鼠的存活率。(如圖1)。
2)煙曲霉文丙腹腔注射抑制腸炎小鼠炎癥局部的病理損傷和炎性細胞浸潤TNBS結腸內(nèi)給藥誘導腸炎后9日處死動物，取出結腸組織。肉眼觀察發(fā)現(xiàn)腸粘膜水腫并有出血性潰瘍。嚴重損傷的結腸壁會由于水腫而增厚。對照組動物腸道內(nèi)沒有成形的糞便，而與此不同的是，給藥治療后的小鼠腸道內(nèi)則有固體糞便(如圖2 A)。組織切片檢查發(fā)現(xiàn)對照組動物的結腸組織發(fā)現(xiàn)腸隱窩變形，杯細胞丟失，單核細胞浸潤，還有嚴重的粘膜損傷；而煙曲霉文丙(20mg/kg)和CsA(10mg/kg)治療后對動物炎癥局部的炎癥反應和粘膜潰瘍都有顯著改善。(如圖2B，C)。根據(jù)炎癥標準評分發(fā)現(xiàn)，煙曲霉文丙治療組(5，10，20mg/kg)的組織評分分別為6.1，3.6和2.1，而對照組的分數(shù)則高達6.9(如圖2D)。
3)煙曲霉文丙抑制sacral lymph node淋巴細胞的炎癥因子的表達和產(chǎn)生以及MMP-9的活性分離對照組動物的sacral lymph node細胞并在37℃培養(yǎng)24小時，體外給予煙曲霉文丙。培養(yǎng)結束后將細胞離心，提取總RNA以檢測細胞因子和MMP-9的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)煙曲霉文丙能夠抑制參與腸炎的許多細胞因子(IL-1β，IL-2，IL-12α，IFN-γ和TNF-α)以及MMP-9的表達(如圖3A，B)。此外，收集細胞培養(yǎng)的上清檢測細胞因子的產(chǎn)生。結果表明煙曲霉文丙可以抑制IL-2和IFN-γ的產(chǎn)生(如圖3E，F(xiàn))。煙曲霉文丙同時還能抑制另一個重要的炎癥因子MMP-9(如圖3C，D)。
4)煙曲霉文丙抑制colonic patch淋巴細胞的炎癥因子的表達和產(chǎn)生以及MMP-9的活性分離對照組動物的colonic patch細胞并在37℃培養(yǎng)24小時，體外給予煙曲霉文丙。培養(yǎng)結束后將細胞離心，提取總RNA以檢測細胞因子和MMP-9的表達水平。結果與sacral lymph node淋巴細胞的實驗結果相似。如圖4A和B所示，本藥物可以劑量依賴性地抑制多種炎癥因子的表達，包括IL-1β，IL-2，IL-12α，IFN-γ，TNF-α和MMP-9。此外，它也能在蛋白水平抑制IL-2 and IFN-γ的(如圖4E，F(xiàn))。同時，酶譜分析也發(fā)現(xiàn)了煙曲霉文丙對MMP-9活性的抑制作用(如圖4C，D)。
5)靜脈注射煙曲霉文丙對腸炎小鼠結腸組織炎癥因子表達和MMP-9活性的抑制作用分離各組動物的結腸組織并勻漿提取總RNA。煙曲霉文丙或CsA給藥后能夠在mRNA水平上顯著抑制炎癥因子的表達(如圖5A，B)。而且，檢測結腸組織分離后體外培養(yǎng)的上清發(fā)現(xiàn)煙曲霉文丙和CsA組的MMP-9活性也受到了明顯抑制(如圖5C，D)。
本發(fā)明較現(xiàn)有技術的有益效果是，煙曲霉文丙(Fumigaclavine C)對難以治愈的免疫性腸炎具有良好的治療作用，能應用于包括克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎在內(nèi)的腸道疾病。鑒于本藥物對各種炎癥因子尤其是Th1細胞因子的顯著抑制作用，本藥物也可作為免疫抑制劑用于其它多種Th1細胞參與的自身免疫性疾病，如遲發(fā)型超敏反應，多發(fā)性硬化癥，胰島素依賴性的糖尿病，自身免疫性心肌炎，橋本氏病，Grave’s病，重癥肌無力等。
四
圖1.煙曲霉文丙和CsA對小鼠TNBS誘導腸炎的改善作用。煙曲霉文丙(5，10，20mg/kg)或CsA(10mg/kg)每日腹腔給藥。每日記錄各組小鼠的體重變化(A)和死亡情況(B)。結果以mean±s.e.m表示。#P＜0.05，##P＜0.01，vs正常小鼠；*P＜0.05，**P＜0.01，vs模型小鼠(Dunnett’s test)。
圖2.煙曲霉文丙和CsA對小鼠炎癥結腸肉眼觀察和顯微鏡觀察表現(xiàn)的改善作用。煙曲霉文丙(5，10，20mg/kg)或CsA(10mg/kg)每日腹腔給藥。TNBS致敏后第九日取出結腸組織進行觀察。A.腸炎小鼠的結腸外觀。B，C.腸炎小鼠結腸的組織學變化。D.腸炎小鼠結腸組織的微觀評分。結果以mean±s.e.m表示。#P＜0.05，##P＜0.01，vs正常小鼠；*P＜0.05，**P＜0.01，vs模型小鼠(Dunnett’s test)。a，正常組；b，模型組；c，d，e，煙曲霉文丙5，10，20mg/kg組；f，CsA 10mg/kg組。組織切片作HE染色。放大倍數(shù)為B×10in，C×100。
圖3.煙曲霉文丙對腸炎小鼠sacral lymph node淋巴細胞的炎癥因子表達、產(chǎn)生以及MMP-9活性的抑制作用。用RT-PCR的方法檢測IL-1β，IL-2，IL-12α，IFN-γ和TNF-α)以及MMP-9的表達(A)。再用Lab Work 4.0軟件與β-actin基因表達相比較進行半定量(B)。細胞培養(yǎng)上清中的MMP-9活性用酶譜分析法檢測(C)并以Lab Work 4.0軟件進行半定量(D)。細胞培養(yǎng)上清中的IL-2(E)和IFN-γ(F)水平分別用ELISA方法進行檢測。*P＜0.05，**P＜0.01，vs正常小鼠(Dunnet’s test)。
圖4.煙曲霉文丙對腸炎小鼠colonic patch淋巴細胞的炎癥因子表達、產(chǎn)生以及MMP-9活性的抑制作用。用RT-PCR的方法檢測IL-1β，IL-2，IL-12α，IFN-γ和TNF-α)以及MMP-9的表達(A)。再用Lab Work 4.0軟件與β-actin基因表達相比較進行半定量(B)。細胞培養(yǎng)上清中的MMP-9活性用酶譜分析法檢測(C)并以LabWork 4.0軟件進行半定量(D)。細胞培養(yǎng)上清中的IL-2(E)和IFN-γ(F)水平分別用ELISA方法進行檢測。*P＜0.05，**P＜0.01，vs正常小鼠(Dunnet’s test)。
圖5.煙曲霉文丙和CsA對腸炎小鼠結腸組織的炎癥因子表達以及MMP-9活性的抑制作用。煙曲霉文丙(5，10，20mg/kg)或CsA(10mg/kg)每日腹腔給藥。將各組的結腸組織取出并勻漿提取總RNA。用RT-PCR的方法檢測IL-1β，IL-2，IL-12α，IFN-γ和TNF-α)以及MMP-9的表達(A)。再用Lab Work 4.0軟件與β-actin基因表達相比較進行半定量(B)。另取腸組織進行體外培養(yǎng)，上清中的MMP-9活性用酶譜分析法檢測(C)并以Lab Work 4.0軟件進行半定量(D)。
五具體實施例方式
煙曲霉文丙腹腔注射能夠顯著改善TNBS誘導的小鼠免疫性腸炎。采用BALB/c雌性小鼠，首先注射TNBS，其后第3日至第8日對小鼠給藥每日腹腔注射煙曲霉文丙(5，10，20mg/kg)或環(huán)孢素A(CsA，10mg/kg)，對照組腹腔注射相應體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)。結果表明TNBS結腸內(nèi)給藥誘導腸炎以后，小鼠會產(chǎn)生嚴重的炎癥癥狀，如腹瀉、體重下降等，伴隨著比較高的死亡率。與對照組相比，煙曲霉文丙在以10和20mg/kg的劑量給藥時能夠使小鼠恢復體重增長提高小鼠的存活率(附圖1)。同時對結腸局部的炎癥反應和粘膜潰瘍都有顯著改善(附圖2B，C)。
在腸炎的發(fā)生發(fā)展過程中有許多炎癥細胞因子的參與。本研究進一步發(fā)現(xiàn)煙曲霉文丙能夠抑制參與腸炎的許多細胞因子(IL-1β，IL-2，IL-12α，IFN-γ和TNF-α)以及MMP-9的表達(附圖3A，B；圖4A，B；圖5A，B)和IL-2和IFN-γ蛋自的產(chǎn)生(如圖3E，F(xiàn)；圖4E，F(xiàn)；圖5E，F(xiàn))。煙曲霉文丙同時還能抑制另一個重要的炎癥因子MMP-9的功能(如圖3C，D；圖4C，D；圖5C，D)。
以上結果提示，煙曲霉文丙(Fumigaclavine C)可以應用于包括克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎在內(nèi)的腸道疾病以及其它多種Th1細胞參與的自身免疫性疾病，如遲發(fā)型超敏反應，多發(fā)性硬化癥，胰島素依賴性的糖尿病，自身免疫性心肌炎，橋本氏病，Grave’s病，重癥肌無力等。
權利要求
1.煙曲霉文丙在制備治療腸炎，包括克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎藥物中的應用。
2.煙曲霉文丙在制備治療多種T細胞參與的自身免疫性疾病，如遲發(fā)型超敏反應，多發(fā)性硬化癥，胰島素依賴性的糖尿病，自身免疫性心肌炎，橋本氏病，Grave’s病，重癥肌無力藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物制藥技術領域，目的是研究煙曲霉文丙作為免疫抑制劑在腸炎中的應用。本發(fā)明所述，煙曲霉文丙(Fumigaclavine C)可以應用于包括克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎在內(nèi)的腸道疾病以及其它多種T細胞參與的自身免疫性疾病，如遲發(fā)型超敏反應，多發(fā)性硬化癥，胰島素依賴性的糖尿病，自身免疫性心肌炎，橋本氏病，Grave’s病，重癥肌無力等。
文檔編號A61K31/48GK1686131SQ20051003863
公開日2005年10月26日 申請日期2005年3月31日 優(yōu)先權日2005年3月31日
發(fā)明者徐強, 譚仁祥, 吳雪豐 申請人:南京大學